一、三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察（论文文献综述）
宋丽军[1]（2020）在《新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究》文中认为新疆南疆地区具有适宜红枣生长的地理和气候条件,红枣种植面积和产量常年稳居世界首位。新疆红枣富含三萜烯酸类、黄酮类、碱基、核苷和环核苷酸类等多种功能因子,具有抗氧化应激、抗癌、抗炎症、免疫调节,以及胃肠道保护等多种生理功能。苯并芘（Ba P）广泛存在于空气、水、土壤、食品及其包装材料中,具有强烈的致癌性、致突变性和间接致畸性。Ba P通过食物、饮水、呼吸系统等途径进入人体,刺激机体产生大量的自由基而导致细胞氧化应激。氧化应激会诱发基因突变、蛋白质变性、线粒体功能障碍及脂质过氧化等损伤,是人体衰老、肿瘤、心脑血管疾病、神经退行性疾病和糖尿病的主要风险因子。因此,挖掘对抗Ba P危害的红枣功能因子,并深入探明其调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的分子机制,对以红枣为原料的新型功能性食品的创制具有重要的科学意义。本文主要研究内容及结果如下:（1）新疆红枣功能因子鉴定及多元统计分析以新疆99个品种红枣为研究对象,采用高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）对红枣中主要功能因子（黄酮类、三萜烯酸类、碱基、核苷和环核苷酸类化合物等）进行定性定量研究。结果表明:新疆不同品种红枣中总三萜烯酸含量范围为1082.775±63.431–7915.451±510.824μg/g DW,其中京39枣（C41）含量最高;白桦脂酸、麦珠子酸、山楂酸、齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酮酸和2α-羟基熊果酸是新疆红枣中主要的三萜烯酸;总核酸类含量范围为408.329±8.611–1030.450±24.634μg/g DW,其中骏枣变种2号（C45）含量最高;尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤是新疆红枣中主要的核酸类物质;黄酮类含量范围为102.886±3.581–571.678±18.653μg/g DW,其中观音枣（C23）含量最高;儿茶素、表儿茶素、对香豆酸、芦丁、牡荆素、异牧荆素、阿魏酸、槲皮素3-O-葡萄糖苷、二氢槲皮素、柚皮苷、槲皮甙、二氢山萘酚、杨梅黄酮、圣草酚和白杨素是新疆红枣中的主要黄酮类物质。（2）基于细胞氧化损伤模型的红枣功能因子筛选首先建立了Ba P诱导的人肺部细胞氧化损伤模型;进一步基于该模型筛选红枣中对细胞氧化损伤具有最佳调控作用的功能因子及其干预方式。结果表明,以Ba P为诱导试剂,诱导浓度为400μmol/L,诱导时间为48 h条件下建立的细胞氧化损伤模型,可用于后续实验。与其他处理组相比,熊果酸（UA）干预可显着提高损伤模型细胞增殖活性和抗氧化酶活性（SOD、CAT、GSH）,同时降低细胞内丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量（P<0.05）。以选择对细胞正常生长影响较小,且相对较高的浓度水平为原则下,筛选得到UA为最佳功能因子,最佳干预浓度为10μg/m L,最佳干预时间为48 h。（3）熊果酸对苯并芘诱导的细胞氧化损伤的调控机制研究在上述功能因子筛选的基础上,以UA为最佳干预试剂,通过研究UA干预对细胞氧化损伤模型周期与凋亡、DNA损伤、自噬相关蛋白表达量的影响,以及激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测,探讨UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控机制。结果表明,与氧化损伤组相比,UA干预组G0/G1期细胞增加12.770%,S期减少13.162%,G2/M期减少49.864%（P<0.01）,细胞凋亡率减少58.170%,8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）含量减少46.39%,说明UA能显着改善Ba P对细胞周期的阻滞作用和减少细胞凋亡比率,修复细胞DNA损伤。同时,损伤模型细胞经UA干预后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin1、ATG5、P62蛋白表达量与损伤模型组相比差异显着（P<0.05）,说明UA干预能显着降低细胞过度自噬,从而有效保护细胞免受Ba P损伤。激光扫描共焦显微镜和透射电镜检测进一步证实UA能显着降低Ba P诱导的细胞氧化损伤,其机制与抑制细胞过度自噬有关。（4）熊果酸调控苯并芘诱导的细胞氧化损伤的转录组学分析采用转录组测序技术结合生物信息学分析,研究UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的调控作用及其分子机制。结果表明,UA干预组与氧化损伤组相比,表达显着上调和下调基因分别为296和688个;差异表达基因富集到的GO条目的生物学过程主要是:细胞连接、细胞内受体信号通路、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号的调节;细胞组分主要是:核质、细胞核、细胞膜、细胞质;分子功能主要是:胰岛素样生长因子激活受体活性、蛋白酪氨酸/苏氨酸磷酸酶活性、转录因子结合。差异表达基因KEGG pathway分析主要富集到NF-kappa B、Wnt、MAPK和m TOR信号通路。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）对主要差异表达基因atg2a,nfkb1,eif4ebp1,pik3ip1和nr4a1进行验证,结果表明UA调控Ba P诱导的细胞氧化损伤的机制主要通过PI3k-AKT/m TOR信号通路上的eif4ebp1、nfkb1与nr4a1基因调控其上下游基因（mapkapk2、zfp36l1、il1a）的表达,从而缓解细胞过度自噬和细胞衰老进程,进而调控Ba P诱导的细胞氧化损伤。综上所述,本研究在新疆不同品种红枣中主要功能因子系统分析的基础上,通过Ba P诱导的细胞氧化损伤模型筛选出UA为最佳功能因子,并初步阐明了UA对Ba P诱导的细胞氧化损伤的保护作用及其分子机制。研究结果为新疆南疆红枣精深加工和利用提供了理论依据,对南疆红枣产业的持续健康发展和农民脱贫致富具有重要意义。
朱丽娟[2]（2020）在《基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制》文中研究说明目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是全球最常见的癌症之一,其在癌症中发病率和死亡率均位于前列,严重威胁着全人类的生命健康。目前对于结直肠癌的治疗以外科手术切除为主,辅助放、化疗等综合治疗措施,但随之产生的抗免疫、骨髓抑制、脏器受损、肿瘤细胞耐药等副作用,严重制约了放化疗的效果。天然药物具有复杂的成分、多重的作用靶点,对于肿瘤发展的多个环节会产生影响,同时其毒性较低,不容易产生肿瘤耐药,已成为结直肠癌辅助治疗方案重要的组成部分。蛇葡萄素（Ampelopsin,AMP）是从植物蛇葡萄根皮及叶中提取出的一种小分子黄酮类化合物,对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用,而且能够诱导肿瘤细胞凋亡。近年研究发现自噬在肿瘤的治疗中也是非常重要的靶点,其与凋亡之间的关系对肿瘤的进程及治疗具有重要的影响,但是,蛇葡萄素对肿瘤细胞自噬和凋亡的调控尚不明确。因此,本研究以多种人结直肠癌细胞系作为研究对象,一方面基于色谱—质谱联用的代谢组学技术平台对蛇葡萄素干预人结直肠癌细胞移植瘤裸鼠肿瘤组织代谢谱进行分析,筛选出与其抑制结直肠癌生长相关的差异性代谢物,并对其代谢通路进行分析,有助于从代谢层面上阐述蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机理。另一方面从细胞水平、组织水平及分子水平,探讨蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的调节以及相关的分子机制,为结直肠癌的治疗提供新的线索和途径,为蛇葡萄素抗肿瘤作用的进一步研究和开发利用提供理论参考。方法:（1）用不同浓度的AMP（6.25、12.5、25、50和100μg/ml）分别作用于人结直肠癌HCT-116、SW480、SW620、LOVO、Colo 205、LS174T细胞48、72及96 h,MTT法检测不同浓度的AMP对这些细胞增殖抑制率的影响。用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,克隆形成实验观察AMP对细胞克隆形成率的影响。用50μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞24 h,细胞创伤愈合实验观察AMP对细胞迁移能力的影响。（2）利用人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型,观察AMP体内抗结直肠癌活性,组织切片HE染色观察AMP对动物主要脏器是否有毒性作用。（3）用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术,研究人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤块组织样本,初步筛选与AMP抑制结直肠癌生长有关的差异代谢物,并通过KEGG通路富集分析其相关代谢通路。（4）用50、100μg/ml的AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,流式细胞分析仪观察AMP对细胞周期和凋亡的影响,倒置显微镜下观察细胞形态。吖啶橙（Acridine orange,AO）染色后,荧光显微镜下观察AMP对细胞中发出红色荧光的酸性自噬囊泡的影响。并用电镜观察AMP对人结肠癌HCT-116细胞自噬的影响。免疫印迹法（Western-blotting）分析25、50、100μg/ml的AMP对细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白BCl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、Atg5表达的影响。（5）分别加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）和自噬促进剂雷帕霉素（Rapamycin,RAPA）作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞,MTT法检测自噬抑制剂和促进剂与AMP合用后对细胞增殖抑制率的影响,流式细胞术观察细胞凋亡率的变化,荧光显微镜下观察自噬抑制剂和自噬促进剂与AMP合用后细胞中酸性自噬囊泡的红色荧光比例。Western-blotting分析细胞中抗凋亡蛋白BCl-2和促凋亡蛋白Bax的比率,以及Cleaved-Caspase-3的表达,同时分析细胞中自噬标志物LC3、自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5表达的变化。（6）Western-blotting分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤模型裸鼠瘤块组织中PI3K,p-mTOR、Total-mTOR,p-Akt,Total-Akt及p-P70S6K、Total-P70S6K蛋白表达的影响。结果:（1）体外抗肿瘤实验表明,AMP对受试的六种结直肠癌细胞均有显着的抑制作用,且具有浓度依赖性。在48、72、96 h作用点,AMP对人结肠癌HCT-116、SW480及Colo 205细胞增殖的抑制作用具有时间依赖性,对人结肠癌SW620、Lovo及LS174T细胞而言,作用72 h时,增殖抑制作用最强,此后,随时间延长抑制作用逐渐降低。克隆形成实验和细胞创伤愈合实验表明,AMP能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成能力,抑制细胞迁移。（2）体内抗肿瘤实验表明,200 mg/kg的AMP能够明显抑制人结肠癌HCT-116细胞裸鼠移植瘤的生长,具有良好的体内抗结直肠癌活性。对动物的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏指数均无明显影响,组织切片HE染色结果显示,动物重要脏器组织无明显异常。（3）基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用（UPLC-TOFMS）非靶标代谢组学技术平台,对人结肠癌HCT-116细胞皮下移植瘤模型小鼠和AMP处理组小鼠瘤组织代谢谱进行了检测,筛选差异性代谢产物,涉及三羧酸循环、氨基酸代谢、核苷酸代谢、氨基酰tRNA的生物合成等通路。（4）流式细胞仪分析结果显示,AMP能够将人结肠癌HCT-116、SW480细胞阻滞于G1期,干扰细胞的有丝分裂,使细胞生长停滞。同时,细胞凋亡率明显增加。AO染色后,荧光显微镜下可见细胞内红色荧光比例明显增加,电镜下可见细胞胞浆中出现了双层或者单层膜包绕着线粒体等细胞器的自噬小体和自噬溶酶体。Western-blotting分析结果显示,AMP作用后,细胞和瘤块组织中BCl-2/Bax比率下调,Caspase-3剪切活性片段Cleaved-Caspase-3的表达上调,同时LC3-Ⅱ、Beclin-1及Atg5蛋白的表达均显着增加。（5）AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞增殖加快,与自噬促进剂RAPA合用后,细胞增殖减慢。细胞AO染色后荧光显微镜下可见,AMP与自噬抑制剂3-MA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡的比例减少,而与自噬诱导剂RAPA合用后,细胞内呈红色荧光的酸性自噬泡比例显着增加。Western-blotting分析显示,3-MA与AMP合用,可以使自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1及Atg5的表达降低,而RAPA与AMP合用后,这些蛋白的表达均明显增加。流式细胞术Annexin-PI双染结果显示,3-MA单独应用时,细胞凋亡率没有太大的变化,当其与AMP合用后,凋亡率明显低于AMP处理组。RAPA与AMP合用后,细胞凋亡率明显增加,高于AMP处理组。Western-blotting分析结果显示,3-MA与AMP合用后,凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例没有显着变化,但Cleaved-Caspase-3的表达显着低于AMP处理组,RAPA与AMP合用后,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax的比例明显降低,Cleaved-Caspase-3的表达显着上调。（6）25、50、100μg/ml AMP作用于人结肠癌HCT-116、SW480细胞以及HCT-116细胞移植瘤裸鼠模型后,细胞及瘤块组织中的PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-P70S6K的表达均呈降低的趋势。结论:（1）AMP具有显着的体外抗结直肠癌活性,能够抑制人结肠癌HCT-116、SW480细胞的克隆形成及迁移能力。（2）AMP具有显着的体内抗结直肠癌活性,且对动物的主要脏器无明显毒性。（3）AMP主要影响结直肠癌组织异常的能量代谢,特别是氨基酸代谢。（4）AMP能够形成结肠癌细胞G1期阻滞,诱导细胞凋亡和自噬。（5）自噬能够促进AMP诱导的细胞凋亡作用,与凋亡合作,共同促进细胞死亡。（6）AMP能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号转导通路。
黄誉娴[3]（2019）在《Caspase-1，IL-1β和IL-18调控在云芝糖肽（PSP）诱导的Molt-4细胞死亡机制中的作用研究》文中提出云芝糖肽（PSP）是从云芝发酵菌丝体中提取的结合蛋白多糖,临床上用于增强肿瘤病人的免疫功能。近年发现它还能直接通过干扰细胞周期、诱导凋亡等机制抑制、杀伤多种癌细胞。本实验室前期研究发现PSP诱导Molt-4等白血病细胞死亡过程中形态除发生典型凋亡样固缩改变外,还有体积膨大现象,提示可能有其它死亡机制存在,因此本研究进一步进行了探讨。研究用显微测量术测量了PSP引起的Molt-4细胞直径变化。结果显示,20、40、80μg/mL PSP可分别使细胞平均直径从正常的10.80±1.40μm增加到12.12±2.06、13.01±2.63和13.81±2.52μm（P<0.01）。流式细胞术前散射信号分析发现细胞大小有增加和缩小两种不同的变化。细胞与PSP（20、40、80μg/mL）分别孵育48h后用caspase-1荧光抑制剂FLICA标记,再用流式细胞术分析FLICA阳性细胞比率,发现由对照组的2.38%分别增加到4.57、5.25、16.40%（P<0.05）。用PSP作用12、24、36、48h后再同样检测,发现FLICA阳性细胞比率从对照组的3.2%分别增加到8.65、12.4、18.6和22.8%（P<0.001）。这些结果提示PSP可浓度和时间依赖性激活Molt-4细胞中的caspase-1。VX-765、Ac-YVAD-CMK等caspase-1抑制剂在25-100μM浓度范围内不但不能抑制PSP诱导的caspase-1激活及细胞死亡,还显示出明显的细胞毒性。采用流式细胞分析法,用Gating技术分析FLICA阳性细胞（FLICA+）在前散射（FS）/侧散射（SS）信号散点图上的分布,发现FS信号强（体积较大）的细胞百分率随PSP（80μg/mL）作用时间延长,由对照组的4.71%分别增加到29.8%（12h）、34.7%（24h）、46.2%（36h）、30.0%（P<0.01）（48h）。FS信号弱的较小的细胞百分率虽然也有增加（9.51、13.3、17.1、24.4%,P<0.001）,但显微镜观察发现细胞出现空泡,有FLICA标记的胞质边缘化推断由此变化造成FS信号减弱,而非体积变化所致。细胞用FLICA、7-AAD和Annexin V-APC三种试剂同时进行标记,流式细胞检测,Gating选取7-AAD阴性的完整细胞,发现随PSP浓度和作用时间的增加,细胞出现Annexin V阳性、FLICA阴性（Ann+/FLICA-）的细胞和FLICA阳性、Annexin V阴性（Ann-/FLICA+）的细胞及Ann+/FLICA+的细胞三种不同变化,提示有部分细胞（Ann+/FLICA-）发生早期凋亡,部分细胞发生caspase-1相关的死亡（Ann-/FLICA+）,且这种死亡机制与凋亡有关（Ann+/FLICA+）。时序研究发现Ann-/FLICA+的细胞先出现在前,Ann+/FLICA+的细胞出现在后,提示caspase-1相关的细胞死亡机制可转为凋亡。流式细胞术进一步分析发现,Ann-/FLICA+的细胞FS信号强,细胞具有较大的体积,而Ann+/FLICA+的细胞FS信号弱,也提示细胞体积增大和caspase-1激活是细胞死亡过程中早期的事件。caspase-1参与的细胞死亡过程通常伴随IL-1β和IL-18的产生,因此用实时定量PCR方法分析了PSP诱导的Molt-4中IL-1β和IL-18基因表达水平。以GADPH基因为内参,发现20,40,80μg/mL PSP可浓度及时间依赖地上调IL-1β和IL-18基因表达。IL-1β最高被上调2.9倍（80μg/mL,12h）,IL-18上升了14.5倍（80μg/mL,24h）。采用DCFH-DA试剂标记细胞内的活性氧簇（ROS）产生,发现20、40、80μg/mL PSP可使ROS阳性细胞相对荧光强度上调1.2、2.7、3.2倍。综上所述,PSP除能诱导凋亡外,还可使细胞体积发生膨大、激活caspase-1、上调IL-1β、IL-18基因的表达。这种机制可能为焦亡。
刘晓丹[4]（2019）在《蟾蜍灵诱导三阴性乳腺癌耐药细胞程序性坏死和逆转耐药的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:三阴性乳腺癌较其他类型乳腺癌恶性程度高,药物治疗效果不理想,原发耐药比例高,继发耐药时间短、预后差。三阴性乳腺癌是困扰临床治疗已久的乳腺癌类型,始终缺乏效果明显而副作用小的治疗药物问世。肿瘤细胞产生耐药性的重要原因是抗凋亡蛋白的过表达和凋亡信号传导障碍,此外还受到多药耐药抵抗、肿瘤干细胞介导的肿瘤耐药和肿瘤微环境的影响。多药耐药的三阴性乳腺癌的临床治疗更是面临巨大的挑战。传统上克服耐药的主要思路,是针对不同凋亡障碍靶点设计药物,来试图恢复肿瘤细胞的凋亡能力,但由于凋亡机制本身极其复杂,加之肿瘤细胞固有的异质性,导致这方面的努力始终没有获得重大突破。近年来的研究表明,除凋亡外,肿瘤细胞还能够通过如程序性坏死等后备死亡机制死亡,并且肿瘤细胞为了躲避凋亡而设置的障碍对程序性坏死并不会造成影响。蟾蜍灵是从中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物中提取的主要活性成分之一,其抗肿瘤作用在众多文献中得到了报道。本课题组前期工作中,用生物素化壳聚糖纳米粒装载蟾蜍灵（Bufalin biotin modified chitosan nanoparticles,Bu-BCS-NPs）,制成了平均直径为171.6nm的大分子药物颗粒,使得该大分子药物颗粒能够在体内环境下,最大限度地利用实体瘤的高通透性和滞留效应,抑制裸鼠体内乳腺癌移植瘤。前期工作中偶然发现蟾蜍灵可以诱导乳腺癌细胞发生程序性坏死。这种坏死并不依赖于Caspase,因此并不会被Caspase的广谱抑制剂z-VAD-fmk所抑制;还具备特殊的超微结构特点:细胞膜早期出现崩解,细胞浆内大量线粒体内部嵴结构消失,呈现低电子密度的空泡样结构,并出现自噬体,但细胞核未见明显改变等。基于国内外学者的研究结果以及本课题组前期的研究发现,本研究试图阐明:（1）蟾蜍灵是否可以有效杀灭三阴性乳腺癌细胞,特别是耐药的三阴性乳腺癌细胞;（2）蟾蜍灵是否确实可以诱导程序性坏死;（3）蟾蜍灵是通过何种分子机制实现诱导乳腺癌细胞程序性坏死;（4）蟾蜍灵是否可以恢复耐药细胞化疗敏感性;（5）蟾蜍灵是否可以协同、增敏化疗药物的作用。研究方法:本研究的主要研究方法包括:（1）MTT检测细胞活性;（2）AV/PI双染法观察细胞存活状态;（3）Hoechst33342/PI双染法荧光显微镜下观察细胞核形态及细胞生存状态;（4）活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧含量;（5）PI染色法检测死亡细胞比例;（6）透射电镜观察细胞微观形态;（7）JC-1染色法检测线粒体膜电位变化;（8）Real-time PCR和Western-blot检测基因在RNA水平和蛋白水平的表达;（9）裸鼠体内肿瘤种植及药物干预实验,包括肿瘤种植、观察、测量、解剖等;（10）实验过程中应用的抑制剂主要包括程序性坏死抑制剂Nec-1、凋亡抑制剂z-VAD-fmk、活性氧抑制剂NAC、磷脂酶A2抑制剂溴烯醇内酯、脂氧合酶抑制剂AA861、线粒体呼吸链复合体I抑制剂Rotenone、复合体III抑制剂Antimycin以及ATP合成酶抑制剂Oligomycin;（11）Image J进行灰度值测定;（12）Graphpad进行图片编辑;（13）SPSS22.0进行数据统计,P<0.05提示显着差异。结果:通过MTT检测我们发现,蟾蜍灵对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系和耐药细胞系MDA-MB-231/ADR、MDA-MB-231/DOC均存在剂量/时间依赖性杀伤作用。通过对MDA-MB-231/ADR细胞的进一步研究我们发现,蟾蜍灵的杀伤作用是通过诱导程序性坏死实现的,具体表现在蟾蜍灵作用后:（1）Hoechst33342/PI双染法观察到的死亡细胞中,以程序性坏死为主;（2）这种细胞死亡可以被程序性坏死抑制剂Nec-1显着抑制;（3）细胞内活性氧含量显着升高,活性氧抑制剂NAC抑制活性氧的含量后,可以显着降低细胞的死亡比例;（4）透射电镜下可以观察到细胞多表现为坏死样形态学改变,包括:1)细胞核肿胀但形态完整,未发生核固缩、碎裂;2)细胞膜完整性丧失,且不以“发芽或气泡”的方式形成凋亡小体;3)细胞浆大量空泡化;4)细胞内形成双层膜结构的自噬空泡;5)线粒体明显肿胀。为了探究蟾蜍灵诱导程序性坏死的可能机制,我们进行了进一步的研究。结果提示,蟾蜍灵作用MDA-MB-231及MDA-MB-231/ADR细胞后:（1）细胞内ROS含量显着升高,并且ROS的升高与蟾蜍灵的作用浓度存在剂量依赖关系;（2）线粒体功能障碍,具体表现为JC-1检测下,线粒体膜电位显着下降;（3）PLA2/LOXs的抑制剂并不能抑制细胞内ROS含量的升高;（4）线粒体呼吸链复合体III抑制剂Antimycin以及ATP合成酶抑制剂Oligomycin不能抑制ROS含量的升高,但线粒体呼吸链复合体I抑制剂Rotenone可以抑制ROS的升高。本研究同时发现,无毒剂量蟾蜍灵可以逆转三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231/ADR和MDA-MB-231/DOC多药耐药,恢复耐药细胞的化疗敏感性。蟾蜍灵能够降低耐药细胞系多药耐药蛋白P-gp、BCRP以及MRP1的表达,这可能是其发挥逆转耐药作用的途径。通过对裸鼠腋下种植MDA-MB-231/ADR细胞,成瘤后给予蟾蜍灵或阿霉素或联合用药的药物干预实验发现,无毒剂量的蟾蜍灵在裸鼠体内可以降低种植瘤耐药蛋白P-gp、BCRP和MRP1的表达,并且可以恢复耐药细胞对阿霉素的治疗敏感性,发挥逆转耐药的作用。结论:1、蟾蜍灵能够有效杀伤三阴性乳腺癌细胞及其耐药细胞,并且这种杀伤是通过诱导细胞程序性坏死途径实现的。2、蟾蜍灵可以破坏三阴性乳腺癌细胞线粒体功能,使线粒体呼吸链功能发生障碍,进而导致细胞内活性氧含量增加,最终诱导细胞发生程序性坏死。3、蟾蜍灵可以通过降低三阴性乳腺癌耐药细胞的多药耐药蛋白的表达,实现逆转耐药。
张蓉[5]（2018）在《毛钩藤碱（Hirsutine）通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡研究》文中研究说明研究背景肺癌是我国第一大癌症,寻找新的高效低毒抗肺癌药物具有重大意义。天然生物碱是抗肿瘤药物的重要来源,本课题前期针对天然生物碱进行了大量的筛选工作,发现毛钩藤碱（Hirsutine）具有良好的体内外抗肺癌活性,对正常细胞毒性小,具有开发成为高效低毒的抗肺癌新药潜力。毛钩藤碱（Hirsutine）是茜草科藤本植物钩藤（Uncaria rhynchophylla）中的生物碱类活性成分之一,已有报道,Hirsutine具有保护缺氧诱导的心肌损伤,保护炎症介导的神经损伤的作用,在抗肿瘤领域亦有报道,Hirsutine可抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭,诱导乳腺癌细胞DNA损伤,提示Hirsutine具有抗肿瘤活性。但Hirsutine抗肺癌作用及分子机制尚不明确。因此,本课题拟进一步明确Hirsutine是否具有选择性抗肺癌作用,并阐明其具体作用机制。一、Hirsutine选择性诱导肺癌细胞凋亡CCK8法和流式细胞术检测发现Hirsutine可诱导肺癌A549和NCI-H1299细胞凋亡增加,呈现良好的量效和时效关系,Western blot检测发现Hirsutine可诱导凋亡相关蛋白C-PARP和C-Caspase 3表达增加。但Hirsutine对人正常肝细胞LO2、人正常胚肺细胞WI-38几乎没有毒性。提示Hirsutine可能具有高效、低毒的抗肺癌效应。二、Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤电镜观察到Hirsutine作用后线粒体呈现空泡化、肿胀和内嵴紊乱,提示Hirsutine可能诱导了线粒体损伤。JC-1染色显示Hirsutine可显着下调线粒体膜电位且具有良好量效关系。荧光素酶法ATP检测试剂盒检测到Hirsutine可显着下调ATP的产生。DCFH-DA染色法流式检测发现Hirsutine可诱导细胞ROS产生增加。Western blot检测Cyto C从线粒体释放到胞浆增加。Calcein-AM/CoCl2染色法发现Hirsutine可诱导线粒体渗透性转换孔（MPTP）开放,免疫沉淀和MPTP开放抑制剂Cyclosporin A的应用确认Hirsutine诱导了环亲和素D（cyclophilinD,CypD）和腺苷酸转运体（adenine nucleotide translocase 1,ANT1）直接结合,从而促使MPTP孔开放,导致线粒体损伤途径细胞凋亡。三、Hirsutine通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡1、为了进一步阐明Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤的机制,采用Western blot法检测到Hirsutine诱导GSK3β（S9）去磷酸化,呈现良好的量效和时效关系。应用GSK3β（S9）小分子抑制剂CHIR99021进一步确认Hirsutine诱导的CypD和ANT1结合介导的MPTP开放依赖于GSK3β（S9）去磷酸化。2、由于GSK3β（S9）是PI3K/Akt通路重要的下游靶点,采用Western Blot法检测PI3K、Akt蛋白表达情况,发现Hirsutine可显着去磷酸化抑制PI3K/Akt活性,并呈现良好的量效和时效关系。采用PI3K抑制剂LY294002发现LY294002可进一步加剧Hirsutine诱导的GSK3β（S9）去磷酸化;LY294002可进一步降低Hirsutine诱导的p-GSK3β（S9）与ANT1直接结合,增加ANT1和CypD结合介导的MPTP开放,增加细胞凋亡。3、进一步研究发现,Hirsutine可诱导ROCK1降解激活、PTEN磷酸化,采用ROCK1抑制剂Y-27632和慢病毒基因敲降ROCK1均可阻断Hirsutine诱导的PTEN磷酸化、PI3K/Akt/GSK3β去磷酸化;Y-27632或稳定敲降ROCK1均可逆转Hirsutine诱导的p-GSK3β（S9）与ANT1结合降低;Y-27632或稳定敲降ROCK1均可阻断Hirsutine诱导的CypD与ANT1直接结合,并进一步阻断MPTP开放,逆转ATP产生减少和细胞凋亡。表明Hirsutine诱导的PI3K/Akt抑制和MPTP开放依赖于ROCK1/PTEN途径的激活。四、肺癌裸鼠异种移植瘤模型证实Hirsutine具有良好的抗肺癌作用,并通过激活了ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路1、采用肺癌A549细胞株构建裸鼠移植瘤模型。随机将裸鼠分为Hirsutine处理组和无菌盐水对照组,定期测量裸鼠生长体重和瘤体体积,每日观察裸鼠状态。结果发现,与对照组相比,Hirsutine可显着抑制裸鼠移植瘤的生长,两组体重无显着差异,肝肾HE染色结果提示Hirsutine对裸鼠无明显肝肾毒性,提示Hirsutine在一定剂量和作用时间下具有高效低毒的体内抗肺癌效应。2、为验证ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路在Hirsutine诱导的体内抗肺癌效应中的重要作用,采用免疫组化法和Western blot法检测了ROCK1、P-PTEN、P-PI3K、p-Akt及p-GSK3β（S9）的表达,免疫组化染色发现:Hirsutine处理组C-Caspase 3表达增加,p-GSK3β（S9）减少。Western blot检测发现:Hirsutine处理可降解激活移植瘤中ROCK1,增加PTEN磷酸化,降低p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β（S9）的表达。表明Hirsutine体内水平诱导的A549细胞凋亡通过激活ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路。本文主要结论如下:Hirsutine可选择性诱导多种肺癌细胞凋亡,并可有效抑制肺癌裸鼠移植瘤生长,具有较强的体内外抗肺癌效应。机制研究发现Hirsutine的抗肺癌作用依赖于ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路的激活,进而引起MPTP开放介导的线粒体损伤,最终导致Caspase激活和细胞凋亡。本研究明确了Hirsutine的体内外抗肺癌作用,阐明了Hirsutine抗肺癌的具体分子机制,为开发Hirsutine成为高效低毒的抗肺癌药物和ROCK1/PTEN/PI3K/Akt/GSK3β通路分子成为新的肿瘤治疗靶点提供实验依据。
张海英[6]（2016）在《新疆阿魏抗肿瘤活性部位的筛选及作用机理研究》文中研究表明目的:应用体外细胞实验,DPPH抗氧化研究新疆阿魏不同极性部位抗肿瘤、抗氧化作用,筛选出新疆阿魏抗肿瘤的活性部位;在此基础上应用血清药理学、划痕实验、Transwell小室实验明确阿魏活性部位的抗肿瘤作用;研究阿魏活性部位对小鼠S-180腹水瘤和小鼠S-180实体瘤的抑制作用,并进一步探讨阿魏活性部位抗肿瘤的分子机制,为开发和有效利用新疆特色药材资源阿魏提供实验依据。方法:1.通过磺酰罗丹明B比色法（SRB）检测新疆阿魏各极性部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位）对人结肠癌细胞HCT116、人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用,通过流式细胞术检测新疆阿魏各极性部位对HCT116、Caco-2、HepG2细胞的促凋亡作用,以细胞增殖抑制率、总凋亡率作为指标筛选阿魏抗肿瘤活性部位。2.通过TLC-DPPH法（薄层生物自显影）和DPPH自由基法,评价新疆阿魏各极性部位（石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、甲醇部位）的抗氧化能力。3.应用血清药理学方法,检测新疆阿魏抗肿瘤活性部位的含药血清对HCT116、Caco-2、HepG2细胞的增殖抑制作用。4.应用划痕实验、Transwell小室实验,以迁移抑制率、侵袭抑制率为评价指标,研究阿魏抗肿瘤活性部位对HCT116、Caco-2、HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。5.建立小鼠S-180腹水瘤模型:120只小鼠,随机分为6组,正常对照组、肿瘤模型组、阿魏高剂量组、阿魏中剂量组、阿魏低剂量组、顺铂（阳性）对照组,灌胃给予阿魏活性部位10天后,观察小鼠生存时间、脾指数、胸腺指数和体重。6.建立小鼠S-180实体瘤模型:60只小鼠,随机分为6组,正常对照组、肿瘤模型组、阿魏高剂量组、阿魏中剂量组、阿魏低剂量组、顺铂（阳性）对照组。灌胃给予阿魏活性部位10天后,观察小鼠肿瘤抑制率、脾指数、胸腺指数和体重,用HE染色法检查小鼠肿瘤。7.流式细胞术研究阿魏活性部位对HCT116细胞周期的影响,Hoechst33258染色法研究对细胞凋亡形态的影响,透射电镜观察凋亡细胞的超微结构。8.应用荧光实时定量PCR的方法,研究阿魏活性部位对HCT116细胞作用后,PI3K-Akt通路中EGFR、PTEN、mTOR、Akt1、Bcl-xl、p53、PI3Kp85等基因表达的影响。9.应用Western Blot的方法,研究阿魏活性部位对HCT116细胞作用后,PI3K-Akt通路中PTEN、mTOR、Bcl-xl、p53等蛋白表达的影响。结果:1.分离得到新疆阿魏石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇4个部位,其以石油醚部位、乙酸乙酯部位所占比重最高,分别为0.12g·g-1、0.15 g·g-1;新疆阿魏各极性部位对3种肿瘤细胞的增殖均有一定抑制作用,其中乙酸乙酯部位效果较好,对HCT116、Caco-2、HepG2细胞的IC50分别为43.7、15.0、28.7μg·mL-1;新疆阿魏各极性部位对3种肿瘤细胞均有促进凋亡作用,其中乙酸乙酯部位效果较好,对HCT116、Caco-2、HepG2细胞的凋亡率分别为46.6%、64.0%、80.8%。除石油醚部位外,阿魏各极性部位均对DPPH自由基有清除作用,其中乙酸乙酯部、正丁醇部效果最好IC50分别为34.1mg·L-1和33.8mg·L-1;TLC-DPPH法（薄层生物自显影）表明乙酸乙酯部、正丁醇部抗氧化活性较好。2.血清药理学结果表明,50%阿魏乙酸乙酯部位含药血清对HCT116、Caco-2、HepG2细胞增殖抑制率分别为25.3%、27.6%、6.7%。3.划痕实验中阿魏乙酸乙酯部位对HCT116、Caco-2、HepG2细胞48 h的迁移率分别为35.8%、24.4%、43.5%;Transwell小室迁移实验,阿魏乙酸乙酯部位对HCT116细胞的48h迁移抑制率为70.67%;Transwell小室侵袭实验测得阿魏乙酸乙酯部位对HCT116、Caco-2、HepG2细胞72h侵袭抑制率分别为55.1%、89.5%、75.0%。4.建立小鼠S-180腹水瘤模型,灌胃给予阿魏乙酸乙酯部位10天后,阿魏低、中、阿魏高剂量组小鼠的生存时间有不同程度的延长,阿魏低、中、高剂量组的脾指数均明显升高,与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,胸腺指数和体重无明显变化。建立小鼠S-180实体瘤模型,灌胃给予阿魏乙酸乙酯部位10天后,阿魏低、中、高剂量组小鼠肿瘤生长抑制率分别为40.43%、50.86%、58.20%,阿魏低、中、高剂量组的脾指数均明显升高,与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）,胸腺指数和体重无明显变化。5.流式细胞术测得阿魏乙酸乙酯部位作用HCT116细胞后,将细胞周期阻滞在G0/G1与S期;Hoechst33258染色法、透射电镜观察到HCT116细胞形态不完整,核染色质凝聚且边缘化,可见凋亡小体。应用荧光实时定量PCR的方法,检测到EGFR、PI3Kp85基因的相对表达量与空白对照组相比差异无统计学意义,PTEN、p53基因表达明显增高,Akt1、mTOR、Bcl-xl基因表达明显降低,与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。应用Western Blot的方法,检测到PTEN、p53蛋白表达明显增高,mTOR、Bcl-xl蛋白表达明显降低,与空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1.通过体外细胞筛选得出阿魏乙酸乙酯部位抗氧化、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡效果较好,浸膏得率较高,有一定的开发应用价值,因此确定为阿魏抗肿瘤活性部位。2.阿魏乙酸乙酯部位含药血清对HCT116细胞增殖抑制作用较强,阿魏乙酸乙酯部位对HCT116细胞的迁移、侵袭均有抑制作用,可能是通过影响PI3K-Akt信号转导途径来发挥作用的。3.阿魏乙酸乙酯部位可延长小鼠S-180腹水瘤模型的生存时间,阿魏乙酸乙酯部位对小鼠S-180实体瘤模型的肿瘤生长抑制率≥40%,并经统计学处理（P<0.05）,表明有抗肿瘤作用。
赵思伟[7]（2014）在《石蒜碱依赖Caspase途径诱导白血病细胞凋亡的研究》文中研究说明生物碱（alkaloid）广泛存在于自然界中,是一类碱性的含氮有机化合物,大多数生物碱含有复杂的氮环结构,如吡啶,吲哚,喹啉,嘌呤等,也有少数是胺类化合物。生物碱的发现始于19世纪初,是人们研究的最早而且最多的一类天然有机化合物,目前已发现的生物碱有6000余种,并且每年又以大约100多种的速度递增。生物碱类化合物大多数具有生理活性,它们经常是许多中草药的有效成分。生物碱提取与纯化的重要依据就是它的溶解性能,它们的溶解度与溶剂种类、极性基团的数目及有无和生物碱分子中氮原子的存在形式都有密切关系。根据生物碱在水和脂类溶剂中的溶解情况可以将生物碱分为脂溶性和水溶性生物碱。石蒜碱广泛存在于石蒜科植物中,为吡咯幷菲啶类生物碱,具有抑制抗肿瘤、降压、抗病毒、抑制乙酰胆碱酯酶等多种药理活性,近年来对于石蒜碱抗肿瘤作用的研究越来越多,但是对白血病细胞抑制作用和机制的研究仍没有在国内发现,所以本实验主要研究了石蒜碱诱导人慢性髓原白血病细胞K-562凋亡的形态学变化及其机制。本实验首先采用MTT法研究羟基喜树碱对K-562的抑制作用,发现其能显着的抑制K-562细胞生长,作用48h的IC50为4μg/mL。采用MTT法观察石蒜碱作用人慢性髓原白血病K-562细胞后,是否对人慢性髓原白血病K-562细胞有生长抑制作用。结果显示,石蒜碱对人慢性髓原白血病K-562细胞有一定的生长抑制作用,作用24h,48h和72h 的 IC50 分别为 30.427μg/mL,22.506μg/mL 和 16μg/mL。进一步采用倒置显微镜和荧光显微镜观察石蒜碱作用后的人慢性髓原白血病细胞K-562的细胞形态,再用流式细胞仪定量实验测定肿瘤细胞凋亡率。在石蒜碱5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL作用人慢性髓原白血病细胞K-562 48h后,在倒置显微镜下（10×40倍）观察细胞形态,阴性对照组细胞细胞生长良好,排列紧密,形状完好。随着给药剂量不断增加,细胞最后呈现明显凋亡形态特征,形态不规则,破碎,细胞生长逐渐变稀疏,贴壁细胞逐渐变少。Hoechst33258染色后的人慢性髓原白血病细胞K-562在荧光显微镜下（10×40倍）观察形态,在石蒜碱分别以5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL作用48h后,阴性对照组染色均匀,细胞生长状态良好且形态规则。石蒜碱组随着给药剂量的增加,依次出现凋亡小体,细胞数量减少等现象。石蒜碱作用人慢性髓原白血病K-562细胞48h后,经流式细胞仪检测凋亡率显示,随给药剂量增加,凋亡率也随之升高。综上三方面实验结果,说明石蒜碱可以诱导人慢性髓原内血病K-562细胞凋亡。采用激光共聚焦扫描显微镜、Caspase-3试剂盒考察石蒜碱作用后K-562细胞的线粒体膜电位的变化和Caspase-3表达的影响。石蒜碱2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL作用人慢性髓原白血病K-562细胞48h后,利用激光共聚焦扫描显微镜定性实验检测线粒体膜电位变化。结果显示,石蒜碱作用于人慢性髓原白血病细胞K-562后,线粒体膜电位降低,且与给药剂量呈正相关。用酶标仪检测石蒜碱作用人慢性髓原白血病细胞K-562蛋白的变化,结果显示,石蒜碱作用人慢性髓原白血病细胞K-562后,Caspase-3蛋白表达量上升。以上研究表明,石蒜碱能够抑制人慢性髓原白血病K-562细胞的生长,导致线粒体膜电位的下降,线粒体受到损伤,膜通透性发生改变,进而促进Caspase-3的释放,诱导K-562细胞发生凋亡。说明线粒体途径很可能是石蒜碱诱导人慢性髓原白血病K-562细胞凋亡的一条通路。
隋云龙[8]（2014）在《爱尔卡因和加替沙星对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究》文中指出由于人们在现代生活节奏下不规律的作息和对电子产品的过度依赖，眼科疾病的发病率近年来呈爆发的趋势。爱尔卡因和加替沙星分别是眼科常用的局部麻醉剂和抗菌药物，在眼科围手术期经常配合使用。随着其应用的普及，其对患者的毒副作用的影响也日益显现，人们普遍开始关注这两种药物的毒副作用。角膜基质层位于整个角膜结构的中间位置，是一层结缔组织，占据整个角膜厚度的90%。其独特结构很大程度上决定了角膜的性质和功能。本文利用实验室自主建立的非转染、无致瘤性的人角膜基质细胞系为实验材料，通过光学显微镜观察、MTT细胞活力检测、AO/EB荧光双染色、提取DNA的琼脂糖凝胶电泳、透射电镜观察、流式细胞仪检测、ELISA实验等手段观察并研究了爱尔卡因和加替沙星这两种药物对体外培养的人角膜基质细胞的影响，并进一步研究其毒性机理，为这两种药物在临床上的安全使用提供参考。将爱尔卡因从临床浓度5g/L开始倍比稀释用于实验，实验结果显示0.078125g/L5g/L浓度的爱尔卡因能引起HCS细胞形态结构的变化，如皱缩变圆、空泡化、脱壁死亡等，其中5g/L和2.5g/L的毒性作用极强。MTT检测表明，0.625g/L5g/L浓度的爱尔卡因处理HCS细胞后，细胞的比活力显着降低，说明这一浓度范围对HCS细胞的毒性作用较强。荧光双染色结果表明0.078125g/L5g/L浓度的爱尔卡因会不同程度地提高HCS细胞的质膜通透性，尤其0.625g/L5g/L的爱尔卡因对HCS细胞影响很大，所有这些影响都有时间和浓度的依赖性。1%琼脂糖凝胶电泳验证了0.625g/L和1.25g/L爱尔卡因能引起HCS细胞发生DNA断片化。用1.25g/L的爱尔卡因处理的HCS细胞的超微结构变化显示，细胞出现了胞质空泡化、染色质凝缩、凋亡小体形成等结构变化，这与发生凋亡的细胞的超微结构变化一致，说明爱尔卡因能诱导HCS细胞发生凋亡。凋亡时相检测结果表明，1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞的16h内，细胞经历了正常-早期凋亡-晚期凋亡的不同时相。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后，细胞周期发生停滞，停留在G1期。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后6h内，细胞的线粒体膜电位显着降低。1.25g/L爱尔卡因处理HCS细胞后，caspase-9首先被激活，激活的caspase-9进一步激活caspase-3，表明爱尔卡因处理后的HCS细胞可能发生了线粒体参与介导的细胞凋亡，但还有待进一步的研究。加替沙星的实验结果显示0.375g/L3g/L的加替沙星会引起HCS细胞形态结构的变化，如皱缩变圆、空泡化、脱壁死亡等，其中1.5g/L3g/L的毒性作用较大。MTT检测表明，0.375g/L3g/L浓度的加替沙星处理HCS细胞后，细胞的比活力显着降低，说明这一浓度范围对HCS细胞的毒性作用较强。0.375g/L3g/L浓度的加替沙星会不同程度地提高HCS细胞的质膜通透性，尤其1.5g/L和3g/L的加替沙星对HCS细胞影响很大，所有这些影响都有时间和浓度的依赖性。1%琼脂糖凝胶电泳验证了0.75g/L和1.5g/L替沙星能引起HCS细胞发生DNA断片化。用1.5g/L的加替沙星处理的HCS细胞的超微结构变化显示，细胞出现了胞质空泡化、染色质凝缩、凋亡小体形成等结构变化，这与发生凋亡的细胞的超微结构变化一致，说明加替沙星诱导HCS细胞发生凋亡。凋亡时相检测结果表明，1.5g/L加替沙星处理HCS细胞的12h内，细胞经历了正常-早期凋亡-晚期凋亡的不同时相变化。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后，细胞周期发生停滞，停留在G1期。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后6h内，细胞的线粒体膜电位显着降低。1.5g/L加替沙星处理HCS细胞后，caspase-9首先被激活，激活的caspase-9进一步激活caspase-3，表明加替沙星处理后的HCS细胞可能发生了线粒体参与介导的细胞凋亡，但还有待进一步的研究。本文证实了临床使用浓度的爱尔卡因和加替沙星对角膜基质细胞具有极强的毒性，因此临床上对着两种药物的使用应该更加谨慎，尽量降低其使用浓度和使用频率。同时作为一种评价眼科药物毒性的高效简便的材料，体外培养的HCS细胞可以为新型眼科药物的研发提供体外实验依据。
牛红军,李邦东,孙昊[9]（2014）在《抗肿瘤药物体外筛选技术研究进展》文中认为化学药物治疗在肿瘤治疗中占有重要地位。抗肿瘤药物体外筛选技术是从数量庞大的候选化合物中筛选理想的抗肿瘤药物的重要手段。本文综述了各种抗肿瘤药物体外筛选技术的原理、操作要点和各自的优缺点,并简要介绍了各技术的实际应用,旨在为开发抗肿瘤药物提供理论依据和方法学指导。
樊廷俊,随蓓蓓,王清扬,温茜,孙倩,于苗苗,葛源[10]（2013）在《噻吗心安对人角膜内皮细胞的影响作用研究》文中研究表明目的:揭示抗青光眼药物噻吗心安（timolol maleate）对体外培养人角膜内皮（HCE）细胞的影响作用,为其眼科临床安全用药提供实验依据。方法:用不同浓度噻吗心安处理体外培养的HCE细胞,在倒置显微镜下观察细胞的生长、增殖和形态变化,利用吖啶橙/溴化乙锭荧光双染色法检测质膜的通透性,利用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的断片化,利用透射电镜观察细胞的超微结构。结果:噻吗心安在0.15625～5g/L的浓度范围内均能不同程度地引起HCE细胞出现不同程度的生长缓慢、数量减少、胞质皱缩、胞内空泡化、变圆脱落、质膜通透性增大、染色质凝缩、DNA断片化和出现凋亡小体等典型的细胞凋亡特征,并具有浓度和时间依赖性。临床使用浓度2.5～5g/L的噻吗心安对HCE细胞的凋亡诱导作用最大,处理28h的凋亡率高达83.23%～96.71%。结论:噻吗心安在0.15625～5g/L的浓度范围内能显着诱导HCE细胞凋亡,临床使用浓度时对HCE细胞的毒性作用极大,在眼科临床中应谨慎使用。
二、三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察（论文提纲范文）
（1）新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 概述 |
| 1.1.1 红枣的起源与分布 |
| 1.1.2 红枣的分类 |
| 1.2 红枣的功能性 |
| 1.2.1 抗氧化和神经保护特性 |
| 1.2.2 抗癌作用 |
| 1.2.3 抗炎症与免疫调节作用 |
| 1.2.4 心脏、肝脏与胃肠道保护作用 |
| 1.2.5 其他生理活性 |
| 1.3 红枣的功能因子及其生物活性 |
| 1.3.1 多酚类化合物 |
| 1.3.2 多糖类化合物 |
| 1.3.3 碱基、核苷和核苷酸类化合物 |
| 1.3.4 三萜烯酸类化合物 |
| 1.4 熊果酸及其功能性研究进展 |
| 1.4.1 熊果酸概述 |
| 1.4.2 熊果酸功能性研究进展 |
| 1.5 本课题研究的意义、主要内容及技术路线 |
| 1.5.1 本课题研究的意义 |
| 1.5.2 本课题研究的主要内容 |
| 1.5.3 本课题研究的技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 新疆红枣功能因子鉴定及多元统计分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验原料 |
| 2.2.2 主要材料和试剂 |
| 2.2.3 主要仪器和设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 红枣功能因子提取 |
| 2.3.2 红枣功能性成分定性与定量分析 |
| 2.3.3 抗氧化活性测定 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 不同品种红枣中三萜烯酸含量 |
| 2.5.2 不同品种红枣中碱基、核苷和环核苷酸含量 |
| 2.5.3 不同品种红枣中黄酮类含量 |
| 2.5.4 不同品种红枣中功能因子多元统计分析 |
| 2.5.5 不同品种红枣叶子多酚类分析 |
| 2.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于细胞氧化损伤模型的红枣功能因子筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 材料和仪器 |
| 3.2.2 耗材和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 苯并芘诱导细胞损伤模型的构建 |
| 3.3.3 不同功能因子对细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.4 功能因子对损伤模型细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.5 功能因子提前干预对损伤模型细胞增殖活性的影响 |
| 3.3.6 单一功能因子对损伤模型细胞抗氧化酶活性的影响 |
| 3.3.7 功能因子对损伤模型细胞活性氧和丙二醛含量的影响 |
| 3.4 统计分析 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 苯并芘诱导细胞损伤模型的构建 |
| 3.5.2 不同功能因子对细胞增殖活性的影响 |
| 3.5.3 不同功能因子组合对细胞增殖活性的影响 |
| 3.5.4 不同功能因子对损伤模型细胞生长的影响 |
| 3.5.5 不同功能因子组合对损伤模型细胞生长的影响 |
| 3.5.6 不同功能因子对ROS及 MDA含量的影响 |
| 3.5.7 不同功能因子对细胞抗氧化酶活性的影响 |
| 3.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 熊果酸对苯并芘诱导的细胞氧化损伤的调控机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 材料和仪器 |
| 4.2.2 主要耗材和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 实验分组 |
| 4.3.3 试验方法 |
| 4.4 统计分析 |
| 4.5 结果与讨论 |
| 4.5.1 熊果酸对细胞周期与凋亡的影响 |
| 4.5.2 熊果酸对细胞8-OHdG含量的影响 |
| 4.5.3 熊果酸对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 4.5.4 LC3自噬的激光扫描共聚焦观察 |
| 4.5.5 自噬小体的透射电镜观察 |
| 4.6 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 熊果酸调控苯并芘致细胞氧化损伤的转录组学分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 .实验仪器和材料 |
| 5.2.1 仪器设备 |
| 5.2.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 试剂配制 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 实验分组 |
| 5.3.4 细胞总RNA的提取及质检 |
| 5.3.5 RNA样本的处理及测序 |
| 5.3.6 测序数据预处理及质量控制 |
| 5.3.7 基因表达水平分析 |
| 5.3.8 差异基因表达分析 |
| 5.3.9 差异表达基因的GO功能注释和KEGG pathway分析 |
| 5.3.10 差异表达基因的RT-PCR验证 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 测序序列质量评估(Fast QC) |
| 5.4.2 基因表达水平分析 |
| 5.4.3 差异表达基因分析 |
| 5.4.4 差异表达基因功能分析 |
| 5.4.5 差异表达基因q RT-PCR验证 |
| 5.4.6 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 1.结论 |
| 2.论文创新点 |
| 3.展望 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 结直肠癌的病因及治疗进展 |
| 1.2 天然药物治疗结直肠癌的研究进展 |
| 1.3 蛇葡萄素的研究进展 |
| 1.4 代谢组学在结直肠癌研究中的应用 |
| 1.5 凋亡和自噬在肿瘤发生发展中的作用 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 蛇葡萄素体外抗结直肠癌作用研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 2.2.3 增殖抑制实验 |
| 2.2.4 细胞克隆实验 |
| 2.2.5 细胞创伤愈合实验 |
| 2.2.6 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MTT法检测不同浓度AMP对人结直肠癌细胞增殖的影响 |
| 2.3.2 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞克隆的影响 |
| 2.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116、SW480 细胞迁移的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 蛇葡萄素抗人结直肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤药效实验 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 3.2.2 分组及给药方法 |
| 3.2.3 检测指标 |
| 3.2.4 统计学方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物体重的影响 |
| 3.3.2 AMP对 HCT-116 细胞裸鼠移植瘤模型动物瘤体积的影响 |
| 3.3.3 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物瘤重及抑瘤率的影响 |
| 3.3.4 AMP对人结肠癌HCT-116细胞移植瘤动物脏器系数的影响 |
| 3.3.5 人结肠癌HCT-116细胞移植瘤模型动物主要脏器组织切片HE染色结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 基于代谢组学研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 样品前处理 |
| 4.2.2 LC-MS/MS分析 |
| 4.2.3 数据统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 样本代谢质谱TIC图 |
| 4.3.2 偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.3 正交偏最小二乘判别分析结果 |
| 4.3.4 单变量统计分析结果 |
| 4.3.5 显着性差异代谢物 |
| 4.3.6 层次聚类分析结果 |
| 4.3.7 相关系数矩阵热图 |
| 4.3.8 KEGG通路富集分析结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 蛇葡萄素对人结直肠癌细胞凋亡和自噬的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细胞培养 |
| 5.2.2 受试药配制 |
| 5.2.3 人结肠癌HCT-116细胞裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 5.2.4 动物分组及给药方法 |
| 5.2.5 流式细胞仪分析细胞周期 |
| 5.2.6 流式细胞仪分析AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞凋亡的影响 |
| 5.2.7 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.2.8 AO染色观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞自噬的影响 |
| 5.2.9 透射电镜观察HCT-116细胞自噬 |
| 5.2.10 Western-blotting观察AMP对人结肠癌HCT-116、SW480细胞及移植瘤裸鼠瘤块组织中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax、Cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3、Atg5、Beclin-1表达的影响 |
| 5.2.11 统计学方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 AMP对人结肠癌细胞周期的影响 |
| 5.3.2 AMP对人结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 5.3.3 倒置显微镜观察细胞形态 |
| 5.3.4 荧光显微镜和透射电镜观察细胞自噬情况 |
| 5.3.5 细胞及瘤块组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.3.6 细胞及瘤块组织中自噬相关蛋白的表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 自噬在蛇葡萄素诱导人结肠癌细胞凋亡中的作用以及相关分子机制研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞培养 |
| 6.2.2 药物及主要试剂配制 |
| 6.2.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞增殖的影响 |
| 6.2.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对结肠癌细胞凋亡的影响 |
| 6.2.5 AO染色观察AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.2.6 Western-blotting观察自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡和自噬蛋白表达的影响 |
| 6.2.7 统计学方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞增殖的影响 |
| 6.3.2 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡的影响 |
| 6.3.3 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.4 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬的影响 |
| 6.3.5 AMP联合自噬抑制剂和促进剂对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 6.3.6 AMP对 PI3K/Akt/mTOR信号转导途径的影响 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 7.1 主要结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）Caspase-1，IL-1β和IL-18调控在云芝糖肽（PSP）诱导的Molt-4细胞死亡机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 云芝糖肽研究进展 |
| 1.2.1 云芝糖肽来源 |
| 1.2.2 云芝糖肽的结构组成 |
| 1.2.3 云芝糖肽的生物活性 |
| 1.3 细胞死亡方式研究现状 |
| 1.3.1 细胞凋亡 |
| 1.3.2 细胞自噬 |
| 1.3.3 细胞胀亡 |
| 1.3.4 坏死性凋亡 |
| 1.3.5 类凋亡 |
| 1.3.6 有丝分裂灾难 |
| 1.3.7 methuosis |
| 1.3.8 细胞焦亡 |
| 1.4 课题研究内容与意义 |
| 第2章 云芝糖肽诱导的细胞形态与直径变化 |
| 2.1 实验材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 PSP对Molt-4细胞增殖的影响 |
| 2.2.2 显微镜观察PSP诱导细胞后的形态变化特征 |
| 2.2.3 PSP对细胞直径的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 细胞焦亡样变化及与凋亡关系研究 |
| 3.1 实验材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 Caspase-1激活的荧光显微镜观察 |
| 3.2.2 流式细胞术分析caspase-1激活比率 |
| 3.2.3 Caspase-1抑制剂干预结果 |
| 3.2.4 Caspase-1激活与细胞大小的相关性研究 |
| 3.2.5 Annexin V与 Caspase-1激活的相关性分析 |
| 3.2.6 IL-1β、IL-18基因表达的水平分析结果 |
| 3.2.7 DCFH-DA染料法检测活性氧簇ROS产生结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（4）蟾蜍灵诱导三阴性乳腺癌耐药细胞程序性坏死和逆转耐药的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:蟾蜍灵能诱导三阴性乳腺癌细胞发生程序性坏死 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 主要方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测活性细胞比例 |
| 2.2.3 Annexin V-FITC/PI标记流式细胞仪检测细胞状态 |
| 2.2.4 PI法检测死亡细胞比例 |
| 2.2.5 Hoechst33342/PI双染激光共聚焦显微镜检测细胞死亡模式 |
| 2.2.6 活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.7 透射电镜观察细胞形态 |
| 2.3 数据统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 蟾蜍灵对三阴性乳腺癌亲本细胞系MDA-MB-231和耐药细胞系MDA-MB-231/ADR、MDA-MB-231/DOC均存在剂量/时间依赖性杀伤作用 |
| 3.1.1 蟾蜍灵对亲本细胞系MDA-MB-231和耐药细胞系MDA-MB-231/ADR、MDA-MB-231/DOC均存在剂量依赖性杀伤作用 |
| 3.1.2 蟾蜍灵对MDA-MB-231 细胞系和耐药细胞系MDA-MB-231/ADR、MDA-MB-231/DOC均存在时间依赖性抑制作用 |
| 3.2 蟾蜍灵通过诱导程序性坏死杀伤MDA-MB-231/ADR细胞 |
| 3.2.1 Annexin V-FITC/PI双染色法观察蟾蜍灵对MDA-MB-231/ADR细胞的杀伤模式 |
| 3.2.2 Hoechst33342/PI双染法观察细胞死亡模式 |
| 3.2.3 程序性坏死抑制剂Nec-1 可以以剂量依赖的方式抑制蟾蜍灵对MDA-MB-231/ADR细胞的杀伤作用 |
| 3.2.4 凋亡抑制剂z-VAD-fmk也能一定程度抑制蟾蜍灵对MDA-MB-231/ADR细胞的杀伤作用 |
| 3.2.5 蟾蜍灵通过诱导ROS的产生杀伤MDA-MB-231/ADR细胞 |
| 3.2.6 透射电镜下观察蟾蜍灵诱导MDA-MB-231/ADR细胞死亡的形态学改变 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:蟾蜍灵诱导三阴性乳腺癌细胞发生程序性坏死与线粒体功能的相关性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 主要方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测活性细胞比例 |
| 2.2.3 活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.4 细胞线粒体膜电位检测(JC-1) |
| 2.3 数据统计处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 蟾蜍灵与MDA-MB-231及MDA-MB-231/ADR细胞内ROS含量的变化存在剂量依赖关系 |
| 3.2 蟾蜍灵增加细胞内ROS含量并非通过PLA2/LOXs途径实现 |
| 3.3 蟾蜍灵导致三阴性乳腺癌线粒体膜电位下降 |
| 3.4 蟾蜍灵诱导的ROS升高来源于线粒体呼吸链 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:蟾蜍灵能逆转三阴性乳腺癌细胞多药耐药 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 抗体 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 常用实验试剂配置 |
| 2.2 主要方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测活性细胞比例 |
| 2.2.3 PI法检测死亡细胞比例 |
| 2.2.4 活性氧(ROS)检测 |
| 2.2.5 Real-time PCR |
| 2.2.6 Western blot |
| 2.2.7 实验动物观察 |
| 2.3 数据统计处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 无毒剂量蟾蜍灵逆转三阴性乳腺癌细胞多药耐药 |
| 3.1.1 无毒剂量的蟾蜍灵能逆转MDA-MB-231/ADR细胞系对阿霉素耐药 |
| 3.1.2 无毒剂量的蟾蜍灵能逆转MDA-MB-231/DOC细胞系对多西紫杉醇耐药 |
| 3.2 与无毒剂量蟾蜍灵联合用药的杀伤模式 |
| 3.3 无毒剂量蟾蜍灵能够降低MDA-MB-231/ADR细胞耐药蛋白的表达 |
| 3.4 蟾蜍灵可以在体内环境下逆转MDA-MB-231/ADR耐药蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本论文创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（5）毛钩藤碱（Hirsutine）通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hirsutine选择性诱导肺癌细胞凋亡效应研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Hirsutine诱导肺癌细胞线粒体损伤上游调控机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 Hirsutine对裸鼠移植瘤的体内抗肺癌效应研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 ROCK蛋白在肿瘤中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）新疆阿魏抗肿瘤活性部位的筛选及作用机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 新疆阿魏各极性部位抗肿瘤活性的筛选 |
| 实验一 新疆阿魏抗肿瘤有效部位的筛选 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验二 新疆阿魏不同极性部位抗氧化的研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 新疆阿魏对肿瘤细胞的血清药理学研究 |
| 实验一 阿魏乙酸乙酯部位HPLC图谱建立及特征成分含量检测 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验二 血清药理学考察含药血清对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分 新疆阿魏乙酸乙酯部位对肿瘤细胞迁移及侵袭的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第四部分 新疆阿魏乙酸乙酯部位的急性毒性及药效学研究 |
| 实验一 新疆阿魏乙酸乙酯部位的急性毒性实验研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4 小结 |
| 实验二 新疆阿魏乙酸乙酯部位对S-180 腹水瘤的药效学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验三 新疆阿魏乙酸乙酯部位对S-180 实体瘤的药效学研究 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第五部分 新疆阿魏乙酸乙酯部位抗肿瘤作用的机理研究 |
| 实验一 新疆阿魏乙酸乙酯部位对HCT116 细胞周期与亚显微结构的影响…… |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验二 荧光实时定量PCR考察新疆阿魏对PI3K-Akt通路相关基因的影响… |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 实验三 Western Blot检测新疆阿魏对PI3K-Akt通路相关蛋白的影响 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 2.实验结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 不足之处 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述1 |
| 参考文献 |
| 综述2 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（7）石蒜碱依赖Caspase途径诱导白血病细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 白血病研究现状 |
| 1.1.1 白血病概述 |
| 1.1.2 白血病的发病机制研究 |
| 1.1.3 白血病的治疗现状 |
| 1.1.4 天然药物成分抗白血病研究 |
| 1.2 生物碱研究概述 |
| 1.2.1 石蒜碱的研究概述 |
| 1.3 生物碱抗肿瘤研究概述 |
| 1.4 生物碱抗肿瘤作用机制研究 |
| 1.4.1 抑制肿瘤细胞生长 |
| 1.4.2 抑制DNA拓扑异构酶活性 |
| 1.4.3 抑制微管蛋白的活性 |
| 1.4.4 诱导肿瘤细胞分化 |
| 1.4.5 诱导肿瘤细胞分化 |
| 1.5 细胞凋亡 |
| 1.5.1 细胞凋亡的概念 |
| 1.5.2 细胞凋亡的形态学特征 |
| 1.5.3 细胞凋亡的意义 |
| 1.5.4 线粒体途径与细胞凋亡 |
| 1.6 本课题来源及研究的目的与意义 |
| 1.6.1 课题来源 |
| 1.6.2 课题研究的目的与意义 |
| 1.7 论文研究的内容 |
| 1.7.1 体外培养K-562细胞 |
| 1.7.2 检测石蒜碱对K-562细胞的抑制作用 |
| 1.7.3 石蒜碱诱导K-562细胞凋亡的研究 |
| 1.7.4 石蒜碱诱导K-562细胞凋亡机制的研究 |
| 2 酶标仪检测石蒜碱对K-562细胞增殖作用的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料、仪器及试剂 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 羟基喜树碱对K-562细胞的生长抑制作用 |
| 2.3.2 石蒜碱对K-562细胞的生长抑制作用 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 石蒜碱诱导K-562细胞凋亡的形态学观察 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 试剂配置 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 倒置显微镜观察石蒜碱对K-562细胞形态学的影响 |
| 3.3.4 荧光显微镜观察石蒜碱对K-562细胞形态学的影响 |
| 3.4 结果分析 |
| 3.4.1 倒置显微镜观察石蒜碱对K-562细胞形态学的影响 |
| 3.4.2 荧光显微镜观察石蒜碱对K-562细胞形态学的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 石蒜碱对K-562细胞凋亡率的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 试剂配置 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 流式细胞仪检测石蒜碱诱导K-562细胞的凋亡率 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 石蒜碱诱导K-562细胞凋亡机制的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验材料、仪器及试剂 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 激光共聚焦显微镜检测K-562细胞中线粒体膜电位变化 |
| 5.3.2 酶标仪检测石蒜碱对K-562细胞Caspase-3蛋白活性的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）爱尔卡因和加替沙星对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 细胞凋亡 |
| 1.1 细胞凋亡的基本概念 |
| 1.2 细胞凋亡的过程及特征 |
| 1.3 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.3.1 外源途径 |
| 1.3.2 内源途径 |
| 1.3.3 内质网途径 |
| 1.3.4 不依赖 caspase 的凋亡途径 |
| 1.4 细胞凋亡的意义 |
| 1.5 细胞凋亡的检测方法 |
| 1.5.1 观察细胞的形态改变 |
| 1.5.2 鉴定 DNA 的降解 |
| 1.5.3 流式细胞术 |
| 2 人角膜基质 |
| 2.1 角膜概述 |
| 2.2 人角膜基质的结构 |
| 2.3 人角膜基质的功能 |
| 3 药物概述 |
| 3.1 爱尔卡因概述 |
| 3.2 加替沙星概述 |
| 4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 爱尔卡因对人角膜基质细胞的影响作用研究 |
| 1 实验材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 几种主要溶液的配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验前的准备 |
| 2.1.1 人角膜基质细胞体外培养方法 |
| 2.1.2 人角膜基质细胞的接种 |
| 2.1.3 爱尔卡因母液的倍比稀释 |
| 2.2 不同浓度爱尔卡因处理HCS细胞的实验方法 |
| 2.2.1 用不同浓度的爱尔卡因处理HCS细胞的形态学观察 |
| 2.2.2 用不同浓度的爱尔卡因处理HCS细胞的MTT检测 |
| 2.2.3 用不同浓度的爱尔卡因处理HCS细胞的荧光双染色 |
| 2.2.4 爱尔卡因处理HCS细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 爱尔卡因处理HCS细胞的电镜观察 |
| 2.2.6 爱尔卡因处理HCS细胞凋亡时相的检测 |
| 2.2.7 爱尔卡因处理HCS细胞的细胞周期检测 |
| 2.2.8 爱尔卡因处理HCS细胞的线粒体膜电位检测 |
| 2.2.9 爱尔卡因处理HCS细胞的caspase表达检测 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同浓度爱尔卡因处理HCS细胞的形态变化 |
| 3.2 不同浓度爱尔卡因处理HCS细胞的MTT检测 |
| 3.3 不同浓度爱尔卡因处理HCS细胞的质膜通透性变化 |
| 3.4 爱尔卡因处理HCS细胞的DNA断片化 |
| 3.5 爱尔卡因处理HCS细胞的超微结构变化 |
| 3.6 爱尔卡因处理HCS细胞的凋亡时相检测 |
| 3.7 爱尔卡因处理 HCS 细胞的细胞周期检测 |
| 3.8 爱尔卡因处理HCS细胞的线粒体膜电位检测 |
| 3.9 爱尔卡因处理 HCS 细胞的 caspase 表达变化检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 加替沙星对人角膜基质细胞的影响作用研究 |
| 1 实验材料与用品 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验药品 |
| 1.4 常用溶液的配制方法 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验前的准备 |
| 2.1.1 人角膜基质细胞体外培养方法 |
| 2.1.2 人角膜基质细胞的接种 |
| 2.1.3 加替沙星母液的倍比稀释 |
| 2.2 不同浓度加替沙星处理HCS细胞的实验方法 |
| 2.2.1 用不同浓度的加替沙星处理HCS细胞的形态学观察 |
| 2.2.2 用不同浓度的加替沙星处理HCS细胞的MTT检测 |
| 2.2.3 用不同浓度的加替沙星处理HCS细胞的荧光双染色 |
| 2.2.4 加替沙星处理HCS细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 加替沙星处理HCS细胞的电镜观察 |
| 2.2.6 加替沙星处理HCS细胞凋亡时相的检测 |
| 2.2.7 加替沙星处理HCS细胞的细胞周期检测 |
| 2.2.8 加替沙星处理HCS细胞的线粒体膜电位检测 |
| 2.2.9 加替沙星处理HCS细胞的caspase表达检测实验 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 不同浓度加替沙星处理HCS细胞的形态变化 |
| 3.2 不同浓度加替沙星处理HCS细胞的MTT检测 |
| 3.3 不同浓度加替沙星处理HCS细胞的质膜通透性变化 |
| 3.4 加替沙星处理HCS细胞的DNA断片化 |
| 3.5 加替沙星处理HCS细胞的超微结构变化 |
| 3.6 加替沙星处理HCS细胞的凋亡时相检测 |
| 3.7 加替沙星处理HCS细胞的细胞周期检测 |
| 3.8 加替沙星处理HCS细胞的线粒体膜电位检测 |
| 3.9 加替沙星处理HCS细胞的caspase表达变化检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 发表的学术论文 |
（9）抗肿瘤药物体外筛选技术研究进展（论文提纲范文）
| 1 前言 |
| 2 细胞形态学观察法 |
| 2.1 相差显微镜法 |
| 2.2 电子显微镜法 |
| 3 细胞计数法 |
| 4 比色法 |
| 4.1 染料摄取法 |
| 4.2 MTT法 |
| 4.3 XTT法 |
| 4.4 CCK-8法 |
| 4.5 Alamar blue法 |
| 4.6 酸性磷酸酶法 |
| 4.7 磺酰罗丹明染色法 |
| 4.8 苏木素法 |
| 4.9 三磷酸腺苷法 |
| 5 分子标记法 |
| 5.1 Brd U法 |
| 5.2 Ed U法 |
| 6 放射性同位素掺入法 |
| 7 集落形成法 |
（10）噻吗心安对人角膜内皮细胞的影响作用研究（论文提纲范文）
| 0引言 |
| 1材料和方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 2结果 |
| 2.1 HCE细胞的光镜观察 |
| 2.2 AO/EB荧光双染色结果 |
| 2.3 HCE细胞DNA的琼脂糖凝胶电泳结果 |
| 2.4 HCE细胞的透射电镜观察结果 |
| 3讨论 |
四、三磷酸腺苷诱导人白血病细胞U937凋亡的电镜观察（论文参考文献）
- [1]新疆红枣功能因子综合分析及对苯并芘诱导细胞氧化损伤的调控机制研究[D]. 宋丽军. 华南理工大学, 2020(01)
- [2]基于代谢组学及自噬和凋亡调控途径研究蛇葡萄素抑制结直肠癌生长的作用机制[D]. 朱丽娟. 兰州大学, 2020(01)
- [3]Caspase-1，IL-1β和IL-18调控在云芝糖肽（PSP）诱导的Molt-4细胞死亡机制中的作用研究[D]. 黄誉娴. 上海师范大学, 2019(08)
- [4]蟾蜍灵诱导三阴性乳腺癌耐药细胞程序性坏死和逆转耐药的机制研究[D]. 刘晓丹. 中国医科大学, 2019(01)
- [5]毛钩藤碱（Hirsutine）通过ROCK1/PTEN/PI3K/GSK3β通路诱导肺癌细胞凋亡研究[D]. 张蓉. 中国人民解放军陆军军医大学, 2018(03)
- [6]新疆阿魏抗肿瘤活性部位的筛选及作用机理研究[D]. 张海英. 新疆医科大学, 2016(05)
- [7]石蒜碱依赖Caspase途径诱导白血病细胞凋亡的研究[D]. 赵思伟. 哈尔滨商业大学, 2014(05)
- [8]爱尔卡因和加替沙星对人角膜基质细胞的凋亡诱导作用研究[D]. 隋云龙. 中国海洋大学, 2014(01)
- [9]抗肿瘤药物体外筛选技术研究进展[J]. 牛红军,李邦东,孙昊. 生命科学仪器, 2014(Z1)
- [10]噻吗心安对人角膜内皮细胞的影响作用研究[J]. 樊廷俊,随蓓蓓,王清扬,温茜,孙倩,于苗苗,葛源. 国际眼科杂志, 2013(06)