一、丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达（论文文献综述）
杜晓明[1]（2012）在《人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定》文中研究指明背景和目的Graves病患者血清中的促甲状腺素受体抗体（TRAb）分为:（1）TSH受体刺激性抗体（TSAb）;（2）TSH受体刺激阻断性抗体（TSBAb）;（3）中性TSH受体抗体。随着基因工程技术的发展,运用噬菌体展示技术,通过对人源性促甲状腺素抗体Fab片段抗体库的构建筛选、鉴定,得到TRAb单克隆抗体,为进一步建立TRAb的定量分析方法及探索免疫干预治疗奠定基础。方法（1）从血清TRAb浓度大于40IU/L的自身免疫性甲状腺疾病患者外周血中,抽提总RNA,反转录获取cDNA。以获取的cDNA为模版,PCR法扩增免疫球蛋白分子轻链λ、λ基因及重链Fd基因。将轻链克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库。将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,构建完成组合文库。（2）将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue,用辅助噬菌体M13K07感染,随机的组合文库表达于丝状噬菌体表面,完成噬菌体表面展示。（3）应用固相化抗原（TSHR-N）吸附筛选法通过数轮"吸附—洗脱—扩增"富集噬菌体抗体,筛选阳性克隆。（4）取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,自连接后转化大肠杆菌XL1-B1ue,以IPTG诱导表达可溶性TRAb Fab片段,应用间接ELISA法对表达产物进行鉴定。（5）利用亲和层析柱纯化人源性TRAb Fab片段,Western blotting鉴定纯化产物。（6）对表达较好的阳性克隆进行测序分析,轻链和重链可变区的DNA序列采用双向测序。结果（1）从外周血单个核细胞中抽提得到总RNA,并成功反转录获得cDNA文库。（2）PCR法扩增了大小均为680bp左右的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为1.32 × 105基因抗体库（轻链库）和库容为2.28 × 1 05Fab抗体库（组合文库）。（3）通过噬菌体表面展示技术,在辅助噬菌体M13K07的帮助下,在组合文库的基础上获得了富含TRAb Fab片段的人源性噬菌体抗体库。（4）以TSHR-N为抗原,通过固相化抗原吸附筛选法对构建的Fab噬菌体抗体库进行5轮富集筛选,初步成功筛选到特异性TRAb Fab噬菌体抗体,富集效应约77倍。（5）通过Phage-ELISA检测,结果鉴定出了具有抗原结合活性的单克隆。提取阳性克隆的噬菌体DNA,切除gⅢ基因片段,实现了可溶性人源性TRAb Fab片段的表达。（6）利用Ni2+金属敖合层析法获得纯化的人源性TRAb Fab片段。（7）间接ELISA法检测结果显示:制备的可溶性人源性TRAb Fab片段具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。（8）经GenBank检索DNA序列分析,证实该克隆的轻链可变区与人的免疫球蛋白λ链同源性达到94.4%,重链可变区与人的免疫球蛋白IgG重链VH4同源性为88.9%。结论本研究通过噬菌体展示技术成功构建了人源性TRAb Fab片段组合文库,并通过固相化抗原吸附筛选法筛选获得阳性克隆,实现了可溶性TRAb Fab片段的表达,基因测序证实其轻重链与人免疫球蛋白可变区具有同源性,ELISA结果显示其具有特异性结合TSHR-N端的免疫学活性。
陈得峰[2]（2009）在《水稻白叶枯病菌HarpinXoo单克隆抗独特型抗体的制备、筛选及其“内影像”特性研究》文中指出位于革兰氏阴性植物病原细菌染色体上的hrp基因簇决定其在非寄主植物上的过敏反应和在寄主植物上的致病性。Hrp基因簇包括编Ⅲ型泌出通道的基因、调节基因和编码效应蛋白的基因。Harpins是由革兰氏阴性植物病原细菌产生并受hrp基因调节的一类非特异性激发子,具有共同的特征：富含甘氨酸、对热稳定对蛋白酶K敏感。它们通过III型泌出通道分泌到细胞膜外并转运到寄主植物的细胞质中,能够在寄主植物上引起致病性,在非寄主植物上引起过敏反应,诱导植物抗病,抗虫,促生长以及提高作物的产量与改善作物品质。Harpinxoo是由水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae的hrfl基因编码的蛋白质,大小为139个氨基酸（15.6 kDa）,具有与其它harpins类似的生物学活性,但在结构和组成上,它显示一些其它harpins不具有的独特性质,如含有其它harpins不具备的半胱氨酸等。植物拥有一套天然的免疫系统,使得它们能够抵御外界病原物的侵染。高等植物的HR,快速在病原物侵染点形成坏死斑,死亡细胞可以将侵入寄主体内的病原物限制在侵染点周围,阻止病原物的进一步扩展而实现局部抗病性,是植物针对多种病原物的主动防御,可进一步激活植物抗病防卫信号通路,使植物获得对此后侵入的多种类型病原物的系统抗病性（systemic acquired resistance, SAR）。当harpin被注射到非寄主植物叶片中时,最显着的特征就是引起过敏反应,而harpin的活性位点是如何被植物细胞识别,在什么部位识别,目前还不清楚。在本研究中,我们引入了一种研究植物-病原菌互作的新方法,应用基于Jerne的免疫网络学说制备出的单克隆抗独特型抗体模拟harpin的活性位点,探索harpin在非寄主植物中受体。本论文着重对以下几方面进行了研究。1 HarpinXoo蛋白的提取与纯化在本研究中,作者从水稻白叶枯病菌PX099基因组DNA中扩增出hrfl基因,用Ndel和HindⅢ叹酶切,随后插入到到pET30a（+）载体的NdeⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,获得了重组质粒pET30a（+）-hrf1,转化宿主菌BL21 （DE3）表达融合蛋白。表达菌株E. coli BL21/pET-hrf1在37℃,225rpm经1mM IPTG诱导培养3小时后收集菌体,在100℃沸水中煮10分钟,提取Harpinxoo蛋白,离心分离菌体,蛋白溶解在提取缓冲液中。SDS-PAGE电泳分析表明,获得了大小为16.8kDa蛋白质。注射烟草叶片,引起过敏反应,说明提取到的蛋白为Harpin。用Ni柱对粗蛋白进行纯化,最终获得了单一条带的Harpin蛋白。2免源多克隆抗-Harpinxoo抗体（Abl）的制备与纯化500μg纯化的Harpinxoo溶解于灭菌的PBS中,与等体积的福氏完全佐剂混合乳化后皮下多点注射与肌肉注射交叉免疫新西兰大白兔,随后的加强免疫用200μg抗原与福氏不完全佐剂混合乳化,每两周免疫一次。六周后,采集兔血清用间接ELISA法测定效价,以免疫前三天采集的阴性血清作对照。Protein A/G亲合层析柱纯化兔源多克隆抗血清,获得多克隆抗-Harpinxoo IgG。HarpinXoo注射烟草引起的过敏反应能被兔源多克隆抗体Ab1抑制,甚至完全阻止,说明Ab1结合harpin的一个或多个活性位点,而这些活性位点可能是非寄主植物中受体的结合位点。3体外、体内都具有抑制活性的单克隆抗-Harpinxoo抗体的制备Balb/c小鼠接受四次免疫注射纯化的Harpinxoo后,选取效价最高的一只小鼠做融合,制备杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选,有限稀释法亚克隆,两轮筛选后获得6株单克隆抗Harpinxoo杂交瘤细胞（2A10、3H12、4B2、4F7.6G4、7F11）。ELISA叠加实验表明,Harpinxoo上的四个表位被6株单克隆细胞株所识别,其中被6G4识别的表位为Harpinxoo引起烟草过敏反应活性位点。体外研究表明,6G4能够与烟草叶片总蛋白竞争性地结合Harpinxoo,最重要的是在体内,6G4能够部分抑制Harpinxoo引起的烟草过敏反应。6G4显然为一个非常合适的免疫原来制备具有Harpinxoo活性位点“内影像”特征的抗独特型抗体。阐明6G4在体外、体内的反应特性将有助于鉴定引起烟草过敏反应的harpin的关键区域。4具有Harpinxoo"内影像”特征的抗独特型抗体的制备与特性分析用固定化的胃蛋白酶消解纯的兔源多克隆抗体Ab1获得F（ab’）2片段,具有抗原结合活性的F（ab’）2被用作免疫原来制备具有Harpinxoo“内影像”特征的抗独特型抗体。为制备单克隆抗独特型抗体Ab2, F（ab’）2片段和福氏佐剂乳化后免疫小鼠。随着免疫次数的增加,小鼠血清中抗独特型抗体的浓度也在增加。Ab2能够抑制Ab1与harpin的结合,当抑制率达到50%时,三只小鼠血清的稀释倍数分别为：鼠1（917）<鼠2（1094）<鼠3（2540）。因此我们选取竞争抑制效果最好的小鼠3进行细胞融合。应用间接ELISA法和竞争抑制ELSIA法筛选具有Harpinxoo“内影像”特征的抗独特型抗体。用间接ELISA法初步筛选,获得224株抗Ab1的阳性克隆,进一步用竞争ELSIA法筛选,抑制率达到50%以上的细胞株仅获得23株。经过第一轮筛选,具有全部抗独特型抗体的特征并能稳定分泌抗体的细胞株6B2被筛选出来。竞争ELISA结果表明,6B2与Ab1的结合受harpin抑制,但不受其它无关蛋白如：BSA抑制,这进一步可以说明6B2与Ab1的结合位点可能为独特型结合位点。6B2与Harpinxoo竞争性地结合非寄主植物中推定的harpin受体,这是本研究的关键所在。6B2与受体的结合位点和harpin与受体的结合位点可能为同一个活性位点或非常相近的活性位点。6B2与非寄主植物中推定受体的结合可能是交叉反应的结果,或者受体构象发生改变结果,然而,也有可能是两种机制共同作用的结果。6B2免疫新西兰大白兔进一步诱导出与兔源多克隆抗体Ab1相同或相似活性的Ab3,这就佐证了我们制备的抗独特型抗体6B2确实具有Harpinxoo的“内影像”特征。这些结果表明,6B2具有抗原相似性,即,抗独特型抗体6B2可以充当Harpinxoo抗原的“内影像”,因此,根据Jerne的系统命名法,6B2可以归类为Ab2β。总之,应用抗独特型抗体进行抗原模拟是探索生物体内含量非常低的受体的一种可行方法。这种方法涉及到多种学科,如：蛋白质化学、酶学、免疫学以及蛋白质-蛋白质互作,其应用也是非常广泛的,如：功能模拟,用作探针鉴定受体和免疫组织化学定位。
马巍娜[3]（2009）在《盐酸克伦特罗单链抗体（scFv）的筛选与表达》文中提出当前,我国食品安全问题突出,生物性危害、化学性危害等问题严重。其中,最突出的化学性危害是贯穿整个农业产业链生产、加工和贮运全程的安全问题。现代社会的发展给人们带来丰富、高产的农产品的同时,种植和养殖业生产过程中不合理的使用农药、化肥、兽药,也带来了农产品中农药、兽药、违禁的饲料添加剂残留等超标,给人类健康造成危害。预防食品化学性危害的关键技术之一是建立快速检测方法。当前,快速检测方法主要采用酶学、免疫学等方法。这些方法的关键问题是要获得可用来检测的抗体。噬菌体抗体库表面展示技术（Phage Display Antibody Library）是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体库能够模拟天然抗体库,不需要免疫人和动物,提供了不经免疫制备抗体的可能;而且它能够模拟抗体亲和力成熟过程,可通过链置换、PCR错配或随机致突变技术改变抗体亲和力,因此噬菌体抗体库表面展示技术在获得难以得到的抗体方面具有着巨大的潜力。近些年对制备化学物质抗体的研究种类很多,而利用噬菌体抗体库表面展示技术完成制备的报道少见。农药、兽药抗体制备技术平台的建设是标准抗体资源库和快速检测方法建立的基础和关键。而小分子的农药、兽药,由于本身没有免疫原性,常规方法很难获得理想的免疫效果,因此建立一种优化的新的技术体系,是获得高质量单克隆抗体的重要保证。本实验以盐酸克伦特罗为模型分子,探索利用噬菌体抗体库表面展示技术筛选化学污染物的单链抗体,建立小分子弱抗原物质抗体制备的方法,为进一步研究奠定基础。第一部分:以盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体盐酸克伦特罗（Clenbuterol,CLB）,俗名瘦肉精,是一种β2-受体激动剂,化学结构稳定,污染的肉食品,如猪肝中的盐酸克伦特罗要经过126℃油煎5min才能破坏一半,常规烹调对肉食品中CLB不起破坏作用。我国从1997年发文明令禁止使用“瘦肉精”。为了建立盐酸克伦特罗的快速检测方法,获得盐酸克伦特罗特异性抗体,我们采用噬菌体表面展示技术,以盐酸克伦特罗为固相包被抗原,将包被板处理后,从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选过程,获得特异性较强的CLB单链可变区抗体。主要结果如下:1.从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到5株噬菌体抗体克隆。2. ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有一定特异性。3.经NotⅠ/SfiⅠ双酶切后,证明得到的片段大小与预想目标片段大小一致。第二部分:以生物素化盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体每个链霉亲合素（Streptavidin,SA）分子具有4个可与生物素分子结合的位点,其结合常数为1015mol/L。约为抗原抗体间Ka (105～1011 mol/L)的1万倍以上。利用生物素具有结合亲和素、亲和力高的特点,以生物素标记抗原,再通过亲和素-生物素的架桥把抗原与抗体结合起来可以提高检测灵敏度,抗原分子经生物素化后,其结合抗体的活性不受影响。本部分实验利用生物素标记后的克伦特罗做为包被抗原,从噬菌体抗体库中筛选其特异性噬菌体单链抗体。为避免非特异性抗体的产生,设计两种方案进行实验。方法（1）,将生物素化靶抗原与链亲和素结合,直接从噬菌体抗体库中筛选特异性的噬菌体抗体;方法（2）,为排除非特异性结合抗体,将扩增的噬菌体抗体库悬液先与链亲和素、生物素作用,又采用①固相消减、②液相消减（比较可行性并摸索条件）做为筛选用的抗体库进行筛选生物素化CLB的噬菌体抗体。两种方法的主要区别在于消减方式上。从此抗体库中经过3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,获得了特异性较强的盐酸克伦特罗生物素化单链抗体。主要结果如下:1.方法（1）中,得到了5株噬菌体抗体克隆,ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好的特异性。2.方法（2）中,采用固相（2-1）消减得到4株噬菌体抗体克隆;液相（2-2）消减得到5株噬菌体抗体克隆。ELISA和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好的特异性。3 .经NotⅠ/SfiⅠ双酶切后,证明得到的片段大小均与预想目标片段大小一致。第三部分:盐酸克伦特罗特异性单链抗体在大肠杆菌中的表达目前,抗体有多种表达系统,如细菌、酵母和哺乳动物细胞,每种表达系统都有各自的优缺点。对于单链抗体,由于不需要糖基化,因此可以选用易于基因操作、成本低、繁殖速度快的大肠杆菌表达系统进行表达。本部分通过对比分析第一、二部分实验数据,得出生物素化CLB噬菌体抗体特异性好于未标记抗原所筛选出的单链抗体的结论,而且此方法能有效避免非特异性抗体的产生。因此确定一株特异性最强的噬菌体抗体克隆进行蛋白表达。主要结果如下:1.对比分析,确定一株噬菌体抗体“pHEN1-BHNS-CLB1”阳性克隆,进行蛋白表达。2.从噬菌粒“pHEN1-CLB1”切下scFv基因片段,亚克隆至可溶性表达载体pCANTAB5E上,构建重组质粒,将所构质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,命名“5E-BHNS-CLB1”。3.对获得的“5E-BHNS-CLB1”进行PCR及酶切鉴定并测序,结果表明片段大小与预想目的片段大小一致,GenBank收录号为EU681272。4.SDS-PAGE及Western blot的结果显示,表达蛋白分子量大小与预想一致,能与酶标抗E-tag标签抗体结合显色（说明表达的蛋白能与表达载体5E后带有E-Tag标签的短肽作用,含有E-Tag标签）,是我们要表达的目的蛋白。第四部分:对其它化学污染物单链抗体的筛选近年来制备化学污染物抗体的研究种类很多,而利用噬菌体抗体库表面展示技术完成制备的报道少见。农药、兽药抗体制备技术平台的建设是标准抗体资源库和快速检测方法建立的基础和关键。小分子的农药、兽药,由于本身没有免疫原性,常规方法很难获得理想的免疫效果,建立优化的新的技术体系,是获得高质量抗体的重要保证。我们利用噬菌体抗体库表面展示技术对化学污染物甲硝唑,氯菊酯,三聚氰胺,进行筛选。结果如下:1.利用第一部分的方法从半合成的噬菌体抗体库中对农药甲硝唑,兽药氯菊酯,以及三聚氰胺,进行3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到了三种化学污染物的单链抗体克隆共16株,ELISA结果和竞争抑制ELISA结果证明其具有较好特异性。2.利用第二部分方法,对生物素化的三聚氰胺进行3轮“吸附—洗脱—扩增”筛选,得到5株噬菌体阳性克隆,ELISA和竞争抑制ELISA结果也证明其具有较好特异性。
李昌[4]（2008）在《新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究》文中认为本研究针对当前AIDS/HIV治疗中面临的病毒变异快、病毒感染细胞贮存池难以清除、病毒感染造成机体免疫功能损伤等关键问题,以构建具特异杀伤和免疫治疗双重功能的基因工程制剂为目标,筛选能够与HIV-1膜蛋白特异结合的抗病毒蛋白西诺维恩（CVN）、格瑞弗森（GRFT）以及免疫诱导因子金黄色葡萄球菌外毒素A（SEA）为研究对象,利用细菌和酵母表达系统,获得了重组抗病毒蛋白CVN、GRFT及其偶联SEA的重组导向制剂CS、GS,对其进行初步活性分析。同时制备了稳定表达中国流行株HIV-1膜蛋白的靶细胞模型,利用该模型,通过免疫印迹（Western blot）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接免疫荧光测定（IFA）、细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤试验等,对CVN、GRFT及其重组导向制剂CS、GS的体外结合活性、细胞结合活性及细胞杀伤活性进行研究。结果表明,成功获得了抗病毒蛋白和重组导向制剂,并且都具有良好的细胞结合活性。重组导向制剂可非特异性活化PBMCs、特异性介导CTLs杀伤表达HIV-1膜蛋白的靶细胞,为该制剂进一步推向临床奠定了基础。
刘兵[5]（2007）在《人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究》文中研究说明前言肾综合征出血热（HFRS）是由布尼亚病毒科汉坦病毒属（Hantavirus）的病毒引起的一种高病死率的传染病。我国是受其危害最严重的国家，大约90％的病例发生在我国，由于其临床表现复杂，并发症多，尚无特效治疗方法，其病死率可达5％。目前，汉坦病毒的检测方法还存在许多缺陷，不能为临床治疗提供及时可靠的早期诊断依据，因而，常常错过最佳治疗时机。HFRS致病机理的研究更是进展缓慢，HFRS致病机理还不清楚。因此，研究汉坦病毒的检测和HFRS的治疗与致病机理具有重要的实际意义。应用噬菌体抗体库技术可筛选出人源抗汉坦病毒抗原抗体，经载体表达出可溶性scFv。可溶性scFv具有穿透力强、容易到达靶细胞等优点，可广泛应用于汉坦病毒的检测及HFRS的治疗和致病机理研究。因此，为表达可溶性抗NP抗原scFv，并初步用于诊断汉坦病毒感染，本研究拟将提取的肾综合征出血热患者外周血淋巴细胞总RNA，扩增VH和VL抗体基因，并合成scFv基因，与T7噬菌体载体连接，构建T7噬菌体抗体库，用汉坦病毒76-118核衣壳蛋白（NP）抗原筛选出特异性噬菌体抗体。并从阳性克隆中扩增出scFv基因，克隆入表达载体pGEX-6p-1，表达出可溶性scFv，再初步应用可溶性单链抗体制备双单链抗体夹心试剂，检测血清中汉坦病毒NP抗原，建立敏感特异的肾综合征出血热诊断方法。实验方法一、scFv抗体基因的合成应用淋巴细胞分离液常规分离HFRS恢复期患者外周血淋巴细胞，用RNAout提取总RNA。以总RNA为模板，以oligo（dT）为引物，反转录合成VH基因和VL基因的cDNA第一条链。设计并合成VH基因和VL基因两端简并引物，并在VH基因5’端引物引入EcoRⅠ，在VL基因引物3’端引入HindⅢ酶切位点。PCR合成VH基因和VL基因，以VH基因和VL基因为模板，SOE PCR拼接scFv抗体基因。二、T7噬菌体抗体库的构建回收SOE PCR扩增scFv基因，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切scFv基因，电泳后凝胶回收双酶切scFv基因与已用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的T7 Select10-3b噬菌体载体的2个臂，经T4DNA连接酶连接。用T7噬菌体包装提取物包装连接反应产物，铺板测定包装效率和scFv基因插入率。接种宿主菌BLT5403，增殖重组T7噬菌体，铺板测定抗体库的滴度。三、T7噬菌体抗体库的筛选以重组汉坦病毒76-118 NP抗原包被酶标板，BSA封闭，加入T7噬菌体抗体库，室温孵育30 min，TBST洗涤5次，1％SDS洗脱抗体库，所得噬菌体抗体即为次级噬菌体抗体库，感染宿主菌BLT5403扩增后，可用于下一轮筛选。滴定次级噬菌体抗体库的滴度，并计算每一轮筛选噬菌体投入／产出比（回收率）作为特异性噬菌体抗体富集的指标，重复上述步骤4次。四、酶免疫实验检测抗体活性将上述筛选所得的抗体库铺板，随机选取噬菌斑，在BLT5403内扩增，以NaCl和PEG 8000纯化噬菌体抗体。用1％戊二醛偶联噬菌体抗体和辣根过氧化物酶（HRP），加过量10％甘氨酸封闭未反应的戊二醛。同时，将野生噬菌体与辣根过氧化物酶偶联，作为阴性对照。将酶偶联噬菌体抗体和阴性对照，分别加入汉坦病毒G1、G2包膜蛋白和NP抗原包被的酶标板，37℃孵育1h，TBST洗涤5次，加邻苯二胺和H2O2底物，37℃作用15min，2M H2SO4终止反应，在492nm波长用酶标仪检测OD值，样品A492／阴性对照A492＞2者，为阳性。五、pGEX-6P-1-scFv重组质粒的构建选择抗体活性最高T7噬菌体抗体在BLT5403中增殖，酚氯仿法提取T7 DNA，对T7噬菌体中scFv进行测序。设计并合成scFv基因简并引物，并在其5’端和3’端引物中引入BamHⅠ和SalⅠ切酶位点。以提取的T7噬菌体DNA为模板，以合成的scFv简并引物为引物，PCR扩增scFv基因。回收PCR扩增的scFv基因，用BamHⅠ和SalⅠ双酶切scFv基因和pGEX-6p-1载体，电泳后凝胶回收双酶切scFv基因和pGEX-6p-1载体大片段，16℃连接4小时，转化E．coli BL-21（DE3）感受态菌。涂于Amp平板培养基，37℃培养过夜。六、重组质粒的筛选及鉴定挑取单个菌落，Amp LB液体培养基培养，碱裂解法粗提质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳初筛阳性质粒，再用BamHⅠ和SalⅠ分别双酶切及PCR扩增法对重组质粒进行鉴定并对scFv测序。七、scFv融合蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE检测和酶免疫检测LB（含50μg／ml Amp）液体培养基培养含有pGEX-6P-1-scFv质粒的E．coliBL-21（DE3）菌株。加入IPTG至终浓度为1mM，诱导scFv融合蛋白表达。离心收集菌体，悬浮于PBS，超声破碎。GST凝胶亲和层析纯化scFv融合蛋白。常规SDS-PAGE检测scFv融合蛋白。酶免疫鉴定可溶性单链抗体scFv生物活性，方法同四、。八、酶标抗体的制备和血清标本检测1％戊二醛偶联辣根过氧化物酶和纯化的可溶性单链抗体，并用聚乙二醇浓缩。以可溶性抗NP单链抗体包被酶标板，BSA封闭酶标板。样品血清每孔加样50μl，37℃反应1h，PBST洗涤5次，加酶标抗体100μl，PBST洗涤5次。显色及结果判断同步骤四、。结果一、scFv抗体基因的合成用淋巴细胞分离液共分离得到1.5×107肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞。RNAout提取总RNA，电泳后呈明显的3条带，即28 S RNA，18 S RNA和5 S RNA，A260nm／A280nm的比值为1.8，说明提取的总RNA完整且纯度好。RT-PCR扩增VH基因和VL基因，两者分子大小约为400bp，与理论估计值大小一致，用SOE PCR将VH基因和VL基因连接成scFv基因，分子大小约为750bp，与理论估计值大小一致。二、T7噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库构建后，测定DNA包装效率为1.5×107／μg DNA。测定scFv基因的插入率为90％，其库容为1.35×107。初级噬菌体抗体库滴度为2.12×1010PFU／mL。三、T7噬菌体抗体库的筛选用NP抗原对噬菌体抗库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选，噬菌体抗体得到约60倍的富集。四、酶免疫实验检测抗体活性随机挑取第4轮筛选产物23个克隆，与辣根过氧化物酶偶联，与用汉坦病毒G1、G2包膜蛋白和NP抗原包被的酶标板特异性反应。酶免疫结果显示，19株具有抗原特异性结合活性，其中有2株具有较高的NP抗原特异性结合活性。五、pGEX-6P-1-scFv重组质粒的构建将亲和力最高的T7噬菌体抗体，在BLT5403中增殖。提取T7噬菌体DNA，干燥后溶于TE，1％琼脂糖凝胶电泳检测，可见36 kbT7 DNA噬菌体。测序证实获得scFv序列。以T7噬菌体DNA为模板，PCR扩增scFv基因，经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测为750bp，与预期的scFv片段大小相同。六、重组质粒的筛选及鉴定碱裂解法粗提质粒，0.7％琼脂糖凝胶电泳初筛阳性质粒，阳性质粒经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后，成5.0kb和750bp两条明显条带，酶切鉴定结果表明成功构建了pGEX-6P-1-scFv重组质粒。同时通过PCR扩增方法对重组质粒进行了鉴定，获得了750bp扩增产物，证实获得了含scFv基因片段的重组质粒。测序结果显示，质粒中scFv与T7噬菌体相同。七、scFv融合蛋白的表达和纯化及SDS-PAGE检测和酶免疫检测将含有pGEX-6P-1-scFv质粒的E．coliBL-21（DE3）菌株培养，加入IPTG诱导，诱导融合蛋白表达，超声破碎菌体，GST凝胶于层析柱纯化单链抗体融合蛋白。10％SDS-PAGE凝胶电泳，检测到纯化的融合scFv分子量大小为56KDa，与预期的结果相同，酶免疫检测具有NP抗原结合功能。八、酶标抗体的制备和血清标本检测以1％戊二醛溶液偶联纯化的可溶性scFv和HRP，聚乙二醇浓缩酶标记抗体至1 ml。双单链抗体夹心法检测56份HFRS患者血清中，检测出29例阳性，阳性率为51.79％，对照组66例，检测结果均为阴性。讨论本研究所构建噬菌体抗体库库容为1.35×107，scFv基因的插入率为90％，测定DNA包装效率为1.5×107／μg DNA，初级噬菌体抗体库的滴度为2.12×1010PFU／mL，经过4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选噬菌体得到约60倍的富集，酶免疫实验显示有2株具有较高的NP抗原特异性结合活性。这些数据与国内姚龙泉等学者所建文库非常相似。T7噬菌体优点是所展示的蛋白质的分子量很大，其最大展示蛋白的分子为1200氨基酸，这是M13噬菌体无法达到的。T7噬菌体的另一大优点是它极为稳定，能在各种严酷的条件下不被破坏，而其它噬菌体常在亲和淘洗过程中失活。此外，T7生长极为迅速，T7噬菌体形成噬斑仅需3小时，这可以大大缩短研究周期。在引物设计方面，设计一对VH简并引物扩增出大部分VH基因，设计一对VL简并引物扩增出大部分VL基因，既最大限度地扩增出了多样的抗体基因，又减少了引物的使用，简化了操作，节约了时间。同时在VH的羧基端基因和VL的氨基端基因引入编码连接肽（Gly4Ser）3序列，通过SOE PCR法直接将VH基因和VL基因拼接成VH-（Gly4Ser）3-VL形式的scFv，这样大大简化了基因重组过程。目前大多数研究只是从噬菌体库中筛选出相映抗体。而本研究进一步将scFv基因克隆到pGEX-6P-1上，表达出可以最终应用的可溶性单链抗体。融合scFv分子量约为56Kda，包括30Kda单链抗体和26Kda载体蛋白，载体蛋白一般不影响单链抗体的功能，而且载体蛋白有利于蛋白纯化，必要时可以被蛋白酶完全切掉。双单链抗体夹心法，与传统的双抗体夹心法相比其最大优势之一是其造价低廉。通过基因工程技术，在大肠杆菌中生产出单链抗体比通过杂交瘤技术在培养细胞中生产的单克隆抗体更节约时间且成本低廉，还容易操作。双单链抗体夹心法检测56份患者血清和对66例对照，在56份HFRS患者血清中，检测出29例阳性，阳性率为51.79％，在对照组中为检测结果均为阴性。目前认为，病程早期以病毒血症为主，在肾综合征出血热的病程晚期，机体免疫功能发挥作用，病毒逐渐被清除，不易在患者血清中检出病毒抗原。由此推测，本研究中25例未检出NP抗原标本可能在病程晚期。结论本研究运用噬菌体抗体库技术构建了人源单链T7噬菌体抗体库，库容量为1.35×107，初级噬菌体抗体库的滴度为2.12×1010PFU／mL。经酶免疫实验筛选到2株具有较高的与NP抗原特异性结合活性噬菌体抗体。研究中成功构建了融合蛋白表达载体pOEX-6P-1-scFv，获得了高效表达的可溶性scFv，酶免疫实验显示，可溶性scFv具有较高的NP抗原特异性结合活性。首次用大肠杆菌表达的抗NP单链抗体，成功制备了双单链抗体夹心诊断试剂，成功用于诊断汉坦病毒感染。
林凤[6]（2004）在《含硒单链抗体酶的人源化》文中进行了进一步梳理需氧生物在利用氧的过程中，会产生对机体有害的活性氧（ROS），在正常情况下，机体ROS的产生和清除处于平衡状态，但在某些情况下，ROS的产生和清除不平衡时，过多ROS会损伤机体的各种生物大分子，如RNA、DNA、蛋白质、糖类和脂类，从而导致细胞功能紊乱。为了清除ROS对机体的损伤，机体建立了一系列防御系统，主要包括酶学和非酶学抗氧化体系。酶学体系由超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶（CAT）等组成：非酶学体系包括一些抗氧化小分子，如α-生育酚、抗坏血酸（Vc）和还原型谷胱甘肽（GSH）等。GPX在机体抗氧化体系中起着十分重要的作用，它不仅能清除脂类氢过氧化物（ROOH），并在过氧化氢酶（CAT）含量很少或过氧化氢（H2O2）产量很低的组织中，可代替CAT清除H2O2，所以GPX有防止畸变，预防衰老及参与前列腺素合成等重要生理作用。人体若缺乏GPX会导致由于H2O2损伤而引起的一系列疾病，如各种炎症、结肠癌、心脑血管疾病、生理性衰老等，因此，研究及开发GPX对酶催化机理的探索和疾病预防具有重大意义。由于天然GPX分子量大，不易纯化，半衰期短以及难于用基因工程方法获得等不利因素，严重限制了其应用。如何生产高GPX活力的模拟物是摆在生物学家面前的一个难题，各国科学家纷纷研制GPX的模拟物，其中比较着名的GPX模拟物为Ebselen（2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3（2H）-酮），在日本它已经进入Ⅲ期临床阶段，但由于GPX活力只有0.99U／μmol，并且水溶性差，导致其应用受到了有一定的限制。在近几年中，我们实验室制各并合成了一系列具有GPX活力鼠源抗体酶，并且在动物模型中表现出很好的抗氧化活性，但由于鼠源抗体应用于人体会存在严重的人—抗 中文摘要..叫，....甲.......鼠反应（HAMA），所以抗体酶人源化势在必行。2001年，丁兰小组成功从人源化半合成噬菌体抗体库中筛选出具有GPX结合活性的单链抗体，并在大肠杆菌中表达、纯化，但遗憾的是当用化学诱变法引入催化基团一硒代半耽氨酸（Sec）时，其GPX活力仅为80U/帅of，同普通的免疫球蛋白（I gG）分子硒化后的GPX活力71 .4U/娜of基本相同，所以制备人源化的高GPX活力抗体酶是巨大的挑战。 本文首次改造己有的经化学诱变后具有高GPX活力的鼠源单链抗体，并展示于噬菌粒pFUW一80表面，设计半抗原，通过亲和筛选获得对半抗原特异结合的单链抗体，在大肠杆菌Rosetta中成功表达。经纯化后的单链抗体通过化学法引入催化基团一Sec，其GpX活力为88OU/卿ol，是第一个人源化GPX抗体酶高11倍，这种高GPX活力的人源化抗体酶作为抗氧化剂具有广阔的应用前景。 1、构建人源化噬菌体展示抗体库 对鼠源单链抗体的改形分重链和轻链两部分。在蛋白质数据库（PDB）中，通过同源序列分析分别确定与重链和轻链同源性较高的人源抗体，对于鼠源单链抗体的改造，除了完全保留CDR区外，还通过计算机模拟的抗原结合位点的空间结构，确定与CDR结构在空间上有关的氨基酸残基，并与人同源抗体该部位的氨基酸同时成对保留，形成人源化轻、重链抗体库。重链采取分段全序列合成的方法连接而成，轻链则通过重迭 PCR方法扩增而成，用连接肤（Gl外Ser）3把轻、重链连接起来，并克隆于噬菌粒载体pFUW一80中，通过辅助噬菌体M13K07使人源化单链抗体展示于噬菌粒pFUw一80表面。构建的抗体库的理论库容为连接产物转化后在有氨节抗性平板上的菌落数，而实际库容为理论库容XPCR可扩增出单链抗体的比例。 2、具有GPX结合活性的单链抗体的筛选 用疏水腔修饰法，设计并合成半抗原GSH一S一DNP一Bu和GSH一S一DNP一Me，进行抗体库的筛选。以噬菌体单链为模板进行PCR扩增，用BstNI酶切扩增的单链抗体基因，通过DNA指纹法验证了单链抗体库的多样性，ELISA法验证了筛选的阳性克隆。经4轮筛选，分别得到了对半抗原特异性结合的单链抗体，从ELISA结果选出Bg和B14对GSH一S一DNP.Bu特异结合的抗体，通中文摘要过双酶切法和DNA序列分析法进行阳性鉴定。 3、定向进化构建次级库及特异结合性抗体的筛选 如何获得高亲和力抗体始终是噬菌体抗体库技术的一个发展方向。由于构建的人源化抗体库库容较小，我们采用DNA改组技术在体外提高抗体的亲和力，即通过有性和无性PCR扩增出特异性单链抗体基因后克隆于噬菌粒载体pFUW一80中，形成次级抗体库，以GSH一sDN甲一Bu为半抗原，进行正向有意义突变的高亲和性抗体的筛选。经过3轮筛选后筛选出的单链抗体的ELISA信号明显高于DNA改组前的两个阳性克隆，我们选ELISA信号最强的噬菌体抗体克隆BS进行以后的表达。 4、单链抗体在大肠杆菌的表达及纯化 通过PCR扩增出单链抗体BS基因，然后克隆于载体pPe扭中，通过双酶切法和DNA序列分析法鉴定连接产物，证实单链抗体基因已按正确方向连入表达载体中。通过对表达菌株进行优化选择了最佳表达菌株，然后对诱导剂加入时菌体浓度、诱导剂浓度和诱导表达时间进行优化，得到适合单链抗体表达的最优条件，按此条件大量表达目的蛋白。通过Ni2+金属离子鳌合纯化目的
成军[7]（2004）在《功能基因组学与肝脏疾病研究》文中提出功能基因组学是指应用整体的研究技术阐明基因和蛋白的生物学功能.因此,需要发展一些强大的分析技术,对基因和蛋白质的功能进行研究.这必将为肝脏病学的研究提供了一个前所未有的发展机遇.本文主要论述功能基因组学的先进技术在肝病领域的应用.
钟彦伟,成军,张忠东,李强,李莉,陈菊梅[8]（2004）在《丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达》文中研究说明目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 （HCV）核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 （抗 Id）scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 （IPTG）诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 （ELISA）证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。
成军[9]（2004）在《噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用》文中提出噬菌体展示技术是一种目的基因在噬菌体表面的表达产物与亲和选择相结合的技术。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质。初期阶段 ,噬菌体展示技术主要是用于单链可变区抗体、随机多肽库等的筛选 ,但近年来随着噬菌体cDNA表达型文库的构建 ,噬菌体展示技术的用途逐渐扩大。目前噬菌体展示技术不仅可以用于研究蛋白结合蛋白 ,而且还可以用来研究DNA/RNA结合蛋白 ,以及非蛋白小分子物质的结合蛋白等。因为蛋白 蛋白之间的结合是许多生物学效应的基础 ,因而噬菌体展示技术的应用范围进一步得到拓展。噬菌体展示技术在研究自身抗体结合与识别的自身抗原、信号转导过程中蛋白之间的相互作用以及肝炎病毒基因表达调节方面都有十分重要的应用前景。
钟彦伟,成军,张忠东,孙敏,李强,李克,王琳,李莉,张玲霞,陈菊梅[10]（2003）在《噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体》文中研究指明目的:制备丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）的特异性人源化单链可变区抗体（scFv）。方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6（HCBP6）16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“黏附-洗脱-扩增”筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析。结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮“黏附-洗脱-扩增”的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍。用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性。其中有30株克隆ELISA的吸光度（A450 nm）值较高（P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等）。对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白（BSA）的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱（P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178）,结合2次ELISA重复实验的/4值及竞争抑制实验结果,最后确定1株（P24）阳性克隆。提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTABSE载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区（FR）及互补决定区（CDR）的序列结构。结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv。
二、丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达（论文提纲范文）
（1）人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 技术流程图 |
| 第一部分 人源性促甲状腺素受体抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 PCR引物 |
| 1.1.3 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 外周血总RNA提取 |
| 1.2.2 轻、重链基因PCR扩增 |
| 1.2.3 噬粒pComb3Hss的扩增 |
| 1.2.4 轻链库的构建 |
| 1.2.5 噬菌体Fab抗体库的构建和鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 单克隆抗体的发展 |
| 1.3.2 噬菌体抗体库成功构建的必要条件 |
| 1.3.3 辅助噬菌体作用机理以及扩增 |
| 1.3.4 噬菌体抗体库的机遇和挑战 |
| 1.4 小结 |
| 第二部分 人源性TRAb Fab片段的筛选及初步鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 TRAb Fab噬菌体抗体的筛选结果 |
| 2.2.2 Phage-ELISA检测噬菌体抗体 |
| 2.2.3 TRAb阳性克隆的鉴定 |
| 2.2.4 TRAb Fab片段的获取 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 用于筛选的抗原 |
| 2.3.2 噬菌体抗体库的筛选技术的原理及影响因素 |
| 2.3.3 人源性TRAb Fab噬菌体抗体的筛选 |
| 2.4 小结 |
| 第三部分 人源性TRAb Fab片段的初步纯化及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 可溶性TRAb Fab ELISA鉴定 |
| 3.2.2 SDS-PAGE电泳结果 |
| 3.2.3 免疫学活性鉴定:Western-Blotting |
| 3.2.4 采用CBG定量法对可溶性TRAbFab的表达蛋白定量 |
| 3.2.5 抗体重链和轻链可变区DNA序列的测序分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点及展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 综述 促甲状腺素受体及其抗体 |
| 综述 噬菌体抗体库 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（2）水稻白叶枯病菌HarpinXoo单克隆抗独特型抗体的制备、筛选及其“内影像”特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 植物病原细菌的harpins及在植物上的作用 |
| 1 植物病原细菌的致病岛和hrp基因簇 |
| 1.1 植物病原细菌的致病岛 |
| 1.2 植物病原细菌的hrp基因簇 |
| 1.3 植物病原细菌的Ⅲ型泌出机构 |
| 2 Harpins在植物上的效应及作用机理 |
| 2.1 Harpins在植物上的多种反应 |
| 2.2 Harpin在植物细胞中的作用位点 |
| 2.3 Harpins在植物上启动的信号传导通路 |
| 2.4 Harpin诱导HR及早期事件 |
| 3 HarpinXoo的特性及在植物上的作用 |
| 第二章 抗独特型抗体的理论与应用 |
| 1 独特型与抗独特型抗体的基础理论 |
| 1.1 抗体的独特型 |
| 1.2 免疫网络学说 |
| 2 抗独特型抗体 |
| 2.1 抗独特型抗体的分类 |
| 2.2 Ab2的功能 |
| 2.3 抗-Id的制备 |
| 3 抗-Id的应用 |
| 3.1 肿瘤抗-Id疫苗 |
| 3.2 寄生虫抗-Id疫苗 |
| 3.3 细菌和真菌抗-Id疫苗 |
| 3.4 病毒抗-Id疫苗 |
| 3.5 酶等生理活性物质的模拟 |
| 3.6 抗体或受体检测 |
| 3.7 生理活动调控性疫苗 |
| 3.8 免疫疾病的治疗与免疫调节 |
| 4 小结 |
| 第三章 抗独特型抗体的分子模拟机制及其应用研究进展 |
| 1 抗独特型抗体的分子模拟机制 |
| 1.1 免疫球蛋白及独特型 |
| 1.2 独特型免疫网络理论 |
| 1.3 "内影像"抗独特型抗体(Ab2β)的鉴定 |
| 2 "内影像"抗独特型抗体Ab2β的应用研究进展 |
| 2.1 生物受体的独特型模拟研究 |
| 2.2 anti-Id模拟外来抗原进行疫苗生产的研究 |
| 2.3 自身抗原的独特型模拟研究 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 水稻白叶枯病菌hrf1基因编码的 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株和载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 缓冲液 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 供试试剂、引物合成和测序 |
| 1.6 基因的克隆与纯化 |
| 1.7 融合蛋白表达载体的构建 |
| 1.8 HarpinXoo的融合表达与纯化 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Hrf1基因的克隆 |
| 2.2 融合蛋白的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 第二章 HarpinXoo抗体制备及免疫学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 HarpinXoo蛋白定量 |
| 2.2 抗血清效价测定 |
| 2.3 Western blot分析 |
| 2.4 单克隆抗体的制备 |
| 3 讨论 |
| 第三章 HarpinXoo抗独特型抗体制备及特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Abl与HarpinXoo的受体结合位点相结合 |
| 2.2 抗独特型抗体Ab2的诱出 |
| 2.3 单克隆抗独特型抗体Ab2的筛选 |
| 2.4 单克隆抗独特型抗体6B2的特性 |
| 2.5 在异种动物诱出Ab3 |
| 2.6 RNA的提取及鉴定 |
| 2.7 VH、VL基因的扩增及鉴定 |
| 2.8 ScFv基因的构建 |
| 2.9 序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结、创新点及展望 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）盐酸克伦特罗单链抗体（scFv）的筛选与表达（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 以盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 以生物素化盐酸克伦特罗为靶抗原筛选噬菌体单链抗体 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 盐酸克伦特罗特异性单链抗体在大肠杆菌中的表达 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四部分 其它化学污染物质单链抗体的筛选 |
| 1 所选化学药品概述 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附录 在读期间发表的论文 |
| 综述 单克隆抗体技术用于农兽药快速检测研究的进展 |
| 综述 噬菌体抗体库技术在农兽药快速检测技术中的进展 |
| 论着 抗盐酸克伦特罗人源scFv 抗体筛选与鉴定 |
| 致谢 |
（4）新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究（论文提纲范文）
| 内容提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 HIV 感染分子机制及其防治研究现状 |
| 1 AIDS/HIV 的流行情况 |
| 2 HIV 病原学 |
| 3 HIV 感染与致病分子机制 |
| 4 HIV 的进化与变异 |
| 5 AIDS/HIV 防治研究现状 |
| 6 问题与展望 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂与免疫治疗研究进展 |
| 1 AIDS 靶向治疗的历史、原理及研究现状 |
| 2 AIDS 靶向治疗运载工具研究 |
| 3 AIDS 靶向治疗生物弹头研究 |
| 4 AIDS 新的免疫治疗策略研究 |
| 5 问题与展望 |
| 6 研究目的与意义 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 新型抗病毒基因西诺维恩、格瑞弗森的合成构建、原核表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗HIV 重组导向制剂CS、GS 的构建及原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 重组抗病毒蛋白及其导向制剂的纯化与复性 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 HIV-1 感染靶细胞模型的制备 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂在酵母中表达探索研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| CURRICULUM VITAE |
（5）人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究（论文提纲范文）
| 一、摘要 |
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 二、英文缩略语 |
| 三、论文 |
| 论文一 人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7 噬菌体抗体库的构建 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文二 可溶性抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆及表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 论文三 双单链抗体夹心法检测汉坦病毒感染的初步研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 四、本研究创新性自我评价 |
| 五、参考文献 |
| 六、附录 |
| 综述 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（6）含硒单链抗体酶的人源化（论文提纲范文）
| 第一章 本论文立题依据 |
| 第二章 人源化噬菌体单链抗体库的构建 |
| 一、 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液配制 |
| 二、 实验方法 |
| 1 、 嵌合单链抗体的重链的合成 |
| 1.1 合成片段的磷酸化 |
| 1.2 重链的合成 |
| 1.3 轻链的合成 |
| 1.4 单链抗体(ScFv)的合成 |
| 1.5 ScFv克隆于噬菌粒载体pFUW-80 |
| 三、 结果与讨论 |
| 1 、 结果 |
| 1.1 人源化单链抗体2F3重链(2F3V_H)的设计 |
| 1.2 人源化单链抗体2F3轻链(2F3V_L)的设计 |
| 1.3 重链基因的合成 |
| 1.4 轻链基因的合成 |
| 1.5 ScFv的合成 |
| 1.6 ScFv基因克隆于噬菌粒载体pFUW-80 |
| 2 、 讨论 |
| 2.1 人源化抗体FR模板的选择 |
| 2.2 确定需要保留的重要鼠源残基 |
| 四、 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 特异性噬菌体抗体的筛选 |
| 一、 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| 2.1 半抗原和全抗原的合成 |
| 2.2 噬菌体抗体库的库容和筛选前抗体库多样性的验证 |
| 2.3 辅助噬菌体M13K07的制备 |
| 2.4 重组人源化单链抗体库的扩增及亚库的制备 |
| 2.5 特异性单链抗体的筛选 |
| 2.6 噬菌体单链抗体的表达 |
| 2.7 噬菌体单链抗体的ELISA鉴定 |
| 2.8 ELISA法测定抗原-抗体解离常数 |
| 2.9 单链抗体的双酶切和基因序列分析鉴定 |
| 2.10 筛选后抗体库多样性的验证 |
| 三、 结果与讨论 |
| 1 、 结果 |
| 1.1 半抗原的表征 |
| 1.2 抗体库的库容及筛选前后抗体库多样性的验证 |
| 1.3 GSH-S-DNP-Bu和GSH-S-DNP-Me特异的噬菌体抗体的筛选与鉴定 |
| 1.4 抗原-抗体解离常数的测定 |
| 1.5 单链抗体的酶切鉴定和基因序列分析 |
| 2 、 讨论 |
| 2.1 半抗原设计 |
| 2.2 人源化抗体库 |
| 四、 小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 高亲和力噬菌体抗体的筛选 |
| 一、 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| 2.1 无性PCR引入随机突变 |
| 2.2 有性PCR重组单链抗体基因 |
| 2.3 单链抗体基因的双酶切 |
| 2.4 ScFv基因与载体pFUW-80的连接 |
| 2.5 TG1感受态细胞的制备及质粒的转化 |
| 2.6 库容量的分析与转化子的鉴定 |
| 2.7 次级库的扩增与亲和筛选 |
| 2.8 阳性克隆的检测及表观解离常数的测定 |
| 三、 结果与讨论 |
| 1 、 结果 |
| 1.1 实验方案 |
| 1.2 次级库的验证 |
| 1.3 筛选结果 |
| 2 、 讨论 |
| 四、 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 单链抗体的表达与纯化 |
| 一、 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 溶液的配制 |
| 二、 实验方法 |
| 2.1 单链抗体基因的扩增 |
| 2.2 双酶切PCR产物和pPe1B质粒 |
| 2.3 表达菌株的构建 |
| 2.4 连接产物的转化 |
| 2.5 重组质粒的鉴定 |
| 2.6 全菌SDS-PAGE蛋白电泳鉴定表达的单链抗体 |
| 2.7 表达条件的优化 |
| 2.8 单链抗体的纯化 |
| 2.9 纯化的单链抗体的鉴定 |
| 三、 结果与讨论 |
| 1 、 结果 |
| 1.1 单链抗体基因的扩增及重组质粒的鉴定 |
| 1.2 单链抗体的表达及表达条件的优化 |
| 1.3 单链抗体的纯化及鉴定 |
| 2 、 讨论 |
| 四、 小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 具有GPX活力的单链抗体酶的制备及酶学性质 |
| 一、 实验材料 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 二、 实验方法 |
| 2.1 单链抗体的硒化 |
| 2.2 过氧化氢浓度的测定 |
| 2.3 GPX活力测定 |
| 2.4 硒含量的测定 |
| 2.5 结合常数的测定 |
| 2.6 酶反应动力学的研究 |
| 三、 结果与讨论 |
| 1 、 结果 |
| 1.1 单链抗体酶的化学诱变和GPX活力测定 |
| 1.2 含硒单链抗体酶与GSH结合常数的测定 |
| 1.3 含硒单链抗体酶的最适pH和最适温度 |
| 1.4 单链抗体酶的稳态动力学性质 |
| 2 、 讨论 |
| 四、 小结 |
| 参考文献 |
| 第七章 文献综述 |
| 一、 硒的生物学功能与含硒蛋白 |
| 1 硒的生物学效应 |
| 1.1 非酶学体系的抗氧化作用 |
| 1.2 酶学体系的抗氧化作用 |
| 2 、 含硒蛋白的生物学功能 |
| 二、 谷胱甘肽过氧化物酶(GPX) |
| 1 GPX的生物学作用 |
| 2 GPX的结构 |
| 2.1 牛cGPX的二级结构 |
| 2.2 牛cGPX的活性中心的结构 |
| 2.3 人pGPX的活性中心的结构 |
| 2.4 GPX的催化机制 |
| 2.5 硒代半胱氨酸在蛋白质合成中的掺入 |
| 三、 GPX的人工模拟 |
| 1 Ebselen及其衍生物 |
| 2 硒化环糊精 |
| 3 硒代谷胱甘肽(GSeH) |
| 4 硒化枯草杆菌蛋白酶 |
| 5 含硒抗体酶 |
| 6 制备人源化抗体的方法 |
| 四、 噬菌体抗体库 |
| 1 噬菌体抗体库技术 |
| 1.1 抗体可变区基因的扩增 |
| 1.2 载体 |
| 2 噬菌体抗体库的筛选 |
| 2.1 宿主直接洗脱 |
| 2.2 双层膜筛选系统 |
| 2.3 筛选抗细胞表面抗原抗体 |
| 2.4 体内筛选 |
| 3 高亲和力抗体制备 |
| 3.1 从大库容噬菌体抗体库或免疫库直接获得亲和力抗体 |
| 3.2 建立次级噬菌体抗体库完成抗体亲和力成熟 |
| 4 噬菌体抗体库的应用 |
| 4.1 医学微生物学研究 |
| 4.2 抗原表位分析 |
| 4.3 肿瘤研究 |
| 4.4 自身免疫性疾病的研究 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
（7）功能基因组学与肝脏疾病研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 功能基因组学的定义和内涵 |
| 2 启动子DNA结合蛋白的研究 |
| 3 蛋白与蛋白分子之间的结合 |
| 4 差异显示研究技术 |
| 5 功能缺失表型分析策略 |
| 6 生物信息学技术 |
（9）噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用（论文提纲范文）
| 1 噬菌体展示技术与基因工程抗体、抗独特型抗体研究 |
| 2 噬菌体展示技术与模拟表位、拮抗多肽研究 |
| 3 噬菌体展示技术与DNA、RNA结合蛋白研究 |
| 4 噬菌体展示技术与蛋白结合蛋白研究 |
| 5 非蛋白小分子结合蛋白筛选 |
四、丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达（论文参考文献）
- [1]人源性TRAb Fab段抗体库的构建筛选与鉴定[D]. 杜晓明. 天津医科大学, 2012(08)
- [2]水稻白叶枯病菌HarpinXoo单克隆抗独特型抗体的制备、筛选及其“内影像”特性研究[D]. 陈得峰. 南京农业大学, 2009(06)
- [3]盐酸克伦特罗单链抗体（scFv）的筛选与表达[D]. 马巍娜. 中国人民解放军军事医学科学院, 2009(10)
- [4]新型抗HIV-1蛋白西诺维恩、格瑞弗森及其重组导向制剂构建、表达与活性研究[D]. 李昌. 吉林大学, 2008(11)
- [5]人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体研究[D]. 刘兵. 中国医科大学, 2007(05)
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