一、护骨素配基反义RNA对破骨细胞样细胞生成的影响（论文文献综述）
万合[1]（2014）在《小鼠成骨细胞分化中表达上调长链非编码RNA的鉴定》文中研究表明目的筛选MC3T3-E1细胞成骨分化过程中表达上调的lncRNA,为进一步研究lncRNA对成骨分化的调控打下基础。方法首先培养MC3T3-E1细胞并诱导其分化,随之提取MC3T3-E1成骨分化过程中的总RNA并予以纯化,合成cDNA并行PCR扩增,继之合成荧光标记cRNA并行PCR扩增,纯化荧光标记cRNA并测量其浓度,将cRNA片段化并和芯片杂交,获得microarray数据后将数据进行标准化,筛选成骨分化过程中表达上调的lncRN。继之qRT-PCR验证MC3T3-E1成骨分化过程中表达上调的lncRNA。然后siRNA干扰lncRNA104表达并qRT-PCR测定其抑制效率。最后测定lncRNA104表达降低时OC浓度和ALP活性。结果1.筛选出19个MC3T3-E1细胞成骨分化过程中表达上调lncRNAs。2.qRT-PCR证实MC3T3-E1细胞成骨分化过程lncRNA642、 lncRNA160和lncRNA104表达均上调,与芯片结果基本一致。3.qRT-PCR显示siRNAb处理MC3T3-E1细胞48小时后lncRNA104表达抑制率达到70%。4.抑制lncRNA104表达致OC分泌和ALP活性降低。结论1.鉴定出小鼠成骨细胞分化过程中表达上调IncRNA。2.1ncRNA104促进小鼠成骨细胞分化。
宁琳琳[2]（2013）在《降钙素基因相关肽及其拮抗剂对乳腺癌骨转移微环境的影响》文中认为[目的与意义]（1）观察降钙素基因相关肽以及降钙素基因相关肽受体拮抗剂CGRP8-37对人成骨样细胞骨代谢的影响。（2）通过建立体外人乳腺癌与人成骨样细胞共培养体系，观察降钙素基因相关肽以及降钙素基因相关肽受体拮抗剂CGRP8-37对共培养条件下成骨样细胞骨代谢的影响。[方法]（1）将对数期的细胞MG-63，每孔3×105个细胞接种于6孔板中。第一部分实验分三组：A组：空白血清对照组；B组：浓度为10-8M CGRP；C组：浓度为10-8M CGRP加浓度为10-8M CGRP8-37。观察护骨素（Osteoprotegerin,OPG），细胞核因子κβ受体活化因子配体（Receptor activator of NF-κβ ligand，Rankl）和runt相关转录因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）的mRNA及蛋白的表达。（2）将对数期的细胞MG-63及MDA-MB-231接种于6孔板中，每孔接种3×105个MG-63细胞，另分别加3×105个MDA-MB-231。第二部分四组A：MG-63单独培养空白血清组；B：共培养空白血清对照组（Contro）；C组：共培养浓度为10-8M CGRP；D组：共培养浓度为10-8M CGRP加浓度为10-8M CGRP8-37。观察OPG，Rankl和Runx2的mRNA及蛋白的表达。[结果]（1）.CGRP可促进MG-63细胞表达OPG的mRNA及蛋白，抑制RANKL及Runx2的mRNA和蛋白表达，与空白对照组比较差异有统计学意（P<0．05）。经CGRP8-37预处理后，CGRP诱导的MG-63细胞OPG的mRNA及蛋白表达显着降低（P<O．05），但仍高于对照组，RANKL及Runx2的mRNA和蛋白表达升高，但仍低于正常对照组。（2）.MG63与MDA-MB-231共培养条件下相对于MG63单独培养下，Rankl和Runx2的mRNA和蛋白表达上调伴OPG的表达下调（p＜0.05）；给予CGRP处理后，上诉改变被逆转；经CGRP8-37处理后，CGRP诱导的OPG的mRNA及蛋白表达显着降低（P<O．05），但仍高于对照组，RANKL及Runx2的mRNA和蛋白表达升高，但仍低于正常对照组。[结论]（1）．CGRP可以上调MG-63细胞OPG表达，下调RANKL及Runx2的表达。（2）．乳腺癌细胞可能通过调节成骨细胞OPG及RANKL的表达，间接调节破骨细胞的活性。（3）.CGRP8-37作为CGRP的竞争性拮抗剂，可广泛用于阐述和说明CGRP的作用。（4）.CGRP能干预OPG/Rankl轴的表达，有可能逆转乳腺癌的促溶骨作用，从而有望成为治疗乳腺癌骨转移的新抑制剂之一。
徐岚[3]（2012）在《骨唾液酸蛋白糖基化修饰对成骨的影响》文中提出目的探讨骨唾液酸蛋白（Bone Sialoprotein, BSP）糖基化修饰对成骨的影响及可能的作用机制。方法1.建立MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型,倒置显微镜观察细胞形态,RT-PCR和Western-Blot检测成骨细胞相关因子骨钙素、骨唾液酸蛋白等mRNA和蛋白水平的表达,碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）、von Kossa染色以鉴定成骨细胞和骨矿化的形成。2.在成骨细胞培养模型中加入人重组骨唾液酸蛋白（Recombinant Human Bone Sialoprotein, rhBSP）及经O-糖苷酶消化的去O-糖基化rhBSP,使用荧光标记的具有特异识别O糖链结构的凝集素VVL,VVA（Biotinylated Vicia Villosa Lectin, VVL,VVA）检测细胞中O糖链,并通过流式细胞仪验证；同时选择在成骨细胞培养模型中高表达ppGalNAcT1和T4（polypeptide GalNAc transferases, ppGalNAcTs）为研究对象,利用RNA干扰技术,分别构建和筛选出高效的T1siRNA和T4siRNA表达载体转染入MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型中,ALP、von Kossa染色及RT-PCR、Western-blot等成骨细胞生物学检测手段观察BSP O-糖基化修饰对成骨的影响。3.在成骨细胞培养模型中加入不同浓度的α2,3神经氨酸苷酶,使用荧光标记的具有特异识别a2,3唾液酸结构的凝集素MALII（Maackia amurensis leukoagglutinin Ⅱ,MALⅡ）检测细胞表面的a2,3唾液酸糖链结构,并通过流式细胞仪验证；Western-blot检测BSP蛋白水平的变化；同时利用ALP、von Kossa染色及RT-PCR、Western-blot等成骨细胞生物学检测手段观察BSP相关的末端唾液酸化对成骨的影响。4.在成骨细胞培养模型中加入rhBSP、肽N-糖苷酶F消化的去N-糖基化rhBSP及不同浓度的衣霉素（N-糖基化糖链合成抑制剂）,使用荧光标记的具有特异识别N糖链结构的凝集素LEA（Lycopersicon esculentum agglutinin, LEA）检测细胞中N糖链,并通过流式细胞仪验证；同时利用ALP、von Kossa染色及RT-PCR, Western-blot等成骨细胞生物学检测手段观察BSP N-糖基化修饰对成骨的影响。5.在MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型中,加入肽N-糖苷酶F、O-糖苷酶、唾液酸酶、β-半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶等,Western-blot检测BSP蛋白水平的变化,同时利用凝集素标记、流式细胞仪鉴定、质谱分析等方法,探讨BSP的糖链结构。结果1.成功建立了MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型,证明MC3T3-E1Subclone14细胞培养至10d左右ALP染色呈强阳性反应,即成骨细胞大量形成,von Kossa染色至14d左右呈强阳性反应,说明成骨细胞分泌的骨基质进入矿化期。2.在成骨细胞培养模型中加入rhBSP及O-糖苷酶消化的去O-糖基化rhBSP, ALP、von Kossa染色结果显示：BSP O-糖基化修饰影响了成骨细胞和骨矿化的形成；同时成功构建和筛选出在MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型中高表达的高效siRNA表达载体ppGalNAcT1-1545和ppGalNAcT4-784,转染入成骨细胞培养模型后有效抑制了成骨细胞分化和骨矿化的形成,证实BSP O-糖基化修饰影响成骨主要为ppGalNAcT1、T4两个糖基转移酶。3.BSP相关的末端唾液酸化对骨矿化的影响主要以a2,3唾液酸为主,它可能通过影响维生素D受体VDR的表达,从而影响骨的矿化,但对成骨细胞的分化无明显影响。4.在成骨细胞培养模型中加入rhBSP、肽N-糖苷酶F消化的去N-糖基化rhBSP及不同浓度的衣霉素,ALP、von Kossa染色等结果显示：BSPN-糖基化修饰及N-糖基化糖链合成抑制剂衣霉素对成骨无明显影响。5.肽N-糖苷酶F释放糖蛋白中N-连接的糖链；质谱检查发现,经唾液酸酶处理后的BSP,其N-糖链末端的唾液酸脱落,1142（H5N4F1）、1366（H6N5F1）、1279（H6N5）、1504（H7N6）等出现在唾液酸酶处理后的图谱中,此结果与Western-blot鉴定BSP的表达基本相符。同时流式细胞仪分析、Western-blot检测进一步证实BSP是一个含N-糖链、O-糖链及末端唾液酸的糖基化蛋白。综上所述,我们成功建立了MC3T3-E1Subclone14成骨细胞培养模型；证实BSP O-糖基化修饰影响成骨主要涉及ppGalNAcT1、T4两个糖基转移酶；BSP相关的末端唾液酸化主要影响骨矿化的形成,并以α2,3唾液酸为主,但对成骨细胞的分化无明显影响；BSP N-糖基化修饰及相关的N糖链对成骨无明显影响；同时我们利用现有的质谱技术初步分析了BSP的糖链结构,.进一步证实BSP是一个含N-糖链、O-糖链及末端唾液酸结构的糖基化蛋白,且BSP糖基化修饰影响成骨主要以BSP O-糖基化修饰为主。
于杨[4]（2011）在《鸡RANKL活性区基因的克隆、表达及抗体制备》文中研究指明核因子-KB受体激活物配基RANKL （receptor activator of NF-KB lignad, RANKL）最早发现于哺乳动物,属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族的一员,它参与破骨细胞形成的全过程：分化、融合、生存、激活,被认为是介导各种刺激因子诱导破骨细胞生成及功能信号传导的最终因子。鉴于RANKL在骨代谢中的重要调节作用,本文旨在克隆表达蛋鸡RANKL活性区蛋白,并制备多克隆抗体,为更深入研究笼养蛋鸡骨质疏松奠定基础,提供RANKL特异性抗体。本试验应用PCR方法扩增得到鸡RANKL编码基因（Genbank登录号EF379383）,将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明,扩增得到651 bp的RANKL活性区序列,扩增序列与Genbank上报道的预测序列完全一致。将鸡RANKL活性区成熟蛋白编码基因克隆入原核表达载体pET-28a（+）。重组表达载体pET-28a（+）-chRANKL转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,通过IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析,原核表达产物为27KD的重组蛋白,与预期结果一致。该诱导表达产物主要以包涵体形式存在。用抗His标签单克隆抗体为一抗,经western blotting分析结果显示,表达得到的重组蛋白能与抗His标签单克隆抗体结合,具有良好的抗原结合活性,证明该表达蛋白是RANKL活性区成熟蛋白,表达获得成功。表达蛋白经Ni亲和柱纯化,经SDS-PAGE凝胶电泳分析无其它杂带,可用做免疫抗原。纯化后的融合蛋白,通过四次免疫程序,免疫新西兰雄兔,制备的抗血清经间接ELISA检测到多克隆抗体效价达到1：106。蛋白质印迹结果显示,纯化的蛋白质与兔抗血清可特异性结合。试验证实,该抗体可应用于细胞免疫组化和组织蛋白Western blot鉴定。
李晓鸣[5]（2010）在《前列腺癌中RANK/RANKL/OPG的表达与前列腺癌侵袭及骨转移的关系》文中指出目的前列腺癌是男性泌尿生殖系统肿瘤中最重要的一种。前列腺癌也是最易发生骨转移的恶性肿瘤,超过80%的前列腺癌患者会发生骨转移,RANK/RANKL/OPG系统最初在骨组织中被发现,且与骨组织吸收、调节有关：RANKL与RANK结合,通过一系列的级联反应和信号传导,可促进破骨细胞的分化、活化与存活。OPG是RANKL的可溶性诱骗受体,OPG通过与RANKL结合从而阻止RANKL与RANK的结合,阻止破骨细胞分化、活化。其中RANKL以跨膜蛋白及可溶蛋白两种形式存在,RANK只以跨膜蛋白形式存在,OPG只以可溶蛋白形式存在。近几年有报道RANK/RANKL/OPG与一些肿瘤包括前列腺癌的发生、发展有关。此外有研究表明RANKL/RANK信号途径还具有趋化作用。而RANK/RANKL/OPG与前列腺癌发生侵袭及骨转移的关系至今未见全面的报道。方法1选取前列癌患者的组织标本70例,前列腺增生组织20例,用免疫组化法测定前列腺癌组织中RANK、OPG、RANKL的表达,分析组织中RANK、RANKL、OPG的表达水平与前列腺癌临床病理特征及转移的关系。2对其中40例前列腺癌、20例前列腺增生病人血清、组织中OPG、sRANKL的表达水平进行了ELISA检测。分析血清及组织中sRANKL、OPG的表达水平与临床病理特征及转移的关系；血清与组织中sRANKL、OPG表达的相关性。3选用三种人类前列腺癌细胞株：PC3、DU145、LNCaP及人类正常前列腺细胞株RWPE2,用Western、RT-PCR法检测了其中RANK的蛋白及mRNA表达情况。4在Transwell侵袭试验做细胞因子sRANKL对前列腺癌细胞株PC3、DU145、LNCaP,正常前列腺细胞株RWPE2侵袭性影响,观察OPG对其侵袭能力的影响。5 RANK的RNA干扰实验进一步明确RANK/RANKL途径对细胞侵袭性的影响：特异性靶向RANK的小干扰RNA,将其转染至前列腺癌细胞系中,用Transwell侵袭试验观察RANK基因被沉默对前列腺癌细胞侵袭性的影响。结果：1免疫组化染色显示：RANK、RANKL、OPG蛋白在良性前列腺增生中不表达、或少量微弱表达,在前列腺癌组织中高表达。在发生淋巴结转移的前列腺癌、高水平PSA、高表达AR的前列腺癌中,RANK、RANKL、OPG的表达水平增高（P<0.05）。而在前列腺癌骨转移时RANK、RANKL、OPG的表达水平显着增高（P<0.01）。2 ELISA结果显示；组织中sRANKL、OPG在前列腺癌中的表达高于前列腺增生组织（P<0.05）。前列腺癌组织中sRANKL、OPG的表达在发生骨转移的、高水平PSA、高表达AR的前列腺癌中,表达水平增高（P<0.05）。血清中OPG在前列腺癌中的表达高于前列腺增生组织（P<0.05）。在发生骨转移的、高水平PSA、高表达AR的前列腺癌中,血清OPG水平增高（P<0.05）;而血清sRANK的表达在前列腺癌及前列腺增生中无明显差异,sRANKL在前列腺癌的表达与年龄、Gleason评分、肿瘤分期、PSA水平、AR的表达情况均无关。血清OPG与组织中OPG含量存在正相关.回归方程为：y=0.9588x+0.4512（R2=0.7504,P<0.05）。血清RANKL水平和组织RANKL水平未见明显相关性。3用Western blot、RT-PCR检测前列腺癌细胞系PC3、DU145、LNCaP及正常前列腺细胞系RWPE2中RANK蛋白及mRNA表达情况的表达：在前列腺癌细胞系中RANK蛋白及mRNA水平均显着高于正常前列腺细胞系中表达。4 Transwell侵袭实验观察RANKL、OPG对前列腺癌细胞侵袭性的影响：2.5μg/mlRANKL可显着提高RANK高表达的PC-3、LnCap、DU145（P<0.05）,对RANK低表达的RWPE2细胞系的侵袭能力无影响。2.5μg/mlRANKL+1Oμg/mlOPG可抑制由RANKL提高的侵袭能力（P<0.05）。5特异性靶向RANK的小干扰RNA，RANK基因被沉默后,用transwell侵袭实验进一步明确RANK/RANKL信号途径对前列腺癌细胞侵袭性的影响：在三种前列腺癌细胞株中,SiRNA-2从10pg／ml浓度就可以显现出抑制侵袭效果；100pg/ml浓度可以显示出显着的抑制侵袭效果（P<0.05）。结论1前列腺癌组织中RANKL、RANK、OPG表达与前列腺癌的发生、侵袭、转移密切相关。前列腺癌组织中sRANKL、OPG水平及血清中OPG水平与前列腺癌的发生、侵袭、骨转移密切相关。血清OPG与组织中OPG含量存在正相关。2sRANKL能增强RANK阳性表达的前列腺癌细胞株的侵袭性,OPG做为RANKL的可溶性诱骗受体,阻止RANKL与RANK结合,能起到抑制前列腺癌细胞的侵袭性和骨转移的作用。
王建浩[6]（2010）在《低剂量辐射与RNA干扰对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1相关因子骨唾液酸蛋白（BSP）影响的初步研究》文中研究指明目的:骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein,BSP）是存在于细胞外基质中的一种主要由成骨细胞、破骨细胞及肥大软骨细胞合成的高度磷酸化和糖基化的分泌性非胶原蛋白,BSP作为一种新的成骨细胞诱导剂,在成骨细胞增殖和分化过程中起到非常重要的作用。本文旨在通过低剂量辐射与RNA干扰技术以改变MC3T3-E1小鼠成骨样细胞BSP的表达水平,以判定BSP表达变化对细胞包括对相关基因表达的影响,从而对BSP基因在成骨增殖和分化过程中的相关功能进行初步研究。方法:1.对MC3T3-E1细胞进行0Gy、0.1Gy、0.5Gy、1.0Gy低剂量辐射:24h后进行MTT测吸光值,观察细胞在5天内的增殖情况差异;24h后,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡差异;24h后换液培养至14d,RT-PCR检测4d、7d、10d、14d时cbfa1、BSP和OCN的表达差异。2.设计四条可能的小干扰RNA（siRNA）,分别将这四段siRNA插入到RNA干扰载体pGPU6/GFP/Neo中构建成四条干扰载体pGPU6/GFP/Neo-siBSP-1,2,3,4。采用阳离子脂质体包裹质粒转染的方法,设计梯度转染体系,以最高转染效率和最低死亡率为原则,优化表达载体转染MC3T3-E1细胞的条件。3.按最优转染体系通过脂质体介导四条载体转染到MC3T3-E1细胞,转染后48小时抽提RNA,RT-PCR鉴定BSP基因在转录水平的改变;筛选出其中一条对BSP抑制作用最佳的载体。利用已构建并筛选出的载体pGPU6/GFP/Neo-siBSP转染MC3T3-E1细胞,转染后48小时抽提总RNA,RT-PCR鉴定BSP基因在转录水平的改变,同时利用RT-PCR鉴定cbfa1、BSP和OCN mRNA的改变。结果:1.与空白对照组比较,第2d后,0.1Gy、0.5Gy的辐射对MC3T3-E1细胞增殖能力没有明显影响（P>0.05）,而1.0Gy辐射对MC3T3细胞增殖能力有显着的促进作用（P﹤0.05）;与空白对照组比较,1.0Gy可以明显促进细胞进入G2/M期,促进细胞增殖,同时可以明显抑制细胞凋亡;与空白对照组比较,0.1Gy,0.5Gy及1.0Gy的辐射均能上调cbfa1、BSP和OCN mRNA的表达趋势,且随辐射剂量的增加而增强,其中1.0Gy组的表达显着高于空白对照组（P﹤0.05）。2.成功构建四条BSP干扰表达载体。分别对4种转染体系转染效率进行比较,综合最高转染效率与最低细胞死亡率的优化原则,最终选择0.8μg质粒/2μl脂质体的转染比例。3.成功筛选出一条对BSP基因抑制效率较高的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo-siBSP-1。RT-PCR结果显示:转染了有效干扰载体pGPU6/GFP/Neo-siBSP-1的细胞,BSP基因表达下调,cbfa1和OCN mRNA表达量明显下调。结论:1.低剂量辐射剂量1.0Gy可明显上调BSP表达,同时促进MC3T3-E1细胞增殖,抑制细胞凋亡,上调cbfa1和OCN mRNA的表达,为研究BSP与其它相关基因之间的关系提供了可能,同时上调BSP表达有利于骨损伤疾病的研究。2.成功构建四条BSP干扰表达载体。在最优转染条件下,采用瞬时转染方法,成功筛选出一条有效的BSP基因的siRNA载体,继而可以转染MC3T3-E1细胞,并抑制cbfa1和OCN等成骨相关基因的表达,为研究BSP在成骨细胞增殖和分化过程中的作用提供了技术支持,为进一步研究siRNA干扰BSP表达在临床上的应用治疗BSP相关疾病提供了实验基础和理论支持。
王艳[7]（2008）在《鸡核因子-κB受体激活物配基（chRANKL）基因的克隆、表达及生物学活性研究》文中认为核因子-KB受体激活物配基RANKL（receptor activator of NF-κB ligand, RANKL）最早发现于哺乳动物,属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族的一员,它参与破骨细胞形成的全过程：分化、融合、生存、激活,被认为是介导各种刺激因子诱导破骨细胞生成及功能信号传导的最终因子。鉴于RANKL在骨代谢中的重要调节作用,本文旨在克隆表达蛋鸡RANKL蛋白,并对其生物学活性进行研究,为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松发生机制提供新的思路。试验Ⅰ、chRANKL编码区基因的克隆与序列分析应用RT-PCR方法从体外培养鸡胚成骨细胞中扩增得到鸡RANKL编码基因（Genbank登录号EF379383）,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定及DNA序列测定。结果表明,扩增得到1203 bp的RANKL序列,扩增序列与GenBank上报道的预测序列具有很高的相似性,达到99.3%,与人、小鼠、犬的一致性分别为55.4%、52%和55.7%,进化树分析结果表明RANKL作为机体内调节骨代谢一种重要细胞因子,在进化中高度保守。RANKL基因的成功扩增为深入研究骨质疏松等代谢性骨病的发病机制及防治开辟广阔的领域。试验Ⅱ、chRANKL的原核表达和纯化设计一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因,然后构建鸡RANKL原核表达载体pET-32a（+）-chRANKL,通过IPTG诱导表达重组鸡RANKL成熟蛋白,经SDS-PAGE电泳分析,原核表达产物为64 kD的重组蛋白,并主要以包涵体形式存在,western blot分析结果显示,表达得到的重组蛋白具有良好的抗原结合活性。试验Ⅲ、chRANKL诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的研究建立简便有效的鸡胚骨髓破骨样细胞的诱导培养体系,获得高密度高纯度的破骨细胞,为进一步研究笼养蛋鸡骨质疏松症的发病机理奠定基础。剔取18日龄鸡胚胫骨和肱骨,用注射器抽取α-MEM培养液冲洗骨髓腔,获取的细胞悬液接种于培养板。2h后吸取未贴壁细胞,离心重悬,使细胞密度为2×106/mL,接种于培养板,加入诱导剂RANKL和M-CSF,成功获得具有破骨细胞特征的细胞：细胞大,多核；TRAP染色阳性,在骨片表面形成吸收陷窝；这表明chRANKL能诱导鸡破骨细胞前体细胞形成OLC,说明chRANKL在鸡OC分化、成熟过程中起重要作用。但加入chOPG后,则大大降低了OLC的形成以及OLC的骨吸收作用,表明chOPG阻断了RANKL介导的OC分化和骨吸收作用。试验Ⅳ、chRANKL在毕赤酵母中的表达和生物学活性研究设计另一对引物用于克隆鸡RANKL成熟蛋白编码基因,然后构建鸡RANKL真核表达载体pPICZa-A-chRANKL,以电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物,表达产物相对分子量为54kDa,表达量约为220mg/L,经Western印迹验证,表达得到的蛋白能够与抗人RANKLIgG反应,表明通过酵母表达得到的蛋白具有较好的免疫原性。试验V、chRANKL酵母冻干产物体内、体外对成熟破骨细胞的影响50羽青年ISA蛋鸡分为5组,A组为对照组,只注射生理盐水,B、C、D、E组分别注射剂量为0.01 mg/kg,0.05 mg/kg,0.1 mg/kg,0.5 mg/kg的RANKL酵母表达冻干产物水溶物。2h后静脉采血,测定血浆钙离子浓度。同时将浓度为2 ng/mL,6ng/mL,10 ng/mL分别加入体外培养的成熟破骨细胞中,培养第3d观察骨吸收陷窝的变化,并测定培养液中钙离子浓度。结果表明,体内注射RANKL后,血浆钙离子浓度升高,且呈剂量依赖性增加。不同浓度的RANKL加入到体外培养的成熟破骨细胞能使骨吸收指数和骨吸收陷窝面积均呈剂量依赖性增加,同时钙离子浓度也有显着差异。结论：RANKL除了能诱导形成破骨样细胞外,也能刺激成熟破骨细胞,使之骨吸收功能增强。
刘幼硕[8]（2007）在《脂联素调节成骨细胞OPG/RANKL的表达和TIMP-3诱导成骨细胞凋亡》文中研究说明第一部分脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响及细胞信号转导机制研究第一章脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响目的：脂联素（adiponectin）是脂肪细胞的特异性分泌因子，成骨细胞可表达脂联素受体，但脂联素对成骨细胞的作用机制尚未阐明。本研究首次探讨脂联素对人成骨细胞护骨素（osteopotegrin，OPG）和核因子κB受体活化素配体（receptor activator of NF-kappaB ligand，RANKL）表达的作用。方法：RT-PCR及Western印迹检测体外培养的人成骨细胞的脂联素受体（adiponectin receptor，AdipoR）mRNA及AdipoR蛋白表达。分别用0、3μg／ml、10μg／ml和30μg／ml脂联素干预人成骨细胞48 h，或分别用0、30μg／ml脂联素干预人成骨细胞0h、12h、24h和48h，干预前后OPG、RANKL的mRNA及蛋白表达分别用Real-time PCR和ELISA检测。结果：（1）人成骨细胞可表达AdiopR1 mRNA、AdiopR1蛋白和AdiopR2 mRNA；（2）脂联素呈剂量和时间依赖性地抑制人成骨细胞OPG的mRNA及蛋白表达；（3）脂联素呈剂量和时间依赖性地促进人成骨细胞RANKL的mRNA及蛋白表达。结论：脂联素可调节成骨细胞OPG和RANKL的表达，是骨代谢的调节因子之一。第二章脂联素对人成骨细胞OPG和RANKL表达影响的细胞信号转导机制目的：研究脂联素对人成骨细胞OPG和RANKL表达的细胞信号转导机制。方法：用小分子RNA干扰技术（siRNA）抑制AdiopR1表达，用30μg／ml脂联素单独干预人成骨细胞48h，或丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号转导阻断剂SB203580（p38MAPK阻断剂）或SP600125（c-Jun氨基端激酶，JNK阻断剂）在脂联素干预前2h加入，以观察脂联素对成骨细胞OPG和RANKL作用的细胞信号转导机制。OPG和RANKL mRNA的表达用Real-time PCR检测，MAPK中JNK、p38、ERK1／2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1／2用Western印迹检测。结果：脂联素通过AdipoR1激活p38MAPK；用AdipoR1-siRNA沉默AdipoR1的表达可阻断脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用；预先给予MAPK阻断剂SB203580阻断p38后，脂联素对成骨细胞RANKL和OPG的作用亦被阻断。结论：在成骨细胞中，脂联素通过AdipoR1／p38途径促进RANKL的分泌，并抑制OPG的表达。第二部分重组组织金属蛋白酶抑制因子-3蛋白诱导鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡目的：研究重组组织金属蛋白酶抑制因子-3（tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3，TIMP-3）蛋白对鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡的影响及细胞信号转导途径。方法：用100μg／L、200μg／L、400μg／L、600μg／L TIMP-3单独干预MC3T3-E1细胞，以观察TIMP-3对MC3T3-E1细胞凋亡的影响；600μg／L TIMP-3联合MAPK信号转导阻断剂SP600125（JNK阻断剂）、SB203580（p38阻断剂）或PD098059（ERK1／2阻断剂）干预MC3T3-E1，以观察TIMP-3作用于MC3T3-E1的细胞信号转导途径。细胞存活率和凋亡用MTT及ELISA检测，凋亡相关基因Fas、Fasl、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-8、cytochrome c的表达，以及丝裂原活化蛋白激酶JNK、p38、ERK1／2及其磷酸化蛋白p-JNK、p-p38、p-ERK1／2用Western印迹检测。结果：MTT及ELISA检测提示，TIMP-3呈剂量依赖性抑制MC3T3-E1细胞存活，呈剂量和时间依赖性诱导MC3T3-E1细胞凋亡。TIMP-1促进Fas、Fasl蛋白质表达，诱导cytochrome c的释放及caspase-8、caspase-3的活化，而对Bax、Bcl-2蛋白质的表达无影响。TIMP-3促进p38和ERK 1／2磷酸化，而PDO98059（ERK1／2阻断剂）和SB203580（p38阻断剂）消除p38和ERK 1／2介导的促凋亡作用。结论：TIMP-3通过死亡受体Fas途径介导成骨细胞MC3T3-E1凋亡，并通过诱导p38、ERK 1／2磷酸化的途径参与，促进MC3T3-E1细胞凋亡。
胡云峰[9]（2007）在《淫羊藿苷对体外培养的鸡骨细胞的影响》文中研究指明淫羊藿（Herba Epimdii）为小檗科植物，具有补肾壮阳，强筋骨，祛风湿的功效。众多临床治疗表明，含有淫羊藿的方药有助于骨折愈合和骨代谢疾病的治疗。本实验主要研究淫羊藿的主要成分淫羊藿苷对体外培养的鸡胚成骨细胞和破骨细胞的药理作用，诣在揭示淫羊藿苷对鸡骨代谢的影响，为淫羊藿应用于笼养蛋鸡骨质疏松症的防治提供理论依据。1鸡胚骨髓源性破骨样细胞的诱导培养建立简便有效的鸡胚骨髓破骨样细胞的诱导培养体系，获得高密度高纯度的破骨细胞，为研究淫羊藿苷及其他药物对鸡破骨细胞的作用和建立笼养蛋鸡骨质疏松症试验平台奠定基础。剔取18日龄鸡胚胫骨和肱骨，用注射器抽取α-MEM培养液冲洗骨髓腔，获取的细胞悬液接种于培养板。2 h后吸取未贴壁细胞，离心重悬，使细胞密度为2×106／mL，接种于培养板，加入诱导剂1，25-羟胆钙化醇，地塞米松，成功获得具有破骨细胞特征的细胞：细胞大，多核；TRAP染色阳性，在骨片表面形成吸收陷窝。’2淫羊藿苷对鸡胚成骨细胞增殖和分化的影响体外培养鸡胚额骨成骨细胞，研究淫羊藿苷对成骨细胞增殖和分化的影响。加入不同浓度的淫羊藿苷，分别观察24 h、48 h、72 h等不同时间段对成骨细胞的影响，结果发现，淫羊藿苷能显着促进成骨细胞的分化，对增殖有微弱的促进作用，但不显着，并呈剂量依赖关系。其中，当淫羊藿苷浓度为20 ng／mL时，作用最为明显。3淫羊藿苷对破骨样细胞形成和功能的影响在成功建立破骨样细胞培养体系的基础上，根据试验二淫羊藿苷的作用浓度，研究淫羊藿苷对破骨样细胞形成和功能的影响。试验开始时，加入不同浓度的淫羊藿苷，观察淫羊藿苷对破骨样细胞形成的影响，结果发现淫羊藿苷显着抑制1，25-羟胆钙化醇，地塞米松诱导破骨样细胞形成的作用；在试验的第八天，即破骨细胞形成时，加入不同浓度的淫羊藿苷，观察淫羊藿苷对破骨样细胞骨吸收功能的影响，结果发现淫羊藿苷显着抑制破骨样细胞的骨吸收功能
葛月宾[10]（2006）在《大豆苷元抗骨质疏松及其壳聚糖长效缓释微球制剂的研究》文中研究表明大豆苷元（daidzein）来源于天然植物大豆，作为一种异黄酮成分，具有弱雌激素样和抗雌激素样作用，广泛用于心脑血管疾病、癌症、骨质疏松等疾病的治疗和预防，具有疗效好、副作用小等特点。为了进一步了解大豆苷元抗骨质疏松的作用，并制成合适给药的新剂型，本文从细胞学和整体动物两个方面进行大豆苷元抗骨质疏松的实验研究，并以壳聚糖为载体材料，设计和研制了大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球，并采用体内外不同方法对其进行了科学的评价。在培养基中添加β-甘油磷酸二钠、L-抗坏血酸和培养时间10、20、30天条件下，采用MTT比色法、碱性磷酸酶活性测定、Ca和P含量测定、茜素红染色和von Kossa染色，考察不同大豆苷元浓度(10-9～10-5M)对MC3T3-E1成骨样细胞增殖、分化和矿化的影响，结果表明大豆苷元能促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化特别是促进矿化的发生和增加矿化的量；建造去卵巢小鼠骨质疏松模型，选择小鼠进行去卵巢手术后1、3和5周模型，与阳性对照药17β-雌二醇比较，考察腹腔注射大豆苷元溶液对小鼠子宫重量系数、股骨病理切片HE染色的骨组织结构和骨组织中细胞因子OPG、RANKL mRNA相对表达水平的影响，从而初步探讨大豆苷元抗骨质疏松的机理，大豆苷元能改善去卵巢导致的小鼠皮毛蓬松、行动迟缓、反应迟钝和精神不振，能增加去卵巢小鼠的子宫重量系数、骨小梁分布密度和骨皮质厚度，并呈现剂量和时间效应，此外大豆苷元能通过调节OPG／RANKL比例从而调节骨重建过程中破骨细胞和成骨细胞的平衡，说明大豆苷元具有抗骨质疏松的作用，这对于了解植物雌激素抗骨质疏松的作用机制具有重要意义。在制剂处方研究前，建立大豆苷元原药的高效液相分析方法，对原料药的理化性质进行了考察。大豆苷元溶液在强光、温度、不同pH介质中72h内的稳定性研究表明药物含量无明显变化，稳定性较好；测定了大豆苷元在H20、0.1mol／LHCl、pH6.8PBS和pH7.4PBS中的平衡溶解度以及不同pH下正辛醇／水系统中，大豆苷元的表观油水分配系数Papp；原料药的稳定性影响因素实验表明，在露置空气、高湿及40℃、60℃条件下，大豆苷元含量无明显变化，在光照条件下含量略有降低。采用Caco-2细胞体外吸收模型，考察了大豆苷元在不同浓度和不同pH条件下穿单分子层细胞膜的渗透速率和吸收百分数，并对其在Caco-2细胞转运实验中产生的代谢物进行了初步测定，大豆苷元跨单分子层细胞膜的转运不受介质pH和浓度的影响，与仅通过经细胞通道转运的标记化合物普萘诺尔的Papp值相近，预测大豆苷元体内吸收良好，通过β-葡萄糖醛酸酶水解，在转运介质和Caco-2单分子层细胞膜中均能检测到少量代谢物，证明存在葡萄糖醛酸化、硫酸酯化代谢物等。采用乳化／戊二醛交联法制备载药壳聚糖微球，以司盘-80为乳化剂和液体石蜡为油相，大豆苷元经微粉化后以微晶状态混悬于壳聚糖水溶液中为水相，乳化后包裹入乳滴继而交联，形成的微球外形圆整，分散性好，载药量高。经单因素考察筛选出影响微球粒径、粒径分布、载药量及释放快慢的处方因素和工艺条件包括聚合物浓度、药物与聚合物投料比和乳化转速，进一步采用球面对称设计-效应面优化法对其进行优化，经专业统计Statistica进行数据处理。优化的微球中位径、跨距、载药量分别为70.40μm、0.526、30.48％，这些实际测定值与模型方程拟和值偏差较小说明设计和优化结果是成功可靠的。透析袋法释药缓慢，符合表观零级动力学过程。三批样品的重现性试验及稳定性加速试验结果表明，制备的大豆苷元-壳聚糖微球处方稳定、质量可控，达到制剂的设计目的与要求。建立测定肌肉内注射微球后药物残留量的分析方法，小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球后缓慢释药长达35天，突释效应不明显，回收肌肉内注射微球的扫描电镜和注射部位肌肉病理切片表明微球生物组织相容性较好，注射于体内21～35天内发生轻微降解。采用大豆苷元时间分辨荧光免疫分析试剂盒测定血浆内总大豆苷元的浓度，测定大鼠静脉注射大豆苷元溶液和肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球后的体内血浆药时曲线，大豆苷元的体内过程符合二室模型，药物动力学参数k10、t1／2（α）、t1／2（β）、Vc分别为1.17 h-1、0.30h、18.94h、0.46 L／kg。大鼠肌肉内注射微球后血浆药物浓度持久保持35天，其绝对生物利用度为39.02％，较口服大豆苷元有显着性提高。体内外相关性研究表明，微球体内吸收百分数与透析袋释药法测定的体外累积释药百分数有较好的相关性（r=0.9975），微球中药物主要以药物结晶溶解和扩散方式释放，在后期伴有体系降解溶蚀释药特征。建立去卵巢小鼠骨质疏松模型，进行大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球肌肉内注射给药。股骨病理切片HE染色表明，与灌胃大豆苷元混悬液相比，微球组特别是高剂量具有明显改善骨小梁和皮质骨组织结构疏松的作用，提示其在体内药效得到提高。
二、护骨素配基反义RNA对破骨细胞样细胞生成的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、护骨素配基反义RNA对破骨细胞样细胞生成的影响（论文提纲范文）
（1）小鼠成骨细胞分化中表达上调长链非编码RNA的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 第三章 结果 |
| 1 MC3T3-E1细胞成骨分化过程中上调表达lncRNA |
| 2 qRT-PCR测定lncRNA芯片中上调lncRNA的表达 |
| 3 siRNA干扰实验 |
| 4 抑制lncRNA104表达对OC分泌和ALP活性的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）降钙素基因相关肽及其拮抗剂对乳腺癌骨转移微环境的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 CGRP 对人成骨样细胞 MG63 表达 OPG/Rankl 及 Runx2 的影响 |
| 1 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 CGRP 及其受体拮抗剂 CGRP8-37 对乳腺癌骨转移微环境中OPG/Rankl 及 Runx2 表达的影响 |
| 1 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语表 |
| 研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）骨唾液酸蛋白糖基化修饰对成骨的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表论文、承担与参与课题 |
| 资助的基金项目 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（4）鸡RANKL活性区基因的克隆、表达及抗体制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 RANKL的研究进展 |
| 1 RANKL的发现 |
| 2 RANKL的结构和分布 |
| 3 RANKL的功能 |
| 3.1 RANKL对骨代谢的作用 |
| 3.1.1 RANKL是破骨细胞的分化因子 |
| 3.1.2 RANKL对钙代谢的影响 |
| 3.1.3 反义RANKL基因对OC生成的影响 |
| 3.2 RANKL对免疫系统的作用 |
| 4 RANKL的作用机制 |
| 5 RANKL的信号转导通路 |
| 5.1 c-Src途径 |
| 5.2 JNK途径 |
| 5.3 NF-κB途径 |
| 6 RANKL与骨免疫学 |
| 7 RANKL与一些骨疾病的关系 |
| 7.1 RANKL与骨质疏松 |
| 7.2 RANKL与骨折和类风湿性关节炎(RA) |
| 7.3 RANKL与人工关节无菌性松动 |
| 7.4 RANKL与牙周炎 |
| 8 RANKL与蛋鸡骨质疏松症 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第二章 鸡RANKL活性区基因的克隆 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌体和载体 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 聚合酶链反应(PCR) |
| 1.2.3 PCR产物的克隆 |
| 1.2.4 重组载体pMD18-T-RANKL的鉴定和PCR产物序列测定 |
| 2 结果 |
| 2.1 鸡RANKL基因的序列分析 |
| 2.2 鸡RANKL cDNA的扩增 |
| 2.3 重组质粒pMD18-T-chRANKL的构建及酶切鉴定结果 |
| 2.4 重组质粒pMD18-T-chRANKL的序列比较 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 鸡RANKL活性区基因的原核表达、纯化及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌体和载体 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡RANKL原核表达载体的构建 |
| 1.2.2 原核表达载体pET-28a(+)-chRANKL的鉴定 |
| 1.2.3 菌株的诱导表达 |
| 1.2.4 菌株的优化诱导表达 |
| 1.2.5 SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定表达产物 |
| 1.2.6 表达产物存在形式的确定 |
| 1.2.7 包涵体的制备溶解 |
| 1.2.8 表达产物的纯化 |
| 1.2.9 Western blot鉴定表达产物 |
| 2 结果 |
| 2.1 原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2 鸡RANKL的诱导表达鉴定 |
| 2.3 鸡骨钙素诱导表达蛋白形式的鉴定 |
| 2.4 表达产物的纯化 |
| 2.5 样品蛋白浓度的测定 |
| 2.6 鸡RANKL蛋白Western blot分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 抗鸡RANKL多克隆抗体的制备和应用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 方法 |
| 1.3.1 鸡RANKL多克隆抗体的制备 |
| 1.3.2 间接ELISA检测抗体效价 |
| 1.3.3 鸡RANKL蛋白抗体的Western blot鉴定 |
| 1.3.4 鸡RANKL蛋白抗体的免疫细胞化学应用 |
| 1.3.5 鸡RANKL蛋白抗体的Western blot应用 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔抗RANKL 血清效价的测定 |
| 2.2 兔抗RANKL 血清效价的Western blot鉴定 |
| 2.3 成骨细胞培养及鉴定 |
| 2.4 兔抗RANKL 血清的免疫细胞化学应用 |
| 2.5 兔抗RANKL 血清的Western blot应用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 论文创新之处 |
| 致谢 |
（5）前列腺癌中RANK/RANKL/OPG的表达与前列腺癌侵袭及骨转移的关系（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 致谢 |
| 附图 |
（6）低剂量辐射与RNA干扰对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1相关因子骨唾液酸蛋白（BSP）影响的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1、BSP 分子的来源及其结构特征 |
| 2、BSP 的分布 |
| 3、BSP 与糖基化 |
| 4、BSP 与骨代谢 |
| 5、小结 |
| 6、参考文献 |
| 第一部分：低剂量辐射对MC3T3-E1 细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 第二部分：BSP 有效siRNA 表达载体的构建、筛选、鉴定及RNA干扰阻断BSP 表达对成骨相关基因表达的影响 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、参考文献 |
| 结论 |
| 附录 |
| 攻读学位期间本人出版或公开发表的论着、论文 |
| 综述 |
| 致谢 |
（7）鸡核因子-κB受体激活物配基（chRANKL）基因的克隆、表达及生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 RANKL的研究进展 |
| 1 RANK的发现 |
| 2 RANKL的结构和分布 |
| 3 RANKL的信号传导通路 |
| 4 RANKL分子功能 |
| 5 RANKL与骨免疫学 |
| 6 RANKL与一些骨疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 第二章 破骨细胞的研究进展 |
| 1 破骨细胞的来源分化及其骨吸收机制 |
| 2 破骨细胞分化的信号传导途径 |
| 3 OC、OB的相互调节 |
| 4 破骨细胞与骨吸收 |
| 5 获得OC方法的研究现状 |
| 6 破骨细胞与骨破坏疾病的治疗策略 |
| 参考文献 |
| 下篇 试验研究 |
| 第三章 chRANKL编码区的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 chRANKL的原核表达和纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 chRANKL诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第六章 chRANKL在毕赤酵母中的表达及生物学活性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第七章 chRANKL酵母冻干产物体内、体外对成熟破骨细胞的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 课题展望 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文总结 |
| 本文创新之处 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 发表论文 |
（8）脂联素调节成骨细胞OPG/RANKL的表达和TIMP-3诱导成骨细胞凋亡（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 论文正文 |
| 缩略词 |
| 前言 |
| 第一部分 脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响及细胞信号转导机制研究 |
| 第一章 脂联素对成骨细胞OPG和RANKL表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二章 脂联素对人成骨细胞OPG和RANKL表达影响的细胞信号转导机制 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第一部 分参考文献 |
| 第二部分 重组组织金属蛋白酶抑制因子-3蛋白诱导鼠成骨细胞MC3T3-E1凋亡 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部 分参考文献 |
| 结语 |
| 综述 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）淫羊藿苷对体外培养的鸡骨细胞的影响（论文提纲范文）
| 目录 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 破骨样细胞的诱导培养及其机制的研究进展 |
| 1 破骨样细胞的诱导培养及鉴定 |
| 1.1 破骨样细胞 |
| 1.2 培养方法 |
| 1.3 鉴定方法 |
| 2 诱导机制 |
| 2.1 ODF与M-CSF |
| 2.2 1,25-羟胆钙化醇 |
| 2.3 IL-6 |
| 2.4 TNF-α |
| 2.5 IL-1 |
| 2.6 白三烯B4 |
| 2.7 PTH及PTHrP |
| 2.8 TGF-β |
| 2.9 PGE_2 |
| 第二章 淫羊藿对骨代谢作用的研究进展 |
| 1 淫羊藿 |
| 2 淫羊藿对骨代谢的作用 |
| 2.1 淫羊藿对骨代谢的直接作用 |
| 2.2 淫羊藿对骨代谢的间接作用 |
| 下篇 研究内容 |
| 第三章 鸡胚骨髓源性破骨样细胞的分离培养与鉴定 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞的形态学变化 |
| 2.2 OLO和骨陷窝测定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第四章 淫羊藿苷对鸡胚成骨细胞增殖和分化的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 鉴定结果 |
| 2.2 不同浓度淫羊藿苷对成骨细胞增殖率的影响 |
| 2.3 不同浓度淫羊藿苷对成骨细胞ALP活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 第五章 淫羊藿苷对破骨样细胞形成和功能的影响 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 细胞的形态学变化 |
| 2.2 OLC计数 |
| 2.3 骨陷窝测定结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同浓度的淫羊藿苷对破骨样细胞形成的影响 |
| 3.2 不同浓度的淫羊藿苷对破骨样细胞骨吸收的影响 |
| 3.3 淫羊藿苷浓度的选择 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
| 全文结论 |
| 创新之处 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（10）大豆苷元抗骨质疏松及其壳聚糖长效缓释微球制剂的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 大豆苷元抗骨质疏松的细胞学和整体动物研究 |
| 一 材料与仪器 |
| 二 方法与结果 |
| 1 大豆苷元对MC3T3-E1细胞的实验研究 |
| 1.1 MC3T3-E1细胞的培养 |
| 1.2 力豆苷元对MC3T3-E1细胞的增殖作用 |
| 1.3 大豆苷元对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性的影响 |
| 1.4 大豆苷元对MC3T3-E1细胞Ca和P含量的影响 |
| 1.5 大豆苷元对MC3T3-E1细胞钙沉积的影响 |
| 2 大豆苷元对去卵巢小鼠骨质疏松的实验研究 |
| 2.1 实验动物和骨质疏松模型的建造 |
| 2.2 给药方案 |
| 2.3 对去卵巢小鼠体重、子宫重量系数和股骨湿重的影响 |
| 2.4 对去卵巢小鼠股骨病理切片的影响 |
| 2.5 对去卵巢小鼠股骨OPG和RANKL mRNA相对表达水平的影响 |
| 三 讨论与小结 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 四 参考文献 |
| 第二章 大豆苷元制剂的处方前研究 |
| 一 材料与仪器 |
| 二 方法与结果 |
| 1 高效液相分析方法的建立 |
| 2 大豆苷元溶液的稳定性 |
| 3 大豆苷元平衡溶解度的测定 |
| 4 大豆苷元表观油/水分配系数的测定 |
| 5 化学稳定性影响因素试验 |
| 6 Caco-2细胞用于大豆苷元吸收的研究 |
| 6.1 Caco-2细胞的培养 |
| 6.2 大豆苷元对Caco-2细胞的毒性实验 |
| 6.3 大豆苷元对Caco-2细胞酶活性的影响实验 |
| 6.4 Caco-2单分子层细胞膜形成的鉴定 |
| 6.5 顶面侧不同pH介质对大豆苷元溶液转运的影响 |
| 6.6 顶面侧不同大豆苷元溶液浓度对其转运的影响 |
| 6.7 大豆苷元代谢物的测定 |
| 三 讨论与小结 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 四 参考文献 |
| 第三章 大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球制剂的制备与评价 |
| 一 材料与仪器 |
| 二 方法与结果 |
| 1 壳聚糖微球中大豆苷元含量测定方法的建立 |
| 2 壳聚糖微球中大豆苷元释放度测定方法的建立 |
| 2.1 增溶剂对大豆苷元的增溶作用 |
| 2.2 桨法 |
| 2.3 透析袋释药法 |
| 3 微球粒径及其分布和包封率的测定方法 |
| 4 壳聚糖的释放实验 |
| 5 大豆苷元-壳聚糖微球的制备方法 |
| 6 处方和工艺的设计与优化 |
| 6.1 单因素考察 |
| 6.2 球面对称设计-效应面优化法设计和优化处方 |
| 6.3 最优处方的制备和评价 |
| 7 壳聚糖的释放试验 |
| 8 大豆苷元-壳聚糖微球的稳定性试验 |
| 三 讨论与小结 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 四 参考文献 |
| 第四章 大豆苷元-壳聚糖长效缓释微球制剂的体内过程研究 |
| 一 材料与仪器 |
| 二 方法与结果 |
| 1 肌肉内注射微球后药物残留量分析方法的建立 |
| 2 时间分辨荧光免疫分析法测定血浆内大豆苷元的浓度 |
| 3 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的体内释药试验 |
| 4 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的生物相容性实验 |
| 5 小鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的体内降解实验 |
| 6 大鼠静脉注射大豆苷元溶液的药物动力学研究 |
| 6.1 给药方案及血样采集 |
| 6.2 血药浓度的测定 |
| 6.3 药物动力学参数的计算 |
| 7 大鼠肌肉内注射大豆苷元-壳聚糖微球的药物动力学研究 |
| 7.1 给药方案及血样采集 |
| 7.2 血药浓度的测定 |
| 7.3 绝对生物利用度的计算 |
| 8 体内外相关性研究 |
| 9 肌内注射大豆苷元-壳聚糖微球对去卵巢小鼠骨质疏松的影响 |
| 9.1 去卵巢小鼠骨质疏松模型的制备与给药 |
| 9.2 对去卵巢小鼠子宫重量系数的影响 |
| 9.3 对去卵巢小鼠股骨切片 HE染色的影响 |
| 三 讨论与小结 |
| 1 讨论 |
| 2 小结 |
| 四 参考文献 |
| 全文结论 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
| 附录 |
四、护骨素配基反义RNA对破骨细胞样细胞生成的影响（论文参考文献）
- [1]小鼠成骨细胞分化中表达上调长链非编码RNA的鉴定[D]. 万合. 中南大学, 2014(03)
- [2]降钙素基因相关肽及其拮抗剂对乳腺癌骨转移微环境的影响[D]. 宁琳琳. 苏州大学, 2013(11)
- [3]骨唾液酸蛋白糖基化修饰对成骨的影响[D]. 徐岚. 苏州大学, 2012(05)
- [4]鸡RANKL活性区基因的克隆、表达及抗体制备[D]. 于杨. 南京农业大学, 2011(06)
- [5]前列腺癌中RANK/RANKL/OPG的表达与前列腺癌侵袭及骨转移的关系[D]. 李晓鸣. 兰州大学, 2010(09)
- [6]低剂量辐射与RNA干扰对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1相关因子骨唾液酸蛋白（BSP）影响的初步研究[D]. 王建浩. 苏州大学, 2010(01)
- [7]鸡核因子-κB受体激活物配基（chRANKL）基因的克隆、表达及生物学活性研究[D]. 王艳. 南京农业大学, 2008(06)
- [8]脂联素调节成骨细胞OPG/RANKL的表达和TIMP-3诱导成骨细胞凋亡[D]. 刘幼硕. 中南大学, 2007(01)
- [9]淫羊藿苷对体外培养的鸡骨细胞的影响[D]. 胡云峰. 南京农业大学, 2007(05)
- [10]大豆苷元抗骨质疏松及其壳聚糖长效缓释微球制剂的研究[D]. 葛月宾. 沈阳药科大学, 2006(04)