一、骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的表达与凋亡的相关性(论文文献综述)
王宝剑[1](2021)在《基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立》文中进行了进一步梳理黄韧带肥厚(Ligamentum flavum hypertrophy,LFH)是退行性腰椎管狭窄症(Degenerative Lumbar Spinal Stenosis,DLSS)的主要病理表现之一。黄韧带(ligamentum flavum,LF)位于上、下椎板之间,从颈椎延伸至骶椎,起到保护和稳定脊柱的作用。黄韧带在纤维化过程中一方面是其自身体积发生增厚的改变,另一方面是其自身弹性的下降在脊柱后伸时出现皱褶、折叠,使椎管容积减小,导致马尾神经、神经根的受压和缺血缺氧。与此同时,肥厚黄韧带中增多的炎性介质会透过硬脊膜而扩撒至神经根,易造成神经根的炎症及水肿。另外,炎性介质还可以激活多种纤维化因子的表达而加速纤维化的进程。因此黄韧带炎症与纤维化的病理改变共同参与、相互影响而导致了 DLSS腰腿痛、间歇性跛行的症状。在退行性脊柱疾病的促炎细胞因子中,IL-1β、TNF-α是最主要的参与者,其在肥厚黄韧带中的高表达已得到初步证实,另外TGF-β 1/Smads被认为是引起纤维化的最重要的信号传导通路,它在各种组织与器官的纤维化和瘢痕组织纤维性修复过程中有着核心的推动作用。但目前关于黄韧带炎性或纤维化信号通路的研究较少。至于Smads通路是否可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带的肥厚,以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路中的相关原件与黄韧带厚度、纤维化程度的具体相关性尚未见报道。而在中医机制方面,“阳化气,阴成形”理论对黄韧带肥厚的病机阐明具有重要指导作用,该理论与现代医学“炎症-纤维化”的病理机制相契合。但目前尚无从该角度探讨黄韧带肥厚的报道。黄韧带肥厚动物模型的建立是研究退行性脊柱疾病的基础,也是探索黄韧带增厚机制、发现药物潜在治疗靶点的前提。但极少数研究涉及腰椎黄韧带肥厚动物模型的制作,对于该动物模型目前仍存在争议。实验一基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性目的:通过对比增厚黄韧带与未增厚黄韧带的纤维化程度以及IL-1β、TNF-α和TGF-β 1/Smads通路相关原件的表达水平,探索黄韧带厚度与纤维化程度和以上原件表达的具体相关性,初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。从“阳化气,阴成形”理论角度阐述黄韧带肥厚的中医病机,以期为中医药干预黄韧带“炎症-纤维化”病理过程提供理论支持。方法:(1)在取得医学伦理批准和患者知情同意的前提下,在临床手术中收集废弃的DLSS组增厚黄韧带和腰椎间盘突出症(Lumbar disc herniation,LDH)组未增厚黄韧带,各25例。(2)通过MRI测量两组黄韧带的厚度并对比其差异。(3)对两组标本组织进行HE染色组织学观察。(4)进行Masson三色法染色后,通过纤维化分级标准以及弹性纤维-胶原纤维比值来对比两组黄韧带总体与各层(腹侧层、中间层、背侧层)纤维化程度的差异。(5)免疫组化法检测两组黄韧带IL-1β、TNF-α、TGF-β 1/Smads(TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、collagen Ⅰ(Col 1)、collagen Ⅲ(Col 3)的定位、半定量表达。(6)Real-Time PCR 法检测两组黄韧带 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1 和 Col 3 mRNA 的定量表达。(7)相关性研究:通过pearson相关与线性回归分析明确DLSS组黄韧带的厚度与其各层纤维化程度、mRNA表达的具体相关性。结果:(1)DLSS 组的黄韧带厚度为 5.13±0.80mm,大于 LDH 组 3.52±0.67mm(p<0.01)。(2)HE染色下,LDH组的未增厚黄韧带弹性纤维呈直线状,排列紧密且整齐,表面光滑连续,以弹性纤维为主,含有少量胶原纤维,细胞数目较少。DLSS组增厚的黄韧带纤维呈波浪状,排列紊乱、疏松,弹性纤维减少,胶原纤维含量增加,成纤维细胞增多。(3)DLSS组的总体纤维化分级为2.44±0.31级,高于LDH组的1.62±0.22级(p<0.05);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级均高于LDH组(p<0.05或p<0.01或p<0.001);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的纤维化分级是逐渐递增的,即腹侧层<中间层<背侧层(p<0.05或p<0.01);DLSS组的弹性纤维-胶原纤维面积比值为1.85±0.54,低于LDH组的2.92±0.37(p<0.01);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值均低于LDH组(p<0.05或p<0.01);DLSS组腹侧层、中间层、背侧层的弹性-胶原纤维比值是逐渐递减的,即腹侧层>中间层>背侧层(p<0.05或p<0.01)。(4)免疫组化:DLSS 组的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-Smad2/3、Col 1和Col 3的蛋白表达均高于LDH组(p<0.05或p<0.01或p<0.001)。DLSS组的Smad7的蛋白表达低于LDH组(p<0.01)。(5)Real-Time PCR:DLSS 组 IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1 和 Col 3 的 mRNA 表达高于 LDH 组(p<0.05 或 p<0.01 或 p<0.001)。DLSS 组 Smad7 的 mRNA 表达低于 LDH 组(p<0.05);DLSS 组的 IL-1β、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3的mRNA表达在背侧层最高,腹侧层最低,有从背侧层向腹侧层逐渐递减的趋势。Smad7的mRNA表达在背侧层最低,腹侧层最高,有从背侧层向腹侧层逐渐递增的趋势。(6)在DLSS组中,黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的纤维化分级随着黄韧带的厚度的增加而升高。各层的相关系数r分别为0.54,0.73,0.84,说明黄韧带的厚度与背侧层纤维化分级的相关程度最高。黄韧带腹侧层、中间层以及背侧层的弹性纤维-胶原纤维比随着黄韧带的厚度的增加而降低。各层的相关系数r分别为-0.62,-0.72,-0.81,说明黄韧带的厚度与背侧层弹性-胶原纤维比值的相关程度最高。(7)在DLSS组中,黄韧带厚度与背侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为IL-1 β、Col 1等;黄韧带厚度与中间层IL-1 β mRNA表达的相关程度最高,其次依次为Smad7、TGF-β 1等;黄韧带厚度与腹侧层TGF-β 1 mRNA表达的相关程度最高,其次依次为为IL-1 β、Col 3等。结论:(1)相较于未增厚黄韧带,肥厚黄韧带中TGF-β1、Smad2、Smad3(或p-Smad2/3)、Col 1和Col3的mRNA和蛋白均呈高表达,Smad7的mRNA和蛋白呈低表达。初步证实Smads通路可以介导TGF-β1致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。(2)在肥厚黄韧带中,背侧层的纤维化程度大于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的纤维化程度呈正线性相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。在肥厚黄韧带中,IL-1β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col 1和Col 3 mRNA表达均高于中间层和腹侧层,Smad7 mRNA表达低于中间层和腹侧层。其厚度也与各层的mRNA表达呈正线性(或负线性)相关,且以背侧层相关性最高,中间层次之,最后是腹侧层。说明黄韧带炎症与纤维化的严重程度由背侧向腹侧逐渐递减,其病理改变可由背侧向腹侧逐渐发展。(3)结合“阳化气,阴成形”理论认为,黄韧带在增龄、急性创伤、慢性劳损等因素作用下易出现微损伤,并诱导了局部炎症反应,当机体处于“阴平阳秘”的生理状态时,这种损伤尚能引发适度的炎症反应,以及正常的纤维化修复和瘢痕的形成,而当机体处于阴阳失衡、阳不化气状态时,持续的炎症反应使细胞因子、趋化因子等代谢产物长期聚集于黄韧带局部,形成了炎症微环境,从而诱发了过度的纤维化修复和瘢痕的形成。该中医理论与现代医学中炎症反应诱发过度的纤维化修复和瘢痕形成的理论相类似。实验二基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价目的:建立一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,并将其与人肥厚黄韧带组织进行比较、评估。同时,探讨腰椎活动范围的增加所诱发黄韧带增厚的机制。方法:(1)将72只大鼠分为A假手术组(切开皮肤等组织后缝合)、B肌肉切除组(切除L5-L6椎旁肌肉)、C骨关节切除组(切除L5-L6棘突和棘上韧带,磨除L5/6双侧关节突关节的一半,关节囊不做缝合处理)以及D肌肉+骨关节切除组(B+C混合)共4组,于造模后的4w、8w、12w共3个时间点取材。(2)通过对黄韧带的HE染色和Masson染色,测量L5/6节段黄韧带总体和背侧层的厚度以及弹性纤维-胶原纤维的比值。(3)通过X线片测量屈曲和背伸位时L5/6节段的活动范围和椎间隙高度。(4)通过免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR法检测黄韧带中炎性因子(IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads通路相关原件和Col 1、Col 3的表达。(5)将大鼠黄韧带与人肥厚黄韧带的退变程度进行比较、评估。结果:(1)HE染色与黄韧带厚度的测量:三种造模方法均可以引起黄韧带厚度的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的整体厚度是假手术组的1.35倍,骨关节切除组是假手术组的1.14倍,肌肉切除组是假手术组的1.06倍。但三种造模方法均不能引起黄韧带宽度的额外增加。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带背侧层厚度是假手术组的2.09倍,骨关节切除组是假手术组的1.26倍,肌肉切除组是假手术组的0.96倍。三种造模方法中只有骨关节切除法和肌肉+骨关节切除法可以引起黄韧带背侧层厚度及其所占比例的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法。(2)Masson染色与纤维化程度:三种造模方法均可以引起黄韧带的弹性-胶原纤维比值的下降,其中以肌肉+骨关节切除法最为明显,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。12w时肌肉+骨关节切除组黄韧带的弹性-胶原纤维比是假手术组的0.43倍,骨关节切除组是假手术组的0.66倍,肌肉切除组是假手术组的0.95倍。(3)影像学测量:三种造模方法均可以造成屈曲位椎间隙后方高度和活动范围的增加,其中以肌肉+骨关节切除法最明显,骨关节切除法次之,最后是肌肉切除法。(4)免疫组化、免疫印迹、Real-Time PCR:①免疫组化结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的 IL-1 β、TNF-α、TGF-β 1、p-smad2/3、Col 1 和 Col 3的蛋白表达量最多,Smad7的表达量最少,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;②免疫印迹结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1和Col 1的蛋白表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法;③Real-Time PCR结果显示,肌肉+骨关节切除组所产生的IL-1 β、TNF-α、TGF-β1、Smad2、Smad3、Col1和Col 3的mRNA表达量最多,其次为骨关节切除法,最后为肌肉切除法。(5)造模术后12w时假手术组的弹性-胶原纤维的比值为2.79,将其与实验一中数据比较,其退变程度类似于人未增厚的黄韧带(2.92);肌肉切除组的弹性-胶原纤维的比值为2.65,退变程度仍接近人未增厚的黄韧带(2.92);骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.84,退变程度接近人轻度肥厚的黄韧带(1.66-2.23);肌肉+骨关节切除组的弹性-胶原纤维的比值为1.19,退变程度与人中度肥厚的黄韧带相近(1.08-1.66)。结论:(1)建立了一种新的黄韧带肥厚大鼠模型,其退变程度可能类似于人类中度肥厚的黄韧带。(2)三种造模方法均能引起黄韧带退变与增厚,其程度依次为肌肉+骨关节切除法>骨关节切除法>肌肉切除法。(3)在大鼠模型中,黄韧带背侧层的增厚占比例最高,这可能是由于背侧层在屈曲位受到更大的应力导致的。说明机械应力可能是诱发或加速黄韧带增厚的重要因素。(4)腰椎屈曲范围的增加所引发的机械应力可导致黄韧带中炎性因子TNF-α、IL-1 β的高表达,并诱导TGF-β 1/Smads通路致使细胞外基质沉积而导致黄韧带肥厚。
谭张奎[2](2021)在《基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究》文中研究表明目的采用补肾化痰方干预去卵巢大鼠,观测肠道黏膜屏障功能变化,血清及骨组织中促炎因子与抗炎因子表达,以及该方对IL-6/JAK2/STAT3和IL-2/JAK1/STAT5信号通路、CD4+T细胞亚群辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)/调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)平衡的影响,探讨补肾化痰方防治绝经后骨质疏松症的机制。方法6月龄雌性SD大鼠90只,按随机数字表分为假手术组(Sham)、模型组(Ovariectomized,OVX)、戊酸雌二醇组(Estradiol valerate,EV)、补肾化痰方低剂量组(OVX+BL,BL)、补肾化痰方中剂量组(OVX+BM,BM)、补肾化痰方高剂量组(OVX+BH,BH)。除Sham组外,其他组均采用手术切除卵巢,制作绝经后骨质疏松症模型。术后1周灌胃给药,OVX组和Sham组以等体积的生理盐水灌胃,1次/d,灌胃12周后取材。实验一:运用苏木精-伊红染色,抗酒石酸酸性磷酸酶染色,碱性磷酸酶染色,观察骨组织的病理形态;微计算机断层扫描技术检测大鼠骨量及骨微结构,观察骨量及骨小梁的变化。实验二:运用苏木精-伊红染色观察结肠组织病理形态变化;采用酶联免疫吸附法检测结肠组织中白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、IL-2、IL-10、IL-17含量;运用实时荧光定量PCR、免疫印迹法检测肠道紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA及蛋白表达。实验三:采用酶联免疫吸附法检血清中IL-6、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor,TNF-α)含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA的表达,免疫印迹法检测骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达。实验四:采用酶联免疫吸附法检测血清中IL-2、转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、STAT5 m RNA的表达,免疫印迹法检测骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB、JAK1、P-JAK1、STAT5、P-STAT5蛋白表达。实验五:采用酶联免疫吸附法检测血清中叉头框蛋白p3(Forkhead Box,Foxp3)、维甲酸相关核孤受体γt(Retinoic acid-related orphan receptorγt,RORγt)、IL-10、IL-17含量,运用实时荧光定量PCR检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17 m RNA表达,免疫印迹法检测骨组织中Foxp3、RORγt、IL-10、IL-17蛋白表达。流式细胞术检测骨组织中Th17,Treg细胞数量及Th17/Treg比值。结果实验一:苏木精-伊红染发现,Sham组股骨组织结构完整,骨小梁丰富,脂肪细胞少。OVX组股骨组织骨微结构破坏,髓腔内出现大量空泡状脂肪细胞。EV组髓腔脂肪细胞数量减少,网状结构略微修复,结构仍不完整。BL、BM、BH组骨小梁形态结构较OVX组明显改善。破骨与成骨细胞计数:与sham组比较,OVX组破骨细胞(Osteoclast,OC)数量显着增多(P<0.01),成骨细胞(Osteoblast,OB)数量无统计学意义;与OVX组比较,EV、BM、BH组OC数量显着减少(P<0.01或P<0.05),BL组差异无统计学意义;OB数量显着增多(P<0.01或P<0.05),EV、BL组差异无统计学意义。骨微结构:与Sham组相比,OVX组中骨组织骨微结构参数BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th降低(P<0.01),Conn.D.、Tb.Sp升高(P<0.01);与OVX组相比,EV、BL、BM、BH组中BMD、TMD、BMC、TMC、BV/TV、Tb.N、Tb.Th升高(P<0.05,P<0.01),Conn.D.、Tb.Sp降低(P<0.01,P<0.05)。三维重建中sham组大鼠骨组织骨小梁结构较均匀,排列整齐,连接呈网状,形态较完整;OVX组骨小梁结构明显变细、断裂、变薄,且骨皮质变薄,形态结构性差,骨质疏松样改变典型。实验二:苏木精-伊红染发现,Sham组结肠黏膜结构较完整,未见上皮细胞明显变性坏死或脱落,肠腺排列较为密集,固有层内杯状细胞丰富,形态及数量正常,未见明显炎症细胞浸润。与Sham组相比,OVX组结肠黏膜完整性受到破坏,上皮细胞变性坏死或脱落,固有层内部肠腺腺腔扩张,可见炎性细胞浸润黏膜肌层。与OVX组相比,EV、BM、BH组结肠黏膜各层次结构较为清晰,肠腺排列较规则,炎症细胞浸润减少,杯状细胞数量增加,形态改善。BL组结构改善不明显。与Sham组比较,OVX组IL-6、IL-17浓度显着升高,IL-2、IL-10浓度显着降低(P<0.01)。与OVX组比较,EV、BM、BH组IL-6、IL-17浓度显着降低(P<0.01),IL-2、IL-10浓度显着升高(P<0.01或P<0.05);BL组IL-6浓度降低(P<0.05),IL-17浓度差异无统计学意义,IL-2浓度升高(P<0.05),IL-10浓度差异无统计学意义。PCR及WB:与Sham组比较,OVX组Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA及蛋白表达显着降低(P<0.01);与OVX组比较,BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1 m RNA表达升高(P<0.01,P<0.05),EV组ZO-1 m RNA表达升高(P<0.05),BM组Claudin-1、ZO-1 m RNA表达升高(P<0.05),EV、BM、BH组Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达显着升高(P<0.01,P<0.05),BL组各项指标差异没有统计学意义。实验三:与Sham比较,OVX组大鼠血清中IL-6、TNF-α含量显着升高(P<0.01);骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA表达显着增加(P<0.01),IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达显着增加(P<0.01)。与OVX组比较,各干预组血清中IL-6、TNF-α含量显着降低(P<0.01);骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3m RNA表达显着降低(P<0.01),IL-6、IL-6R、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05)。与BL组比较,BH组血清中IL-6、TNF-α含量显着降低(P<0.01)。骨组织中IL-6、IL-6R、JAK2、STAT3 m RNA表达显着降低(P<0.01),IL-6、IL-6R、P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显着降低(P<0.01)。实验四:与Sham比较,OVX组大鼠血清中IL-2、TGF-β1含量显着降低(P<0.01);骨组织中IL-2、IL-2RA IL-2RB m RNA及蛋白表达显着降低,JAK1、STAT5 m RNA表达显着升高(P<0.01),JAK1、P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显着升高(P<0.01);与OVX组比较,各干预组血清中IL-2、TGF-β1含量显着升高(P<0.01),EV、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB m RNA表达显着升高,JAK1、STAT5m RNA表达显着降低(P<0.01,P<0.05),BL组中仅IL-2RA差异有显着性统计学意义(P<0.05)。EV、BL、BM、BH组骨组织中IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05),P-JAK1、P-STAT5蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05)。JAK1、STAT5蛋白差异无统计学意义。与BL组比较,BH组血清中IL-2、TGF-β1含量显着升高(P<0.01)。BH组骨组织中IL-2、IL-2RB m RNA表达显着升高,JAK1、STAT5 m RNA表达显着降低(P<0.01,P<0.05)。IL-2、IL-2RA、IL-2RB蛋白表达显着升高,P-JAK1、P-STAT5蛋白表达显着降低(P<0.01,P<0.05)。实验五:与Sham组比较,OVX组血清中Foxp3、IL-10浓度显着降低,骨组织中Foxp3、IL-10 m RNA及蛋白表达显着降低(P<0.01),RORγt、IL-17m RNA及蛋白显着升高(P<0.01);与OVX组比较,各干预组血清中Foxp3、IL-10浓度显着升高(P<0.01),RORγt、IL-17浓度显着降低(P<0.01,P<0.05)。EV、BM、BH组骨组织中Foxp3、IL-10m RNA显着升高(P<0.01,P<0.05),BL组差异无统计学意义,EV、BL、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17m RNA显着降低(P<0.01,P<0.05)。EV、BM、BH组骨组织Foxp3、IL-10蛋白表达显着升高(P<0.01,P<0.05),BL组Foxp3蛋白表达升高(P<0.05),IL-10蛋白差异无统计学意义;EV、BM、BH组骨组织RORγt、IL-17蛋白表达显着降低(P<0.01,P<0.05)。BL组中差异无统计学意义。流式分析:与Sham组比较,OVX组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显着降低(P<0.01),CD4+IL-17A(Th17)细胞数量显着升高(P<0.05),Th17/Treg比值显着升高(P<0.01)。与OVX组比较,EV、BL、BM、BH组CD4+CD25+Foxp3(Treg)细胞数量显着升高(P<0.01),CD4+IL-17A(Th17)细胞数量在EV、BM、BH组显着降低(P<0.01,P<0.05),在BL组差异无统计学意义;Th17/Treg比值显着降低(P<0.01)。结论补肾化痰方可能通过修复肠道黏膜屏障功能,改变骨免疫环境,调节Th17/Treg平衡,双向调节骨形成与骨吸收,起到防治PMOP的作用。
李静宜[3](2021)在《己酮可可碱逆转唑来膦酸对MC3T3-E1及RAW264.7细胞的作用研究》文中研究表明[目 的]探讨己酮可可碱(PTX)对成骨前体细胞MC3T3-E1及破骨前体细胞RAW264.7的作用机制,为临床己酮可可碱治疗药物相关性颌骨骨髓炎提供理论依据。[方 法]使用3μg/mL的唑来膦酸(ZOL)及1μg/mL的焦磷酸(NP)分别处理小鼠胚胎成骨前体细胞MC3T3-E1及小鼠巨噬细胞白血病细胞RAW264.7,再用100μg/mL的己酮可可碱治疗细胞后,细胞增殖、细胞周期及凋亡、细胞迁移分别通过CCK-8、流式细胞术和划痕实验检测,成骨诱导MC3T3-E1细胞后进行茜素红染色检测成骨分化,用RANKL因子对RAW264.7细胞进行破骨诱导分化后,TRAP染色检测其破骨分化情况,qPCR、蛋白印迹检测细胞TGF-β1、Smad4、RANKL、RANK和OPG的表达。[结 果]己酮可可碱抑制MC3T3-E1细胞凋亡,促进RAW264.7细胞凋亡(P<0.05)。48h时,唑来膦酸明显抑制MC3T3-E1和RAW264.7细胞迁移,己酮可可碱可以改善唑来膦酸对细胞的迁移抑制(P<0.05),焦磷酸钠可抑制MC3T3-E1细胞矿化。另外,己酮可可碱降低MC3T3-E1和RAW264.7细胞中TGF-β1蛋白的表达,己酮可可碱、唑来膦酸和焦磷酸钠均促进MC3T3-E1细胞中OPG的表达,唑来膦酸降低RANK蛋白表达,而己酮可可碱能改善唑来膦酸引起的RANK蛋白表达抑制。[结 论]己酮可可碱可部分逆转唑来膦酸对MC3T3-E1及RAW264.7细胞的促进或抑制作用,而焦磷酸钠可抑制MC3T3-E1细胞的矿化。
何芳[4](2021)在《TGF-β1在诱导血管钙化过程中激活Wnt/β-catenin信号通路与COX-2关系的研究》文中认为研究背景及目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney Disease,CKD)是世界范围内的公共健康问题,给全球带来了严重的经济负担。心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD)是CKD患者最常见的并发症和主要的死因,且随着疾病的进展,心血管事件的发生率和死亡率进一步增加。在CKD中血管钙化极其常见,据报道,血管钙化是CKD患者CVD发生和死亡的独立危险因素,但CKD血管钙化的具体机制还不清楚。研究发现TGF-β1诱导血管钙化的发生发展,我们的前期研究也发现,COX-2参与介导血管钙化这一过程。本研究主要探讨TGF-β1在血管钙化中的作用及其机制,探究COX-2在TGF-β1诱导的血管钙化过程中的作用及其机制,以及评价COX-2抑制剂-美洛昔康对肾衰模型大鼠肾损伤和血管钙化的作用,为临床血管钙化的预防和治疗提供新的靶点,对减少CKD患者心血管事件的发生和死亡以及提高患者生存质量有重要意义。实验方法:1.体外实验(1)原代SD大鼠主动脉VSMCs提取。(2)高磷诱导VSMCs钙化,qPCR和Western Blot检测TGF-β1m RNA和蛋白表达情况以及COX-2和β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白水平变化,荧光素酶报告质粒检测高磷对TGF-β1信号的影响。(3)腺病毒TGF-β1处理VSMCs,qPCR和Western Blot检测成骨指标Runx2、OPN以及VSMCs标记α-SMA、SM22αm RNA和蛋白表达情况,同时检测COX-2、β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Sclerostin和c-myc蛋白水平变化;免疫荧光检测β-catenin蛋白表达;茜素红染色检测VSMCs钙化情况;腺病毒TGF-β1处理SD大鼠主动脉环,14d后进行硝酸银染色,检测主动脉环钙化情况。(4)对VSMCs进行如下处理:对照、Ad TGF-β1、NS398(COX2抑制剂)、Ad TGF-β1+NS398,qPCR和Western Blot检测成骨指标Runx2、OPN以及VSMCs标记α-SMA、SM22αm RNA和蛋白表达情况,同时检测β-catenin、GSK3β、p-GSK3β、Sclerostin蛋白表达情况;对SD大鼠主动脉环做同样处理,14d进行硝酸银染色,检测主动脉环钙化情况。(5)腺病毒TGF-β1处理VSMCs,免疫沉淀(IP)检测p-Smad2/3与p-CREB之间的相互作用;染色质免疫共沉淀(CHIP)检测p-Smad2/3或p-CREB在Sclerostin和β-catenin启动子区域的募集情况。2.体内实验(1)0.75%腺嘌呤饮食诱导SD大鼠肾衰模型;(2)大鼠随机分为6组:对照组(正常饮食6W),低剂量预防组(0.75%腺嘌呤饮食+1mg/kg美洛昔康6W),高剂量预防组(0.75%腺嘌呤饮食+6mg/kg美洛昔康6W),模型组(0.75%腺嘌呤饮食6W),低剂量治疗组(0.75%腺嘌呤饮食6W后,胃内给药1mg/kg美洛昔康20d),高剂量治疗组(0.75%腺嘌呤饮食6W后,胃内给药6mg/kg美洛昔康20d)。(3)每个实验终点,处死大鼠,测量体重,收集眼眶静脉血,检测血生化指标:钙(Ca)、磷(Pi)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),同时ELISA实验检测血清中TGF-β1与COX-2的表达情况;取大鼠肾脏标本做HE染色看肾脏的病理改变情况;取大鼠胸主动脉,Western Blot检测TGF-β1与COX-2蛋白表达情况,硝酸银染色,检测每组大鼠血管的钙化情况。3.临床样本收集(1)收集重庆医科大学附属第一医院肾脏内科CKD患者血液样本,分为2组:CKD非透析患者和CKD透析患者。以下是该研究的纳入和排除标准:纳入标准:KDOQI分期三期及以上即:肾小球路过滤(GFR)≤60ml/(min·1.73m2);排除标准:(1)有慢性基础疾病;有传染性疾病,如乙型肝炎、梅毒等;(2)长期服用影响骨代谢的药物;(3)严重贫血或有出血性疾病,如:弥漫性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜等;(4)严重心血管疾病;(5)昏迷患者;(6)未经知情同意。特别说明:该研究在进行前均取得各位患者知情同意以及签字后才实施,且已通过重庆医科大学附属第一医院伦理审查委员会审查。(2)清晨空腹安静状态下,透析患者在未透析之前采血;(3)采血前仔细核对病人的姓名、性别、年龄、床号和住院号;(4)采血后在室温下静置2小时,低温(4℃)、3500rmp离心5min,收集血清,并于-80℃保存样本;(5)血生化检测:钙(Ca)、磷(Pi)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)(6)ELISA检测收集血清样本中TGF-β1、COX-2以及Sclerostin的表达情况。(7)本研究开始共计有175里患者参与,经排除标准筛选后共计96例患者入选。结果:1.体外实验结果(1)高磷诱导VSMCs钙化中,TGF-β1的m RNA和蛋白水平上调,以及TGF-β1信号转录活性增强,同时COX2和β-catenin、p-GSK3β蛋白水平上调,GSK3β蛋白水平无改变;(2)TGF-β1能上调VSMCs中Runx2、OPN的m RNA和蛋白水平,下调α-SMA、SM22αm RNA和蛋白水平,TGF-β1能诱导VSMCs和大鼠主动脉环钙化。TGF-β1在诱导VSMCs钙化过程中,上调COX2和β-catenin、p-GSK3β蛋白水平,下调Sclerostion表达,GSK3β蛋白水平无改变;(3)COX-2抑制剂NS398能降低TGFβ对Runx2、OPN表达的上调以及减少TGFβ对α-SMA、SM22αm RNA的下调作用。NS398能减少TGF-β1诱导的VSMCs和大鼠主动脉环钙化。NS398能降低TGFβ上调的β-catenin、p-GSK3βm RNA和蛋白水平,以及增加TGFβ下调的Sclerostion m RNA和蛋白水平。对GSK3β表达水平无改变。(4)IP和CHIP实验结果显示,TGF-β1处理VSMCs后,p-Smad2/3与p-CREB相互作用,p-Smad2/3与p-CREB在Sclerostion或β-catenin的启动子区域募集。2.体内实验结果(1)体重测量结果:与对照组相比,模型组大鼠体重明显下降,而治疗组大鼠体重较模型组有明显改善。(2)血清生化结果:模型组大鼠血清中Ca、Pi、BUN、Scr明显高于对照组,预防组大鼠血清中Ca、Pi、BUN、Scr高于治疗组但都低于模型组。(3)ELISA实验结果显示:模型组大鼠血清中COX-2和TGF-β1蛋白水平高于对照组。(4)HE染色结果显示:对照组大鼠肾脏结构正常,肾小球、肾小管及间质无异常改变;模型组大鼠肾脏病理改变明显:肾小球数量明显减少,肾小管扩张,管内有棕褐色晶体物质沉积,间质区域增宽,间质纤维组织增生,纤维化比较明显;预防组肾脏病理改变较模型组稍微改善一些;而治疗组肾脏病理得到一定程度的改善。(5)大鼠胸主动脉组织检测结果:WB结果显示,与对照组相比,模型组大鼠胸主动脉组织中,COX-2和TGF-β1蛋白水平明显高于对照组;硝酸银染色结果表明,模型组大鼠血管可见明显的钙化,预防组血管钙化改善不明显,治疗组血管钙化得到明显改善。3.临床样本检测结果(1)血清生化的分析结果:所有参与该研究的患者BUN及Scr水平均达到CKD KDOQI 5期,血磷水平明显升高,血钙水平降低。(2)ELISA实验结果:进行血液透析的CKD5期患者血清中COX-2和TGF-β1明显低于非透析CKD5期患者;非透析患者血清中Sclerostin水平明显低于CKD透析患者。结论:1.高磷诱导VSMCs钙化过程中,促进TGF-β1表达并且激活TGF-β1信号。2.TGF-β1可诱导VSMCs成骨分化以及胸主动脉钙化,同时也能促进高磷诱导的VSMCs钙化。3.高磷和TGF-β1在促进VSMCs钙化过程中,激活Wnt/β-catenin信号通路。4.高磷和TGF-β1在促进VSMCs钙化过程中,COX-2表达上调;抑制COX-2后能明显抑制高磷和TGF-β1诱导的VSMCs钙化。5.COX-2参与调节高磷与TGF-β1对Wnt/β-catenin信号通路的激活,抑制COX-2后高磷和TGF-β1激活Wnt/β-catenin信号作用明显减弱。6.在体内大鼠肾衰模型中,COX-2抑制剂-美洛昔康能明显减轻血管钙化,同时肾脏损伤得到一定程度的改善。
何桂松[5](2020)在《miR-877-3p调控Smad7促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究》文中认为研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)属于临床上常见的骨代谢疾病,以骨密度降低、骨量减少及骨小梁结构紊乱等为主要特征,对患者的身体健康和正常生活造成严重影响。有效增强成骨细胞活性及增加数量能明显改善骨质疏松症状,研究成骨细胞的成骨分化机制,可以为骨质疏松的治疗提供新的思路。近年来,miRNA与骨代谢的关系备受关注,目前已经发现了一些特异性miRNA及其作用靶点在成骨分化过程中起着重要作用,miRNA在成骨分化中作用机制的深入研究,将有助于为骨类疾病的治疗提供新的理论。本研究通过探究miR-877-3p在MC3T3-E1细胞成骨分化中的作用及调节机制,为骨形成障碍疾病提供了一种潜在的治疗方法。实验方法1、miR-877-3p对TGF-β1诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化的影响(1)用含TGF-β1的培养基诱导MC3T3-E1,qRT-PCR检测诱导后miR-877-3p、RUNX2、COL1A1 和 OSX 的表达水平,Western Blotting 检测 RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,碱性磷酸酶活性检测。(2)分别转染miR-877-3p mimics或inhibitor,qRT-PCR验证转染效率,并检测RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,转染后的细胞进行成骨分化诱导,碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察矿化结节的形成。(3)体内实验验证miR-877-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用2、miR-877-3p调控Smad7在MC3T3-E1成骨分化过程中表达的研究(1)利用生物信息学预测miR-877-3p的下游靶基因,双荧光素酶报告实验进行验证。(2)用含 TGF-β1 的培养基诱导 MC3T3-E1,qRT-PCR 和 Western Blotting 检测Smad7的表达水平。(3)转染 miR-877-3p mimics 或 inhibitor,qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Smad7的表达水平。(4)MC3T3-E1细胞转染miR-877-3p inhibitor后用含TGF-β1的培养基诱导,qRT-PCR 检测 Smad7、RUNX2、COL1A1 和 OSX 的表达水平。Western Blotting检测RUNX2、Smad7、p-Smad2、t-Smad2、p-Smad3、t-Smad3 的表达。(5)在MC3T3-E1细胞中共转染miR-877-3p mimics和Smad7过表达质粒,并进行成骨分化诱导,qRT-PCR检测Smad7、RUNX2、COL1A1和OSX的表达水平,ALP染色和茜素红染色观察矿化结节的形成。研究结果1、miR-877-3p对TGF-β1诱导的MC3T3-E1细胞成骨分化的影响(1)TGF-β1能促进MC3T3-E1细胞成骨分化。(2)过表达miR-877-3p促进MC3T3-E1细胞成骨分化;反之,干扰miR-877-3p抑制MC3T3-E1细胞成骨分化。(3)体内裸鼠实验证实过表达miR-877-3p促进MC3T3-E1细胞成骨分化2、miR-877-3p调控Smad7在MC3T3-E1成骨分化过程中表达的研究(1)Smad7是miR-877-3p的下游靶基因。(2)Smad7在MC3T3-E1细胞成骨分化中低表达。(3)miR-877-3p在MC3T3-E1细胞成骨分化中抑制Smad7的表达。(4)TGF-β1逆转抑制miR-877-3p导致的成骨分化减弱。(5)miR-877-3p通过抑制Smad7来促进MC3T3-E1细胞成骨分化。结论TGF-β1培养基促进MC3T3-E1细胞成骨分化,并增加miR-877-3p的表达,miR-877-3p有促进MC3T3-E1细胞成骨分化的作用。miR-877-3p通过抑制其靶基因Smad7的表达,从而促进MC3T3-E1细胞的成骨分化。下调Smad7的表达后,能提高MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。
王宗江[6](2020)在《PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究》文中提出前言随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增加。骨骼是人体中的重要器官之一,它拥有着自己的发育过程、新陈代谢、修复和改建。随着骨折患者的增多,出现骨折不愈合的比例也逐渐增加,其主要由创伤、先天性畸形、恶性肿瘤、手术和感染等多种因素引起。影响骨折愈合的因素有很多,例如骨折部位、类型、血液供应以及患者的年龄和健康状况等,骨折对患者的生活和社会具有极大的不利影响。骨折不愈合的有限治疗方法以及其他骨重建技术所具有的局限性是我们增加对骨折愈合研究的两个重要因素。虽然骨骼具有相当大的修复能力,但在当再生条件不利的情况下,例如感染、周围组织血供不足、全身性疾病等时,就需要临床干预来促进骨再生。骨折的修复仍然是骨科临床的一大挑战。目前临床上采用的修复骨损伤的方法主要有自体骨移植,同种异体骨移植,异种骨移植和人工材料的植入等。这些治疗方法在临床应用上具有很大的局限性,包括不能与宿主周围组织融合,可用的供体组织有限,医源性损伤以及术后疼痛等。骨是一种动态且高度血管化的组织,其中血管和骨细胞之间存在紧密的空间和时间关系以确保骨骼完整性。骨折修复涉及多个事件的协调,例如成骨和血管生成。干细胞生物医学研究的最新进展表明,干细胞治疗在组织再生和器官修复方面具有重要的应用前景。干细胞是指能够高度增殖和具有自我更新能力且可以分化为多种细胞的原始细胞。其中成体干细胞能够跨胚层多系统分化。在胚胎形成过程中,中胚层分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、髓基质、脂肪等多种间充质组织,而这些前体细胞因具有干细胞的特性而被称为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)。间充质干细胞在骨折患者中具有缩短愈合时间和治疗骨不连的潜能,因为这些细胞不仅具有多样性,而且能够分化为成骨细胞,还具有免疫调节功能。因此,骨组织再生成功的关键是制备足够的MSCs。MSCs具有自我更新和多能性的主要特征,在再生医学中具有很大的应用潜力,它最初存在于许多出生后的组织中,例如骨髓、脂肪组织、皮肤、脐带和胎盘。从理论上讲,不同来源的MSCs都有可能分化为成骨和软骨细胞谱系。成骨对于骨质的稳态更新和骨折再生愈合也是必不可少的。塑造骨骼结构,确保骨骼的完整性,是一个贯穿一生的动态骨重塑过程,在这个过程当中涉及了多种细胞增殖、分化和细胞外基质的合成与钙化。骨重建依赖于骨吸收和骨形成的精确协调,在这个过程当中祖细胞、间充质干细胞分化成功能性成骨细胞,这些成骨细胞组织细胞外基质骨化形成新骨。基因检测已经发现了一些分子,它们在骨重塑过程中调控这些细胞的谱系,揭示了它们抵消骨骼损失和修复受损骨组织方面的潜力。没有血管系统就没有骨骼。血管生成在骨骼发育和骨折修复过程中起着至关重要的作用。与成骨相结合的血管生成主要发生在血管形成和介导营养物质、氧气、矿物质和代谢废物的运输中,这对于维持适当的骨基质合成和矿化至关重要。在血管生成过程中,内皮细胞被募集并增殖,参与毛细血管的形成。值得注意的是,新形成的血管需要MSCs稳定,MSCs与内皮细胞的相互作用通过分泌血管生成生长因子、细胞因子等信号分子进一步调控血管生成。基于近些年对于体内和体外的研究进展,我们利用骨形成和骨修复模型,为更好的了解血管系统在骨骼发育和骨折修复过程中的补充性质提供了依据。一个活跃的血管网络是组织工程骨存活和与现有宿主组织整合的必要前提。越来越多的证据表明,在各种激素,生长因子和机械应激的影响下,细胞因子通过引导细胞增殖、迁移和分化,促进受损骨组织周围的骨生长和愈合。转化生长因子-β 1(Transforming growth factor-β 1,TGF-β 1)是骨基质中含量丰富的细胞因子,可以被释放以诱导MSCs向成骨细胞迁移和分化以产生骨骼。而血小板衍生生长因子 BB(Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)也因其在血管生成中的作用而闻名,它被作为间充质来源细胞的一种强有力的促有丝分裂原,PDGF-βB被认为可以激活这些细胞,稳定新形成的血管,协调细胞成分,促进成骨细胞分化。PDGF-BB在血管周细胞-MSC-成骨细胞的多组分级联动力学中具有重要意义,表明PDGF-BB偶联TGF-β 1可以作为成骨因子之间的中心信号。本研究主要是探讨:(1)骨组织损伤后PDGF-BB与TGF-β 1表达变化及其功能;(2)PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞迁移、增殖过程中的表达变化;(3)PDGF-BB联合TGF-β 1在间充质干细胞成骨过程中的表达变化;(4)PDGF-BB 与 MSCs 对血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达变化影响。通过研究PDGF-BB和TGF-β 1两者在联合作用对MSCs迁移、增殖与分化的影响,进一步探讨PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复过程中所起到的作用。在本研究中,我们选取了6周龄小鼠骨髓,制作骨折模型,分离出骨髓间充质干细胞,通过PDGF-BB与TGF-β 1的干预,来检测这两个因子与骨髓间充质干细胞(MSCs)的迁移增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,从而研究PDGF-BB和TGF-β 1在骨修复中的机制。PDGF-BB联合TGF-β 1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究目的:骨折的修复目前仍然是临床医生面临的一个巨大的挑战,如何有效的预防、治疗和康复是亟待解决的问题,而组织工程学提供了用于产生新骨的有希望的疗法。骨形成是一种细胞过程,对于整个生命中的骨骼发育非常重要,涉及骨生成与血管生成的耦合。在这里,我们研究了 PDGF-BB和TGF-β 1在骨折修复过程中的表达,并检测这两个因子与骨髓间充质干细胞(MSCs)的迁移、增殖和血管内皮细胞以及相关因子表达变化,为进一步研究二者在骨折修复机制的分子通路提供线索。有助于进一步认识骨折修复的分子机制以及相关因子的作用,为骨折的防治提供新思路。方法:1.通过在动物组织标本中,将第1周、3周、6周、9周时留取的骨折修复组织处理后,应用实时定量PCR技术、Western Blot检测PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量,采用Pearson检验对三者进行相关性分析;通过建立种植体移植物模型,在第2周、4周、6周、8周、10周时留取骨组织及种植物标本,测定种植物作用时间,通过AP及Von Kossa染色法检测骨组织中的碱性磷酸酶含量及钙盐含量。2.通过体外培养MSCs细胞及EPCs细胞,应用Transwell实验检测不同条件下,MSCs细胞的迁移能力及增殖;采用ARS染色观察对不同条件下的MSCs细胞的钙质含量;通过实时定量PCR技术检测成骨相关蛋白Runx2、Alkaline phosphase(AP)、Collagen type I alpha 1(Coll α 1)及 Osteocalcin(Ocn)的基因表达水平变化;使用流式细胞技术来检测内皮祖细胞表面标志物;运用ELISA检测不同处理条件下的EPCs细胞上清液中VEGF的表达量,并从分子水平上探讨骨折修复反应发生的机制。结果:1.与正常小鼠骨组织相比,小鼠骨折修复中的PDGF-BB、TGF-β 1及VEGF的mRNA表达及蛋白表达量高于对照组;而在基因表达水平上TGF-β 1分别与PDGF-BB、VEGF呈正相关;通过测定种植体移植物,发现其作用时间大于4周,且碱性磷酸酶含量及钙盐含量高于对照组。2.通过Transwell实验分别发现PDGF-BB、TGF-β 1可显着促进MSCs迁移及增殖,而且我们还发现TGF-β 1比PDGF-BB显示出更大的潜力;ARS染色观察到PDGF-BB处理后的MSCs细胞细胞内钙质丰富,而TGF-β 1处理后的MSCs细胞细胞内钙质减少;通过检测成骨相关蛋白我们发现其在PDGF-BB组表达升高,而在TGF-β 1表达减少,当二者共同作用时,相关蛋白基因表达含量Runx2、AP、Coll a 1表达增加,而Ocn表达减低;PDGF-BB能够诱导EPCs毛细管形成,加入MSCs后,进一步增强EPCs管形成;通过ELISA检测到VEGF在经PDGF-BB和MSCs处理的EPCs中高表达。结论:1.PDGF-BB和TGF-β 1都能够招募MSCs并促进其迁移、增殖,但TGF-β1更为显着;相反,PDGF-BB促进成骨作用,但TGF-β 1抑制成骨作用。2.PDGF-BB和TGF-β1的联合应用可显着诱导体内新骨形成。3.PDGF-BB与MSCs共培养可增强诱导EPCs的血管生成。4.PDGF-BB和TGF-β 1联合应用在骨折愈合修复中起到了重要作用,因此,适当调控MSCs中二者的表达量可能是调节骨折损伤后修复的一条新途径,也成为研究促进骨折后骨修复的一个新靶点。
施又兴[7](2020)在《M2型巨噬细胞在腱骨愈合中作用和机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景腱骨愈合一直是骨科、运动医学和组织再生领域的研究难点。腱骨连接部是肌肉将力量传导到骨骼的重要结构,是由软组织到硬组织过渡的特殊结构,由于应力集中容易发生断裂,使腱骨连接部损伤成为运动损伤中最常见的疾病之一。由于腱骨愈合中腱骨界面形成大量的瘢痕组织,生物力学强度远低于正常水平,临床上腱骨连接部损伤术后的再断裂率较高,增加了治疗的负担。因此,促进腱骨愈合仍然是运动医学领域面临的一个巨大挑战。腱骨连接部组成结构复杂,由渐变的四层结构组成:骨组织、钙化的纤维软骨层、非钙化的纤维软骨层和肌腱。这四层结构是梯度变化的,力学特性也逐渐发生变化,在力学传导中避免了应力的集中。然而愈合过程中在腱-骨界面形成大量的瘢痕组织代替了纤维软骨层,而腱骨愈合过程中纤维软骨层的形成与腱骨愈合的质量密切相关。腱骨连接部的发育过程中纤维软骨层发育不良将导致力学强度降低,在损伤愈合中抑制腱骨界面纤维软骨的形成导致力学性能下降。因此,腱骨愈合中促进纤维软骨形成是提高愈合的质量的关键。炎症反应参与腱骨愈合过程,愈合早期局部有大量M1巨噬细胞浸润,分泌大量促炎因子以增强局部的炎症反应,刺激细胞的分裂、趋化成纤维细胞聚集受损部位。随后巨噬细胞极化为M2型,分泌大量抗炎因子以降低局部炎症反应,促进组织再生和修复。研究表明在很多组织的愈合中,M2型巨噬细胞通过分泌多种细胞因子促进组织的修复。然而,在腱骨愈合中巨噬细胞作用研究鲜有报道,巨噬细胞对腱骨愈合的作用仍然不清楚。多项研究发现使用干细胞、物理治疗能促进腱骨愈合,并发现这些干预措施都促进了愈合部位M2巨噬细胞增多。因此,我们推测在腱骨愈合中M2型巨噬细胞发挥着重要的作用。腱骨愈合中纤维软骨形成是影响愈合的关键,但巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成的作用不清。在关节中巨噬细胞是影响软骨修复和成软骨分化的重要炎症细胞。在软骨的修复中缺乏巨噬细胞导致软骨的修复失败。M1型巨噬细胞在软骨的再生和修复中起着负性的作用,它能抑制软骨基质生成基因的表达,分泌的促炎因子和基质金属蛋白酶会诱导软骨细胞的退化,加速软骨的退变。在软骨修复进程中,M0型巨噬细胞向M2型转化有助于受损软骨的修复,M2型巨噬细胞分泌IL-10、TGF-β3等因子具有很强促进软骨修复或促成软骨分化的作用。目前为止,没有研究报道不同类型巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成的作用,但在腱骨愈合中M1型巨噬细胞分泌的促炎因子导致大量的瘢痕形成,阻碍了纤维软骨形成。因此,我们推测在腱骨愈合中M2型巨噬细胞可能通过分泌细胞因子促进纤维软骨的形成。因此,本研究旨在探明巨噬细胞在腱骨愈合中的作用和机制。我们首先建立了腱骨愈合模型,分析愈合过程中巨噬细胞转变与界面纤维软骨形成的关系。接下来通过清除愈合中巨噬细胞分析缺乏巨噬细胞对腱骨界面纤维软骨形成及生物力学性能的影响。接下来通过局部诱导巨噬细胞向M2型极化,探讨M2型巨噬细胞对腱骨愈合中纤维软骨形成和对生物力学的影响。然后通过基因测序、PCR等方法筛选M2型巨噬细胞促进腱骨愈合的目标因子,并验证M2型巨噬细胞是否通过分泌该因子促进腱骨愈合。最后,我们采用BMSCs外泌体调节腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化,观察对腱骨愈合中纤维软骨形成和生物力学的影响。研究目的1.明确腱骨愈合中巨噬细胞变化与纤维软骨形成的关系。2.阐明M2巨噬细胞对腱骨愈合和纤维软骨形成的作用。3.探明腱骨愈合中M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制。4.研究BMSCs外泌体对腱骨愈合中巨噬细胞极化和腱骨界面纤维软骨形成的作用。研究方法1.明确腱骨愈合中巨噬细胞变化与纤维软骨形成的关系我们通过建立腱骨愈合模型,收集不同时间点标本,采用免疫荧光染色和PCR分析不同时间点巨噬细胞表型的转变,采用免疫荧光染色和PCR分析不同时间点界面纤维软骨形成的规律,分析腱骨愈合中巨噬细胞表型转化与纤维软骨形成的关系。通过建立腱骨愈合模型,在愈合过程中清除巨噬细胞,观察对腱骨界面纤维软骨形成的影响,分析缺乏巨噬细胞对愈合后生物力学的影响。2.阐明M2巨噬细胞对腱骨愈合和纤维软骨形成的作用首先,我们构建小鼠腱骨愈合模型,通过局部注射IL-4/13诱导巨噬细胞向M2型极化,通过组织学、免疫荧光染色等评价腱骨界面纤维软骨变化,采用生物力学评价M2型极化巨噬细胞对愈合的影响。3.探明腱骨愈合中M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制首先,我们通过流式细胞术分选腱骨愈合中的M1和M2型巨噬细胞,通过测序筛选出具有调控干细胞成软骨分化的细胞因子,通过PCR和ELISA验证和进一步筛选,然后验证M2型巨噬细胞是通过分泌TGF-β3促进腱骨界面纤维软骨形成。4.研究BMSCs外泌体对腱骨愈合中巨噬细胞极化和腱骨界面纤维软骨形成的作用从BMSCs中分离出外泌体,与水凝胶混合后局部注射到腱骨愈合部位,观察BMSCs外泌体对腱骨愈合过程中巨噬细胞的影响及对腱骨愈合的作用。研究结果1.腱骨愈合过程中巨噬细胞变化与纤维软骨形成有关发现术后第3天界面组织内以M1型巨噬细胞为主,术后第7天以M2型巨噬细胞为主,促进成软骨分化的因子在术后第7、10天表达增多,术后14天开始有纤维软骨形成;在腱骨愈合中清除巨噬细胞导致愈合部位细胞因子减少,细胞外基质形成减少,界面纤维软骨形成显着减少,导致愈合后生物力学强度降低,表明腱骨愈合过程中巨噬细胞与纤维软骨形成具有相关性。2.腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化促进腱骨界面的纤维软骨形成,提高了生物力学性能腱骨愈合过程中M2型巨噬细胞极化后,组织中具有促进成软骨分化的因子(TGF-β3、TGF-β1、IGF-1)也显着增加,促进了腱骨界面纤维软骨形成,从而提高生物力学强度。体外研究表明M2巨噬细胞能促进BMSCs成软骨分化。3.腱骨愈合中M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β3促进腱骨界面纤维软骨形成筛选出腱骨愈合中M2型巨噬细胞分泌大量的TGF-β3,通过验证表明在腱骨愈合第7天M2型巨噬细胞出现最多时,组织中检测到TGF-β3表达增加。ELISA检测显示腱骨愈合中分选出的M2型巨噬细胞分泌大量TGF-β3。体内研究表明重组TGF-β3能显着增加腱骨界面纤维软骨的形成,而TGF-β3中和抗体抑制了纤维软骨的形成。4.BMSCs外泌体诱导巨噬细胞向M2型极化促进腱骨愈合界面纤维软骨形成在腱骨愈合中,BMSCs外泌体能调节巨噬细胞向M2型极化,减少促炎因子生成,增加细胞因子生成,促进腱骨界面的纤维软骨层的形成,提高生物力学强度。研究结论和意义本课题较为全面的阐述了巨噬细胞在腱骨愈合中的作用和机制。首先通过分析发现腱骨愈合中巨噬细胞与纤维软骨形成具有相关性,然后证明腱骨愈合中清除巨噬细胞不利于纤维软骨形成,降低了生物力学性能,接下来通过诱导腱骨愈合中巨噬细胞向M2型极化,发现M2型巨噬细胞能促进腱骨愈合中纤维软骨形成。然后通过筛选和验证证明M2巨噬细胞是通过分泌TGF-β3促进纤维软骨形成。最后发现BMSCs外泌体在腱骨愈合中可调节巨噬细胞向M2型极化,从而促进纤维软骨形成,提高生物力学性能。通过本研究,我们发现了巨噬细胞在腱骨愈合中的作用以及M2型巨噬细胞促进纤维软骨形成的机制。我们的研究结论为促进腱骨愈合提供了科学依据,为临床提高腱骨愈合强度提供了治疗策略。
代光明[8](2020)在《长链非编码RNA H19在BMP2诱导MSCs软骨终末分化和骨折修复过程中的作用及机制研究》文中研究表明目的:阐明骨形态发生蛋白2(BMP2)诱导的间充质干细胞(MSCs)软骨终末分化过程的机制对于构建BMP2介导的组织工程软骨和解决骨折愈合不良等临床问题至关重要。既往各研究表明长链非编码RNA H19(LncRNA H19)可以调节多种细胞的生物学过程,包括细胞增殖、凋亡及分化。本研究我们旨在探讨:(1)LncRNA H19是否能够调节BMP2介导的MSCs软骨终末分化和其具体相关机制;(2)运用LncRNA H19在MSCs成软骨终末分化的调节效应,进一步探讨LncRNA H19在软骨内成骨介导的骨折修复过程中的具体作用和机制。材料和方法:(1)本研究首先通过建立体外和体内BMP2诱导的MSCs成软骨分化模型,以探讨LncRNA H19对BMP2诱导的MSCs成软骨分化和软骨细胞终末分化过程的作用。FISH分析用来检测LncRNA H19在胎鼠前肢生长板软骨中的表达趋势。用腺病毒载体沉默或过表达外源性基因BMP2,GFP,LncRNA H19。而软骨分化过程相关因子的表达情况通过RT-qPCR,组织特异性染色、western blotting和免疫组织化学染色等验证。再利用Spearman的相关系性去分析LncRNA H19的表达与MSCs成软骨分化过程中的特异性标志物表达,来了解之间的相关性。机制上首先通过RIP分析鉴定了LncRNA H19和成骨转录因子Runx2的结合关系。接着miRNA芯片筛选了沉默LncRNA H19后差异miRNAs的表达谱后,联合qPCR、western blotting、生物信息学分析以及双荧光素酶报告基因检测确定出LncRNA H19靶向作用的miRNA和miRNA下游的靶基因。(2)在探讨了LncRNA H19在MSCs成软骨终末分化的调节效应后,本研究再通过构建小鼠胫骨骨折模型,以探讨LncRNA H19在软骨内成骨介导的骨折修复过程中的作用。C57小鼠胫骨近端骨折髓内针固定联合腺病毒载体沉默或过表达外源性基因GFP,LncRNA H19以及化学转染AntagomiRNA。X线检测小鼠胫骨骨折大体愈合情况。μCT及ABH/OG、TRAP染色分析骨折愈合过程骨痂组织形成和骨重建质量。western blotting检测、免疫组化及荧光染色检测骨折愈合过程中特异性标志物的表达。结果:首先,我们发现LncRNA H19在14.5 d胎鼠前肢生长板的增生软骨细胞区表达最高,而从肥大前区到肥大区表达逐渐降低。另外我们发现,在BMP2诱导下,LncRNA H19的最高表达水平紧随Sox9的峰值表达水平,而且LncRNA H19的表达与MSCs成软骨分化标志物collagen2α1、Sox9以及aggrecan呈正性相关,尤其是在BMP2诱导分化的后期。然而LncRNA H19与MSCs软骨终末分化过程中特异性标志物MMP13、Collagen10α1、Adamst5表达呈负性相关。然后我们通过体外和体内实验进一步发现,沉默LncRNA H19能够促进BMP2触发的软骨终末分化过程,这表明LncRNA H19在维持BMP2诱导的软骨细胞表型中的重要作用。在机制上,首先我们证实了LncRNA H19可以通过促进Runx2的磷酸化来调节BMP2介导的MSCs软骨终末分化过程。另外我们也发现LncRNA H19也可以通过调节miRNA-21a-5p/Smad7信号轴来调节BMP2介导的MSCs软骨终末分化过程。接着我们在骨折修复模型中发现沉默LncRNA H19会延迟骨折愈合过程,虽然在沉默LncRNA H19后,骨折周围更快的形成了更大的骨痂组织,而且骨痂组织中软骨性骨痂向骨性骨痂转化过程增强了,但是骨痂的重建过程却被抑制了。最后我们验证了miRNA-21a-5p的拮抗剂AntagomiRNA-21a-5p能够部分逆转LncRNA H19导致的骨折延迟愈合。结论:本研究中的结果表明LncRNA H19可以调节BMP2诱导的MSCs软骨终末分化过程,其作用机制主要通过:(1)促进Runx2的磷酸化;(2)调节miRNA-21a-5p/Smad7信号轴。另外本研究还证明LncRNA H19是骨折愈合过程中必要的调节因子,能够调节正常骨痂组织的形成和骨重建过程。这一发现为构建BMP2介导的组织工程软骨过程中降低软骨终末分化问题提供更多理论基础,为解决临床中骨折延迟愈合导致的骨缺损修复提供更多理论参考。
李豫皖[9](2020)在《Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究》文中研究指明研究背景/目的:目前在构建骨组织工程中血管形成的作用越来越受到广泛关注,但在构建骨组织工程中,血管形成和成骨分化之间的分子机制目前尚未阐明。人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSC)是一种来源于人废弃胎盘表层的多潜能干细胞具有向成骨细胞,成软骨细胞和成脂细胞等多系分化的能力,hAMSCs也具有良好的血管生成能力;Schnurri-3(Shn3)也称为人类免疫缺陷病毒增强结合蛋白-3(human immunodeficiency virus type I enhancer binding protein 3,HIVEP3)属于BMP/TGF-?的同源物家族。由于Shn3在成骨细胞中的缺失导致Runx2蛋白水平升高进而增强骨形成;骨形态发生蛋白9(Bone morphogenetic protein 9)具有显着上调间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)中的各种成骨分化过程中成骨相关因子的表达也能够刺激血管生成相关因子表达。然而,目前Shn3是否能够调节以及如何调节BMP9诱导的hAMSCs在体内外成骨分化和血管形成尚不清楚。基于此,在本课题研究中探讨Shn3是否参与调节BMP9在体内和体外诱导的hAMSCs向成骨分化和血管形成作用的影响及其信号通路和分子机制。方法:(1)胰酶/胶原酶联合消化方法分离并培养hAMSCs,倒置相差显微镜观察其形态改变;使用第3代hAMSCs,通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞表面分子标志物的表达;免疫荧光染色鉴定hAMSCs中波形蛋白和CK-19的表达,检测对第3代hAMSCs向成骨、成软骨及成脂细胞诱导分化潜能。(2)通过构建重组腺病毒(adenovirus,Ad)外源性过表达BMP9(Ad-BMP9)、Shn3(Ad-Shn3)和沉默Shn3腺病毒(Ad-Sim-Shn3)以及红色荧光蛋白(Red fluorescent protein,RFP)(Ad-RFP)转染第3代hAMSCs后,观察转染效率,并使用qRT-PCR检测Shn3基因在细胞中的表达情况;使用碱性磷酸酶染色和生化定量检测第3、5和7天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的早期成骨分化效应;使用茜素红S染色和骨矿化定量观察第14和21天时,Shn3对BMP9诱导的第3代hAMSCs的晚期骨矿化的作用,并使用qRT-PCR检测第7天时过表达Shn3对BMP9诱导的成骨相关基因Runx2(Runt related transcription factor 2)、骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)、I型胶原(Collagen type I,COL-I)、和成骨相关转录因子OSX(Osterix)的mRNA表达水平。(3)通过使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染技术,设BMP9组,Sim-Shn3组,BMP9+Sim-Shn3组和BMP9+Shn3组,分别转染第3代hAMSCs在24h后,将细胞打入裸鼠皮下形成裸鼠体内异位骨化的模型,在4周左右时收取异位骨块样本,并通过Micro-CT(μ-CT)对骨块扫描并行分析,对骨块行固定、包埋和切片染色,使用Masson’s Trichrome三色染色、H&E染色(hematoxylin and eosinstaining)对切片行骨小梁数量和分布进行分析,番红O固绿染色(Safranin O-fast green staining)染色观察异位成骨内软骨形成情况。使用免疫组织化学染色对各实验组异位骨块切片行染色观察,主要观察异位骨块内成骨相关指标包括OCN和骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)以及血管形成相关分子如血管生成素-1(Angiopoietin 1,ANGPT1)和血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在异位骨块中的数量和分布情况。(4)使用细胞免疫组化技术观察过表达或沉默Shn3腺病毒转染细胞后,对BMP9诱导的第3代hAMSCs血管分化指标VEGF的表达及分布。使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)在Transwell小室内共培养,其中腺病毒转染的hAMSCs在上层,HUVECs细胞在下层,使用基质胶(Matrigel)铺于板底,观察HUVECs细胞的小管形成能力,简介检测过表达或沉默Shn3对BMP9诱导的hAMSCs血管形成能力。(5)使用电纺聚乳酸-羟基乙酸(poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)共聚物支架材料,将过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)对支架材料的机构和搭载细胞后的细胞长入情况进行观察和分析。通过使用上述支架材料搭载转染腺病毒后的各实验组细胞,在培养48h后,将PLGA-细胞复合物移植入小鼠背部皮下组织内,在5周后,收集小鼠背部皮下移植物样本,并对样本行大体观察移植物在体内的血管长入情况,之后对移植物样本行免疫组织荧光染色,观察其血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)在移植物内的表达和分布。(6)使用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后,其成骨分化相关指标OCN、OPN和Runx2的蛋白表达水平;通过使用Western blot技术,检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对BMP/Smads经典的信号(Smad-1/5/8)进行蛋白印迹检测其表达;通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验检测过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后对成骨相关转录因子Runx2和VEGF的直接作用关系。结果:(1)使用胰酶和II型胶原酶联合消化方法可以一次性获得大量形态均一的hAMSCs;通过细胞传代之后到第3代hAMSCs时,hAMSCs可稳定表达波形蛋白,而低表达CK-19;流式细胞检测第3代hAMSCs细胞表面分子标志物符合MSCs鉴定的表型。第3代hAMSCs具有向成骨、成软骨和成脂细胞分化的潜能。(2)重组腺病毒外源性过表达BMP9(Ad-BMP9)、Shn3(Ad-Shn3)和沉默Shn3腺病毒(Ad-Sim-Shn3)以及红色荧光蛋白(Ad-RFP)成功转染第3代hAMSCs后,且qRT-PCR结果显示Shn3在72h左右达到峰值。ALP染色和碱性磷酸酶活性结果显示,在第3、5和7天时,外源性过表达Shn3减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应,而沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化效应;茜素红S染色和骨矿化定量结果提示在第14和21天时,外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的hAMSCs晚期骨矿化和钙结节的形成;qRT-PCR结果显示在第7天时,外源性过表达Shn3下调了BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关因子包括Runx2、BSP、COL-I和OSX的mRNA表达。(3)在上述Shn3抑制BMP9诱导的hAMSCs体外成骨分化的基础上,进一步研究了Shn3对BMP9诱导的裸鼠皮下异位骨形成的成骨分化的影响。使用外源性重组腺病毒过表达或沉默Shn3基因转染BMP9诱导的第3代hAMSCs细胞后制造的裸鼠异位成骨模型中,大体观察结果和micro-CT结果显示,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组异位成骨的骨体积减小。与其他组相比,BMP9+Sim-Shn3组具有较强的异位成骨能力。Micro-CT的分析结果显示外源性Shn3表达增加了BMP9在hAMSCs中诱导异位骨块的平均骨密度,相反,外源性过表达Shn3降低了BMP9诱导的hAMSCs异位骨形成的平均骨密度。骨组织形态学定量分析显示骨体积/总体积(Bone volume/total volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular number,Tb.N),骨小梁厚度(Trabecular thickness,Tb.Th)和骨密度(Bone mineral density,BMD)与BMP9组相比,在BMP9+Sim-Shn3组有显着增加,相反,与BMP9组相比,BMP9+Shn3组的上述参数有不同程度的下降,但骨小梁分离度在各组中无明显差异。组织化学染色结果显示与BMP9组相比,Sim-Shn3可增加了BMP9诱导的异位成骨中小梁骨数量和骨基质的形成。而外源性过表达Shn3抑制了BMP9诱导的骨基质形成,同时免疫组化染色结果显示沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的异位骨化中成骨相关因子OCN和OPN以及血管形成相关因子ANGPT1和VEGF的表达,但外源性过表达Shn3基因抑制了此种效应。(4)细胞免疫组化染色结果显示,在第7天是,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs血管分化相关指标VEGF的表达;免疫荧光染色结果显示HUVECs细胞表达内皮粘蛋白(Endomucin,EMCN)、CD31、VEGF和vWF分子的表达;在与HUVECs细胞使用Transwell共培养诱导小管形成实验结果同样显示,外源性沉默Shn3表达增强了BMP9诱导的hAMSCs间接小管形成的能力。(5)在使用过表达或沉默Shn3腺病毒转染BMP9诱导的第3代hAMSCs后和其他各组细胞分别搭载在PLGA支架材料上培养24h后,扫描电镜结果显示,细胞在PLGA电纺支架中生长情况良好,多数细胞能够贴壁;PLGA-细胞复合物移植入小鼠皮下的血管形成实验样本大体观察结果显示,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的皮下血管长入,且样本的免疫荧光染色结果提示,较其他各组中,沉默Shn3基因表达可以增强BMP9诱导的血管形成相关分子vWF的表达。(6)Western blot结果显示,在第7天是,较其他各组,沉默Shn3基因表达后能够增强BMP9诱导的hAMSCs成骨分化相关指标包括OCN、OPN和Runx2的蛋白水平表达;外源性过表达BMP9增强了Smad1/5/8的磷酸化水平,同时Sim-Shn3显着增强了BMP9诱导的Smad1/5/8的磷酸化表达。ChIP分析结果表明,转录因子Runx2能够在BMP9诱导的hAMSC中与VEGF启动子区域相结合。且免疫沉淀和免疫印迹结果表明外源性沉默Shn3的表达能够增强BMP9诱导的细胞中转录因子Runx2对其下游分子VEGF启动子的活性,证明了转录因子Runx2与VEGF分子之间的直接作用关系。结论:(1)人羊膜间充质干细胞具有MSCs的基本表型,具有向多系分化的能力包括成骨、成软骨及成脂细胞的潜能。(2)外源性沉默Shn3基因表达能够增强BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化,而外源性过表达Shn3基因表达则减弱了BMP9诱导的hAMSCs早期成骨分化和晚期骨矿化。在外源性沉默Shn3表达后,能够加强BMP9诱导的hAMSCs在体外的血管形成。(3)通过沉默Shn3基因表达可以在体内外促进BMP9诱导的早期和晚期成骨分化以及血管形成的这一过程中,这可能是通过增强BMP/Smads信号来介导,并且Shn3在参与调节BMP9诱导的hAMSCs成骨分化和血管形成的双向效应中,Shn3通过调节关键成骨转录因子Runx2,激活其下游分子VEGF以促进BMP9诱导的hAMSCs的成骨和血管生成方面,Shn3发挥了重要的作用。
黄秋霞[10](2020)在《基于Cx43蛋白研究肾主骨生长发育理论与相关实验》文中提出目的阐明肾主骨生长发育的中医理论内涵及现代医学研究情况。以Cx43蛋白及其介导的GJIC功能为切入点探讨肾主骨生长发育的理论实质,并通过大鼠BMSCs体外培养软骨向诱导分化实验,进行实验研究,论证左归丸对Cx43蛋白的调控作用及机制。方法1、理论研究:理论研究从理论渊源、理论内涵、理论运用角度,阐明祖国医学对“肾主骨生长发育”理论的认识。根据现代医学肾主骨生长发育研究情况,探讨其理论的现代医学实质。2、实验研究:SPF级2月龄SD雄性大鼠中药浓缩剂灌胃,通过血清药理学方法,制备体积分数为10%的含药血清培养液,进行共培养。采用密度梯度离心法制取BMSCs培养传代,加入诱导液进行成软骨诱导。实验分组:设立正常对照A组(培养基加入灌服生理盐水动物血清配制的诱导液)、左归丸含药血清B组(培养基加入左归丸含药血清配制的诱导液),左归丸含药血清+缝隙连接阻滞C组(同B组+AGA)。细胞分组处理后,每3d换液一次,诱导培养21d。培养过程中进行细胞形态学观察;第14天采用RT-PCR技术检测Cx43、GDF-5mRNA表达、免疫荧光染色检测Cx43蛋白表达,划痕染料标记示踪法检测细胞GJIC功能;第21天免疫组化学检测II型胶原蛋白的表达情况。各指标检测,行组间对比。所得数据均用sx?表示,用SPSS 17.0软件处理,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.O5表示差异有统计学意义。结果1、理论研究:肾主骨生长发育理论源于《内经》“肾主骨”理论,“肾主藏精,生髓养骨”是其理论核心。“气-血-精-髓”联系密切,它们是形成骨外在形态的重要物质成分。肾阴、肾阳均以肾中精气为基础,相互协调,维持骨正常的生长发育。肾化生精髓为骨生长发育提供物质基础;病理情况下肾虚影响骨骼的生长发育、骨骼的运动功能、产生各种骨骼疾病。现代医学研究证明中医肾与骨之间存在密切的联系,肾主骨生长发育的过程,具体体现为调控NEI网络、各种骨骼细胞、微环境间的动态平衡。其中BMSCs、Cx43蛋白及其介导的GJIC功能研究是肾主骨生长发育的实质研究中重要的内容。2、实验研究:软骨向分化诱导培养的细胞由初期的梭型,逐渐变成圆形或类圆形,胞浆丰富,分泌大量基质,分化为软骨细胞。左归丸含药血清能明显促进Cx43mRNA、GDF-5mRNA表达,B组与A组比较,P<0.O5。Cx43蛋白荧光反应沉积物主要在细胞膜表面、胞质、胞核附近区域表达,平均积分光密度值组间对比,左归丸含药血清能明显促进细胞Cx43蛋白表达,B组与与A组比较,P<0.O5。GJIC染料标记检测中,可见绿色荧光在划痕两侧扩散,荧光定量分析存在组间差异,B组与A组、C组比较,P<0.O5。细胞II型胶原蛋白表达于细胞外基质和细胞浆中,阳性反应物平均光密度,组间比较,差异具有统计学意义,B组与A组比较,P<0.O5。加用AGA后,Cx43 mRNA及蛋白、GDF-5mRNA表达无明显影响,但II型胶原蛋白表达减少,定量分析显示,B组显着高于A组、C组,P<0.O5。结论现代医学从多方面证明了中医肾与骨之间存在密切联系,Cx43蛋白可能是是肾主骨生长发育的重要物质基础,是肾精重要的功能层次体现。左归丸含药血清能增加BMSCs成软骨向诱导分化过程中Cx43蛋白的表达及GJIC功能,发育基因GDF-5在此过程中发挥协同作用。这可能是其促进BMSCs成软骨分化成熟过程中的重要机制。
二、骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的表达与凋亡的相关性(论文开题报告)
(1)论文研究背景及目的
此处内容要求:
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例:
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
(2)本文研究方法
调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的表达与凋亡的相关性(论文提纲范文)
(1)基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
英文缩略词 |
第一部分 文献综述 |
综述一 黄韧带肥厚的机制及动物模型建立的研究进展 |
参考文献 |
综述二 TGF-β1/Smads信号通路与纤维化 |
参考文献 |
第二部分 实验研究 |
实验一 基于“阳化气,阴成形”理论研究IL-1β、TNF-α和TGF-β1/Smads在LFH中的表达及相关性 |
前言 |
1 材料与方法 |
1.1 标本收集 |
1.2 纳入与排除标准 |
1.3 影像学测量 |
1.4 主要器械、设备、试剂等 |
1.5 手术方式 |
1.6 标本的取材、运输等标准操作规程 |
1.7 HE染色与组织形态学观察 |
1.8 Masson染色与纤维化观察 |
1.9 免疫组化法检测两组黄初带IL-lp、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1和Col3蛋白的定位、半定量表达 |
1.10 实时焚光聚合酶链式反应(Real-Time PCR)检测IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3&mRNA表达 |
1.11 统计学方法 |
2 结果 |
2.1 一般资料 |
2.2 HE染色结果 |
2.3 Masson染色结果 |
2.4 免疫组化结果 |
2.5 Real-Time PCR结果 |
2.6 DLSS组内黄韧带厚度和各层纤维化分级的相关性分析 |
2.7 DLSS组内黄韧带厚度和各层弹性-胶原纤维比的相关性分析 |
2.8 DLSS组内黄韧带厚度和各层mRNA表达的相关性分析 |
3 讨论 |
3.1 炎症与纤维化是黄韧带肥厚的主要病理机制 |
3.2 黄韧带背侧层是退变的起点 |
3.3 基于“阳化气,阴成形”理论探讨黄韧带“炎症-纤维化”病理过程 |
3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨DLSS的中医药治疗 |
3.5 其他 |
4 结论 |
参考文献 |
实验二 基于三种造模方法诱导大鼠黄韧带肥厚动物模型的建立与评价 |
前言 |
1 材料与方法 |
1.1 实验动物 |
1.2 主要器械、设备、试剂等 |
1.3 实验动物的分组与取材 |
1.4 实验动物的造模 |
1.5 影像学测量 |
1.6 HE染色与大鼠黄韧带厚度的测量 |
1.7 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化观察 |
1.8 免疫组化法检测各组黄初带IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7)、Col1、Col3蛋白的定位、半定量表达 |
1.9 免疫印迹法定性、半定量分析IL-1β、TNF-α、TGF-β1和Coll蛋白在各组黄韧带内表达 |
1.10 Real-Time PCR检测 IL-1β、TNF-α、TGF-β1/Smads (TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7)、Col1、Col3的mRNA表达 |
1.11 统计学方法 |
2 结果 |
2.1 HE染色与大鼠黄韧带厚度的结果 |
2.2 Masson染色与大鼠黄韧带纤维化的结果 |
2.3 影像学测量结果 |
2.4 免疫组化结果 |
2.5 免疫印迹结果 |
2.6 Real-Time PCR结果 |
2.7 大鼠黄韧带与人增厚黄韧带的比较 |
2.8 模型成功率 |
3 讨论 |
3.1 大鼠黄韧带肥厚模型的建立方法 |
3.2 大鼠黄韧带肥厚的病理表现 |
3.3 机械应力是诱发或加速黄韧带肥厚的重要因素 |
3.4 基于“阳化气,阴成形”理论探讨大鼠黄韧带增厚模型的建立 |
4 结论 |
参考文献 |
结语 |
不足与展望 |
创新点 |
致谢 |
附件 |
(2)基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究(论文提纲范文)
摘要 |
Abstract |
中英文缩略词表 |
前言 |
第一部分 理论研究 |
1 中医对绝经后骨质疏松症的认识 |
2 西医对绝经后骨质疏松症的认识 |
3 补肾化痰方组成及药理研究进展 |
第二部分 实验研究 |
实验一 补肾化痰方对去卵巢大鼠骨量及骨组织病理形态的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验二 补肾化痰方对OVX大鼠肠道物理屏障功能的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验三 补肾化痰方对IL-6/JAK2/STAT3 通路的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验四 补肾化痰方对IL-2/JAK1/STAT5 通路的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
实验五 补肾化痰方对 Th17/Treg 平衡的影响 |
1 实验材料 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
结语 |
1 结论 |
2 创新点 |
3 问题与展望 |
参考文献 |
附录 |
附录一 综述 肠道微生物与骨的相关性研究进展 |
参考文献 |
附录二 博士期间学术成果 |
致谢 |
(3)己酮可可碱逆转唑来膦酸对MC3T3-E1及RAW264.7细胞的作用研究(论文提纲范文)
缩略词表 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
前言 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
综述 己酮可可碱在治疗药物相关性颌骨骨髓炎中的作用 |
参考文献 |
攻读学位期间获得的学术成果 |
致谢 |
(4)TGF-β1在诱导血管钙化过程中激活Wnt/β-catenin信号通路与COX-2关系的研究(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
参考文献 |
第一部分 TGF-β1 诱导VSMCs钙化过程中与Wnt/β-catenin信号通路关系的研究 |
1 材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
第二部分 COX-2在TGF-β1 诱导VSMCs钙化中的作用及其机制的研究 |
1 试验材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
第三部分 体内抑制COX-2 对慢性肾衰所致血管钙化和肾损伤作用的研究 |
1 材料和方法 |
2 实验结果 |
3 讨论 |
4 结论 |
全文总结 |
参考文献 |
文献综述 慢性肾脏病血管钙化的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间的研究成果及发表的学术论文目录 |
(5)miR-877-3p调控Smad7促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究(论文提纲范文)
摘要 |
ABSTRACT |
第一章 前言 |
第一节 骨质疏松的概念 |
第二节 骨质疏松的流行病学研究 |
第三节 骨质疏松的危害 |
第四节 骨质疏松的发病原因 |
第五节 骨质疏松的发病机制 |
第六节 骨质疏松的治疗和研究现状 |
第七节 TGF-β与骨质疏松关系的研究 |
第八节 miRNA与骨质疏松症的相关性研究 |
第九节 Smad家族与骨质疏松的相关性 |
第十节 本课题的研究目的和意义 |
第二章 TGF-β1对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响 |
2.1 前言 |
2.2 材料和方法 |
2.3 实验方法 |
2.4 结果 |
2.5 讨论 |
第三章 miRNA-877-3P对MC3T3-E1细胞成骨分化的相关性分析 |
3.1 前言 |
3.2 材料和方法 |
3.3 实验方法 |
3.4 结果 |
3.5 讨论 |
第四章 miR-877-3p调控Smad7在MC3T3-E1成骨分化过程中表达的研究 |
4.1 前言 |
4.2 材料和方法 |
4.3 实验方法 |
4.4 结果 |
4.5 讨论 |
全文总结 |
参考文献 |
附录: 缩略语和中英文对照表 |
攻读学位期间发表论文情况 |
致谢 |
(6)PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究(论文提纲范文)
中文摘要 |
英文摘要 |
符号说明 |
第一部分 骨组织损伤修复过程中PDGF-BB及TGF-β1表达变化及其功能的研究 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第二部分 PDGF-BB及TGF-β1诱导间充质干细胞表达及作用机制 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第三部分 PDGF-BB和TGF-β1诱导体外间充质干细胞成骨分化的实验研究 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
第四部分 PDGF-BB与间充质干细胞对内皮祖细胞的影响 |
材料与方法 |
结果 |
讨论 |
结论 |
参考文献 |
致谢 |
攻读学位期间发表的学术论文目录 |
学位论文评阅及答辩情况表 |
英文文章 |
(7)M2型巨噬细胞在腱骨愈合中作用和机制研究(论文提纲范文)
缩略语表 |
英文摘要 |
中文摘要 |
第一章 前言 |
第二章 腱骨愈合中巨噬细胞转变与纤维软骨形成的相关性研究 |
2.1 引言 |
2.2 材料与方法 |
2.3 结果 |
2.4 讨论 |
2.5 小结 |
第三章 腱骨愈合中M2型巨噬细胞促进腱骨愈合的作用 |
3.1 引言 |
3.2 材料与方法 |
3.3 结果 |
3.4 讨论 |
3.5 小结 |
第四章 腱骨愈合中M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β3促进纤维软骨的形成 |
4.1 引言 |
4.2 材料与方法 |
4.3 结果 |
4.4 讨论 |
4.5 小结 |
第五章 腱骨愈合中BMSC外泌体通过调节巨噬细胞向M2型极化促进纤维软骨形成 |
5.1 引言 |
5.2 材料与方法 |
5.3 结果 |
5.4 讨论 |
5.5 小结 |
全文总结 |
参考文献 |
文献综述 腱骨愈合的研究进展 |
参考文献 |
攻读博士学位期间发表的论文 |
致谢 |
(8)长链非编码RNA H19在BMP2诱导MSCs软骨终末分化和骨折修复过程中的作用及机制研究(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
中文摘要 |
英文摘要 |
前言 |
第一部分 长链非编码RNA H19在BMP2 诱导MSCs成软骨分化到软骨终末分化过程中的作用及机制 |
前言 |
1 第一节 长链非编码RNAH19与软骨分化过程中相关分子表达的相关性 |
2 第二节 长链非编码RNA H19在BMP2 诱导MSCs成软骨终末分化过程中的作用 |
3 第三节 长链非编码RNA H19 调控BMP2 诱导MSCs成软骨终末分化过程的机制 |
4 讨论 |
参考文献 |
第二部分 长链非编码RNAH19在骨折愈合过程中的作用及机制 |
前言 |
1 第一节 构建小鼠胫骨近端沉默长链非编码RNAH19的骨折模型 |
2 第二节 长链非编码RNAH19对骨折愈合的作用 |
3 讨论 |
参考文献 |
全文总结 |
文献综述:长非编码RNAH19调节软骨形成、成骨和骨关节炎的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
攻读博士期间的主要学术成果 |
(9)Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究(论文提纲范文)
英汉缩略语名词对照 |
中文摘要 |
ABSTRACT |
第一部分 羊膜间充质干细胞分离、提取与鉴定及其多向分化潜能的实验研究 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 实验方法 |
3 结果 |
4 讨论 |
第二部分 Shn3对BMP9 诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成的作用 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
第三部分 Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化和血管形成中的信号机制 |
前言 |
1 材料与方法 |
2 实验方法 |
3 实验结果 |
4 讨论 |
参考文献 |
文献综述:成骨分化和血管形成中分子的偶联机制的研究进展 |
参考文献 |
致谢 |
博士期间的主要学术成果 |
(10)基于Cx43蛋白研究肾主骨生长发育理论与相关实验(论文提纲范文)
中文摘要 |
Abstract |
缩略词表 |
前言 |
第一部分 理论研究 |
1 祖国医学对肾主骨生长发育理论的认识 |
1.1 理论渊源 |
1.2 理论内涵 |
1.3 理论运用 |
2 现代医学肾主骨生长发育相关研究 |
2.1 肾主骨生长发育研究概况 |
2.2 BMSCs与肾主骨生长发育研究 |
2.3 Cx43 与肾主骨生长发育研究 |
第二部分 实验研究 左归丸对大鼠BMSCs成软骨分化过程中Cx43 表达的影响研究 |
1 材料与方法 |
1.1 中药 |
1.2 含药血清制备 |
1.3 主要仪器与试剂 |
1.4 大鼠BMSCs分离培养 |
2 指标检测 |
2.1 培养细胞形态学观察 |
2.2 Cx43、GDF-5mRNA表达检测 |
2.3 Cx43 蛋白表达及定量检测 |
2.4 细胞GJIC功能检测 |
2.5 Ⅱ型胶原蛋白表达 |
2.6 统计学处理 |
3 结果 |
3.1 培养细胞形态学观察 |
3.2 Cx43、GDF-5mRNA表达结果 |
3.3 Cx43 蛋白表达结果 |
3.4 细胞GJIC功能检测结果 |
3.5 Ⅱ型胶原蛋白表达结果 |
讨论 |
1 左归丸选方意义 |
1.1 左归丸方义 |
1.2 左归丸与骨发育相关研究 |
2 左归丸对BMSCs成软骨分化及Cx43 表达的影响 |
3 左归丸对Cx43 表达影响的相关机制研究 |
3.1 GDF-5 与骨发育的相关研究 |
3.2 Cx43与GDF-5 协同促进软骨发育 |
结语 |
参考文献 |
附录 |
1 综述 肾主骨生长发育理论相关研究进展 |
参考文献 |
2 发表论文 |
致谢 |
四、骨折愈合过程中BMP2和TGFβ1mRNA的表达与凋亡的相关性(论文参考文献)
- [1]基于“阳化气,阴成形”理论研究TGF-β1/Smads影响黄韧带肥厚的机制及模型的建立[D]. 王宝剑. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于肠物理屏障与骨免疫探讨补肾化痰方防治去卵巢大鼠骨丢失的实验研究[D]. 谭张奎. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [3]己酮可可碱逆转唑来膦酸对MC3T3-E1及RAW264.7细胞的作用研究[D]. 李静宜. 昆明医科大学, 2021(02)
- [4]TGF-β1在诱导血管钙化过程中激活Wnt/β-catenin信号通路与COX-2关系的研究[D]. 何芳. 重庆医科大学, 2021(01)
- [5]miR-877-3p调控Smad7促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究[D]. 何桂松. 南方医科大学, 2020(01)
- [6]PDGF-BB联合TGF-β1在骨折修复中的表达及其作用机制的研究[D]. 王宗江. 山东大学, 2020(08)
- [7]M2型巨噬细胞在腱骨愈合中作用和机制研究[D]. 施又兴. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(01)
- [8]长链非编码RNA H19在BMP2诱导MSCs软骨终末分化和骨折修复过程中的作用及机制研究[D]. 代光明. 重庆医科大学, 2020(01)
- [9]Shn3参与调控BMP9诱导的人羊膜间充质干细胞成骨分化与血管形成的效应和机制研究[D]. 李豫皖. 重庆医科大学, 2020(01)
- [10]基于Cx43蛋白研究肾主骨生长发育理论与相关实验[D]. 黄秋霞. 湖北中医药大学, 2020(11)