一、抗肿瘤单克隆抗体导向药物的研究概况（论文文献综述）
方佳成[1]（2021）在《泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用》文中认为癌症已经成为危害人类健康的主要疾病,据世卫组织国际癌症研究机构数据显示,2020年,全球男性和女性将合计出现约1930万和1000万的新发病例和癌症死亡病例,其中的1800万例和930万例将来自实体瘤。然而,对肿瘤治疗的系统评估数据显示,欧洲药物管理局在2009-2013年度批准的大多数抗癌药物未能对患者的整体生命质量产生重大改善。因此,需要继续提高抗肿瘤药物的临床疗效。抗体偶联药物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）和嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法是发展迅速的肿瘤靶向治疗技术,它们通过特异性识别在恶性细胞和正常组织细胞之间差异过表达的靶标抗原,达到辨识肿瘤和消融肿瘤的目的。ADC和CAR-T实现安全性与有效性的关键,在于其所识别的靶标抗原是否具备足够的肿瘤特异性。因而,鉴别出理想的靶标抗原至关重要。理想的靶标抗原由恶性细胞特异性表达,然而肿瘤特异性抗原屈指可数。肿瘤相关抗原在肿瘤细胞上表达升高,在正常细胞上限制性表达,这一特性使得它们亦能够作为有效定位恶性肿瘤的靶标分子。目的:以发现理想的肿瘤相关抗原为出发点,着力于打造肿瘤相关抗原发现新平台,构建全面的泛实体瘤肿瘤相关抗原图谱,为癌症研究人员和广泛的科学与医药界科研工作者提供研究便利。方法:1.使用经统一处理的TCGA和GTEx的RNA序列数据,对19种类型实体瘤中的20242个HUGO基因进行差异分析;通过将阈值设置为Benjamini-Hochberg adjusted p值为0.01,log2Fold Change为1.0,保留那些在肿瘤细胞群中显着差异表达的HUGO基因;结合蛋白质亚细胞定位信息,排除不具备胞外结构域的蛋白;使用集成了GTEx,HPA和FANTOM5的m RNA表达信息和HPA和HPM的蛋白质丰度信息的数据集,获取在正常组织中受限表达的蛋白分子;使用公开的Blood Spot平台,发现那些在骨髓Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-HSCs和Lin-CD34+CD38-CD90-45RA-MPPs中限制性表达的蛋白分子。2.将RNA测序的读段计数数据转换为TPM格式,并将每个基因在其配对适应症和正常组织中的TPM值作为差异表达分析的输入数据。采用非参数Mann-Whitney U检验分析,计算并绘制每个候选靶标分子在特定适应症中的表达相比其在各个人体正常组织中的表达的差异表达谱。3.提取并整理TCGA中泛癌表型数据中的癌组织学分级,病理分级和TNM分期信息;通过挖掘MC3（“多中心多癌种突变识别”）TCGA MAF（“突变注释格式”）数据,确定靶标基因的非沉默体细胞突变（SNP和INDEL）。结合m RNA表达数据,汇编用于评价靶标基因的异质表达模式的综合数据集。4.从TCGA下载并提取靶标基因组变异数据,从Onco KB收集致癌或功能性基因组变异信息,注释并统计靶标基因的变异类型及发生频率,确定在临床上有应用价值的携带特异性驱动变异的功能性靶标。5.通过杂交瘤技术制备CDH17特异性单克隆抗体,进而运用流式细胞术、过表达共定位分析、结合亲和力检测、抗体测序和可变区序列进化关系分析等,多重表征抗体的各项指标。通过偶联mc-Val Cit PABC-MMAE,制备CDH17靶向型ADC。结合体外杀伤实验与细胞内化评估,完成效应分子的初筛验证。6.通过构建KM12SM和COLO205结肠癌细胞系CDX动物模型,综合评估chi2E21-MMAE和chi2F12-MMAE的体内抗肿瘤活性。通过制备和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子,并对给药的荷瘤小鼠的心/肺/肝/肾/结肠/直肠/脾脏进行HE染色,评估CDH17靶向型ADC对小鼠的组织毒性。7.通过慢病毒载体感染CD3+T细胞,制备LYPD3靶向型CAR-T细胞。通过对CAR-T细胞进行分化检测,确定其向效应细胞持续分化的能力。通过体外细胞杀伤实验和细胞因子分泌检测,研究LYPD3靶向型CAR-T细胞对肿瘤细胞的的特异性杀伤作用。通过对荷瘤小鼠循环血中的CAR-T细胞进行计数和检测肿瘤组织中的T细胞浸润水平,揭示LYPD3靶向型CAR-T细胞在小鼠体内发挥持久抗肿瘤作用的机制。结果:1.开发专门的算法和汇编整合有泛实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组信息的综合数据集。2.系统地识别肿瘤相关抗原。通过我们的肿瘤相关抗原发现平台,筛选得到75个潜在的肿瘤相关抗原分子。特别是BACE2、CDH17、CELSR1、CELSR2、COL17A1、COL23A1、CRIM1、DSC3、GPR87、LYPD3、MUC17、NOX1、PTPRN2、SCTR、TRPM8、VCAM1等分子值得做进一步的临床前研究。3.基于CDH17蛋白定向开发的ADC分子可以在体内显着消融KM12SM和COLO205异种移植瘤,并对高表达CDH17蛋白的结肠癌病人来源的异种移植瘤表现出一定的肿瘤抑制效果。chi2F12-MMAE在体外对高药敏度的COLO205显示高水平的细胞毒性（IC50=60.9p M）,chi2E21-MMAE和chi1A13-MMAE对COLO205的抑瘤水平相当（IC50:925.8 p M vs.998.3 p M）。两次单药静脉注射（Q2W）chi2E21-MMAE或chi2F12-MMAE,均能以剂量依赖性的方式抑制KM12SM在小鼠体内的生长,但无法完全清除肿瘤。在COLO205 CDX模型中,按同样的给药方式静注chi2F12-MMAE,1.5 mg/kg剂量的第一针治疗可以起到平缓异种移植肿瘤增长的效果,且两周后的第二针治疗亦能继续起到溶瘤效果;3 mg/kg的中剂量治疗组有部分小鼠的肿瘤在后期出现反弹;6 mg/kg的高剂量治疗可以根治异种移植瘤。4.CDH17靶向型ADC在小鼠体内具有相对可控的组织毒性。制备了能和人鼠CDH17蛋白交叉反应的ADC分子677-MMAE,观察到在677-MMAE给药组小鼠的结直肠的局部组织中有炎症反应,聚集了大量的淋巴细胞;但在其它组织中没有出现炎症反应。此外,在观察期内,小鼠对chi2E21-MMAE、chi2F12-MMAE或677-MMAE的体内耐受良好,用药期间未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。5.LYPD3靶向型CAR-T细胞能够在小鼠体内对PC9异种移植肿瘤发挥持久的抗肿瘤作用。且小鼠对LYPD3-CAR-T的耐受良好,在观察期内未有小鼠死亡个例出现,亦没有观察到10%以上的减重。进一步调查发现,LYPD3-CAR-T细胞不仅在小鼠外周血中大量存在,还在高响应LYPD3-CAR-T治疗的PC9异种移植瘤组织中大量浸润。此外,LYPD3-CAR-T治疗组的小鼠脾脏内出现大量CD3+T细胞,但在对照组中却没有。CAR-T细胞的记忆表型对于激发持久的免疫应答至关重要。数据显示,LYPD3-CAR-T细胞在输注前,其中的Tn/Tscm细胞和Tcm细胞比例分别高达52.4%和21.7%,具有良好的向效应细胞分化的潜能。结论:通过开发肿瘤相关抗原识别算法和整合来自19种实体瘤和正常组织的大型转录组、蛋白质组和基因组数据,完成了泛实体瘤相关抗原的探索。通过考察CDH17靶向型ADC和LYPD3靶向型CAR-T细胞在模型小鼠中的抗肿瘤活性,例证了CDH17和LYPD3蛋白分别作为ADC和CAR-T靶标开发的可行性。
刘丹丹[2]（2019）在《人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究》文中研究指明近年来,全球医药市场的发展重心正逐步从小分子化学药转向生物药,生物药在全球医药市场中的比例已接近20%,并有逐步扩大之势。在生物药研发中,单克隆抗体药物研发无疑成为最受关注的焦点,是增长最快的细分领域之一,已成为生物药中最重要的一大品类,人源化单克隆抗体药物在单克隆抗体药物中占有重要地位,尤其是在国内单克隆抗体药物研发中占有更加重要的地位。由于创新药物研发是一项风险高、耗费时间长、投入资金巨大的工程。我国创新药物研究发展比较落后,各个制药企业规模小,自主创新能力弱,对创新药研发风险估计不足,承担新药研究风险的能力弱。所以,对人源化单克隆抗体药物研发风险管理进行系统研究,降低企业研发风险,对我国制药企业意义重大。本文基于人源化单克隆抗体药物研发的特点,结合我国人源化单克隆抗体药物研发的现状,对人源化单克隆抗体药物临床前研发过程中的风险进行研究:①通过文献研究,梳理出人源化单克隆抗体药物研发流程。包括:靶点的选取研究、鼠源性单克隆抗体的获取研究、人源化单克隆抗体细胞株构建研究、细胞培养与工艺研究、制剂处方与工艺设计研究、临床前动物试验研究和临床试验研究。②通过文献研究法和德尔菲法,准确识别出人源化单克隆抗体药物临床前研发风险:细胞株构建研发阶段包括3个目标层指标、19个因素层指标、83个指标层指标;细胞培养和工艺研发阶段包括1个目标层指标、6个因素层指标、58个指标层指标;制剂研发阶段包括1个目标层指标、5个因素层指标、21个指标层指标;动物试验研发阶段包括1个目标层指标、3个因素层指标、16个指标层指标。③通过问卷调查的方式对相关风险指标进行量化和赋值,运用风险矩阵法对人源化单克隆抗体药物临床前研发风险进行评价:靶点的选取研究风险RR值为2.74,是较高风险;鼠源性单克隆抗体的获取研究风险RR值为2.08,是一般风险,人源化单克隆抗体细胞株构建研究风险RR值为2.56,是较高风险;人源化单克隆抗体药物细胞培养与工艺研究风险RR值为2.32,是一般风险;人源化单克隆抗体药物制剂研究风险RR值为2.63,是较高风险;人源化单克隆抗体药物动物试验研究风险RR值为2.93,是较高风险。④根据风险评价结果,提出风险控制的措施。通过人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究,为降低企业人源化单克隆抗体药物研发风险,提升我国单克隆抗体药物研发风险管理研究水平提供多角度的参考依据。
熊佳妮[3]（2019）在《基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理研究目的:通过化学交联曲妥珠单抗和重组南瓜蛋白构建免疫毒素T-CUS245C,以增强HER-2靶向治疗疗效。基因工程方法将曲妥珠单抗可变区基因与南瓜蛋白基因序列通过连接子融合,构建HER-2单链抗体（Ts）重组免疫毒素Ts/CUS。检测T-CUS245C及Ts/CUS的体外抗肿瘤活性,并研究T-CUS245C内化作用及其同药效的关系,同时研究Ts/CUS同抗PD-1单克隆抗体联合在体外对肿瘤细胞表达PD-L1的影响。通过上诉研究了解以南瓜蛋白为毒素靶向HER-2受体的免疫毒素的药效、及其同其他药物联合应用的可能性,旨在改善曲妥珠单抗药效,提高其抗肿瘤作用,为拓宽HER-2靶向治疗窗提供理论基础以及实验依据。研究方法:1.重组南瓜毒素CUS245C的表达鉴定原核表达系统表达,Ni-柱亲和纯化CUS245C;质粒酶切,SDS-PAGE,Western Blot鉴定表达产物;2.抗CUS245C单克隆抗体的制备杂交瘤技术表达小鼠源性抗CUS245C单克隆抗体,Protein G亲和层析柱亲和纯化;3.T-CUS245C的化学交联SPDP巯基化曲妥珠单抗,DTT解聚CUS245C;交联反应后以透析法去除游离CUS245C,镍柱纯化得T-CUS245C;4.Ts的表达鉴定PCR酶切连接构建pET-32a（+）-Ts-His原核表达载体;流式细胞技术鉴定表达产物抗原亲和力及特异性,确保后续同南瓜毒素融合表达的准确性;5.Ts/CUS的构建、表达及纯化（GGGGS）3连接子连接CUS和Ts基因序列,PCR扩增,酶切连接入pET-32a（+）原核表达载体,IPTG诱导表达,Ni+柱亲和纯化;6.T-CUS245C和Ts/CUS的鉴定SDS-PAGE和Western Blot分别鉴定T-CUS245C和Ts/CUS分子量及其性质;流式细胞技术鉴定人源性肿瘤细胞BT-474、SK-BR-3、SK-OV-3、MCF-7以及MDA-MB-231胞膜上HER-2的表达情况,并检测T-CUS245C和Ts/CUS对HER-2阳性细胞的结合活性;流式细胞术检测不同浓度药物诱导细胞的凋亡情况;7.T-CUS245C和Ts/CUS的体外抗肿瘤活性SRB方法分别检测T-CUS245C和Ts/CUS对HER-2表达程度不同的各细胞的增值抑制率;8.T-CUS245C内化作用的检测FITC标记抗CUS245C抗体,普萘洛尔和洛利普兰处理细胞,利用荧光共聚焦显微镜对T-CUS245C内化情况及细胞器定位情况进行检测并观察上诉两种药物对细胞内化T-CUS245C作用的改变,探究改变内化作用对T-CUS245C抗肿瘤药药效影响;9.Ts/CUS联合Keytruda对肿瘤微环境的影响人外周血淋巴细胞同肿瘤细胞共培养,观察Ts/CUS联合Keytruda应用对肿瘤细胞PD-L1表达的影响和对淋巴细胞分泌IFN-γ的作用;研究结果:1.流式细胞术检测上述肿瘤细胞系HER-2表达情况:BT-474 HER-2表达最强,SK-OV-3次之,SK-BR-3较弱,而MCF-7和MDA-MB-231因抗原阴性被作为对照组细胞;2.大肠杆菌成功表达CUS245C,镍离子亲和层析法纯化后,纯度高;3.免疫毒素T-CUS245C偶联成功。SDS-PAGE结果显示T-CUS245C存在不同的偶联分子比纯度高。Western blot明确交联产物条带中含有CUS。流式细胞技术显示,T-CUS245C对HER-2阳性细胞亲和力未受交联影响并具有诱导细胞凋亡的作用;4.Sulforhodamine B检测T-CUS245体外细胞增殖抑制作用。结果显示,和曲妥珠单抗、CUS245C或曲妥珠单抗+CUS245C相比较,交联免疫毒素T-CUS245对HER-2阳性细胞株（SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474）的增殖抑制作用明显,呈剂量依赖性和时间依赖性,72h的IC50分别为0.07 nM、0.67 nM、0.37 nM、;120 h的IC50分别为0.005 nM、0.03 nM、0.04 nM。对HER-2阴性细胞株MCF-7和MDA-MB-231则无明显的增殖抑制作用;5.荧光共聚焦显微镜显示随时间推移,T-CUS245C逐渐进入HER-2阳性细胞胞质,并定位于溶酶体。但无法进入HER-2阴性细胞中。CUS245C内化效应不明显;6.T-CUS245C内化过程可被普萘洛尔促进,这一促进作用可被洛利普兰中和。SRB显示促进T-CUS245C内化可增强其体外抗肿瘤作用,但给予磷酸二酯酶PDE4抑制剂洛利普兰后,T-CUS245C细胞毒作用随之减弱;7.Ndel/Xhol酶切及质粒DNA测序结果表明成功构建HER-2scFv重组载体;经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为25 kDa,流式细胞技术证明表达产物对能够特异性结合抗原,解离常数Kd值为119.6 nM,并且结合抗原的位点同曲妥珠单抗相同;8.质粒DNA测序及Ndel/Xhol酶切鉴定表明成功构建Ts/CUS重组载体,经SDS-PAGE显示表达产物分子量约为55 kDa,蛋白表达纯度高,Western Blot进一步验证表达产物性质。流式细胞技术检测Ts/CUS同HER-2scFv比,对HER-2阳性细胞亲和力未受改造影响;流式细胞技术体外初测药效证明Ts/CUS具有诱导细胞凋亡的作用;9.Sulforhodamine B检测Ts/CUS体外细胞增殖抑制作用。结果显示,同Ts相比,Ts/CUS对SK-OV-3、SK-BR-3和BT-474的增殖抑制作用明显,且呈剂量依赖性和时间依赖性。其作用72h的IC50分别为0.43nM、1.8 nM、8.79nM,120h的IC50分别为0.15nM、0.37nM、1.82nM,远低于CUS245C对这几株细胞的IC50;10.在体外淋巴细胞/肿瘤细胞共培养体系中,应用Ts/CUS联合Keytruda后,对SK-BR-3细胞的杀伤作用较无药物处理组、单独应用Ts/CUS组和单独Keytruda组升高,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞技术显示CD3CD4T淋巴细胞百分比升高,ELISA提示培养液中IFN-γ和IL-2均有升高,Ts/CUS联合Keytruda组升高最为明显,IFN-γ升高较IL-2显着。结论1.重组南瓜蛋白CUS245C具有细胞毒作用,并能够同曲妥珠单抗通过化学交联的方法构建成免疫毒素T-CUS245C,简化交联步骤,提高产物产量和纯度;2.通过化学交联,成功构建高产,高亲和的免疫毒素T-CUS245C;3.T-CUS245C具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;4.T-CUS245C可内化进入细胞质,定位于溶酶体中,这一过程可被普萘洛尔增强,内化速率的增加或减弱与T-CUS245C细胞毒作用相关;5.基因工程技术成功构建单链抗体免疫毒素Ts/CUS;6.Ts/CUS均具有体外抗肿瘤活性强,特异性高的特性;7.Ts/CUS联合Keytruda可体外激活淋巴细胞,促进其表达IFN-γ,提高抗肿瘤效应。
李森浩[4]（2019）在《抗VEGF单克隆抗体偶联顺铂胶束的制备、表征及靶向治疗兔舌癌的研究》文中研究指明第一部分抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束的制备及表征目的:本部分拟制备出抗VEGF单克隆抗体偶联两亲性聚合物纳米载药胶束,并装载难溶性抗癌药物顺铂（CDDP）。通过两亲性聚合物载体在水中自组装形式包裹药物,从而增加溶解度、延长半衰期,改善持续缓释性和主动靶向能力。方法:本实验采用新型载体材料氨基聚乙二醇-聚乳酸（NH2-PEG-PLA）与模型药物顺铂按一定比例,以透析法制备载药胶束。抗VEGF单克隆抗体的偶联:以碳化二亚胺为交联剂,将抗VEGF单克隆抗体与载药胶束进行偶联,制备双重靶向胶束Ab-PEG-PLA-CDDP。使用动态光散射仪表征Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束,计算包封率和载药量。测定Ab-PEG-PLA-CDDP体外释放药物规律。结果:应用不同溶剂类型,药物与载体的投料比以及有机相与水相的体积比,成功制备出Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束,并测定其粒度大小和包封效率。按最优制备方式为:丙酮作为溶媒,药物与载体的质量比为1:15,有机相和水相的体积比为2:10。按照最佳工艺得到的Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束平均粒径在（102±2.08）nm,包封率为（64.36±1.18）%,载药率为（5.84±0.11）%。结论:本实验中,载体材料为NH2-PEG-PLA,模型药物为CDDP,制备出Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束,应用单因素试验和正交设计试验优化制备工艺,选择最优处方。激光粒度分析仪测定聚合物胶束粒径分布范围符合要求。第二部分抗VEGF-PEG-PLA-CDDP纳米胶束中抗癌药物CDDP含量的测定目的:建立一种测定抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP胶束包封率和载药率的方法。方法:紫外分光光度法测定抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束中CDDP含量。通过配制CDDP标准溶液进行波谱扫描以确定合适吸收波长。取不同浓度溶液,采用UV法测定已知波长下的吸光度,以浓度（ug/ml）为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,计算标准曲线方程,测定精密度和回收率。结果:通过紫外扫描测得药物在348nm波长处有吸收,载体在该波长处无吸收并不干扰测量结果。药物在2.0-7.0ug/ml范围内呈线性关系,绘制出标准曲线并计算得到回归方程为:y=0.1069x+0.0046（R2=0.9985）,日内和日间精密度小于5%,平均回收率99.4%。结论:紫外光分光度计法（UV法）检测抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束的包封率和载药量符合方法学要求,简单可行。第三部分抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP对RSCC-1细胞体外抑制实验目的:研究Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束对兔舌癌细胞（RSCC-1）的体外抑制作用。方法:将RSCC-1细胞经复苏、传代培养至对数生长期。经与PBS、NH2-PEG-PLA空白载体、不同浓度的CDDP和Ab-PEG-PLA-CDDP共同培养不同时间后,MTT检测其体外细胞毒性,统计细胞生长抑制率并绘制抑制率曲线。结果:MTT结果示NH2-PEG-PLA载体对RSCC-1细胞无细胞毒作用（p≤0.05）;市售CDDP剂型组呈明显细胞毒作用,生长抑制率曲线显示,随药物浓度和作用时间的增加而逐渐升高;Ab-PEG-PLA-CDDP纳米胶束剂型组48h时生长抑制率低于市售CDDP剂型组（p≤0.05）,至96h时与市售CDDP组己无统计学差异（p≤0.05）。结论:1)Ab-PEG-PLA-CDDP聚合物胶束对RSCC-1细胞具有显着抑制作用,且呈现时间和剂量依赖性。2)Ab-PEG-PLA-CDDP聚合物胶束较市售CDDP剂型具有缓释特性。第四部分抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束体内分析方法的建立目的:建立一种检测抗癌药物顺铂在体内组织分布的分析方法方法:采用高效液相色谱（HPLC）技术,检测分析新西兰白兔肝组织及血浆中CDDP含量。研究分析组织内及血浆的专属性、重复性、稳定性、计算精密度及回收率,绘制相应标准曲线图。结果:成功检测正常兔组织及血浆中抗癌药物CDDP的含量。组织和血浆样品精密度RSD均小于5%,重复性、稳定性RSD均小于10%。组织中CDDP含量在0.1-10.0ug/ml范围内呈线性关系,结合数据绘制出标准曲线方程为:y=49013x+19141（R2=0.9995）。血浆中CDDP含量介于0.1-10.0ug/ml范围内,计算标准曲线方程:y=36268x+9666.7（R2=0.9905）,回收率均符合样品检测学标准。结论:采用高效液相色谱法检测正常兔组织及血浆中CDDP含量,其方法专属性好,稳定性、重复性、精密度和回收率均符合样本验证指导原则。为后续实验验证Ab-PEG-PLA-CDDP聚合物胶束靶向治疗兔舌癌移植瘤动物模型时组织及血浆内CDDP含量的测定提供检测基础。
邢韶芳[5]（2019）在《壮药国虾薄（绞股蓝）皂苷及其抗非小细胞肺癌（NSCLC）作用的研究》文中指出目的以国虾薄（绞股蓝）为研究对象,对原药材中的皂苷成分进行系统分离并确定其化学结构,以期发现新的皂苷成分,进一步丰富绞股蓝皂苷的化学结构;探讨绞股蓝皂苷对A549细胞抑制作用的构效关系,为临床科学合理用药提供参考;从细胞毒性、细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移四方面对代表性皂苷抗NSCLC细胞活性进行探究,阐释国虾薄抗NSCLC作用的物质基础。方法1.以“文献导向、质谱信息比对”的方式发现国虾薄原药材中仍可能存在新皂苷成分,综合利用正、反相分离填料,常、中、高压色谱柱体系等分离手段对国虾薄原药材中的皂苷成分进行较全面系统的分离,通过“四大谱”（UV、IR、MS、NMR）及与已知文献比对的方法确定绞股蓝皂苷的化学结构,通过酸水解,薄层色谱法（TLC）检识糖链中单糖的种类。2.以A549细胞为NSCLC细胞模型,CCK 8法检测绞股蓝皂苷成分对A549细胞的抑制作用,通过比较绞股蓝皂苷单体的化学结构及其对A549细胞的IC50值,探讨构效关系。3.CCK 8法探究damulin B对MRC-5、A549、H1299细胞的抑制作用,采用相关试剂盒及相应抗体从细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移方面探究damulin B对NSCLC的作用机制。4.CCK 8法探究绞股蓝皂苷L（Gyp L）和绞股蓝皂苷LI（Gyp LI）对A549细胞的抑制作用,采用相关试剂盒及相应抗体从细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移比较Gyp L和Gyp LI对A549作用的异同。5.CCK 8法探究新皂苷成分对人的5种肿瘤细胞的抑制作用,构建H202诱导的SH-SY5Y氧化应激模型,探究新皂苷成分的神经保护作用。结果1.从国虾薄原药材中共分离获得19种皂苷单体成分:绞股蓝皂苷LXXⅦ（GPF-1）、2α,3β,12β,20（S）-四羟基达玛-24-烯-3-O-β-D-葡萄糖苷-20-O-β-D-葡萄糖苷（GPF-2）、绞股蓝皂苷Ⅸ（GPF-3）、绞股蓝皂苷Ⅷ（人参皂苷 Rd,GPF-4）、绞股蓝皂苷LXⅧ（GPF-5）、2α,3β,12β,20-四羟基-25-过氧氢-达玛-23-烯-3-O-[β-D-葡萄糖基（1→2）][β-D-葡萄糖基]-20-O-[β-D-木糖基（1→6）]-β-D-葡萄糖苷（GPF-6）、2α,3β,12β,20,24（S）-五羟基达玛-25-烯-3-0-[β-D-葡萄糖基（1→2）][β-D-葡萄糖基]-20-O-β-D-葡萄糖苷（GPF-7）、绞股蓝皂苷LⅦ（GPF-8）、3-O-[β-D-葡萄糖基（1→2）[β-D-葡萄糖基]-2α,3β,12β,20,24（S）-四羟基-达玛-25-烯-20-O-[β-D-木糖基（1→6）]-β-D-葡萄糖苷（GPF-9）、2α,3β,12β,20,25-五羟基达玛-23-烯-3-O-[β-D-葡萄糖基（1→2）][β-D-葡萄糖基]-20-O-β-D-葡萄糖苷（GPF-10）、3-O-[β-D-葡萄糖基（1→2）[β-D-葡萄糖基]-2α,3β,12β,20,24（R）-四羟基-达玛-25-烯-20-0-[β-D-木糖基（1→6）]-β-D-葡萄糖苷（GPF-11）、2α,3β,12β,20-四羟基达玛-25-烯-24-酮-3-O-[β-D-葡萄糖基（1→2）[β-D-葡萄糖基]-20-O-[β-D-木糖基（1→6）]-β-D-葡萄糖苷（GPF-12）、绞股蓝皂苷GD5（GPF-13）、绞股蓝皂苷LⅥ（14）、绞股蓝皂苷XLⅥ（15）、绞股蓝皂苷L（16）、绞股蓝皂甘LI（17）、绞股蓝皂苷damulin B（18）、绞股蓝皂苷damulin A（19）。其中,未见文献报道的新化合物6个,分别命名为化合物GPF-6（绞股蓝皂苷J4）、GPF-7（绞股蓝皂苷J1）、GPF-9（绞股蓝皂苷J5）、GPF-10（绞股蓝皂苷J2）、GPF-11（绞股蓝皂苷J6）、GPF-12（绞股蓝皂苷J3）。2.绞股蓝皂苷LXXⅦ（GPF-1）、绞股蓝皂苷L（GPF-16）、绞股蓝皂苷LI（GPF-17）、绞股蓝皂苷damulin B（GPF-18）、绞股蓝皂苷damulin A（GPF-19）对A549细胞的抑制作用较强,且具有浓度依赖性,其IC50值分别为:53.6±2.6μM、30.6±1.4μM、22.7±1.3μM、21.9±1.3 μM、22.5±0.9μM,而其它绞股蓝皂苷的IC50均大于80μM,表现出很弱的A549细胞抑制活性。3.Damulin B对NSCLC细胞的抑制作用细胞毒性:damulin B对两种非小细胞肺癌细胞的抑制率比对人正常胚肺成纤维细胞MRC-5的抑制率高7.5-30.7%。Damulin B对NSCLC细胞抑制作用较阳性对照紫杉醇具有更明显的浓度依赖性。经damulin B处理后,A549细胞和H1299细胞数目明显减少,细胞变圆皱缩,空泡化现象明显,漂浮细胞明显增多,而正常MRC-5细胞处理组与实验组无明显的形态变化。细胞凋亡:经damulin B处理后,TUNEL检测发现NSCLC细胞实验组较空白对照组发出明显的绿色荧光,Annexin V/PI双染法检测发现实验组较空白对照组发出明显的绿色或橙红色荧光。经damulin B处理后A549细胞凋亡率由（5.2±2.3）%上升至（42.4±3.3）%,H1299细胞凋亡率由（7.8±0.5）%上升至（22.5±4.1）%,且呈浓度依赖性。JC-1荧光探针检测发现,经damulin B处理后,NSCLC细胞处理组较空白对照组产生明显的绿色荧光,A549细胞红绿荧光之比由3.4±0.7降为0.4±0.1,H1299细胞红绿荧光之比由2.0±0.5降为0.3±0.2。经DCFH-DA检测发现,NSCLC细胞处理组较空白对照组产生明显的绿色荧光,A549细胞的平均荧光强度由14.3 ± 0.1增加到143.3 ± 3.6,H1299细胞的平均荧光强度由9.1±0.2增加到76.4±7.6,具有浓度依赖性。经damulin B处理后,两种细胞内procaspase-8、procaspase-9、抑凋亡蛋白Bcl-2的表达均下调,cleaved caspase-8、促凋亡蛋白Bax、胞浆中促凋亡蛋白Bid、tBid和细胞色素C表达均上调。细胞周期:与空白对照组相比,damulin B能明显抑制克隆的形成,A549细胞克隆率由（63.5±2.1）%降为（4.0±1.4）%,H1299细胞克隆率由（66.0±2.8）%降为（4.8±1.4）%,且呈浓度依赖关系,当damulin B浓度为24μM时,两种细胞的克隆形成率均<5%。经damulin B处理后,A549细胞的G0/G1期细胞比例由（54.3±2.1）%上升至（72.9±0.7）%,S期细胞由（27.9±2.5）%降为（19.02±0.7）%,G2/M期细胞由（17.9±0.4）%降为（8.1±0.1）%;H1299细胞的G0/G1 期细胞由（66.8±2.8）%上升至（82.4±1.2）%,S期细胞由（21.5±0.3）%降为（7.5±1.1）%,G2/M期细胞由（16.7±4.0）%降为（9.8±0.3）%。DamulinB能明显上调p53的表达,明显下调CDK4、CDK6和Cyclin D1的表达;而对CDK2和Cyclin E1的表达无明显影响,甚至出现上调趋势。细胞迁移:Damulin B浓度为20μM和24μM时,A549细胞的迁移抑制率分别为（42.5±1.8）%和（62.1±3.7）%,H1299细胞的迁移抑制率分别为（40.7±2.5）%和（59.4±1.6）%,具有浓度依赖性。Damulin B能明显上调A549细胞和H1299细胞IL24蛋白的表达,明显下调MMP2和MMP9蛋白的表达。4.Gyp L和Gyp LI对NSCLC细胞抑制作用的异同点细胞毒性:CCK-8法探究发现,Gyp LI（C-20为R构型）的抑制作用强于GypL（C-20为S构型）。Gyp L和Gyp LI处理组,贴壁细胞数量明显减少,漂浮细胞明显增多,出现空泡化现象,Gyp L处理组细胞较空白对照组,细胞皱缩细瘦,Gyp LI处理组细胞较空白对照组,细胞皱缩变圆。细胞凋亡:TUNEL检测发现,Gyp L和Gyp LI处理组细胞较空白对照组,发出明显的绿色荧光;Annexin V/PI双染后,A549细胞经Gyp L和Gyp LI处理后,低浓度组绿色荧光较明显,中、高浓度发出较明显的橙色或红色荧光。经低、中、高浓度处理后,Gyp L组凋亡率由（7.26±0.2）%上升至（72.31±1.5）%,Gyp LI组凋亡率由（7.26±0.18）%上升至（87.4±1.2）%,两种皂苷均能显着增加胞浆中细胞色素C的释放,降低procaspase8的浓度。细胞周期:Gyp L和Gyp LI均能明显抑制克隆的形成,Gyp L低、中、高浓度组的克隆形成率分别为（59.3± 10.4）%,（39.8±8.2）%,（4.4±0.5）%;Gyp LI低、中、高浓度组的克隆形成率分别为（57.5±10.6）%,（43.7±1.9）%,（2.5±3.5）%,克隆形成率随浓度的增加而降低,高浓度组细胞克隆率均低于5%。Gyp L能增加G0/G1期细胞量,低、中、高浓度组G0/G1 期分别为（70.9±0.4）%、（77.7±0.6）%、（83.8± 0.6）%,而空白组G0/G1期细胞为（66.0 ± 0.8）%;而S期细胞经Gyp L处理后,由（25.2±1.6）%降为（10.8±0.5）%,G2/M期细胞经Gyp L处理后,由（8.7±2.2）%降为（5.4±0.1）%,表明Gyp L能明显阻滞A549细胞于G0/G1期,并呈现浓度依赖性。Gyp LI能增加G2/M期细胞量,低、中、高浓度组G2/M期分别为（24.7±1.0）%、（27.3±0.4）%、（29.8±6.2）%,而空白组G2/M期细胞为（9.6±3.5）%;而G0/G1 期细胞经Gyp LI处理后,由（65.4±1.6）%降为（54.3±1.6）%,S期细胞由（24.9±2.1）%降为（15.9±4.6）%,表明Gyp LI能明显阻滞A549细胞于G2/M期,并呈现浓度依赖性。Western Blotting检测发现:Gyp L能明显下调CDK2和CDK4的表达,对CDK1蛋白表达影响不明显;而Gyp LI能明显下调CDK1蛋白的表达,而对CDK2和CDK4蛋白的表达不具有抑制作用。细胞迁移:Transwell小室实验中,Gyp L组低、中、高浓度的迁移抑制率分别为（40.3±7.6）%、（51.5±7.1）%、（65.2±0.1）%,Gyp LI组低、中、高浓度的迁移抑制率分别为（29.5±3.4）%、（42.6±1.3）%、（64.9±0.4）%,具有浓度依赖性。Gyp L和Gyp LI均能下调MMP2和MMP9的表达,并呈现出浓度依赖性。5.新皂苷成分在浓度为100μM时对人的5种肿瘤细胞（肺癌A549和H1299细胞、肝癌HepG2细胞、胃癌SGC7901细胞、前列腺癌PC-3和骨髓神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞）的抑制率均低于15%。与H202诱导的SH-SY5Y细胞氧化模型组相比,新皂苷处理组存活率高2-15%,且具有一定的浓度依赖性。结论本课题从国虾薄原药材中共分离获得19种皂苷单体成分,其中,6种为新皂苷成分,一定程度地丰富了绞股蓝皂苷的化学结构。对绞股蓝皂苷的A549细胞抑制作用归纳出4条SAR规律,为临床科学、合理、高效用药提供依据。对代表性皂苷进行抗NSCLC活性探究发现,damulin B对NSCLC细胞增殖具有一定的选择性抑制作用,能通过外源性和内源性途径诱导细胞凋亡,阻滞细胞于G1早期和抑制细胞迁移多种途径发挥抑制NSCLC细胞的作用。C-20位构象异构体Gyp L和Gyp LI均能通过外源性和内源性途径诱导A549细胞凋亡和通过调控MMP2/9的表达发挥抑制A549细胞迁移的作用,但R构型的Gyp LI比S构型的Gyp L具有更强的抑制作用,且能将A549细胞周期阻滞于不同的周期。从细胞水平阐释了国虾薄抗NSCLC作用的物质基础。探究发现新皂苷类成分对肿瘤细胞的抑制作用很弱,但具有一定的神经保护作用,这为临床提供了神经保护候选药物。
丁琳[6]（2019）在《曲妥珠单抗修饰的多功能囊泡用于卵巢癌的靶向化疗》文中研究说明近年来,抗体药物偶联物（ADC）由于其选择性高、特异性强以及精准的药物靶向性在癌症治疗领域受到了广泛的关注。目前已有4种产品进入市场,其中KadcylaTM（曲妥珠单抗-美登素偶联物,T-DM1）产品在HER2阳性晚期或转移性乳腺癌的治疗中展示了优异的疗效。然而,包含T-DM1在内的ADC仅适用于强效的细胞毒素,且存在着药物负载量低（每个单抗携带3.5-4个药物分子）、抗体用量大和价格昂贵等问题。为此,在本论文中,我们设计制备了曲妥珠单抗导向的多功能囊泡用于抗癌药表阿霉素盐酸盐（EPI·HCl）和DM1的高效装载及HER2特异性靶向递送,实现卵巢癌的高效治疗。论文第一章简单介绍了曲妥珠单抗的临床用法,并对曲妥珠单抗导向的纳米药物和双硫交联的聚合物纳米药物进行了概述。论文第二章设计制备了集双硫可逆交联、小尺寸、HER2特异性靶向及高效装载EPI·HCl于一体的多功能囊泡（Tra-Ps）,用于SKOV-3卵巢癌的靶向治疗。Tra-Ps是由马来酰亚胺-聚乙二醇-b-聚（三亚甲基碳酸酯-co-二硫戊环三亚甲基碳酸酯）（Mal-PEG-P（TMC-DTC））和PEG-P（TMC-DTC）共组装形成双硫交联囊泡后,通过迈克尔加成反应在其表面修饰曲妥珠单抗而得到。包载EPI·HCl的靶向聚合物囊泡（Tra-Ps-EPI）的载药量约为12.7wt.%,粒径较小（50-60 nm）,且表面单抗密度方便可调。表面含有1.3个曲妥珠单抗的Tra-Ps与HER2膜外蛋白的亲和力较强,相比游离的曲妥珠单抗约提高了 6倍。体外实验表明,Tra-Ps-EPI具有优异的长期储存稳定性,然而在还原条件下可快速释放药物,且可高效递送EPI·HCl至HER2阳性的SKOV-3细胞,细胞毒性显着高于非靶向的Ps-EPI。此外,Tra-Ps-EPI可在体内长循环并穿透至肿瘤深处,从而在荷皮下SKOV-3卵巢癌裸鼠模型中展示了优异的肿瘤抑制效果,显着优于Ps-EPI和游离的EPI·HCl组。论文第三章我们研制了曲妥珠单抗导向的双硫交联囊泡美登素偶联物（Tra-Ps-DM1）用于卵巢癌的HER2特异性靶向治疗。Tra-Ps-DM1由PEG-P（TMC-DTC）和N3-PEG-P（TMC-DTC）在水溶液中自组装,同时通过巯基-硫硫交换反应偶联DM1和自发双硫交联,再通过张力触动的点击化学反应在表面修饰曲妥珠单抗得到。Tra-Ps-DM1的粒径在60 nm左右,表面含有1.4-5.7个单抗,其中每个单抗可至少携带210个DM1分子。细胞实验结果表明,Tra-Ps可高效靶向HER2阳性的SKOV-3细胞,其内吞量相比非靶向对照组提高了 23倍。Tra-Ps-DM1可高效杀伤SKOV-3细胞,其细胞毒性相比Ps-DM1提高了 9倍。
张海强[7]（2019）在《抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证》文中进行了进一步梳理胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,预后相对较差,严重威胁人类健康。早期胃癌临床症状不典型,故多数患者确诊时已为进展期,这些患者预后较差,除手术治疗外,均需辅助内科化疗等后续治疗。胃癌的内科治疗主要包括化疗、免疫治疗和靶向治疗。但化疗有效率有限,而且毒副作用高,免疫治疗尚未寻找到胃癌特异性靶点而进展缓慢。靶向治疗已在乳腺癌、肺癌治疗中广泛采用,特别是曲妥珠单抗（trastuzumab）在乳腺癌治疗中已被广泛认可。鉴于靶向治疗的精准性,人们已开始探索靶向治疗在胃癌中的应用。本研究旨在以HER2蛋白为靶点,构建并合成融合基因工程蛋白,探讨其对HER2阳性胃癌细胞的杀伤效果。单克隆抗体是目前应用较广泛的靶向治疗药物,抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）是单抗发挥杀伤作用的重要机制,但单抗抗体分子量大,难以穿透肿瘤组织,这些弊端限制了单抗的应用,同时具有免疫杀伤作用的T细胞因表面缺乏与单抗结合的受体而不能被有效介导,从而削弱了机体对肿瘤的免疫反应。单链抗体（sc Fv）仅含有全抗的可变区片段,具有免疫源性小、分子量小、穿透力强的特点,因此是理想的肿瘤治疗靶向载体。CCL19是一类可趋化免疫细胞定向移动的小分子蛋白,可诱导T细胞、NK细胞、DC细胞等发挥抗肿瘤作用。IL7在T细胞的发育、分化及增殖过程中发挥着重要作用,可通过促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子分泌抑制多种实体瘤的生长。所以本研究设计了以人源HER2 sc Fv为靶向载体,连接免疫细胞趋化因子CCL19及介导T细胞活化的IL7,构建了抗HER2sc Fv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,转染并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株,并从其培养上清中成功获得目标蛋白。获得目标蛋白后,第二部分实验验证了抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物学活性。第三部分实验为融合蛋白抗肿瘤疗效研究,选用高表达HER2蛋白的NCI-N87胃癌细胞和HER2阴性的SGC7901细胞分别给予不同剂量融合蛋白,观察其杀伤效果。同时建立了人源化NOD/SCID小鼠模型,并建立胃癌移植瘤小鼠模型,给予抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白进行治疗,观察肿瘤体积变化,检测体内IFN-γ和IL-2细胞因子分泌水平,评价其体内抗肿瘤效果。第一部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白表达载体的构建及真核表达目的:构建抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的表达质粒并筛选出稳定表达融合基因工程蛋白的HEK293T稳定细胞株。方法:从Genbank数据库中检索到人CCL19 c DNA序列（gene ID6363）,目的基因大小294bp,人IL7 c DNA序列（gene ID 9606）,目的基因大小531bp,抗人HER2 sc Fv基因由本实验室制备的鼠抗人HER2单克隆抗体杂交瘤细胞株中的VH、VL基因,经过密码子优化及人源化合成获得。按照抗HER2 sc Fv基因-连接肽基因-CCL19基因-连接肽基因-IL7基因形式排列,并于整段基因合成序列的两端分别设置的XhoⅠ/HindⅢ酶切位点,全基因序列合成,合成后的基因序列亚克隆在pc DNA3.1载体中,经过XhoⅠ/HindⅢ内切酶的酶切反应,将HCI-pc DNA3.1质粒中的抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因连接到慢病毒表达载体质粒上,酶切检验目的基因片段大小,并回收测序无误后使用慢病毒转染的方式将目的基因转染至HEK293T细胞中,并用PURO筛选转染后的细胞,以获得稳定表达融合蛋白的HEK293T细胞体系。将筛选得到的高表达融合蛋白的HEK293T细胞大量扩增培养,提取培养上清内表达的融合蛋白,利用His标签,通过镍柱亲和层析纯化目标蛋白,并通过Western-blot检测该融合蛋白在HEK293T细胞培养上清中的表达情况。结果:1.通过基因工程技术,成功合成了抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列,并亚克隆在pc DNA3.1载体中,通过基因测序证明基因序列正确,无突变。2.成功构建含有抗HER2 scFv-CCL19-IL7全基因序列的慢病毒载体,并通过慢病毒转染的方式成功的将目的基因序列成功转染至HEK293T细胞中,并筛选出稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HEK293T细胞株。3.Western blot检测到抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在HEK293T细胞培养上清中表达。第二部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白靶向性验证及生物活性分析目的:验证抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的HER2靶向性及生物活性方法:以流式细胞术检测人NCI-N87胃癌细胞、SGC7901胃癌细胞中HER2蛋白表达情况;流式细胞术测定分析抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白抗HER2抗原靶向性及生物学活性;ELISA法测定纯化获得的融合蛋白中的IL7含量及生物学活性;测定抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的结合常数,证实抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原亲和力,并具备生物活性,为进一步验证其体内外抗肿瘤研究奠定基础。结果:1.流式细胞术检测发现人NCI-N87胃癌细胞表面HER2蛋白呈高表达、SGC7901胃癌细胞表面HER2蛋白呈低表达或无表达。2.流式细胞术检测后分析荧光强度显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可与赫赛汀、HER2-FITC竞争性结合人胃癌NCI-N87细胞表面的HER2抗原。3.蛋白结合常数测定显示抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白具有与HER2抗原结合的抗体活性,具有一定亲和力。4.ELISA法检测到HEK293T细胞培养基中含有IL7,并且结果显示随着培养时间的延长,培养基中IL-7含量呈上升趋势。第三部分抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体内外抗肿瘤的实验研究目的:探讨抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体外对HER2过表达胃癌细胞的杀伤效力及对HER2阳性胃癌移植瘤小鼠模型的抗肿瘤作用。方法:CCK-8法检测体外HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白介导PBMCs对HER2过表达及低表达胃癌细胞的杀伤作用;ELISA法检测细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量。鼠尾静脉注射人外周血单个核细胞构建人源化NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3+T淋巴细胞和CD19+B淋巴细胞的表达情况。人源化NOD/SCID小鼠接种HER2过表达的NCI-N87人胃癌细胞建立胃癌移植瘤动物模型。成瘤后将动物随机分为三组,分别给予生理盐水、赫赛汀、抗HER2sc Fv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白初始负荷治疗量1次,维持治疗量3次,每周给药1次,共治疗4次,定期测量肿瘤体积变化,计算三组小鼠移植瘤平均体积和SD值。ELISA检测各组小鼠血清中IFN-γ和IL-2的分泌量。肿瘤标本进行病理切片,HE染色观察其形态,免疫荧光组化法观察肿瘤组织内T淋巴细胞、DC细胞的浸润情况。结果:1.不同效靶比下抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体外介导PBMCs对HER2阳性NCI-N87细胞及HER2阴性SGC7901细胞的杀伤效率随着效靶比的增加而明显提高。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白在体内对HER2阳性胃癌细胞杀伤效果显着。4.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可趋化T细胞、DC细胞等淋巴细胞向肿瘤内迁移。结论:1.携带抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的全基因序列,通过慢病毒转染的方式成功的转染至HEK293T细胞中,并可稳定表达抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白。2.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性靶向肿瘤细胞表面的HER2蛋白,并具有抗体抗原结合活性。3.抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可介导活化免疫细胞,增加IFN-γ和IL-2分泌量。4.通过鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并通过肿瘤细胞株皮下注射成功建立了胃癌移植瘤模型。抗HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白可特异性识别HER2抗原,并通过趋化DC细胞,活化T细胞等途径介导免疫系统发挥抗肿瘤作用。
杜国秀[8]（2016）在《基于SP90和穿膜肽协同介导的乳腺癌靶向蛋白给药体系的研究》文中进行了进一步梳理缺乏肿瘤细胞选择性以及胞内传递效率低是传统抗肿瘤药物的两个主要弊端。肿瘤靶向肽与穿膜肽分别能增强载药系统的组织细胞特异性和药物向细胞内转运的效率,两者的联合使用更利于开发高效、低毒、特异性强的抗肿瘤药物。基因工程药物已在多种疾病的预防与治疗中崭露头角,开发能高效、靶向性杀伤肿瘤的基因工程药物对战胜癌症意义重大,且应用前景广阔。本论文在基因水平上设计合成基于靶向肽SP90和人源性穿膜肽C-Petide的融合分子,考察各组成部分的生物学功能。首先采用DNA重组技术成功构建了重组蛋白EGFP、SP90-EGFP、SP90-EGFP-C、SP90-VPR与SP90-VPR-C的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导表达以及Ni柱亲和层析纯化,获得细胞实验用融合蛋白。接着,以绿色荧光蛋白为报告分子,利用荧光显微镜、流式细胞仪分析证实SP90能促进蛋白分子靶向乳腺癌细胞;C-Peptide与SP90间具有协同性,能在保持SP90靶向乳腺癌细胞能力的同时显着提高EGFP胞内摄取量与摄取效率。在1.5μM蛋白浓度下,SP90-C融合体较SP90与C-Peptide单独使用,EGFP胞内摄入量提高了 10-12倍。Pull Down实验发现一约35kD的SP90潜在靶标蛋白;Far-Western Blotting研究证实该SP90潜在靶标受体蛋白在正常乳腺细胞与不同乳腺癌细胞中表达有差异。最后,以正常乳腺细胞NAFB、低迁移性乳腺癌细胞MCF-7和高迁移性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞为测试对象,探究了 SP90-VPR与SP90-VPR-C可能具有的靶向性肿瘤杀伤功能。MTT实验表明SP90-VPR与SP90-VPR-C蛋白对正常细胞没有毒性,但能诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7细胞凋亡;流式细胞仪分析表明,SP90-VPR蛋白与SP90-VPR-C-Peptide蛋白作用于乳腺癌细胞后均能刺激细胞凋亡,SP90-VPR-C蛋白对乳腺癌细胞的促凋亡效率优于SP90-VPR蛋白,且诱导细胞凋亡的主要原因是使细胞周期停滞在G2/S期,其中SP90-VPR蛋白主要是G2/M期阻滞,SP90-VPR-C蛋白主要是S期阻滞。证实靶向肽SP90与穿膜肽C-Peptide间具有协同促进药物靶向胞内运输效应。
沙慧子[9]（2015）在《融合蛋白EGFR单域抗体-iRGD的构建及联合抗肿瘤药物对胃癌的作用评价》文中认为研究目的:靶向治疗是目前肿瘤治疗最具有发展前景的治疗手段之一。然而,在靶向治疗领域仍然存在许多尚未解决的问题,其中肿瘤靶向性与穿透性是进一步提高肿瘤治疗效果的关键。胃癌组织高表达EGFR分子,本论文选取靶向EGFR的单域抗体以及肿瘤穿透肽iRGD,构建融合蛋白,从以下两个方面进行了研究:（1）采用简捷、易行的方法,构建融合蛋白anti-EGFR-iRGD,在2D细胞、3D肿瘤多细胞球状体（MCS）及荷瘤裸鼠水平评价其靶向性、高穿透性及其体内外抗肿瘤作用;（2）对融合蛋白anti-EGFR-iRGD的应用进行了拓展,在MCS水平研究了融合蛋白anti-EGFR-iRGD对DOX、纳米粒子渗透性影响,及对抗肿瘤药物（5-FU、CPT-11、DOX、PTX、贝伐单抗、力扑素）抗肿瘤效果的影响。研究方法:利用DNA重组技术将针对EGFR单域抗体的序列和肿瘤穿透肽iRGD的序列构建融合蛋白,通过金属螯合层析技术得到纯化的anti-EGFR-iRGD并对其进行鉴定。利用Biacore（Biomolecular Interaction Analysis）生物分子间相互作用分析法检测融合蛋白anti-EGFR-iRGD与人EGFR的相互作用,验证了其对EGFR的靶向性;通过MALDI-TOF实验验证融合蛋白的分子量。在2D细胞、3D MCS及荷瘤裸鼠水平分别考察anti-EGFR-iRGD融合蛋白对胃癌细胞株的靶向性及穿透性;研究该融合蛋白在2D肿瘤细胞、3D MCS以及荷瘤裸鼠水平对胃癌的抗肿瘤作用。在此基础上,在3D MCS水平研究anti-EGFR-iRGD对DOX、纳米粒子渗透性影响,及对抗肿瘤药物（5-FU、CPT-11、DOX、PTX、贝伐单抗、力扑素）抗肿瘤效果的影响。研究融合蛋白与PTX联用,对胃癌细胞BGC-823增殖、凋亡、细胞周期的影响,并通过测量肿瘤大小,评价融合蛋白联用PTX对人胃癌细胞株BGC823裸鼠皮下瘤模型的治疗效果。结果:利用DNA重组技术及金属螯合层析技术得到纯化的anti-EGFR-iRGD并对其进行鉴定。Biacore测定融合蛋白anti-EGFR-iRGD的KD值为7.09nM,MALDI-TOF实验得出融合蛋白的分子量为18kDa,与氨基酸序列预测结果一致、三株胃癌细胞株中摄取anti-EGFR-iRGD最多的为EGFR表达水平最高的BGC-823细胞株。anti-EGFR-iRGD对BGC-823细胞及荷胃癌细胞BGC-823的裸鼠有较好的靶向性。在穿透性实验中,anti-EGFR-iRGD可以渗透入BGC-8233D MCS及荷BGC-823的裸鼠的肿瘤组织。该融合蛋白对多种肿瘤细胞都表现出较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用,在MCS及荷瘤裸鼠水平都有较好抗肿瘤作用,并且无明显的毒副作用。除了融合蛋白单独作用外,我们又在MCS水平验证了融合蛋白anti-EGFR-iRGD可以促进小分子药物DOX（分子量0.6kDa）、大分子纳米粒子（粒径100nm-200nm）在3D MCS中的渗透性;在MCS水平,融合蛋白anti-EGFR-iRGD可以提高亲水性化疗药物（5-FU、CPT-11）、疏水性化疗药物（DOX、PTX）、分子靶向药物（贝伐单抗）的抗肿瘤效果。融合蛋白anti-EGFR-iRGD与PTX联合使用时通过抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡以及将肿瘤细胞进行细胞周期阻滞等机制发挥抗肿瘤作用,并且无明显的毒副作用。anti-EGFR-iRGD对抗癌药物有广谱的提高疗效的作用,具有较好的临床应用潜能。结论:融合蛋白anti-EGFR-iRGD具有双特异靶向性及高穿透性,并且对表达EGFR的肿瘤有较好的抗肿瘤效果;anti-EGFR-iRGD可以促进抗癌药物（不超过200nm）渗透入肿瘤,并具有提高抗癌药物抗肿瘤作用的优势,提示融合蛋白anti-EGFR-iRGD对抗癌药物有广谱的提高疗效的作用,具有较好的临床应用潜力。
车越,何珊,陈玉文[10]（2014）在《我国单克隆抗体抗肿瘤药物研发流程研究》文中研究说明目的通过梳理我国单克隆抗体（简称单抗）抗肿瘤药物研发阶段的文献,整理出单抗抗肿瘤药物研发流程,为进一步识别研发流程中的风险因素、控制和规避单克隆抗肿瘤药物的研发风险奠定基础。方法采用文献综述方法进行整理分析。结果总结出我国单抗抗肿瘤药物研发的一般流程,即靶点发现、靶点选择、抗原制备、单克隆抗体制备技术选择以及抗体功能鉴定5个部分,分析了各环节中存在的风险因素。结论通过对单抗抗肿瘤药研发环节的整理以及对各环节风险因素的总结,初步识别了抗肿瘤抗体药物研发过程中的技术风险,为以后单抗抗肿瘤药物研发技术的风险管理提供参考。
二、抗肿瘤单克隆抗体导向药物的研究概况（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抗肿瘤单克隆抗体导向药物的研究概况（论文提纲范文）
（1）泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 抗体偶联药物的知识现状 |
| 引言 |
| 1.1.1 ADC发展简史 |
| 1.1.2 获得监管批准的上市ADC |
| 1.1.3 临床试验中的在研ADC及其靶标图谱 |
| 1.1.4 抗体骨架和靶标的选择 |
| 1.1.5 连接子类型和偶联技术 |
| 1.1.6 有效载荷 |
| 1.1.7 ADC在体内的工作原理 |
| 1.1.8 ADC对难治性癌症的治疗 |
| 1.1.9 ADC的毒性问题 |
| 1.1.10 ADC耐药机制 |
| 1.1.11 未来展望 |
| 1.2 嵌合抗原受体T细胞的知识现状 |
| 引言 |
| 1.2.1 CAR-T发展简史 |
| 1.2.2 CAR-T细胞的工作原理 |
| 1.2.3 CAR和T细胞受体的结构 |
| 1.2.4 获得监管批准的CAR-T |
| 1.2.5 CAR-T细胞疗法的毒性 |
| 1.2.6 未来挑战、机会和应用 |
| 1.3 本课题的研究目标 |
| 第二章 基于多组学构建泛实体瘤相关抗原图谱 |
| 引言 |
| 2.1 数据采集与分析方法 |
| 2.1.1 正常组织转录组和蛋白组的数据采集 |
| 2.1.2 蛋白质亚细胞定位数据的采集与编译 |
| 2.1.3 人体组织器官的重排与映射 |
| 2.1.4 正常组织的表达及其分级 |
| 2.1.5 基因在肿瘤及其癌旁组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.6 基因在肿瘤与其他正常组织之间的差异表达分析 |
| 2.1.7 肿瘤组织转录组、基因组和表型数据的编译 |
| 2.1.8 功能相关突变的注释 |
| 2.1.9 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.1.10 肿瘤相关抗原与癌细胞功能状态的相关性分析 |
| 2.1.11 基因集富集得分分析 |
| 2.1.12 临床试验的检索策略 |
| 2.1.13 统计分析 |
| 2.2 分析结果 |
| 2.2.1 组装综合数据集并通过算法识别肿瘤相关抗原 |
| 2.2.2 肿瘤相关抗原的表达谱与差异表达谱 |
| 2.2.3 肿瘤相关抗原的异质表达谱 |
| 2.2.4 预测肿瘤相关抗原的蛋白过表达率 |
| 2.2.5 癌症驱动基因变异全景 |
| 2.2.6 候选肿瘤相关抗原的组合评估 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 靶向CDH17 的新型ADC的制备及抗结直肠癌活性研究 |
| 引言 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 实验仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 TCGA与 GTEx中 CDH17的m RNA数据的获取与分析 |
| 3.3.2 免疫原的设计与制备 |
| 3.3.3 制备靶向CDH17 的单克隆抗体的免疫方案 |
| 3.3.4 抗体可变区基因测序 |
| 3.3.5 鼠-人嵌合抗体的构建与表达纯化 |
| 3.3.6 抗体结合亲和力的测定 |
| 3.3.7 CDH17 靶向抗体偶联vc MMAE |
| 3.3.8 细胞内吞实验 |
| 3.3.9 细胞膜蛋白的提取 |
| 3.3.10 免疫沉淀 |
| 3.3.11 免疫沉淀产物的银染 |
| 3.3.12 蛋白免疫印迹 |
| 3.3.13 免疫组化 |
| 3.3.14 免疫荧光 |
| 3.3.15 流式细胞实验 |
| 3.3.16 体外细胞毒性实验 |
| 3.3.17 体内抑瘤活性实验 |
| 3.3.18 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CDH17 在消化道肿瘤和正常组织中的表达 |
| 3.4.2 CDH17 靶向抗体的多重表征 |
| 3.4.3 CDH17 靶向ADC的制备与表征 |
| 3.4.4 CDH17 靶向ADC在体外的抗肿瘤活性 |
| 3.4.5 CDH17 靶向ADC在 KM12SM结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.6 CDH17 靶向ADC在 COLO205 结肠癌异种移植模型中的抗肿瘤活性 |
| 3.4.7 荷瘤小鼠对CDH17 靶向ADC的耐受性 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 靶向LYPD3的CAR-T细胞的抗肺腺癌活性研究 |
| 引言 |
| 4.1 实验动物 |
| 4.2 试剂耗材及设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 TCGA与 GTEx中 LYPD3 m RNA数据的获取与分析 |
| 4.3.2 抗体人源化 |
| 4.3.3 慢病毒包装 |
| 4.3.4 CD3+T细胞的复苏与激活 |
| 4.3.5 CD3+T细胞慢病毒感染 |
| 4.3.6 CAR-T细胞分化与耗竭的检测 |
| 4.3.7 CAR-T体外细胞杀伤 |
| 4.3.8 CAR-T体内活性实验 |
| 4.3.9 细胞因子的检测 |
| 4.3.10 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 LYPD3 蛋白在肿瘤和正常组织中的表达 |
| 4.4.2 LYPD3 靶向的CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性 |
| 4.4.3 LYPD3 靶向的CAR-T细胞在PC9 肺腺癌异种移植模型中抗肿瘤活性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究目的 |
| 1.3 研究思路 |
| 1.4 研究内容 |
| 1.5 研究方法 |
| 1.6 技术路线 |
| 1.7 创新点 |
| 1.8 有关概念的界定与说明 |
| 1.9 本章小结 |
| 第二章 相关理论回顾及研究综述 |
| 2.1 风险管理相关理论回顾 |
| 2.1.1 风险管理理论研究回顾 |
| 2.1.2 风险管理标准研究回顾 |
| 2.1.3 风险管理模型及方法研究回顾 |
| 2.2 研发风险管理研究综述 |
| 2.2.1 国外研发风险管理研究综述 |
| 2.2.2 国内研发风险管理研究综述 |
| 2.3 药物研发风险管理研究综述 |
| 2.3.1 国外药物研发风险管理研究综述 |
| 2.3.2 国内药物研发风险管理研究综述 |
| 2.4 生物制品药物研发风险管理研究综述 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 风险管理方法设计 |
| 3.1 风险评估方法确定 |
| 3.2 风险评估方法介绍 |
| 3.3 数据处理和统计分析方法 |
| 3.3.1 数据筛查和整理 |
| 3.3.2 统计分析方法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 人源化单克隆抗体药物研发流程 |
| 4.1 人源化单克隆抗体药物研发概述 |
| 4.2 人源化单克隆抗体药物研发流程 |
| 4.2.1 第一阶段:细胞株构建研发阶段 |
| 4.2.2 第二阶段:细胞培养与工艺研发阶段 |
| 4.2.3 第三阶段:制剂研发阶段 |
| 4.2.4 第四阶段:动物试验研发阶段 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 人源化单克隆抗体药物细胞株构建研发阶段风险管理 |
| 5.1 风险识别 |
| 5.2 风险分析 |
| 5.3 风险评价 |
| 5.4 风险控制 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 人源化单克隆抗体药物细胞培养与工艺研发阶段风险管理 |
| 6.1 风险识别 |
| 6.2 风险分析 |
| 6.3 风险评价 |
| 6.4 风险控制 |
| 6.5 本章小结 |
| 第七章 人源化单克隆抗体药物制剂研发阶段风险管理 |
| 7.1 风险识别 |
| 7.2 风险分析 |
| 7.3 风险评价 |
| 7.4 风险控制 |
| 7.5 本章小结 |
| 第八章 人源化单克隆抗体药物动物试验研发阶段风险管理 |
| 8.1 风险识别 |
| 8.2 风险分析 |
| 8.3 风险评价 |
| 8.4 风险控制 |
| 8.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文（专着）目录 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 附录7 |
| 附录8 |
| 附录9 |
| 附录10 |
| 附录11 |
| 附录12 |
| 附录13 |
| 附录14 |
| 附件 |
（3）基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 T-CUS_(245C)的制备及体外抗肿瘤活性检测 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细菌 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 1.5 主要实验试剂配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 流式细胞学检测各细胞株HER-2表达情况 |
| 2.2 CUS_(245C)的制备与纯化 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 CUS_(245C)的表达与纯化 |
| 2.3 免疫毒素T-CUS_(245C)的制备 |
| 2.3.1 免疫毒素T-CUS_(245C)的偶联 |
| 2.3.2 免疫毒素T-CUS_(245C)的纯化 |
| 2.3.3 免疫毒素T-CUS_(245C)的鉴定 |
| 2.4 T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 2.4.1 细胞培养 |
| 2.4.2 SRB检测免疫毒素T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 2.5 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 各细胞株HER-2 表达情况 |
| 3.2 CUS_(245C)的原核表达与纯化 |
| 3.3 T-CUS_(245C)的制备与检测 |
| 3.3.1 T-CUS_(245C)的偶联与纯化 |
| 3.3.2 免疫毒素T-CUS_(245C)的鉴定 |
| 3.3.3 T-CUS_(245C)诱导细胞凋亡的检测 |
| 3.4 T-CUS_(245C)的体外抗肿瘤活性 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 T-CUS_(245C)的内化作用及其与药效的关系 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 南瓜蛋白单克隆抗体的制备 |
| 2.1.1 杂交瘤细胞的体外培养 |
| 2.1.2 Protein G亲和层析法纯化南瓜蛋白单克隆抗体 |
| 2.1.3 南瓜蛋白单克隆抗体的鉴定 |
| 2.2 T-CUS_(245C)内化作用的检测 |
| 2.2.1 鼠抗CUS_(245C)单克隆抗体FITC荧光标记 |
| 2.2.2 细胞爬片 |
| 2.2.3 药物处理 |
| 2.2.4 细胞破膜固定 |
| 2.2.5 染色 |
| 2.2.6 封片 |
| 2.2.7 激光共聚焦显微镜上机成像 |
| 2.3 T-CUS_(245C)内化强度改变对细胞毒作用的关系检测 |
| 2.3.1 普萘洛尔增强T-CUS_(245C)内化作用的检测 |
| 2.3.2 普萘洛尔和洛利普兰对SK-OV-3的生长抑制作用-- |
| 2.3.3 普萘洛尔和洛利普兰对T-CUS_(245C)药效的影响 |
| 2.4 公式计算和统计 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 抗CUS_(245C)单克隆抗体(1G9)的制备与纯化 |
| 3.2 T-CUS_(245C)的内化作用及溶酶体共定位 |
| 3.3 T-CUS_(245C)内化作用与其药效的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 Ts/CUS的制备及抗肿瘤活性研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细菌 |
| 1.2 实验细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器和设备 |
| 1.5 主要试剂配置方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 pET-32a(+)Ts/CUS基因构建 |
| 2.1.1 Ts/CUS的 PCR引物设计 |
| 2.1.2 Ts基因扩增 |
| 2.1.3 CUS基因扩增 |
| 2.1.4 PCR产物切胶回收纯化 |
| 2.1.5 制备线性粘性末端pET-32a(+)载体 |
| 2.1.6 连接反应 |
| 2.1.7 连接产物的转化 |
| 2.1.8 重组载体pET-32a-Ts/CUS的挑取 |
| 2.2 Ts表达纯化产物的鉴定 |
| 2.2.1 流式细胞技术检测Ts抗原结合特异性 |
| 2.2.2 Ts亲和力测定 |
| 2.3 重组质粒pET-32a-Ts/CUS的鉴定 |
| 2.4 重组蛋白Ts/CUS的诱导表达与纯化 |
| 2.4.1 Ts/CUS的表达 |
| 2.4.2 Ts/CUS的纯化 |
| 2.5 重组蛋白的鉴定 |
| 2.5.1 SDS-PAGE鉴定 |
| 2.5.2 Western blot免疫印记试验 |
| 2.5.3 Ts/CUS诱导细胞凋亡检测 |
| 2.6 重组免疫毒素Ts/CUS的结合活性检测 |
| 2.7 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 单链抗体Ts基因的构建、表达纯化及鉴定 |
| 3.2 pET-32a-Ts/CUS质粒的构建和鉴定 |
| 3.3 融合免疫毒素Ts/CUS的表达、纯化与鉴定 |
| 3.4 Ts/CUS对SK-OV-3细胞的凋亡诱导作用 |
| 3.6 SRB检测Ts/CUS的体外增殖抑制作用 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分 Ts/CUS联合Keytruda在对肿瘤细胞的杀伤作用 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 流式细胞学检测各细胞株PD-L1表达情况 |
| 2.2 人淋巴细胞提取与分离 |
| 2.3 抗体阻断实验 |
| 2.4 肿瘤细胞淋巴细胞共培养 |
| 2.5 ELISA检测上清IL-2和IFN-γ |
| 2.6 流式细胞学检测肿瘤细胞调往和淋巴细胞亚型 |
| 2.7 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 各细胞株PD-L1表达情况的检测及抗PD-1抗体的选择 |
| 3.2 Ts/CUS联合Keytruda共培养系统中抗肿瘤作用 |
| 3.3 Ts/CUS联合Keytruda对T淋巴细胞亚型的影响 |
| 3.4 Ts/CUS联合Keytruda对培养上清IFN-γ的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）抗VEGF单克隆抗体偶联顺铂胶束的制备、表征及靶向治疗兔舌癌的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 前言 |
| 第一部分 抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束的制备及表征 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束中抗癌药物CDDP含量测定 |
| 1.实验材料 |
| 2.方法与结果 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三部分 抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP对 RSCC-1 细胞体外抑制实验 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四部分 抗VEGF单克隆抗体-PEG-PLA-CDDP纳米胶束体内分析方法的建立 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.组织HPLC方法学考察 |
| 4.血浆HPLC方法学考察 |
| 5.讨论 |
| 6.结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（5）壮药国虾薄（绞股蓝）皂苷及其抗非小细胞肺癌（NSCLC）作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照及英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 壮药国虾薄皂苷的分离与鉴定 |
| 第一节 壮药国虾薄皂苷类新成分的发现 |
| 1.1.1 实验仪器与材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 实验结果 |
| 1.1.4 讨论与结论 |
| 第二节 壮药国虾薄皂苷类成分的提取与分离 |
| 1.2.1 实验仪器与材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.2.3 实验结果 |
| 1.2.4 讨论与结论 |
| 第三节 壮药国虾薄皂苷类成分的结构鉴定 |
| 1.3.1 实验仪器与材料 |
| 1.3.2 实验方法 |
| 1.3.3 实验结果 |
| 1.3.4 讨论与结论 |
| 第二章 壮药国虾薄皂苷类成分对A549细胞SAR的探讨 |
| 2.1 实验仪器与材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论与结论 |
| 第三章 Damulin B体外对人NSCLC细胞的抑制作用 |
| 第一节 Damulin B对A549及H1299细胞的细胞毒作用 |
| 3.1.1 实验仪器与材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.1.3 实验结果 |
| 3.1.4 讨论与结论 |
| 第二节 Damulin B对A549及H1299细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.2.1 实验仪器与材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.2.4 讨论与结论 |
| 第三节 Damulin B对A549及H1299细胞周期的阻滞作用 |
| 3.3.1 实验仪器与材料 |
| 3.3.2 实验方法 |
| 3.3.3 实验结果 |
| 3.3.4 讨论与结论 |
| 第四节 Damulin B对A549及H1299细胞转移的抑制作用 |
| 3.4.1 实验仪器与材料 |
| 3.4.2 实验方法 |
| 3.4.3 实验结果 |
| 3.4.4 讨论与结论 |
| 第四章 构型异构体gypenoside L和gypenoside LI体外对人NSCLC A549细胞抑制作用的比较 |
| 第一节 Gyp L和Gyp LI对A549细胞的细胞毒作用 |
| 4.1.1 实验仪器与材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.1.4 讨论与结论 |
| 第二节 Gyp L和Gyp LI对A549细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.2.1 实验仪器与材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.3 实验结果 |
| 4.2.4 讨论与结论 |
| 第三节 Gyp L和Gyp LI对A549细胞周期的阻滞作用 |
| 4.3.1 实验仪器与材料 |
| 4.3.2 实验方法 |
| 4.3.3 实验结果 |
| 4.3.4 讨论与结论 |
| 第四节 Gyp L和Gyp LI对A549细胞转移的抑制作用 |
| 4.4.1 实验仪器与材料 |
| 4.4.2 实验方法 |
| 4.4.3 实验结果 |
| 4.4.4 讨论与结论 |
| 第五章 新皂苷单体成分生物活性的探究 |
| 5.1 实验仪器与材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.4 讨论与结论 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 一、壮药国虾薄概况介绍 |
| 参考文献 |
| 二、国虾薄皂苷类成分研究动态 |
| 参考文献 |
| 三、非小细胞肺癌与其化疗现状 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 附图 |
（6）曲妥珠单抗修饰的多功能囊泡用于卵巢癌的靶向化疗（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 单克隆抗体概述 |
| 1.2 曲妥珠单抗的简介及临床用法 |
| 1.3 曲妥珠单抗作为靶向配体的应用 |
| 1.3.1 抗体药物偶联物(ADC) |
| 1.3.2 曲妥珠单抗导向的纳米药物 |
| 1.4 双硫交联的聚合物纳米体系 |
| 1.4.1 双硫交联的聚合物胶束 |
| 1.4.2 双硫交联的纳米凝胶 |
| 1.4.3 双硫交联的聚合物囊泡 |
| 1.5 课题的提出和研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 高效装载盐酸表阿霉素的还原敏感免疫聚合物囊泡用于卵巢癌的HER2特异性靶向治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 试剂与仪器 |
| 2.2.2 细胞和动物培养 |
| 2.2.3 聚合物Mal-PEG-P(TMC-DTC)和PEG-P(TMC-DTC)的合成与表征 |
| 2.2.4 曲妥珠单抗修饰的囊泡(Tra-Ps)的制备与表征 |
| 2.2.5 Tra-Ps与HER2膜外蛋白(HER2ECD)的亲和力评价 |
| 2.2.6 马来酰亚胺官能化的载药双硫交联囊泡(Mal-Ps-EPI)的制备 |
| 2.2.7 曲妥珠单抗修饰的载药囊泡( Tra-Ps-EPI)的构建与表征 |
| 2.2.8 肿瘤细胞HER2的表达水平 |
| 2.2.9 细胞内吞实验 |
| 2.2.10 细胞毒性实验 |
| 2.2.11 小鼠体内血液循环、生物分布和肿瘤穿透 |
| 2.2.12 体内抗肿瘤效果研究 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 聚合物PEG-P(TMC-DTC)和Mal-PEG-P(TMC-DTC)的合成 |
| 2.3.2 曲妥珠单抗修饰的囊泡(Tra-Ps)的制备 |
| 2.3.3 曲妥珠单抗修饰的包载EPI·HCl囊泡(Tra-Ps-EPI)的制备 |
| 2.3.4 Tra-Ps-EPI的细胞内吞行为和体外抗肿瘤效果 |
| 2.3.5 Tra-Ps-EPI的小鼠体内血液循环、成像和肿瘤穿透 |
| 2.3.6 Tra-Ps-EPI的体内抗肿瘤活性 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 曲妥珠单抗导向的聚合物囊泡美登素偶联物用于卵巢癌的靶向治疗 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 试剂与仪器 |
| 3.2.2 聚合物N3-PEG-P(TMC-DTC)的合成 |
| 3.2.3 二苯并环辛炔官能化的曲妥珠单抗(Tra-DBCO)的制备 |
| 3.2.4 叠氮官能化的聚合物囊泡(N3-Ps)的制备 |
| 3.2.5 聚合物囊泡美登素偶联物(Ps-DM1)的制备 |
| 3.2.6 曲妥珠单抗修饰的囊泡美登素偶联物(Tra-Ps-DM1)的制备 |
| 3.2.7 体外药物释放 |
| 3.2.8 细胞培养 |
| 3.2.9 Tra-Ps-Cy5的细胞内吞实验 |
| 3.2.10 Tra-Ps-DM1的细胞毒性实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 聚合物N3-PEG-P(TMC-DTC)的合成 |
| 3.3.2 Tra-DBCO的制备 |
| 3.3.3 Tra-Ps-DM1的制备与表征 |
| 3.3.4 Tra-Ps的靶向细胞内吞 |
| 3.3.5 Tra-Ps-DM1的体外抗肿瘤活性 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 展望 |
| 附录 英文缩写对照 |
| 硕士期间的学术成果 |
| 致谢 |
（7）抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白表达载体的构建及真核表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白靶向性验证及生物活性分析 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白体内外抗肿瘤的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 HER2阳性胃癌的靶向治疗现状和研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）基于SP90和穿膜肽协同介导的乳腺癌靶向蛋白给药体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 综述 |
| 1.1 肿瘤治疗 |
| 1.2 肿瘤治疗药物 |
| 1.2.1 肿瘤抑制剂 |
| 1.2.2 单克隆及多克隆抗体 |
| 1.2.3 导向性的酶催化前体药物 |
| 1.2.4 限制性氨基酸摄入 |
| 1.3 乳腺癌及其治疗方法 |
| 1.3.1 乳腺癌的分类 |
| 1.3.2 乳腺癌治疗方法 |
| 1.4 肿瘤药物传递 |
| 1.4.1 肿瘤给药模式 |
| 1.4.2 细胞穿膜肽的起源及分类 |
| 1.4.3 细胞靶向肽 |
| 1.5 人类免疫缺陷病毒HIV-1辅助蛋白VPR |
| 1.6 本课题研究的目的及意义 |
| 第2章 基于SP90及C-peptide的EGFP重组质粒的构建与表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂及药品 |
| 2.2.3 培养基及主要试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物设计 |
| 2.3.2 目的基因的获取 |
| 2.3.3 DNA琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.4 PCR产物纯化 |
| 2.3.5 目的基因片段及载体的双酶切反应 |
| 2.3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 2.3.7 连接和转化 |
| 2.3.8 重组质粒的鉴定及序列测定 |
| 2.3.9 PAGE凝胶电泳 |
| 2.3.10 碱法质粒抽提 |
| 2.3.11 重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株 |
| 2.3.12 重组蛋白的表达 |
| 2.3.13 重组蛋白的纯化及透析 |
| 2.3.14 SDS-PAGE电泳分析 |
| 2.3.15 蛋白浓度测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 重组质粒的设计图谱 |
| 2.4.2 sp90基因的合成及原核表达载体的构建 |
| 2.4.3 SP90-EGFP、SP90-EGFP-C、EGFP、EGFP-C融合蛋白的表达 |
| 2.4.4 融合蛋白的纯化与透析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 SP90-C靶向穿膜融合肽的生物活性分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及设备 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 主要试剂及配制方法 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.2.4 主要工作液的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞传代 |
| 3.3.3 细胞冻存 |
| 3.3.4 激光共聚焦显微镜观察细胞内摄取 |
| 3.3.5 流式细胞仪检测细胞摄取 |
| 3.3.6 MTT检测融合蛋白对乳腺癌细胞及正常细胞生长的影响 |
| 3.3.7 细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.8 BCA法测蛋白浓度 |
| 3.3.9 Far-western Blot |
| 3.3.10 Pull Down试验 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 融合蛋白在MDA-MB-231细胞内的摄取 |
| 3.4.2 融合蛋白的肿瘤靶向性及细胞选择性研究 |
| 3.4.3 融合蛋白胞内摄取的浓度及时间依赖性 |
| 3.4.4 融合蛋白对不同细胞生长的影响 |
| 3.4.5 SP90靶向受体的初步筛选 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 基于SP90及C-peptide的VPR融合蛋白对乳腺癌的靶向治疗效果研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要缓冲液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 重组质粒的构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3) |
| 4.3.3 融合蛋白的表达及纯化 |
| 4.3.4 G25脱盐柱除盐 |
| 4.3.5 MTT检测融合蛋白对乳腺癌细胞及正常细胞生长的影响 |
| 4.3.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 4.3.7 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 VPR系列重组质粒的构建 |
| 4.4.2 VPR系列重组蛋白的表达 |
| 4.4.3 重组质粒表达载体及表达条件的优化 |
| 4.4.4 药物蛋白对乳腺癌细胞及正常乳腺细胞生长的影响 |
| 4.4.5 药物蛋白对乳腺癌细胞促凋亡能力的研究 |
| 4.4.6 药物蛋白对MDA-MB-231细胞周期的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）融合蛋白EGFR单域抗体-iRGD的构建及联合抗肿瘤药物对胃癌的作用评价（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1. 传统肿瘤化疗药物所面临的问题 |
| 2. 分子靶向药物的研究现状 |
| 3. 肿瘤治疗相关肽段的研究进展 |
| 4. 我们的设计 |
| 参考文献 |
| 第二章 融合蛋白EGFR单域抗体-iRGD的构建及其对胃癌的作用评价 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 融合蛋白EGFR单域抗体-iRGD在提高抗肿瘤药物穿透性中的应用及联合抗肿瘤药物对胃癌的作用评价 |
| 1. 前言 |
| 2. 材料与方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间学习情况及所获奖励 |
| 博士研究生期间发表论文 |
| 致谢 |
（10）我国单克隆抗体抗肿瘤药物研发流程研究（论文提纲范文）
| 1 背景与现状 |
| 2 研发的一般流程及风险分析 |
| 2.1 肿瘤靶点的发现和选择 |
| 2.2 单抗抗肿瘤药抗原制备 |
| 2.3 抗肿瘤单克隆抗体制备 |
| 2.3.1 杂交瘤技术 |
| 2.3.2 抗体人源化技术 |
| 2.3.3 全人抗体制备技术 |
| 2.4 抗肿瘤单克隆抗体功能鉴定 |
| 3 结语 |
四、抗肿瘤单克隆抗体导向药物的研究概况（论文参考文献）
- [1]泛实体瘤相关抗原图谱的构建及其在抗体偶联药物和嵌合抗原受体T细胞上的应用[D]. 方佳成. 西北大学, 2021(12)
- [2]人源化单克隆抗体药物临床前研发风险管理研究[D]. 刘丹丹. 沈阳药科大学, 2019(02)
- [3]基于南瓜蛋白和曲妥珠单抗的免疫毒素的制备及抗肿瘤作用研究[D]. 熊佳妮. 福建医科大学, 2019(07)
- [4]抗VEGF单克隆抗体偶联顺铂胶束的制备、表征及靶向治疗兔舌癌的研究[D]. 李森浩. 内蒙古医科大学, 2019(03)
- [5]壮药国虾薄（绞股蓝）皂苷及其抗非小细胞肺癌（NSCLC）作用的研究[D]. 邢韶芳. 中央民族大学, 2019(01)
- [6]曲妥珠单抗修饰的多功能囊泡用于卵巢癌的靶向化疗[D]. 丁琳. 苏州大学, 2019(02)
- [7]抗胃癌HER2 scFv-CCL19-IL7融合基因工程蛋白的构建及生物活性验证[D]. 张海强. 河北医科大学, 2019(02)
- [8]基于SP90和穿膜肽协同介导的乳腺癌靶向蛋白给药体系的研究[D]. 杜国秀. 华东理工大学, 2016(05)
- [9]融合蛋白EGFR单域抗体-iRGD的构建及联合抗肿瘤药物对胃癌的作用评价[D]. 沙慧子. 南京大学, 2015(01)
- [10]我国单克隆抗体抗肿瘤药物研发流程研究[J]. 车越,何珊,陈玉文. 中国药业, 2014(19)