一、斑点酶联免疫吸附试验检测伤寒特异性抗体（论文文献综述）
靳纬坤[1]（2021）在《牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用》文中研究说明研究背景及目的:片形吸虫病对畜牧业危害严重,广西地区牛大片形吸虫病感染率较高。本研究旨在利用F22及其所含的关键分子作为诊断抗原建立起牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,并利用该方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查;同时对本地区使用化学药物驱虫效果进行初步评估,为广西地区牛大片形吸虫病的防控提供借鉴。此外,国内外尚缺乏牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒及胶体金快速诊断试纸条,本研究可为今后牛大片形吸虫病ELISA诊断试剂盒、胶体金快速诊断试纸条的研制奠定基础。研究方法与结果:1、本研究制备了F22并对其进行质谱鉴定,从中选取Fg SAP-2、Fg Cat L2、Fg LAP三种诊断抗原候选分子进行了原核表达。2、从三种分子中筛选出r Fg SAP-2作为诊断抗原并与F22一起进行了各项反应条件的优化从而建立起牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法并进行敏感性、特异性、稳定性及早期诊断价值的检测并与传统的Fg ESP作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法进行比较,表明三种诊断方法均与前后盘吸虫、巴贝斯虫无交叉反应且稳定性均较好。其中F22作为诊断抗原检测的敏感性最高,假阴性率为0%。Fg ESP、F22、r Fg SAP-2作为诊断抗原均能在感染后2周检测到抗体,其中F22在感染后2周OD450nm值最大且极显着高于Fg ESP、r Fg SAP-2的OD450nm值（P<0.01）,提示F22具有更高的早期诊断价值。3、本研究成功研制出F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条并证明其具有良好的敏感性、特异性、稳定性,在感染后2周即可检测到抗体,可以应用于牛大片形吸虫病的现场快速诊断。4、利用F22和Fg ESP作为诊断抗原的间接ELISA法对广西地区牛片形吸虫病进行流行病学调查发现,阳性率分别为68.37%和57.30%。利用上述两种间接ELISA法及胶体金试纸条对A牛场牛血清进行检测,检测的阳性率分别仅为6.15%、4.31%、2.00%。利用建立的方法对A牛场的片形吸虫病用药方案进行效果评价,初步表明其用药方案具有较好的驱虫效果。结论:本研究建立了牛大片形吸虫病免疫学诊断方法,即F22作为诊断抗原的间接ELISA法及胶体金快速诊断试纸条,均具有较好的敏感性、特异性、稳定性,并能用于牛大片形吸虫病早期诊断,为今后牛大片形吸虫病ELISA试剂盒及胶体金快速诊断试纸条研制奠定了基础。利用建立的方法对广西地区牛大片形吸虫病进行流行病学调查并对A牛场的用药方案进行效果评价,结果表明广西地区牛大片形吸虫感染情况比较严重,A牛场的用药方案具有较好的驱虫效果,该用药方案可供广西地区各牛场借鉴参考。
毕锦[2]（2021）在《免疫斑点法快速诊断视神经脊髓炎谱系疾病的临床应用研究》文中研究说明背景及目的视神经脊髓炎谱系疾病（Neuromyelitis optica spectrum disorder,NMOSD）是一种主要累及视神经和脊髓、以高复发率和高致残性为特点的中枢炎性脱髓鞘性疾病。NMOSD患者自然病史通常为多相病程,且随着发病次数的增加,残疾系数则越高,而早期诊断,尽早干预可提高NMOSD患者生活质量。NMOSD的诊断有赖于患者的临床表现、实验室检查、影像学检查等,其中针对水通道蛋白（Aquaporin-4,AQP4）自身抗体检测至关重要。2005年,AQP4被证明是视神经脊髓炎免疫球蛋白G（NMO-Ig G,或AQP4-Ig G）的抗原靶点,这一发现促进了视神经脊髓炎疾病扩展为视神经脊髓炎谱系疾病,并与MS等其他脱髓鞘疾病分开来。2015年IPND小组NMOSD诊断标准将基于细胞的免疫荧光法（cell-based assay,CBA）作为检测AQP4抗体的金标准;也有一些实验室利用高表达该抗原的神经组织（如猴神经）切片,即间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence assay,IIFA）以检测AQP4抗体。但上述2种检测方法对实验室条件以及检测人员的要求较高,无法应用于基层医院;同时检测的周期较长,无法辅助急症患者的快速诊断。部分实验室使用重组AQP4蛋白作为抗原,利用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测AQP4抗体,但AQP4是一种四聚体的跨膜蛋白,正确的空间构象结构对自身抗体的识别至关重要,而在重组蛋白的表达过程中往往因为翻译折叠不正确,形成错误的构象,影响检测的特异性及灵敏性。本研究所采用的免疫斑点法是利用纯化AQP4-细胞膜蛋白复合物作为抗原以检测患者样本中的特异性AQP4抗体,该方法保留了AQP4空间构象,且检测耗时短,过程不需依赖特殊的仪器设备,只需肉眼判读,对操作人员要求低,适合基层医院推广使用,同时能够实现疾病的快速诊断。本研究旨在验证这种快速、简便的新型AQP4抗体检测方法的敏感性及特异性,推进临床应用。方法选取2019年2月-2020年11月福建医科大学附属第一医院中枢炎性脱髓鞘疾病队列中诊断为NMOSD（AQP4抗体阳性）患者及健康对照受试者233例。所有受试者均经过CBA法对AQP4抗体进行检测,选取阳性组100例,阴性对照组100例随机编盲后进行免疫斑点法检测。本临床试验经过福建医科大学附属第一医院伦理委员会伦理审查,并在Clincial Trail注册（NCT04388072）。结果1、盲法通过免疫斑点法进行AQP4抗体检测,100例阳性组中99例免疫斑点法检测为阳性（99%）,1例阴性（1%）,100例阴性对照组中99例免疫斑点法检测为阴性（99%）、1例抗体检测阳性（1%）。与CBA法检测相比,免疫斑点法敏感性99%（95%CI 0.94～1）,特异性99%（95%CI 0.94～1）,阳性似然比99（95%CI 14～696）,阴性似然比0.01（95%CI 0.001～0.71）,ROC曲线AUC=0.99（95%CI 0.97～1）,kappa系数98%（95%CI 0.953～1）,>75%,认为两种检测方法检测效能一致。2、对免疫斑点法抗体检测结果根据颜色深浅评分,采用Spearman检测血清AQP4抗体滴度进行相关性分析（r=0.523,p<0.001）,具有中等强度相关性。结论免疫斑点法在检测AQP4抗体的效能与CBA法具有一致性,是有潜力的向基层医院推广的AQP4抗体检测试剂盒,有望对NMOSD进行快速精准诊断,以尽快开展干预治疗,防止疾病进一步恶化。免疫斑点法试纸条颜色深浅与血清AQP4抗体滴度存在相关性,可预测患者血清AQP4抗体滴度。
许彤[3]（2021）在《表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究》文中认为背景包虫病（Hydatidosis）是由棘球绦虫的幼虫寄生宿主器官引起的一种人兽共患病。该病主要流行于中国、中亚、中东、南美和欧洲等地区。其中由细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,E.g）寄生引起的囊型包虫病（Cystic echinococcus,CE）在我国广泛流行,导致严重疾病负担及畜牧业损失。牛羊等家畜为细粒棘球绦虫的中间宿主,犬科动物是终末宿主,人作为中间宿主偶发感染。其临床症状是由幼虫感染中间宿主,导致肝肺等脏器实质性病变,损害器官功能,或包囊破裂导致过敏性休克或继发性细菌感染。CE每年导致1.93万例死亡,以及87.1万残疾调整生命年（Disable-adjusted Life-years,DALYs）,每年与该病相关的治疗费用及畜牧业损失约为30亿美元。给中间宿主接种疫苗以切断其生活史发育环节是一种更实用的有效控制细粒棘球绦虫传播的选择。目前由细粒棘球蚴表达的EG95蛋白制成的亚单位疫苗在一些CE流行地区进行实验证明该抗原安全有效。但该疫苗接种程序复杂,多次接种且需要佐剂才能达到预期的免疫保护效果,社会成本高。因此,迫切需要研制更廉价、更高效的细粒棘球绦虫疫苗。同时,狂犬病（Rabies）是一种严重的人兽共患病,由弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）的狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）所引起,所有的温血动物均可感染,病死率几乎为100%。该病呈全球流行,主要发生在发展中国家,严重威胁公共卫生安全。由于犬源狂犬病控制不足和野生动物狂犬病的蔓延,我国边境牧区羊、牛等家畜狂犬病近年来迅速增加,不但造成畜牧业经济损失,而且给农民和兽医带来潜在的感染风险。世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）建议在狂犬病流行区对牛羊等进行狂犬病疫苗免疫,并在一些国家成功实施。RABV作为表达外源基因的良好载体,具有独特优势,已有很多研究者以RABV为载体研制多种表达各类外源病毒抗原蛋白的重组疫苗。综上所述,为避免包虫病和狂犬病双重流行对边境牧区牛羊造成严重的经济损失,亟待研制一种安全有效的可以同时预防牛羊细粒棘球绦虫和RABV的二联疫苗。目的1.以狂犬病病毒弱毒株LBNSE为载体表达细粒棘球蚴EG95蛋白,利用反向遗传技术构建重组病毒LBNSE-EG95。2.通过体内和体外实验,评价LBNSE-EG95的生物学特性、致病性、保护性和免疫原性,评估重组病毒LBNSE-EG95作为囊型包虫病和狂犬病的候选二联疫苗的潜力。方法1.重组狂犬病病毒LBNSE-EG95的构建与鉴定。将细粒棘球蚴EG95基因插入LBNSE感染性克隆伪基因区,获得重组感染性克隆,转染BHK-21细胞拯救获得重组病毒LBNSE-EG95。通过RT-PCR、免疫荧光实验（IFA）、流式细胞术和Western blot等鉴定该重组病毒的生物学特性。2.重组病毒LBNSE-EG95的致病性分析。雌性BALB/c小鼠（6-8周）随机分为实验组、对照组、空白组,分别经后肢肌肉免疫重组病毒LBNSE-EG95、亲本毒株LBNSE和DMEM,连续21天观察监测小鼠的体重变化、饮食情况和精神状况等。3.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生特异性保护性抗体能力检测。免疫小鼠后第2、4、8周采集血清,利用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）检测RABV中和抗体效价,用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测EG95特异性抗体水平。4.重组病毒LBNSE-EG95的保护性评价。免疫小鼠后4周,经后肢肌肉注射RABV。连续21天观察监测感染后小鼠的存活率、体重变化、饮食情况和临床症状等,评价重组病毒对小鼠的保护作用。5.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,通过流式细胞术检测LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结募集/激活DCs能力。6.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠淋巴结和外周血募集/激活B淋巴细胞能力检测。免疫后第3、6、9天收集小鼠腹股沟淋巴结淋巴细胞,并且在免疫后第7、14、28天收集外周血,通过流式细胞术检测LBNSE-EG95诱导小鼠募集/激活B淋巴细胞的能力。7.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞能力检测。免疫后第7、14天收集小鼠脾脏淋巴细胞,通过流式细胞术检测在RABV和EG95蛋白特异性刺激下,LBNSE-EG95诱导小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4的特异性CD4+和CD8+T细胞的能力。在免疫后第28天分离小鼠脾脏淋巴细胞,利用酶联免疫斑点实验（ELISpot）检测小鼠产生分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞的能力。8.重组病毒LBNSE-EG95诱导小鼠产生的特异性抗体亚型。通过ELISA检测在RABV和EG95特异性抗原刺激下,LBNSE-EG95免疫小鼠4周后诱导产生特异性IgG2a/IgG1的滴度。结果1.重组病毒LBNSE-EG95拯救成功,通过IFA、RT-PCR、流式细胞术和Western blot等实验鉴定表明重组病毒可高效及正确的表达目的蛋白EG95。2.免疫后连续观察21天,与空白组和LBNSE对照组小鼠相比,LBNSE-EG95组小鼠体重无明显差异,且三组小鼠体重都呈现整体上升趋势,且生长状态良好,未出现异常情况。3.抗体检测结果表明,LBNSE-EG95可诱导小鼠产生高效价的RABV的中和抗体和高水平的EG95特异性抗体。4.RABV感染实验表明,LBNSE-EG95与LBNSE组可对RABV的攻击提供完全保护,而空白组小鼠均发病。5.流式细胞实验结果显示,相比空白组,LBNSE-EG95可诱导小鼠体内募集/激活更多DCs。6.流式细胞实验结果显示,相比空白组,LBNSE-EG95可诱导小鼠淋巴结中募集/活化更多B细胞,并在外周血中持续募集活化B细胞。7.流式细胞实验结果显示,LBNSE-EG95诱导小鼠产生更多分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞。ELISpot实验结果显示,LBNSE-EG95组小鼠在EG95蛋白和RABV G蛋白刺激下,可诱导产生更多分泌IFN-γ和IL-4特异性T细胞,明显多于空白组和LBNSE组。8.ELISA实验结果显示,免疫LBNSE-EG95小鼠的免疫应答更倾向于Th1型免疫反应。结论本研究成功构建了表达细粒棘球蚴EG95蛋白的重组狂犬病病毒LBNSE-EG95,该重组病毒安全性高且能诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫和细胞免疫,是预防囊型包虫病和狂犬病的理想候选二联疫苗。
郑雨桐[4]（2021）在《五种立克次体多重PCR-ELISA检测体系的建立》文中认为目的:立克次体（Rickettsia）是革兰阴性原核细胞型微生物,是一类专性寄生于真核细胞内、天然寄生于多种吸血节肢动物体内,如:虱、蚤、蜱、螨等。当机体与立克次体感染的昆虫接触后,引发立克次体病（Rickettsioses）,该类疾病是一种急性发热性人兽共患的自然疫源性疾病。由于传播媒介的特殊性,使得该疾病流行特征为地域性及季节性,但随着国内外旅游业迅速发展,世界各地有关立克次体感染的报道屡见不鲜。在我国,根据广泛的流行病学调查发现,几乎31个省区均有立克次体感染的病例出现;另外,近几年来,世界各地不断发现新型立克次体种类。疾病范围的扩展以及病原体变异的迅速均表明立克次体引发大流行的可能,因此立克次体成为旅游、健康的重大危害之一。不仅如此,立克次体具有潜在的战争生物威胁,因此建立精准、有效的实验室检测、监测方法十分重要。本研究将建立PCR-ELISA反应模型,对5种立克次体进行多重检测,为精准检测立克次体提供理论依据。方法:1、实验前,对立克次体种类进行文献调查,确定本研究所需的病原体。2、选取各病原体特异且保守的目的基因片段,并设计特异性探针及引物。为方便实验,通过重叠延伸PCR方法将所有病原体目的基因片段进行融合,并制备融合基因质粒参考品。3、建立融合基因PCR检测体系,并优化环境条件。4、建立多重PCR-ELISA检测体系,并优化环境条件。5、多重PCR-ELISA检测体系中阴阳性界定值的确定,以及方法学评价。结果:1、通过文献调查,确定了5个我国较为常见的立克次体（普氏立克次体、嗜吞噬细胞无形体、莫氏立克次体、羌虫病东方体、贝氏柯克斯体）,分别确定出目的基因片段后,进行基因融合并构建了融合基因质粒参考品。融合过程中对重叠引物浓度进行优化,发现当重叠引物浓度0.1-0.01μM时,融合基因条带亮度较高,且杂带较少。2、建立融合基因PCR检测体系,并对退火温度、循环次数进行优化,确定了退火温度为60℃,循环数为32次。同时检测体系的特异性及重复性均良好。3、多重PCR-ELISA检测体系建立,同时环境优化结果如下:链酶亲和素浓度为5μg/m L、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体稀释度为1:2000、BSA最佳封闭时间为2 h、地高辛标记的PCR产物与生物素标记的探针杂交温度及时间分别为68℃和5 min、探针浓度为6.25μM、杂交产物与酶标板结合时间为30 min、显色时间为30 min。4、多重PCR-ELISA检测体系OD450阴阳界定值为0.201。方法学评价中发现,5种立克次体的检测灵敏度均明显高于普通PCR方法,同时特异性及重复性良好。另外,完全可以检测出血液中微量的立克次体。结论:本研究通过建立起来的多重PCR-ELISA检测体系,成功检测了5种立克次体,同时该方法的灵敏性及特异性有极大提高,因此是一个多重、及时、快速、有效检测方法。
霍永宝[5]（2020）在《A组链球菌脂质体疫苗的研究》文中认为研究目的:A组链球菌（Group A Streptococcus,GAS）又称为化脓性链球菌（Streptococcus Pyogenes）,是致病力最强的链球菌之一,能产生多种毒素,除引起侵袭性和非侵袭性感染外,反复感染还可以出现感染后的自身免疫性疾病,导致严重的临床后果。尽管青霉素仍然是GAS感染的一线用药,但是治疗失败率高,且近年侵袭性GAS感染率仍逐年上升,给全球带来了沉重的医疗负担,GAS疫苗是预防和治疗疾病最有效的方法。然而细菌血清型众多,且可能与人体正常组织发生交叉反应,给疫苗的研发带来具大的挑战,至今尚未有疫苗批准上市。M蛋白是GAS的主要毒力因素,其结构内含有C区,不同GAS菌株血清型之间序列高度保守,针对该区域研发的疫苗具有广谱性。既往研究显示M蛋白C3区含有最小B细胞表位J8i,将其嵌合于酵母DNA结合蛋白GCN4中获得α螺旋结构,称为J8。前期我们以脂质体为载体已经成功合成出J8-Lipo-DT,近年还发现了与J8具有共同母肽段的p*17。本研究将在J8-Lipo-DT的基础上,分别从抗原肽段、佐剂和免疫方式三方面对GAS疫苗进行全面深入探讨和改进,筛选出理想的疫苗合成方法,搭配合理的给药途径,实现免疫原性的最大化和毒副作用的最小化,力求加快推进GAS疫苗临床试验的进程。研究方法:（1）以J8肽段为基础合成J8-Lipo-DT,通过鼻吸入免疫小鼠,了解对GAS菌株上呼吸道感染的保护性,并应用白细胞介素（interleukin,IL）-1β敲除小鼠,探讨IL-1β在脂质体疫苗诱导免疫中发挥的作用。随后分别通过添加PHAD佐剂以及更换抗原肽为p*17,制备含PHAD的J8相关脂质体疫苗和p*17相关脂质体疫苗,进一步筛选候选疫苗。（2）头对头研究对比p*17-DT/Lipo-PHAD和p*17-DT/CAF01两种结合疫苗的免疫原性和保护性,分别通过菌落计数和流式细胞术方法体外检测疫苗抗血清与GAS菌株的结合能力。（3）采用prime-pull免疫策略对h CD4.IAE-/-.DR3-DQ2.B6人源化小鼠给予p*17-DT+K4S2-DT/CAF01免疫,评价其免疫原性,并给予emm75菌株攻毒模拟人类GAS上呼吸道感染及评估p*17-DT+K4S2-DT/CAF01的保护作用。另取一组免疫完成静息至抗体滴度回落后的小鼠,给予低剂量cov R/S GAS突变菌株或者抗原肽再次刺激,复测其抗体水平、体外检测细胞因子以及用ELISPOT方法检测分泌特异性抗体的B细胞数,了解疫苗的长程免疫记忆。研究结果:（1）J8-Lipo-DT鼻吸入免疫小鼠后可产生血清和唾液特异性J8抗体,上呼吸道M12菌株攻毒后疫苗组各组织器官菌落计数减少。给予IL-1β-/-小鼠鼻吸入免疫后,小鼠上呼吸道保护作用较野生型免疫小鼠弱,且体外刺激脾细胞所分泌的IL-17A也较野生型小鼠下降。在脂质体系统中添加PHAD成分,不论是J8-Lipo-DT PHAD还是J8-DT/Lipo-PHAD,抗体滴度均显着升高,攻毒后细菌负荷显着减少。更换抗原肽后,p*17-Lipo-DT一次鼻吸入免疫后抗原特异性抗体就开始升高,较J8-Lipo-DT反应迅速。三次免疫后两者上呼吸道保护作用相当。与J8相关脂质体疫苗类似,p*17-Lipo-DT PHAD和p*17-DT/Lipo-PHAD免疫原性均较p*17-Lipo-DT提高,可以抵御上呼吸道GAS感染,但仍然无法提供针对皮肤感染的有效保护。（2）p*17-DT/Lipo-PHAD和p*17-DT/CAF01头对头研究,prime-pull（皮下注射-皮下注射-鼻吸入）免疫方法可以显着提高抗原特异性抗体水平,p*17-DT/CAF01免疫小鼠抗体滴度显着高于p*17-DT/Lipo-PHAD组,既可以抵御GAS上呼吸道感染,也可以有效抵抗皮肤感染。DT的前期暴露不影响p*17-DT/CAF01的免疫原性。体外研究显示,p*17-DT/CAF01抗血清较其他佐剂p*17或J8相关脂质体疫苗抗血清与GAS的结合力更高。（3）覆盖cov R/S突变菌株的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01经prime-pull（肌肉注射-肌肉注射-鼻吸入）免疫后,h CD4.IAE-/-.DR3-DQ2.B6人源化小鼠可获得高滴度的p*17和K4S2特异性抗体,使用低致病性emm75菌株攻毒后显示出一定程度的保护作用。有DT前期暴露的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗组小鼠较无DT前期暴露疫苗组小鼠抗体滴度下降幅度减少。免疫后小鼠静息至血清抗体下降,给予低剂量cov R/S突变菌株再次刺激后,p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗组小鼠唾液腺分泌p*17特异性Ig G的细胞数较对照组显着升高;脾细胞分泌的TNF、IL-2、IL-6、IL-17A,疫苗组均较未接受免疫的小鼠显着升高,与新近免疫的小鼠之间无明显差异。研究结论:（1）J8-Lipo-DT鼻吸入免疫后可以有效抵御不同GAS菌株上呼吸道感染,可能通过IL-17,在IL-1β的协同下发挥作用。p*17-Lipo-DT鼻吸入免疫后保护作用优于J8-Lipo-DT,p*17可能是GAS疫苗更优选的抗原肽。PHAD可以显着提高脂质体疫苗的抗原性,在上呼吸道感染中起到更好的保护作用,但不论是含PHAD成分的J8相关脂质体疫苗还是p*17相关脂质体疫苗,单纯鼻吸入免疫尚不足以抵御异位的皮肤浅表感染。（2）Prime-pull免疫策略可有效的放大疫苗的保护作用,是理想的GAS疫苗免疫方式。不论是在体实验还是体外试验,p*17-DT/CAF01均较p*17-DT/Lipo-PHAD显示出更强的免疫原性和保护性,且DT前期暴露不影响p*17-DT/CAF01效价。p*17-DT/CAF01,可能是目前最有前景的GAS候选疫苗之一。（3）覆盖cov R/S突变菌株的p*17-DT+K4S2-DT/CAF01 GAS脂质体疫苗经肌肉注射和鼻吸入联合免疫,在人源化小鼠中显示出一定程度的保护作用。p*17-DT+K4S2-DT/CAF01疫苗可有效产生免疫记忆,当再次受到细菌感染后可迅速产生免疫反应,唾液腺Ig G在上呼吸道感染的防护中起重要作用,TNF、IL-2、IL-6、IL-17A也参与了疫苗诱导的细胞免疫。
葛成[6]（2020）在《河北地区禽白血病流行病学调查与gp85蛋白表达及免疫效果评价》文中提出禽白血病（Avian Leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起对家禽危害较大的一种以垂直及水平方式进行传播的肿瘤性疾病。该病发病率为3%?5%,病程长,严重增加家禽养殖业的损失。目前对于该病没有有效的药物及疫苗。因此,本研究对河北地区AL展开流行病学调查,及主要流行亚群gp85基因进行了原核表达及真核表达,并对其进行了免疫效果的初步研究。研究内容和结果如下:1.河北地区种鸡ALV p27携带情况、流行亚群及其分子特征分析本研究通过对河北地区种鸡场采集种蛋和肛拭子样本（共包含6个地区的7个种鸡场3496份样品,其中地方品种2533份、引进品种159份、培育品种804份）,利用p27抗原ELISA试剂盒检测ALV p27携带情况,结果显示2018-2019年河北地区种鸡场的阳性率达85.71%,个体平均阳性率达13.79%,地方品种阳性率达18.91%,引进品种阳性率为1.26%,培育品种阳性率仅为0.12%;采用PCR方法检测2018-2019年主要流行亚群,结果显示J亚群检出率为13.79%,E亚群检出率为13.70%,A亚群检出率为0.09%,K亚群检出率为2.23%;对主要流行亚群ALV-J gp85基因测序分析,显示分离株与参考株的同源性达98.50%100.00%,且主要围绕HPRS-103发生变异。2.ALV-J gp85原核表达及免疫保护力评价为克隆出ALV gp85基因,设计引物,构建pET-32a-gp85表达载体,将重组载体转化入BL21大肠杆菌工程菌中,成功表达目的蛋白,蛋白分子质量约54kDa,Western blot方法表明该蛋白具有良好的免疫原性。将原核表达蛋白以100μg、150μg、200μg/只剂量进行免疫,免疫后第7、14、21、28d采血,通过ELISA方法检测特异性gp85抗体水平,结果显示,免疫各组各期的血清gp85抗体水平均显着高于对照组（P<0.05）,以150μg免疫组的各期抗体水平最高,与100μg、200μg免疫组比较均达显着水平（P<0.05）。第35d天以3 TCID50攻毒,利用ELISA p27抗原试剂盒检测其抗原携带情况,进而分析其保护率,结果表明,在攻毒21d时,100μg免疫组保护力最低,150μg免疫组保护力次之,200μg免疫组保护力为26.67%。3.ALV-J gp85真核蛋白在293T细胞中的表达及免疫效果评价为获得293T细胞表达的gp85蛋白,本研究将gp85基因导入表达质粒pEGFP-N1,得到重组质粒pEGFP-N1-gp85,转染293T细胞,经倒置荧光显微镜观察和Western blot鉴定,获得gp85真核蛋白,分子质量约为60 kDa。将pEGFP-N1-gp85真核质粒以100μg、150μg、200μg/只剂量进行免疫,免疫后第7、14、21、28d采血,利用ELISA方法检测特异性gp85抗体水平,利用MTT法检测T淋巴细胞转化率,第35d天以3 TCID50攻毒,检测ALV p27抗原携带情况,进而分析其保护率。结果显示,免疫各组各期的血清gp85抗体水平及外周血T淋巴细胞转化率均显着高于对照组（P<0.05）,以150μg免疫组的各期抗体水平最高,与100μg、200μg免疫组比较均达显着水平（P<0.05）。在攻毒试验21d时,100μg免疫组保护力最低,200μg免疫组保护力次之,150μg免疫组保护力为53.33%。表明该真核质粒适宜免疫剂量为150μg。
程婕[7]（2020）在《体外活化B细胞分化特异性浆细胞方法的研究及HBs Ag特异性全人源单抗的制备》文中研究表明第一部分体外诱导外周血记忆B淋巴细胞分化抗原特异性浆细胞方法的建立背景:新型感染性疾病因其传染性强易导致暴发流行,抗体作为免疫防治的策略之一,可以用于应急预防以及重症患者的治疗。全人源单克隆抗体（单抗）具有特异性高、毒副作用低、可大量生产等优点。新型感染性疾病爆发流行,快速筛选相应的中和抗体可以用于预防和治疗。中和抗体的制备通常采用患者恢复期外周血单个核淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）,但是患者恢复期PBMCs中特异性浆细胞含量极低,难以捕获。体外诱导PBMCs中记忆B淋巴细胞（后简称B细胞）分化抗原特异性浆细胞的方法可获得大量浆细胞用以抗体基因的提取,为全人源单抗的制备提供研究基础。目的:本研究旨在建立体外诱导外周血记忆B细胞增殖并分化抗原特异性浆细胞的方法,以期自PBMCs中获得大量抗原特异性浆细胞用以分离抗体基因,为制备高亲和力的、具有中和作用的全人源单抗药物研究提供研究基础。方法:本研究收录接种乙肝疫苗超过3年以上的健康志愿者,使用密度梯度离心法分离PBMCs,分别使用TLR7/8激动剂R848或TLR9激动剂CpG DNA 2006与不同细胞因子（IL-2、IL-4、IL-10）组合的方式进行诱导活化,体外诱导6天后评价活化效果。使用台盼兰对活化后细胞染色并计数,绘制细胞生存曲线图检测细胞生存状态;使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清中总IgG或/和HBsAg抗原特异性IgG的分泌量;酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测活化细胞中总抗体分泌细胞（Antibody secret cells,ASCs）或/和HBsAg抗原特异性ASCs数量,分析不同诱导方案的活化效果。诱导方案分别为:不同浓度R848和IL-2（后缩写为R848+IL-2）组合诱导,用以确定R848使用的最佳浓度;R848+IL-2联合不同细胞因子（IL-4、IL-10）组合诱导,用以确定细胞因子对R848诱导活化的影响;CpG DNA 2006和CD40抗体联合细胞因子IL-2、IL-4和/或IL-10组合诱导,用以确定使用CpG DNA 2006活化效果最优的组合。结果:1.R848+IL-2体外方案最佳浓度及细胞因子对活化效果的影响:ELISA及ELISPOT结果表明,R848与IL-2联合使用,当R848浓度在1-2.5μg/ml时,能够有效诱导B细胞扩增分化为浆细胞,且最早在活化后第5日即可检测到ASCs;细胞因子IL-4、IL-10对R848+IL-2联合诱导B细胞活化的方法并无明显影响;2.CpG DNA 2006体外诱导方案的最优组合:对CpG DNA 2006与不同细胞因子组合诱导的结果进行检测证明,在抗CD40抗体作用下,CpG DNA 2006与细胞因子IL-2、IL-4和IL-10联合使用能够更好诱导PBMCs中B淋巴细胞分化为ASCs;3.两种体外诱导方案的对比:对R848+IL-2（R848组）或CpG DNA2006+CD40抗体+IL-2、IL-4、IL-10（CpG组）两种方法的活化效果进行比较,发现R848组能够更有效分化ASCs,ELISPOT浆细胞检出率至少高出CpG组8倍以上;4.R848+IL-2诱导抗原特异性ASCs:使用R848+IL-2方法诱导接种乙肝疫苗（3年及以上）的健康志愿者PBMCs后,ELISA可在细胞上清中检测到HBsAg特异性IgG且ELISPOT能够检测到HBsAg特异性浆细胞（频率大约在1/100-1/1000）。结论:R848+IL-2或在抗CD40抗体作用下,CpG DNA 2006与细胞因子IL-2、IL-4和IL-10联合这两种方法,均可体外诱导PBMCs中记忆B细胞增殖分化为浆细胞。使用R848+IL-2方法,仅需少量患者恢复期外周血（5-10ml）便可获得抗原特异性ASCs用于分析和分选,为中和抗体的制备提供方法。第二部分全人源乙肝表面抗原抗体的制备及其特性鉴定背景:乙型病毒性肝炎是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染所导致的、严重危及人类健康的传染性疾病。我国是HBV感染的高发区,因目前对慢乙肝患者尚缺乏有效治疗,故常导致疾病迁延不愈,增加了并发症的风险。应用于临床的高效价免疫球蛋白能够中和并清除入侵的病毒,使机体免受病毒的感染,但由于血源来源有限、制备成本高等问题,致使应用受到了限制,寻找一种有效治疗乙肝的药物显得尤为迫切。乙肝治疗性疫苗是指按照一定比例,在仅使用抗原制备疫苗的基础上额外添加HBs Ag抗体,对其的研究目前已经入临床III期,证实其有一定疗效。构建具有高亲和力的HBs Ag全人源单克隆抗体,使大规模生产人源化抗体成为可能,为乙肝的临床治疗和治疗性疫苗的发展提供研究基础。目的:构建并表达多对全人源HBs Ag单克隆抗体,制备抗体蛋白,检测其纯度及特异性;建立细菌展示技术,探讨HBs Ag抗原表位。本课题研究,以期为单克隆抗体的制备、抗原表位的筛选以及乙肝治疗性疫苗的研发提供基础。方法:1.重组质粒的构建:通过PCR的方法,获得HBs Ag抗体轻、重链可变区基因及人/鼠Ig G轻、重链恒定区基因,使用overlap PCR的方法分别将轻、重链的可变区与恒定区相连接,克隆至真核表达载体Pc DNA3.4中,构建重组质粒。通过酶切及基因测序,验证质粒的准确性;2.293F真核系统表达抗体蛋白:将鉴定正确的质粒转染293F细胞,收集包含目的蛋白的细胞培养液上清,利用Protein G亲和层析柱对其进行纯化,得到纯度及浓度均较高的抗体蛋白;3.抗体蛋白纯度检测:使用SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色,对纯化后抗体蛋白纯度进行检测;4.抗体蛋白活性及特异性结合力检测:使用ELISA检测抗体蛋白的活性及其对HBs Ag的特异性结合力;使用免疫组化方法检测HBV相关HCC患者石蜡切片样本中HBs Ag的表达水平;5.细菌展示技术的建立:将HBs Ag ADR/AYW亚型基因序列克隆至细菌展示载体,使用所制备的不同抗体与其反应,探究抗体与抗原的结合情况。结果:1.成功构建5对全人源HBs Ag单克隆抗体的轻、重链表达质粒,分别命名为HBs Ab-h116、HBs Ab-h1444、HBs Ab-h1425、HBs Ab-h1453、HBs Ab-h477,将其中2对HBs Ab-h116和HBs Ab-h477改造为嵌合鼠源。酶切后质粒经琼脂糖凝胶电泳后出现两条条带,其与理论大小相符;比对测序结果,显示插入序列正确;2.成功使用293F细胞将抗体进行表达,并使用Protein G亲和层析柱纯化,使用SDS-PAGE胶进行考马斯亮蓝染色后,7对抗体均显示轻、重链两条清晰条带,相对分子质量分别约27000和55000,无明显杂带,证实抗体纯度较高;3.使用ELISA包被HBs Ag对制备抗体进行检测,结果证实抗体均对HBs Ag具有特异性结合能力;使用HBV相关HCC患者样本制备石蜡切片,使用免疫组化对改造后的嵌合鼠源抗体HBs Ab-m116和HBs Ab-m477进行验证,结果显示所制备抗体可特异性结合样本中HBs Ag;4.成功建立细菌展示方法,构建含有乙肝表面抗原ADR、AYW亚型全长基因的细菌展示APEX载体,使用流式检测证实制备的HBs Ab-h116及HBs Ab-h1444能够与ADR亚型有较明显反应,较其他几对亲和力高,后续可将抗原进行进一步截短,筛选线性表位。结论:成功构建5对全人源及2对嵌合鼠源HBs Ag抗体轻、重链表达质粒,并在真核细胞293F中进行表达后纯化。纯化后抗体蛋白纯度较好且对HBs Ag有特异性结合能力。成功建立细菌展示技术,证实所制备HBs Ab-h116及HBs Ab-h11444能够与ADR亚型全长有较明显反应,为单克隆抗体的制备、抗原表位的筛选及乙肝治疗性疫苗的研发提供研究基础。
胡瑞鸿[8]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中指出小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
钱雯[9]（2020）在《乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究》文中进行了进一步梳理肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）引起的细菌性肺炎是一种危害人类健康的全球性传染病。肺炎链球菌以侵入性或非侵入性感染引起全人群,尤其在儿童和老年人中的肺炎、脑膜炎、鼻窦炎、中耳炎和菌血症等多种疾病。肺炎多糖蛋白结合疫苗在对肺炎链球菌引起的感染和疾病的预防和控制中取得了巨大的成功。由于其优于单纯多糖的抗体增强效应,以及可以产生免疫记忆和群体保护的优势,已成为肺炎疫苗的主要开发和应用方向。多糖与有效载体蛋白的结合是研制高效肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的关键。目前已开发上市的肺炎多糖结合疫苗所用的载体局限在破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（PT）、白喉毒素突变体（CRM197）,不可分型流感嗜血杆菌蛋白（PD）少数的几种。这些载体蛋白也被用于其它多种结合疫苗中。重复接种含相同载体蛋白抗原的疫苗会导致免疫抑制效应（CIES）的产生,而使得机体对多糖的免疫反应减弱。另一方面,用作载体的蛋白经过脱毒、结合等化学过程可能改变载体蛋白原有抗原表位从而影响其免疫原性,还没有结合疫苗的产品说明书将其载体部分的免疫效果明确列入说明书中。因此,迫切需要开发安全、有效的新载体蛋白偶联疫苗来控制这种免疫抑制风险,并诱导产生针对多糖和蛋白载体的有效免疫应答,实现一针双效的目标,这对多糖蛋白结合疫苗尤其是肺炎多糖蛋白结合疫苗的开发十分必要和重要。本研究利用一种病原相关蛋白乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）作为新的载体蛋白偶联新型肺炎球菌多糖结合疫苗及其对应的蛋白抗原和多糖抗原分别免疫小鼠后,比较研究免疫后不同时间点诱导产生的荚膜多糖和乙肝表面抗原蛋白的特异性抗体水平、细胞免疫应答和早期基因表达谱的情况。对这种新载体的肺炎结合疫苗的综合免疫效果研究结果表明,这种以乙肝表面蛋白（HBs）为载体偶联33F型肺炎荚膜多糖（PN33Fps）的新型肺炎结合疫苗能刺激免疫小鼠产生分别针对两种抗原的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应。与两种单抗原免疫的小鼠相比,这种新的结合疫苗可同时产生更强的针对多糖（PN33Fps）和蛋白（HBs）的体液免疫和细胞免疫,达到一针双效的免疫效果,且随免疫针次的增加而增强。然而,同等剂量的多糖免疫组即使加强免疫也不能产生抗体阳转。此外,采集免疫后小鼠脾脏组织,分析疫苗免疫早期基因表达谱的差异特征发现:这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗诱导了更多的免疫相关基因的表达,并呈现出与单抗原不同的变化规律,特别是在免疫细胞的分化和发育中呈现出与单抗原不同的变化规律。这种差异变化规律可能是不同抗原刺激后的先天和适应性免疫细胞中某些免疫信号分子的特征性表达,与多糖和蛋白结合后更强抗体水平的产生以及细胞免疫反应有关。此外,通过细胞融合技术从这种乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫的小鼠脾淋巴细胞中,分离到了分别针对肺炎33F型多糖抗原和乙肝表面蛋白抗原的特异性B淋巴细胞的单克隆抗体细胞株。对分离的特异性B淋巴细胞单克隆细胞株进行抗体分泌能力和特性的鉴定显示出所筛选的细胞株具有持续分泌特异性IgG1抗体的能力。进一步验证了这种以乙型肝炎病毒表面蛋白作为载体蛋白的新型肺炎结合疫苗诱导了小鼠脾细胞中特异性B淋巴细胞的分化和发育以及血清中抗体的产生。简而言之,从体液免疫、细胞免疫到分子水平的研究提示了这种新载体结合疫苗在小鼠上良好的免疫效果。在这种以乙肝表面蛋白为载体的新型肺炎结合疫苗免疫效果研究的基础上,我们也对免疫后小鼠的初步安全性进行了评估,通过对免后小鼠不同时间体重观察以及主要器官的组织病理学进行观察和研究。结果表明,该结合物免疫后的小鼠与对照组相比,未出现明显的病理改变,且体重在免疫期内持续增长,显示出了这种结合疫苗的初步安全性是可预期的。总之,本论文研究结果表明出这种以乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎球菌多糖结合疫苗在小鼠中具有良好的免疫效果和安全性。提示了以乙肝表面抗原为载体可以促进对多糖免疫效果的提升,同时也能诱导小鼠产生针对乙肝表面蛋白的免疫反应,在小鼠上验证了这种乙肝表面抗原蛋白可以作为肺炎结合疫苗新的载体,并能实现一针双效的免疫效果。对这种结合疫苗免疫小鼠后的早期体液、细胞和分子水平的免疫机理研究为结合疫苗的研究和开发提供了一种新的路径。而用这种结合疫苗免疫小鼠后分离到的肺炎33F型多糖和乙肝表面蛋白的特异性B淋巴细胞单克隆抗体细胞株及其分泌的抗体应用的初步研究为后期该结合疫苗的开发的质量评价奠定了基础。
王晶[10]（2019）在《环境胁迫对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响研究》文中研究指明尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是我国重要经济养殖鱼类。近年来,由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）感染引起的罗非鱼无乳链球菌病频繁发生,给该产业造成了严重经济损失。疫苗免疫是相对药物治疗等其他方式更为安全有效的理想防控措施,但免疫反应是一种受机体、抗原和环境等因素影响的复杂生理过程。为评价免疫接种后罗非鱼对无乳链球菌的抵抗能力是否受环境胁迫影响,本论文以温度、间歇性低溶氧、高盐和禁食为胁迫因子,建立环境胁迫尼罗罗非鱼生物模型,开展环境胁迫对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响研究。本研究不仅对环境胁迫如何影响尼罗罗非鱼免疫反应和疫苗效力的评价十分必要,也为采用疫苗接种方式预防罗非鱼无乳链球菌病时疫苗效力发挥最优化提供科学参考依据。主要研究结果如下:1.为评价免疫接种后,温度对尼罗罗非鱼免疫反应和疫苗效力的影响,免疫接种的罗非鱼分别在水温为21、25、29和33°C的环境下饲养。结果显示,21°C和33°C免疫组鱼脾脏和头肾组织IgM、IL-1β、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平显着低于29°C免疫组鱼;白细胞总数和中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞绝对数量、血清抑菌能力和白细胞吞噬活性在21°C免疫组鱼中均为最低;白细胞呼吸爆发活性和特异性抗体水平随温度的升高呈先上升后下降显着变化趋势。所有试验组在相同温度下感染无乳链球菌,21°C免疫组鱼的存活率显着低于其他免疫组鱼,而25、29和33°C免疫组间存活率差异不显着;这表明在水温为21°C时对罗非鱼进行免疫接种后,其免疫反应和对无乳链球菌抵抗能力会显着降低。2.为评价不同温度下间歇性低溶氧对尼罗罗非鱼免疫调节的影响,尼罗罗非鱼经免疫接种后,分别在30°C和35°C水温下进行间歇性低溶氧（4.0±1.0mg/L DO）和常氧（8.0±0.5 mg/L DO）环境饲养。结果显示,在间歇性低氧环境下,免疫的鱼脾脏和头肾组织细胞因子（IL-1β、TNF-α和IFN-γ）表达水平、血清抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性、白细胞吞噬活性和头肾组织细胞呼吸爆发活性均显着降低;组织切片观察发现,在间歇性低氧环境下的鱼小肠绒毛出现脱落,且脾脏组织细胞间质增生。无乳链球菌感染后第1天,在30°C和35°C间歇性低氧环境下,免疫的鱼脾脏和头肾组织载菌量均显着高于常氧组;感染14天后,免疫的鱼在35°C间歇性低氧组中的存活率显着降低;这表明免疫接种后间歇性低溶氧环境对尼罗罗非鱼的免疫调节具有一定的抑制作用。3.为评价盐度对尼罗罗非鱼免疫反应和疫苗效力的影响,尼罗罗非鱼经免疫接种后,分别在盐度为0、10、20和30‰环境下饲养。随盐度水平梯度升高至30‰后,30‰组鱼出现持续性死亡现象,鱼体表出现不同程度的皮肤损伤,部分鱼可见皮下出血,且鳃丝上的鳃小片脱落严重。在任一盐度下,血清皮质醇水平均显着升高;在20和30‰盐度下,免疫接种的罗非鱼免疫相关基因（IgM、IL-1β和IFN-γ）mRNA表达水平、白细胞总数、淋巴细胞绝对数量、血清抑菌能力和特异性抗体水平均被显着抑制。经无乳链球菌感染后,免疫接种的罗非鱼在20‰盐度下存活率显着降低,这表明≥20‰的盐度胁迫能够显着抑制免疫接种后尼罗罗非鱼的免疫反应和疫苗保护效力。4.为评价禁食对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌感染能力的影响,对免疫接种28天和未免疫接种的尼罗罗非鱼进行0、1、3和7天禁食处理,禁食胁迫后对其感染无乳链球菌。结果显示,免疫和未免疫的鱼血清皮质醇水平随禁食时间的延长呈先下降后上升趋势;而抗氧化酶（SOD、CAT和GSH-Px）活性、细胞因子（IL-1β和IL-6）表达水平和免疫的鱼血清特异性抗体水平变化与皮质醇相反,在禁食后第7天均为最低。葡萄糖含量在禁食后第3天和第7天下降不显着,这可能与禁食后肝糖原、甘油三酯、总胆固醇含量和糖酵解关键酶（HK和PK）活性显着下降而糖异生关键酶（PEPCK）活性显着升高的自身糖代谢调节有关。无乳链球菌感染后,对未免疫的鱼而言,禁食3天组的存活率显着高于禁食7天组;但对免疫的鱼而言,经不同禁食时间胁迫后其对无乳链球菌的抵抗能力差异不显着;这表明适当的禁食有助于提高未免疫接种的罗非鱼对无乳链球菌的抵抗能力。
二、斑点酶联免疫吸附试验检测伤寒特异性抗体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、斑点酶联免疫吸附试验检测伤寒特异性抗体（论文提纲范文）
（1）牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 片形吸虫病概述 |
| 1.1.1 片形吸虫的病原特性 |
| 1.1.2 片形吸虫病的流行状况及危害 |
| 1.2 片形吸虫病的诊断 |
| 1.3 片形吸虫诊断抗原研究进展 |
| 1.3.1 虫体可溶性抗原 |
| 1.3.2 被膜抗原 |
| 1.3.3 分泌排泄产物(ESP)抗原 |
| 1.3.4 纯化抗原 |
| 1.3.5 重组抗原 |
| 1.4 片形吸虫病诊断试剂盒的研究 |
| 1.5 片形吸虫病的治疗与防控 |
| 1.6 本课题的研究目的与意义 |
| 第二章 大片形吸虫诊断抗原的制备 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂耗材 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 F22的制备 |
| 2.2.2 F22的质谱分析 |
| 2.2.3 蛋白分子的生物信息学分析 |
| 2.2.4 蛋白分子的原核重组表达 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 F22的制备结果 |
| 2.3.2 F22的质谱结果 |
| 2.3.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP生物信息学分析结果 |
| 2.3.4 rFgSAP-2、rFgCatL2、rFgLAP制备结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 F22的制备及质谱鉴定 |
| 2.4.2 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的生物信息学分析 |
| 2.4.3 FgSAP-2、FgCatL2、FgLAP的原核重组表达 |
| 第三章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要耗材 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂配制 |
| 3.1.5 血清及其他样品来源 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.2.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.3.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 牛大片形吸虫病间接ELISA诊断方法的建立及效果评价 |
| 3.4.2 牛大片形吸虫病胶体金快速诊断试纸条的研制及效果评价 |
| 3.4.3 F22作为诊断抗原的牛大片形吸虫病间接ELISA法与胶体金试纸条诊断效果的比较分析 |
| 第四章 牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的应用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 主要仪器设备 |
| 4.1.3 主要试剂配制 |
| 4.1.4 血清 |
| 4.1.5 实验动物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.2.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清的检测 |
| 4.2.3 广西地区牛片形吸虫病用药情况调查及用药试验 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行病学调查 |
| 4.3.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.3.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.3.4 用药试验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 广西部分地区牛大片形吸虫病流行情况调查 |
| 4.4.2 广西壮族自治区A牛场水牛血清检测 |
| 4.4.3 广西地区针对牛片形吸虫用药情况调查 |
| 4.4.4 用药试验 |
| 第五章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 项目资助 |
（2）免疫斑点法快速诊断视神经脊髓炎谱系疾病的临床应用研究（论文提纲范文）
| 缩略语/符号说明 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分:研究设计 |
| 1.研究目的 |
| 2.研究内容 |
| 3.研究对象 |
| 4.研究方法 |
| 5.技术路线 |
| 6.讨论 |
| 第二部分:免疫斑点法检测AQP4抗体的敏感性与特异性 |
| 1.研究对象与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第三部分:免疫斑点试剂盒检测与 AQP4 抗体滴度相关性分析 |
| 1.对象与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 全文总结 |
| 1.研究结论 |
| 2.研究创新性 |
| 3.研究局限性 |
| 参考文献 |
| 综述 视神经脊髓炎谱系疾病抗体检测的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 结果 |
| 4.1 重组病毒LBNSE-EG95的感染性克隆的鉴定 |
| 4.2 重组病毒LBNSE-EG95的RT-PCR鉴定 |
| 4.3 重组病毒LBNSE-EG95的免疫荧光鉴定 |
| 4.4 重组病毒LBNSE-EG95的流式细胞鉴定 |
| 4.5 重组病毒LBNSE-EG95的Western blot鉴定 |
| 4.6 重组病毒LBNSE-EG95的生长特性 |
| 4.7 重组病毒LBNSE-EG95的动物免疫评价 |
| 4.8 淋巴细胞的激活/募集 |
| 4.9 特异性T细胞反应 |
| 4.10 特异性IgG亚型 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 创新与不足 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 发表论文情况 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）五种立克次体多重PCR-ELISA检测体系的建立（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 五种立克次体融合基因质粒标准品的制备与PCR体系的建立 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 溶液配置 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 靶基因选择 |
| 2.2 引物设计 |
| 2.3 融合基因构建及鉴定 |
| 2.4 融合基因胶回收及纯化 |
| 2.5 融合基因片段与p EASY-Blunt载体连接 |
| 2.6 重组质粒的转化与鉴定 |
| 2.7 阳性单克隆菌液质粒提取及验证 |
| 2.8 融合基因质粒PCR体系的建立 |
| 结果 |
| 1.靶基因选取及引物设计 |
| 2.一步法基因融合 |
| 3.融合基因质粒鉴定 |
| 4.融合基因质粒PCR体系的建立 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 多重PCR-ELISA检测体系的建立及优化 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 溶液配置 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 特异性探针设计及标记 |
| 2.2 多重PCR-ELISA反应体系构建、优化及评价 |
| 结果 |
| 1.特异性探针设计及标记 |
| 2. PCR-ELISA反应体系的构建 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 立克次体实验室诊断技术的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（5）A组链球菌脂质体疫苗的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 M蛋白保守区相关鼻吸入GAS脂质体疫苗 |
| 一、材料及方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第二部分 Prime-pull免疫策略有效预防上呼吸道和皮肤感染 |
| 一、材料及方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 第三部分 p~*17-DT+K4S2-DT/CAF01抗covR/S突变菌株候选疫苗的临床前研究 |
| 一、材料及方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 A族链球菌疫苗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 论文发表 |
| 致谢 |
（6）河北地区禽白血病流行病学调查与gp85蛋白表达及免疫效果评价（论文提纲范文）
| 缩略词 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽白血病病原学 |
| 1.1.1 ALV的分类 |
| 1.1.2 ALV结构特征 |
| 1.1.3 ALV理化特性 |
| 1.2 ALV基因组及蛋白结构 |
| 1.2.1 Gag基因编码的蛋白 |
| 1.2.2 Pol基因编码的蛋白 |
| 1.2.3 Env基因编码的蛋白 |
| 1.3 AL流行病学 |
| 1.3.1 AL的宿主范围 |
| 1.3.2 ALV的传播途径 |
| 1.4 AL的临床症状及病理变化 |
| 1.5 AL的检测诊断方法 |
| 1.5.1 病毒的分离鉴定 |
| 1.5.2 酶联免疫吸附试验 |
| 1.5.3 核酸斑点杂交试验 |
| 1.5.4 免疫荧光技术 |
| 1.5.5 快速检测试纸条 |
| 1.5.6 PCR技术 |
| 1.6 AL的防制 |
| 1.6.1 灭活疫苗 |
| 1.6.2 活疫苗 |
| 1.6.3 基因工程疫苗 |
| 1.7 本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 河北地区种鸡ALVp27携带情况、流行亚群及分子特征分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 样品的处理 |
| 2.2.2 样品中ALVp27抗原检测 |
| 2.2.3 ALp27阳性样品亚群检测 |
| 2.2.4 ALV-J gp85 分子特征分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ALVp27携带情况 |
| 2.3.2 ALV亚群检测情况 |
| 2.3.3 ALV-J gp85 序列分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ALV-J囊膜蛋白gp85 原核表达及免疫效力评价 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株、表达载体、ALV-J病毒及试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 ALV基因组的提取 |
| 3.2.2 ALV-J gp85 引物的设计及合成 |
| 3.2.3 ALV-J gp85 基因克隆与纯化 |
| 3.2.4 重组表达质粒pET-32a-gp85 的构建 |
| 3.2.5 原核蛋白gp85 的表达及Western blot检测 |
| 3.2.6 重组蛋白gp85特异性免疫效果测定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 gp85 基因克隆与原核表达质粒pET-32a-gp85 的构建 |
| 3.3.2 重组蛋白gp85的表达验证 |
| 3.3.3 pET-32a-gp85 蛋白表达的可溶性分析及纯化 |
| 3.3.4 Western blot分析重组蛋白gp85 的免疫原性 |
| 3.3.5 gp85蛋白免疫对雏鸡血清特异性抗体gp85的影响 |
| 3.3.6 不同剂量免疫攻毒后鸡ALVp27阳性数及保护率分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ALV-J gp85 真核蛋白在293T细胞中的表达及免疫效果评价 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 质粒、病毒及细胞株 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 引物的设计合成及gp85基因扩增 |
| 4.2.2 pMD-18T-gp85 基因的克隆、测序 |
| 4.2.3 重组质粒pEGFP-N1-gp85 的构建 |
| 4.2.4 细胞转染 |
| 4.2.5 pEGFP-N1-gp85 重组蛋白在293T细胞中的表达 |
| 4.2.6 Western blot检测pEGFP-N1-gp85 的表达情况 |
| 4.2.7 ALV-J gp85 真核蛋白的免疫效果评价 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ALV-J gp85 基因扩增 |
| 4.3.2 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 4.3.3 pEGFP-N1-gp85在293T细胞中的表达 |
| 4.3.4 Western blot分析pEGFP-N1-gp85在293T细胞中的表达 |
| 4.3.5 血清抗体特异性检测 |
| 4.3.6 血清抗体水平检测 |
| 4.3.7 外周血T淋巴细胞转化率测定 |
| 4.3.8 不同剂量免疫攻毒后鸡ALVp27阳性数及保护率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 论文受资助情况 |
| 致谢 |
（7）体外活化B细胞分化特异性浆细胞方法的研究及HBs Ag特异性全人源单抗的制备（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 体外诱导外周血记忆B淋巴细胞分化抗原特异性浆细胞方法的建立 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 人外周血单个核细胞分离 |
| 1.2.2 B淋巴细胞体外培养及活化 |
| 1.2.3 细胞存活分析 |
| 1.2.4 ELISPOT检测抗体分泌细胞 |
| 1.2.5 ELISA检测培养液上清中抗体含量 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同浓度R848诱导记忆B细胞分化浆细胞分析 |
| 2.2 不同时间R848诱导记忆B细胞分化浆细胞分析 |
| 2.3 细胞因子IL-10对R848诱导的记忆B细胞分化的影响 |
| 2.4 细胞因子IL-4对R848诱导的记忆B细胞分化的影响 |
| 2.5 TLR9 激动剂CpG DNA和 TLR7/8 激动剂R848 诱导分化效果比较 |
| 2.6 R848诱导记忆B细胞分化抗原特异性浆细胞的分析 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 全人源乙肝表面抗原抗体的制备及其特性鉴定 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 全人源HBsAg抗体可变区和恒定区及鼠恒定区基因片段的获取 |
| 1.2.2 PcDNA3.4表达载体的构建 |
| 1.2.3 293 F细胞培养 |
| 1.2.4 HBsAg特异性抗体表达及纯化 |
| 1.2.5 考马斯亮蓝染色检测HBsAg特异性抗体蛋白纯度 |
| 1.2.6 ELISA检测HBsAg特异性抗体蛋白特异性 |
| 1.2.7 免疫组化检测HBV相关原发性肝细胞肝癌(HCC)组织HBsAg表达水平 |
| 1.2.8 细菌展示法对HBsAg特异性抗体的表位进行初步筛选 |
| 2.实验结果 |
| 2.1 HBsAg特异性抗体重组质粒的构建 |
| 2.2 HBsAg特异性抗体蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.3 HBV相关原发性肝细胞肝癌(HCC)组织HBsAg表达水平检测 |
| 2.4 细菌展示法HBsAg特异性抗体的表位初步筛选 |
| 3.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表文章 |
（8）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（9）乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗体液与细胞免疫研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第二章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠后早期表达谱的研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第三章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠的特异性B淋巴细胞的分离、鉴定及初步应用研究 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 第四章 乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗免疫小鼠后小鼠体重和主要脏器的病理学观察 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料 |
| 三、实验方法 |
| 四、结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 结论与创新点 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 参考文献 |
| 文献综述 细菌多糖蛋白结合疫苗研发进展 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略语表 |
| 附录二 偶联物免疫组较单独原液组比较不同时间上调（3day)和下调（3day)基因 |
| 致谢 |
| 研究生个人简介 |
（10）环境胁迫对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 无乳链球菌研究进展 |
| 1.2 无乳链球菌病防控手段 |
| 1.3 环境胁迫影响鱼类免疫 |
| 1.4 本研究目的及意义 |
| 第二章 温度对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同温度下间歇性低溶氧对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 盐度对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 禁食对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响 |
| 5.1 材料 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 全文总结及展望 |
| 参考文献 |
| 附录一 英文缩略词 |
| 附录二 攻读博士学位期间的科研和获奖情况 |
| 致谢 |
四、斑点酶联免疫吸附试验检测伤寒特异性抗体（论文参考文献）
- [1]牛大片形吸虫病免疫学诊断方法的建立与应用[D]. 靳纬坤. 广西大学, 2021
- [2]免疫斑点法快速诊断视神经脊髓炎谱系疾病的临床应用研究[D]. 毕锦. 福建医科大学, 2021(02)
- [3]表达细粒棘球蚴EG95蛋白重组狂犬病病毒的构建及免疫研究[D]. 许彤. 山东大学, 2021(09)
- [4]五种立克次体多重PCR-ELISA检测体系的建立[D]. 郑雨桐. 大连医科大学, 2021(01)
- [5]A组链球菌脂质体疫苗的研究[D]. 霍永宝. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [6]河北地区禽白血病流行病学调查与gp85蛋白表达及免疫效果评价[D]. 葛成. 河北科技师范学院, 2020(12)
- [7]体外活化B细胞分化特异性浆细胞方法的研究及HBs Ag特异性全人源单抗的制备[D]. 程婕. 重庆医科大学, 2020(12)
- [8]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [9]乙肝表面蛋白偶联的新型肺炎多糖结合疫苗小鼠综合免疫效果研究[D]. 钱雯. 北京协和医学院, 2020(05)
- [10]环境胁迫对尼罗罗非鱼抗无乳链球菌免疫应答的影响研究[D]. 王晶. 中山大学, 2019(01)