一、RNA干扰与基因功能研究（论文文献综述）
朱熙[1]（2021）在《马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究》文中研究指明丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase,MAPK）级联是真核生物中高度保守的信号转导模式,由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成。该级联途径通过三种激酶依次逐级磷酸化将感知的外源信号放大并传递下去,从而产生应激反应介导细胞增殖、分化和死亡。马铃薯（Solanum tuberosum L.）为世界第四大粮食作物,日益突出的土地干旱和盐碱化问题造成其减产。目前,关于植物MAPK在干旱、盐及渗透胁迫条件下的基因功能研究十分有限。迄今为止,马铃薯StMAPKs基因响应非生物胁迫和植物激素诱导表达模式的系统研究仍未见报道,而且其在马铃薯不同组织和器官中的表达模式也不清楚。本研究主要解析StMAPKs是否介导多种与胁迫相关的信号转导途径,StMAPKs是否在干旱、盐和渗透胁迫下起作用以及其潜在机制。本研究对StMAPKs响应不同非生物胁迫和植物激素处理表达模式行了分析,同时还分析了其在不同组织和器官中的表达模式。从马铃薯“大西洋”中分离得到一个与盐和渗透胁迫相关的StMAPK3功能基因和一个与干旱胁迫相关的StMAPK11功能基因,并通过亚细胞定位、酵母双杂文库筛选、酵母双杂检测互作蛋白、双分子荧光互补、磷酸化蛋白组学,以及对过表达和RNA干扰表达转基因的植株在胁迫下生理指标和光合指标的检测做了研究。取得的主要研究结果如下:1.通过qRT-PCR技术分析了马铃薯15个StMAPKs基因在不同非生物胁迫和植物激素处理以及不同组织和器官中的表达模式。结果表明:马铃薯中15个StMAPKs基因不仅在非生物胁迫和植物激素处理时表达差异显着,而且在不同组织和器官中的特异性表达差异也显着。2.从马铃薯中克隆得到两个促分裂原活化蛋白激酶基因StMAPK3和StMAPK11,其中StMAPK3是与盐和渗透胁迫相关,而StMAPK11与干旱胁迫相关,构建了pCAM35s-GFP-StMAPK3和pCAM35s-GFP-StMAPK11亚细胞定位载体,并在烟草表皮细胞中进行了瞬时表达。结果表明,StMAPK3和StMAPK11均定位于细胞膜和细胞核。3.构建了原核重组表达载体pET28b-StMAPK11,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）后,IPTG诱导并纯化StMAPK11重组蛋白,制备兔抗StMAPK11多克隆抗体,Western blot结果显示制备好的抗体可以很好的与StMAPK11蛋白特异性结合。4.分别构建了酵母双杂和双分子荧光互补载体,通过酵母双杂交和双分子荧光互试验验证结果显示,StMAPK3可以与StDof1、StSR2、StACS5、StMEK2和StMAPKK1发生互作,其中StMAPK3与StSR2在细胞核内相互作用。StMAPK11可以与StbZIP2、StPTP1和StVQP9发生互作,其中StMAPK11与StbZIP2在细胞核内相互作用。5.与盐和渗透胁迫相关StMAPK3基因的功能分析。在盐和渗透胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK3植株中过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活性和脯氨酸含量均增加,在RNA干扰表达植株中,结果相反,而在StMAPK3过表达植株中H2O2和丙二醛（MDA）含量减少,RNA干扰表达植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK3提高了盐和渗透胁迫下植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率,在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因植株相比都不同程度的降低。并且还发现在盐和渗透胁迫下转StMAPK3基因对马铃薯植株的气孔开合度、植株高度、茎粗、鲜重、根长和侧根数都有不同程度的影响。结果表明StMAPK3能明显提高马铃薯植株对盐和渗透胁迫的抗性。6.与干旱胁迫相关StMAPK11基因的功能分析。在干旱胁迫条件下,与非转基因植株相比,过表达StMAPK11植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中CAT、POD、SOD酶活性和脯氨酸含量均增加,但在RNA干扰表达马铃薯植株中,结果相反,在StMAPK11过表达植株（马铃薯、烟草和拟南芥）中H2O2和MDA含量减少,但在RNA干扰表达马铃薯植株中H2O2和MDA含量增加。同时过表达StMAPK11提高了干旱胁迫下马铃薯植株的蒸腾速率、净光合速率、气孔导度和水分利用效率;在RNA干扰表达植株中,这些光合指标与非转基因相比都不同程度的降低。并且还发现转StMAPK11基因在干旱胁迫下对马铃薯植株的鲜重、干重、根鲜重和根干重都有不同程度的影响。表明StMAPK11能明显提高植株（马铃薯、烟草和拟南芥）对干旱胁迫的抗性。7.对StMAPK3过表达和RNA干扰表达马铃薯植株进行磷酸化蛋白质组学分析共鉴定得到2180种磷酸化蛋白。通过修饰位点定量分析在两组中共同鉴定到的修饰位点2922个,其中差异显着的修饰位点总数78个,显着上调的修饰位点总数49个,显着下调的修饰位点总数29个。通过磷酸化蛋白差异分析两组共鉴定蛋白2023个,其中上调表达蛋白15个,下调表达蛋白14个。利用GO、KEGG、COG数据库对鉴定的磷酸化蛋白质进行功能注释,结果表明这些蛋白质主要在植株生长发育过程,信号转导和代谢途径中发挥相应功能。
周悦南[2]（2021）在《菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究》文中指出寄生蜂是一类营寄生生活的膜翅目昆虫,其寄主大部分为鳞翅目害虫。菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis是世界性十字花科蔬菜害虫小菜蛾Plutella xylostella的一类优势寄生蜂。其成功寄生需要精准调控寄主的生长发育和免疫,这些功能的实现主要依赖于寄生蜂体内携带的多种寄生因子,包括多分DNA病毒（Polydnavirus,PDV）、毒液、畸形细胞等。其中PDV是稳定整合在寄生蜂基因组上的一类共生病毒,仅能特异地在雌性寄生蜂卵巢的卵萼细胞（calyx cell）内发生复制和组装。PDV前病毒包括两部分,一是能够形成环状的双链DNA分子,此为成熟病毒粒子的基因组成分,另一部分功能为辅助病毒复制、组装并成熟,本研究统称这类基因为内源病毒元件（endogenous virus elements,EVEs）。一直以来,对PDV的研究主要围绕PDV环状基因组中的毒性基因对寄主昆虫的生理调控,而对PDV在寄生蜂体内的复制和组装的研究则相对较少。因此,本研究以菜蛾盘绒茧蜂及其携带的PDV（Cotesia vestalis Bracovirus,CvBV）为对象,通过基因组、转录组、蛋白组、绝对定量、RNA干扰、透射电镜等多组学和多种分子生物学技术,围绕CvBV在寄生蜂卵巢内的复制和组装机制展开研究。获得主要研究成果如下:1)明确CvBV复制和组装的动态过程。利用透射电镜及绝对定量的方法,阐明了CvBV复制和组装与寄生蜂卵巢发育的关系,明确了CvBV复制开始节点为寄生蜂蛹期第2.5天。详细展示了CvBV病毒组装的动态过程,发现CvBV于3日龄雌蛹的卵巢内出现少量组装,到蛹期第4天达到组装高峰期,羽化1天后病毒粒子成熟,卵萼内腔中CvBV丰度达到最高。2)明确CvBV复制和组装相关的EVEs的数量和表达动态。通过对菜蛾盘绒茧蜂基因组及转录组的数据分析,明确了菜蛾盘绒茧蜂基因组中共有73个保守的EVEs,获得了它们的全长序列,并进一步结合质谱分析对CvBV的结构蛋白和其它辅助组装的基因进行了鉴定,发现26个可能为其结构蛋白。表达谱分析表明EVEs在卵巢内的表达模式可分为两种:一类包含病毒DNA复制和病毒RNA转录调控相关基因,这部分基因在蛹早期开始表达,并在3日龄雌蛹的卵巢内达到最高峰,随后开始下降,此类基因称之为早期表达基因。另一类包括结构蛋白和组装相关基因,这部分基因的表达从2日龄雌蛹开始,并在在4日龄雌蛹的卵巢内达到峰值,到1日龄雌成虫体内出现缓慢下调,该类基因称为晚期表达基因。3)明确多个关键EVEs在CvBV复制和组装过程中的作用。通过RNA干扰等技术对24个EVEs在CvBV复制和组装过程的作用进行了探究,其中3个和病毒DNA复制相关（helicase、integrase-1和integrase-2）,3个和病毒RNA转录调控相关（p47、lef-9和lef-5）,8个为病毒衣壳组分（vp39、PMV、Hz NVorf9-1、Hz NVorf9-2、Hz NVorf106、38k、27b和K425＿459）,5个为病毒囊膜结构蛋白（11k、17a-1、35a-1、35a-2和K425＿461）,3个与衣壳组装相关（vlf-1、Hz NV140-1和Hz NVorf140-2）,1个负责病毒结构成分（衣壳与囊膜）运输（Hz NVorf64）,1个为辅助侵染因子（vp91）。4)明确蜕皮激素（20E）在CvBV复制和组装过程的调控作用,并鉴定了下游调控因子。发现20E在寄生蜂雌蛹卵巢内的丰度变化为早期（1-2日龄蛹）较高,蛹期第3天开始下调,此变化趋势正好和CvBV组装相关的晚期基因表达模式相反。通过体外添加20E活体培养卵巢的方式,明确了较高浓度的20E能够显着抑制EVEs相关基因的表达,进一步通过卵萼区转录组测序及RNA干扰方法明确了20E通路下游转录因子E93能够抑制vp39、38k和vlf-1基因的表达。综上,本研究表明,CvBV的复制和组装过程需要多个基因在寄生蜂蛹期协同作用,包括调控病毒基因表达的相关基因以及病毒结构蛋白等。本研究系统地对这些基因进行全基因组的鉴定,并利用RNA干扰等方法对其功能进行系统地探究,初步揭示了CvBV复制和组装的复杂过程。此外,本研究首次发现了20E通路对CvBV组装相关基因的调控作用。这些新的发现不仅提升了对PDV复制和组装机制的认知,也对深入探究PDV的起源和进化具有重要的参考意义。
郭铭[3]（2021）在《大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究》文中研究指明大麦条纹病（Barley leaf stripe）是对大麦危害最严重的病害之一,发病严重年份造成产量损失可达70%以上,该病害由麦类核腔菌（Pyrenophora graminea）引起。研究大麦条纹病病原菌的致病机制,能够为大麦条纹病防治及抗条纹病新品种选育提供理论依据。本研究以大麦条纹病强致病野生菌株QWC中的基因Pgr07060为对象,对其功能进行了初步研究。研究结果包括以下3个方面:1.本研究克隆到了大麦条纹病菌强致病菌株QWC中的基因Pgr07060,生物信息学分析表明:Pgr07060基因的开放阅读框全长为1119 bp,总共编码372个氨基酸,其中苏氨酸占比最高,为11.80%;分析其蛋白二级结构得出,以无规则卷曲占比为主,比例达到了56.18%;Pgr07060基因编码蛋白的不稳定性指数为51.96,说明该蛋白质为不稳定的蛋白,且为亲水性蛋白;该基因编码的蛋白存在跨膜区,属于跨膜蛋白。2.构建基因Pgr07060的瞬时表达载体PVX:Pgr07060和亚细胞定位载体PCAMBIA1300-35S-GFP:Pgr07060,并转入到农杆菌GV3101中,通过注射法侵染烟草叶片,进行瞬时表达,对照组为PVX:BAX、PVX:INF1和PGR107,结果显示:PGR107不能在烟草叶片上引起细胞坏死,而PVX:BAX、PVX:INF1及基因Pgr07060均使烟草叶片发生严重皱缩,出现坏死的现象,表明基因Pgr07060可使细胞发生坏死,从而诱导免疫反应;运用在线软件Cell-PLoc 2.0预测出基因Pgr07060携带核定位序列（NLS）PPSASTKTKKKKKKSTP,为细胞核内表达基因,亚细胞定位结果显示,基因Pgr07060的绿色荧光与细胞核自发荧光重合度很高,同时膜上荧光也很强,说明基因Pgr07060既能在细胞核内表达,也能在细胞膜上表达。3.成功构建基因Pgr07060的干扰载体p Silent-1:Pgr07060与过表达载体p BARGPE1:Pgr07060。采用PEG4000介导法进行遗传转化,经潮霉素抗性筛选和荧光定量分析,获得3株干扰转化菌株和2株过表达转化菌株。转化菌株及野生株QWC中Pgr07060基因表达量检测结果表明,与野生株QWC相比较,3株干扰转化菌株的基因表达量分别下降了45.17%、65.38%和68.09%,而2株过表达菌株的基因表达量分别升高了668.88%和908.79%;通过观察培养7 d的菌落生长状况发现,与野生株QWC相比,3株干扰转化菌株的菌落生长速度分别降低了26.91%、48.19%及52.21%,而2个过表达转化株的生长速度分别增加了61.02%和95.76%（P<0.05）。观察菌株的菌丝形态发现,野生株QWC的菌丝呈细长平滑态,菌丝生长正常,而干扰和过表达转化株的菌丝均出现了明显的分隔,且菌丝间的夹角均小于野生株QWC;致病性分析显示,野生株QWC与3个干扰菌株侵染大麦高抗品种甘啤2号后均未发病,而侵染高感品种Alexis后,3个干扰菌株的发病率较野生株QWC分别降低了52.22%、49.29%和49.04%（P<0.05）,并且经野生株QWC侵染的大麦长势较弱,叶片明显萎缩,叶片上有大面积病斑,发病较为严重,而干扰菌株侵染的大麦叶片发病较轻,呈黄绿色,出现较少病斑。
李慧[4]（2021）在《热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究》文中研究表明昆虫作为一种变温动物,高温胁迫对其生长发育及繁殖产生不利影响。此外,全球气候变暖的加剧带来平均气温的升高和高温事件的频发,给昆虫带来了更大的挑战。在长期的进化过程中,昆虫逐步形成了一套基于行为、生理生化及遗传上的应对高温的响应机制。松墨天牛（Monochamus alternatus）是我国南方松林的一种重要蛀干害虫,也是我国重大检疫性森林病害—松材线虫病的主要媒介昆虫,对我国森林资源从经济上和生态上都造成了巨大的损失。松墨天牛主要分布于我国东南部地区,成虫在野外常常面临37.5℃及以上的高温天气。松墨天牛的耐热性及耐热机制直接影响其在气候变暖条件下的种群动态和地理分布,进而间接影响松材线虫病的扩散蔓延。热激蛋白（Heat Shock Protein,HSP）是一类分子伴侣,可在生物体遭遇热胁迫时保护底物蛋白热变性聚集和非正常降解,是昆虫应对高温胁迫的生理生化响应的重要组成部分。为探究松墨天牛在高温胁迫下的响应机制,本论文在明确松墨天牛成虫对高温胁迫的耐受性基础上,以热激蛋白为研究对象,利用基因克隆、荧光定量PCR、蛋白免疫印记和免疫荧光染色等技术,系统探究高温胁迫下HSP在雌雄成虫的虫体、组织和生殖细胞中的响应模式,异源表达后对其体外分子伴侣活性进行测定,最后通过RNA干扰实验验证HSP基因在松墨天牛热胁迫响应中的功能。主要研究结果和结论如下:1.高温胁迫处理条件下测定成虫的存活、取食、繁殖和子代适合度指标,对其耐热性进行评估。设置连续高温胁迫处理,测定松墨天牛雌雄成虫在37.5、40、42.5和45℃条件下的致死中时间。设置每天3 h的周期重复性热胁迫处理,发现37.5℃周期重复性热胁迫对成虫的存活情况、取食量、产卵量与子代适合度等参数未产生显着影响。当胁迫温度提高至40和42.5℃时,雌雄成虫寿命缩短、取食量和产卵量降低及子代适合度下降。但仍有部分个体可继续延续种群,并且成虫出现了热适应性及产卵策略的改变。研究结果可知,松墨天牛成虫的耐热性较强,夏季常见的37.5℃高温天气不会对其种群动态产生影响,随着全球气候变暖加剧,40℃及以上的高温频率增加,仍有部分个体可成功存活及繁殖。2.利用RACE和RT-PCR扩增技术,克隆获得了13条MaltHSP20s基因、2条MaltHSP40s基因和6条MaltHSP70s基因。通过生物信息学预测HSPs的结构特点,发现这些基因的开放阅读框长度、蛋白相对分子质量、结构域、序列标签、二级结构和三维结构均符合所属家族的特征。亚细胞定位预测显示松墨天牛热激蛋白基因广泛分布于胞外、细胞核、细胞质、线粒体与内质网等部位。对来自不同类群昆虫的HSP20、HSP40和HSP70基因分别构建系统发育树,显示松墨天牛的HSP基因均聚类在鞘翅目分支上,且与光肩星天牛（Anoplophora glabripennis）的HSP基因亲缘关系最近,表明松墨天牛热激蛋白基因序列的结构较为保守。3.通过荧光定量PCR检测了21条HSP基因在雌雄成虫在短时高温胁迫下的转录响应,结果表明:HSP基因的相对表达量在35℃的处理下开始上调,随胁迫温度的升高在42.5℃条件下达到峰值;热胁迫下,MaltHSP20-5、MaltHSP20-11、MaltHSP70-2这3条基因在雌雄成虫中的上调倍数最高;辅助分子伴侣MaltHSP40s和保守型Malt HSC70s的上调倍数较低;大多数HSP基因在卵巢和精巢中相对表达量最高,其次是触角、足和翅等组织,热激后HSP基因在头部上调倍数很高。筛选MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2为松墨天牛成虫热胁迫响应的关键基因,推测其优先保护生殖相关蛋白质。4.通过体外原核表达纯化成功获得了高浓度的MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白。体外分子伴侣活性验证实验表明MaltHSP20-5和MaltHSP20-11可有效保护苹果酸脱氢酶、柠檬酸合酶在43℃下的热聚集,且与底物摩尔浓度比例为1:1时保护效果较好,MaltHSP20-5的分子伴侣活性显着优于MaltHSP20-11。MaltHSP70-2在25至40℃温度区间内具备较高且稳定的ATP酶活力,过表达MaltHSP70-2的大肠杆菌细胞耐热性显着提高。说明松墨天牛HSP具备较高的分子伴侣活性,可在热胁迫下对松墨天牛体内蛋白质进行保护并提高细胞耐热性,从而帮助机体抵御热胁迫。5.通过蛋白免疫印记实验对松墨天牛热激蛋白在翻译水平上的表达特性进行检测。发现热胁迫后MaltHSP20-5、MaltHSP20-11及MaltHSP70-2蛋白在雌雄成虫及卵巢和精巢叶中大量上调。利用免疫荧光染色对热激蛋白在松墨天牛精巢叶中的分布进行检测,表明MaltHSP20-5和MaltHSP70-2均主要分布于初级精母细胞的细胞质中,并且热胁迫后平均荧光强度显着提高,而在精细胞中分布较少且无显着差异;热激后MaltHSP20-5蛋白在初级精母细胞的细胞核中有分布。从翻译水平上验证了HSP参与松墨天牛的热胁迫响应及其对生殖细胞的保护。6.利用RNA干扰技术探究降低MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因在松墨天牛体内的表达量对成虫耐热性及其他HSP基因表达量的影响,发现注射8μg MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因片段的双链RNA后,3～5d内检测到靶标基因的下调。MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因下调使松墨天牛雌雄成虫在42.5℃下的致死中时间缩短及存活率降低。同时,MaltHSP20-5基因下调后,MaltHSP40-1和MaltHSP70-2的表达量下调;MaltHSP70-2下调后,MaltHSP20-5和MaltHSP40-1的表达量上调。说明热激蛋白各家族之间存在互作关系,进一步验证了热激蛋白基因参与松墨天牛的热胁迫响应。
王俊秀[5]（2021）在《飞蝗DEAD-box家族基因及分子功能研究》文中研究表明DEAD-box蛋白是一类依赖于ATP的RNA解旋酶,广泛存在于细菌、真菌和动植物中,参与细胞内几乎所有与RNA有关的代谢过程,在生物体的生长发育过程中扮演着不可或缺的角色。多数有关DEAD-box蛋白的研究集中在酵母、哺乳动物和人中,而昆虫中的研究相对较少。本文以农业害虫飞蝗（Locusta migratoria）为研究对象,分析DEAD-box基因在飞蝗不同发育阶段和表皮、脂肪体及卵巢等组织器官中的表达模式,并通过RNAi方法探究了DEAD-box基因在飞蝗生长和生殖发育过程中的功能。本研究为全面解析飞蝗DEAD-box基因功能奠定了基础,也为害虫防治提供了新的靶标基因。本文主要研究结果如下:一、飞蝗DEAD-box家族基因的分子特性及系统发育分析根据人和果蝇DEAD-box基因（DDXs）序列,搜索飞蝗转录组数据库,获得了32个飞蝗DEAD-box家族基因,并参照与人DDXs的同源性,对飞蝗DDXs进行命名（LmDDXs）。研究发现,不同LmDDXs基因之间的序列长度集中在840-2502 bp之间,其中26个基因具备全长CDS序列,均包含DDXs基因特有的9个保守motifs。大部分LmDDXs蛋白均含有DEXDc和HELICc功能域,且部分LmDDXs蛋白的N-或C-末端含有特异的结构域,如DUF4217、Zn＿C2HC、KH和DBP10 CT domain,这些结构可能决定了LmDDXs基因的功能特异性。利用飞蝗基因组数据库分析其基因结构,结果显示,LmDDXs基因的外显子数目差异较大,其中LmDDX23和LmDDX41只有一个外显子,而LmDDX27有15个外显子。系统发育分析发现:几乎所有LmDDXs基因在果蝇、家蚕、赤拟谷盗、白蚁和德国小蠊中都有直接同源基因,表明昆虫中DDXs基因具有高度保守性。另外,大多数飞蝗LmDDXs在人中也都有同源基因。这说明DDXs基因在动物进化过程中是保守的。二、飞蝗DEAD-box家族基因的mRNA表达特性及功能分析利用RT-qPCR对32个飞蝗LmDDXs基因在不同发育阶段的表达进行了分析,结果显示:LmDDXs基因在卵（中期）、若虫和成虫中均有表达;大部分LmDDXs基因在飞蝗卵期的表达量较低,在2、3龄若虫期的表达较高;LmDDX4、LmDDX49和LmDDX52等基因在整个发育过程中的表达比较稳定。LmDDXs基因在飞蝗表皮、脂肪体、前肠、中肠、后肠、胃盲囊、马氏管、精巢和卵巢中的表达图谱显示:大部分基因在精卵巢中的表达水平较其它组织高。采用RNAi技术分析了32个LmDDXs基因在飞蝗生长发育中的功能,对3龄若虫飞蝗注射ds LmDDXs,结果表明:LmDDXs的沉默效率在52%-98%之间;其中下调LmDDX18、LmDDX39、LmDDX41、LmDDX47、Lme IF4A和LmDDX3、LmDDX6 7个基因导致飞蝗存活时间缩短,最终于蜕皮前后相继死亡;解剖死亡飞蝗的内部结构发现,前5个基因的下调引起飞蝗中肠和胃盲囊发育萎缩,而后2个基因则无此现象。上述结果表明:部分LmDDXs基因在飞蝗肠道发育中发挥重要作用。三、LmDDX47对飞蝗肠道发育的影响为了解LmDDXs基因对飞蝗肠道发育的具体影响,本文选择了LmDDX47,分别在5龄若虫和成虫中对其进行RNAi分析。结果表明:在这些发育阶段中下调LmDDX47,均会导致飞蝗中肠及胃盲囊萎缩,表明LmDDX47在肠道发育和维持上是必需的,没有发育阶段特异性。进一步通过切片染色观察中肠和胃盲囊组织学变化,结果显示:下调LmDDX47,导致肠上皮细胞和肠道干细胞的数目明显减少;经TUNEL染色发现肠上皮细胞出现明显的凋亡现象,Histone 3 RNA原位杂交显示肠道干细胞的增殖能力减弱;深入观察其超微结构变化发现,线粒体形态肿大且分布于整个细胞中;为了更好地理解LmDDX47在肠道发育中的作用机制,本文分析了LmDDX47在中肠的表达丰度及其亚细胞定位情况,结果表明:LmDDX47在整个飞蝗中肠发育过程中稳定表达,且定位于细胞核仁,预测其参与核糖体的合成。经RT-qPCR检测发现下调LmDDX47确实引起18S r RNA的合成减少。为了深入解析LmDDX47在飞蝗中肠的作用机制,对干扰LmDDX47后的飞蝗中肠蛋白进行了蛋白修饰检测,结果显示:部分中肠蛋白的乙酰化、巴豆酰化程度增加。这些研究结果表明:LmDDX47在飞蝗肠道发育中对肠干细胞的增殖、线粒体正常形态的维持和部分肠道蛋白的修饰具有调控作用。四、DEAD-box基因对飞蝗生殖发育的影响LmDDXs表达数据显示:绝大部分LmDDXs在飞蝗精、卵巢表达较高,但下调这些基因后,没有发现明显的精巢发育异常。因此,本文仅聚焦LmDDXs基因对卵巢发育的影响。首先选择了12个在飞蝗卵巢中表达量较高的LmDDXs基因进行研究,结果表明:下调LmDDX3,LmDDX6,LmDDX18,LmDDX39,LmDDX41,LmDDX47和Lme IF4A的表达,均导致飞蝗卵巢发育和卵母细胞成熟阻滞,表明这些基因对飞蝗卵巢发育至关重要。进一步以LmDDX3和LmDDX6为例,具体分析了其在成虫飞蝗卵巢发育中的作用。下调LmDDX3或LmDDX6,均引起调控卵巢发育的JH信号通路靶基因的表达异常,脂肪体组织中卵黄原蛋白（LmVg）的表达降低;最终导致飞蝗卵巢发育和卵母细胞成熟受阻。然而,下调LmDDX3和LmDDX6后,部分靶基因的表达出现明显差异。下调LmDDX3后,卵黄原蛋白受体（LmVg R）的表达显着升高,而下调LmDDX6后,LmVg R的表达则没有明显变化;此外,下调LmDDX6导致JH受体LmMet及其靶基因LmGrp78-2均发生下调,而干扰LmDDX3并不影响这些基因的表达。这表明这些LmDDXs在卵巢发育过程中的作用机制可能不同。综上所述,本文通过生物信息学方法获得了32个LmDDXs基因,并对其进行了基因和蛋白结构分析;采用RT-qPCR的方法分析了这些基因在飞蝗不同发育阶段和不同组织器官中的表达情况;利用RNAi方法筛选获得了参与飞蝗肠道和卵巢发育的几个关键基因。详细研究了LmDDX47对飞蝗中肠发育以及LmDDX3和LmDDX6对成虫飞蝗卵巢发育的作用机制。研究结果揭示了部分LmDDXs基因在飞蝗生长发育中的生物学功能,为研究其它生物类群DDXs基因功能奠定了基础,并为开展基于RNAi的害虫防治提供了新的分子靶标。
周长印[6]（2021）在《淡色库蚊Met基因的表达模式及其在生殖、吸血和吡丙醚抗性中的功能研究》文中研究指明保幼激素（juvenile hormone,JH）是在昆虫生长发育中起重要调控作用的物质,Methoprene-tolerant（Met）作为JH的受体,属于bHLH-PAS家族成员之一,在JH发挥功能效应中扮演着重要角色。本文以重要的媒介昆虫淡色库蚊Culexpipienspallens为研究对象,克隆了保幼激素受体基因CpMet的全长cDNA序列并对序列特征结构进行分析,利用实时荧光定量PCR技术分析了 CpMet在淡色库蚊不同组织、不同发育阶段的表达分布以及激素处理对CpMet基因表达的影响,使用RNA干扰技术研究了CpMet对淡色库蚊生殖和吸血行为的影响及CpMet在淡色库蚊对吡丙醚抗性中的作用。研究结果对进一步认识保幼激素信号通路调控昆虫生殖的分子机制和仿生保幼激素类杀虫剂的抗药性治理具有重要的科学意义和应用价值。主要研究结果如下:克隆了淡色库蚊保幼激素受体基因CpMet全长cDNA序列,并对其序列和结构特征进行了分析。CpMet开放阅读框（ORF）长2,892 bp,编码963个氨基酸,预测蛋白质分子量（Mw）和等电点（pI）分别为105.10kDa和6.44。结构域分析表明,CpMet具有保守的 bHLH（basic Helix-Loop-Helix）,PAS（Per-Arnt-Sim,PAS-A,PAS-B）和 PAC（PAS C terminal）结构域。序列分析发现,CpMet与埃及伊蚊Aedesaegypti和赤拟谷盗Tribolium castaneum的氨基酸序列一致性分别为52.7%、26.6%。系统发生分析表明:CpMet基因与其它双翅目昆虫,如埃及伊蚊、中华按蚊Anophels sinensis、冈比亚按蚊Anopheles gambiae等聚为一支。CpMet在淡色库蚊不同发育阶段和不同组织中的相对表达量测定结果表明:CpMet在淡色库蚊各个发育阶段均有表达,在卵期表达量显着高于其他阶段,其次是蛹和成虫,幼虫期表达量很低。CpMet在雌成蚊卵巢中表达水平较高,其次是脂肪体。进一步研究发现在保幼激素类似物烯虫酯（Methoprene）处理6h、12h、24h后,雌性成蚊的CpMet表达量分别上调1.27倍,4.15倍和1.26倍,表明CpMet受JH的正调控。用蜕皮激素20E处理蚊蛹24h后,CpMet基因的表达量急剧增加,表明CpMet基因表达受20E的诱导。研究了 CpMet在淡色库蚊生长发育和生殖中的作用。采用显微注射法对未吸血未交配的雌性淡色库蚊成蚊进行RNA干扰,结果显示,与对照组（dsEGFP处理）相比,dsCpMet处理组CpMet mRNA表达水平在干扰后24h和48h分别下调50.29%和86.29%。注射dsCpMet后雌蚊存活率降至74.44%。注射dsCpMet1日后,蚊虫正常交配吸血,记录其产卵量、平均产卵数和孵化率,结果显示注射dsCpMet的雌蚊所产的卵块平均含卵数下降了26.58%,卵的孵化率降至73.36%。研究了 CpMet对淡色库蚊吸血行为的影响,检测了未吸血雌蚊与吸血后3日的雌蚊CpMet的相对表达量,结果显示CpMet表达量无显着差异。对未吸血的雌性成虫采用显微注射法进行RNA干扰,结果表明:注射dsCpMet组的雌蚊吸血响应时间显着增加,吸血率和饱血率分别下降了 34.45%和19.07%。研究了CpMet基因在淡色库蚊对吡丙醚抗性中的作用,通过荧光定量PCR检测了敏感品系和抗性品系的CpMet基因的相对表达量,实验结果表明,抗性品系的CpMet基因表达量显着降低,为敏感品系的43.59%。检测了用不同剂量（敏感品系的LC30、LC50和LC70）吡丙醚处理6h、12h和24h后淡色库蚊4龄幼虫和蛹CpMet基因的相对表达量,结果显示:三个剂量处理4龄幼虫,6h后CpMet mRNA表达水平显着下调了 79.67%、88.10%、92.91%,12h后表达水平上显着升,是对照组的3.98倍、4.78倍、4.45倍,24h后与对照组相比LC30、LC50处理组无显着性差异,LC70处理组表达水平是对照组的1.97倍。三个剂量处理蚊蛹,6h后LC50处理组CpMet表达量上升,是对照组的1.35倍。12h、24h后LC30和LC50处理组,CpMet表达量呈现下降趋势,在24h时分别下调了 94.73%、92.93%,而6h、12h、24h后LC70处理组CpMet几乎不表达。RNA干扰CpMet基因后对吡丙醚进行敏感性测定,将RNA干扰后的蛹放入LC30、LC50和LC70吡丙醚药液中浸泡,观察至羽化。结果表明,LC30和LC50的对照组和干扰组无显着差异。LC70的存活率上调至51.12%。
刘凯[7]（2021）在《家蚕味觉受体的RNA干扰条件摸索及BmGr63相关功能初探》文中研究说明植食性昆虫在长期的进化过程中与寄主植物形成了特定的相互作用模式。昆虫利用化学感受系统对外界环境信息进行综合处理进而对趋性反应、觅食、取食行为进行指导。目前开展的比较多的是对昆虫嗅觉受体的研究,对于昆虫味觉受体的研究相对较少。昆虫的味觉受体参与到昆虫的多项生理活动,例如在昆虫的取食行为中起着至关重要的作用。位于昆虫味觉神经元中的味觉受体可以识别植物汁液中的可溶性化学成分,再通过味觉受体神经将这些信息传入到中枢神经中,中枢神经将传入的信息进行整合进而决定是否取食该植物。目前对于这种分子识别机制的研究尚未透彻,家蚕（Bombyx mori）作为一种重要的经济昆虫,经过长期的人工驯化历程,它已与桑树形成了独特的互作关系。对家蚕味觉受体配体的鉴定与分析能够为寡食性的鳞翅目昆虫与其寄主植物间的关系提供一定见解,为深入了解动物-植物协同进化打下基础。本研究以家蚕幼虫为实验材料,采用分子生物学、钙离子成像等方法,通过RNAi技术对家蚕的味觉受体表达模式进行研究,主要研究结果如下:1、家蚕味觉受体BmGr63的克隆及表达根据家蚕味觉受体在家蚕幼虫各部位的表达图谱,发现该家蚕味觉受体相对于其他味觉受体在取食旺盛期的取食相关器官中有较高的表达量。本研究从家蚕幼虫的下颚c DNA中成功克隆得到了BmGr63,通过蛋白结构预测网站HMMTOP（http://www.enzim.hu/hmmtop/html/adv＿submit.html）预测该基因蛋白序列跨膜结构,结果表明其蛋白结构具有典型的7个跨膜结构域,符合味觉受体的结构特征。进行荧光定量PCR发现BmGr63在家蚕幼虫的上唇、上颚、下唇、下颚、胸足以及中肠中均有表达,对BmGr63和几个已鉴定配体物质的昆虫味觉受体进行氨基酸序列比对分析,结果显示BmGr63与Harm Gr1亲缘关系相对较近,而Harm Gr1被证明是识别海藻糖的受体,因此推测BmGr63也是相关糖受体。通过钙离子成像技术对BmGr63的配体物质进行了初步的鉴定,筛选了四种糖类物质蔗糖、葡萄糖、果糖、海藻糖,结果表明这四种糖类物质均不是BmGr63的配体物质。2、dsRNA介导的BmGr63表达量下调以BmGr63为研究对象,使用细菌诱导表达dsRNA和T7体外转录合成dsRNA两种方法均成功合成BmGr63特异的dsRNA,使用增强绿色荧光蛋白基因EGFP特异的dsRNA作为对照。利用饲喂和注射的方法将dsRNA导入家蚕幼虫体内对该基因进行干涉表达。五龄幼虫在连续添加3次1μg,3μg,5μg剂量的dsRNA63后,结果表明在饲喂后12 h、24 h、36 h时BmGr63的相对表达量都低于正常的幼虫。并且发现添加剂量为5μg,作用时间为24 h时,干扰效率达到最大为34.19%。进一步探究添食dsRNA对味觉受体表达量的影响,添加1次5μg,10μg剂量的dsRNA后,结果表明在饲喂后的12 h、24 h、36 h后BmGr63的相对表达量都低于正常的幼虫,并且发现添加剂量为5μg,作用时间为12 h时,干扰效率达到最大为54.45%。对四龄眠起的家蚕每隔12 h添加剂量为5μg的dsRNA并观察出现的表型,结果显示干扰BmGr63没有对家蚕幼虫的体重以及产卵量造成明显的影响,但发现了两头翅原基发育不完全的蚕蛹,可能与相关激素识别受抑制相关。下一步可通过基因编辑技术对这一功能进行深入的研究。
裴培[8]（2021）在《花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究》文中提出花绒寄甲（Dastarcus helophoroides）属鞘翅目寄甲科昆虫,作为一种重要的天敌生物,已被广泛应用于天牛类害虫的生物防治。细胞色素P450是昆虫三大解毒酶之一,在昆虫对多种化学杀虫剂的解毒代谢过程中发挥重要作用。随着化学农药的大量使用,药剂在杀死害虫的同时,对天敌昆虫也有较大影响。关于农药对害虫的影响、害虫对农药的解毒代谢机制有较多的相关报道,但关于蛀干害虫的天敌——花绒寄甲对农药胁迫的响应机制未见相关报道。本文首先探究了常用杀虫剂氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力;其次利用转录组测序技术筛选出花绒寄甲在氯氰菊酯药剂处理下高表达的P450基因,再同时借助实时荧光定量技术检测不同浓度氯氰菊酯处理后花绒寄甲相关P450基因表达差异,最后使用RNAi技术验证相关P450基因的功能,为后续探究花绒寄甲对氯氰菊酯的解毒代谢过程奠定基础。主要试验结果如下:1、利用浸渍法,获得氯氰菊酯对花绒寄甲的击倒中浓度KC50为0.19 mg/L,KC30为0.08mg/L。被击倒后的花绒寄甲胸足抽搐,无法正常爬行和取食。花绒寄甲对氯氰菊酯的耐受性较好,只有在较高浓度的氯氰菊酯处理下才会出现死亡。2、利用氯氰菊酯KC30药剂浓度和丙酮浸渍处理花绒寄甲成虫,提取处理后24h的总RNA,构建cDNA文库,利用Illumina技术进行测序,获得相应转录组数据。以|log2（Fold Change）|>0为标准,共筛选出90条差异表达的P450基因,其中有57条基因表达量升高,最高的差异倍数为39.4倍;有33条基因的表达量下降,最高下降了7.5倍。3、从转录组数据中筛选出差异表达的12条P450基因,利用实时荧光定量技术检测花绒寄甲在氯氰菊酯KC10、KC30浓度处理下,1h、4h、8h、12h、24h、48h时基因的表达差异,结果表明:花绒寄甲在受到药剂胁迫后,这12条基因的表达量在各时段内均有上升,在8h-24h内,基因表达量上升最明显的分别是:农药处理8h时,基因Dh 1216的表达量是对照组的9倍,处理12h时,基因Dh 775的表达量是对照组的9倍,处理24h时,基因Dh 1094的表达量是对照组的5倍。4、利用RNAi技术,向花绒寄甲体内注射不同注射量、不同P450基因的dsRNA,结果发现:对花绒寄甲的P450基因进行单一干扰时,基因Dh 775的表达量下降最明显,下降了77.0%;基因Dh 1094的表达量下降最小,下降了47.3%;当两条基因或三条基因混合干扰时,在一定注射量范围内,基因表达量会随dsRNA注射量的增加而降低。干扰基因Dh 1094后,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性变化最为明显,用KC50浓度处理24h时,击倒率上升至96.7%。单一干扰基因Dh 775、Dh 1216后,击倒率分别上升至68.2%、73.7%。混合干扰中,干扰基因相同的情况下,花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性会随着注射量的增多而升高。因此推测花绒寄甲的三条P450基因:Dh 1216、Dh775、Dh 1094与其对氯氰菊酯的解毒代谢功能相关。
李岚[9]（2021）在《利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究》文中研究说明毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPCs）是位于毛囊底部的特殊的成纤维细胞团,绒山羊绒毛生长和周期性发育机制与毛乳头细胞的增殖密切相关,这一过程受到多个基因的调控。研究表明Hoxc13基因在控制毛发形成中具有重要作用,其主要在真皮乳头细胞中表达,经过该基因过表达或者缺陷处理的小鼠都显示异常的毛发生长。目前利用转录组等多种方法鉴定了大量与绒山羊绒毛生长和周期性发育相关的候选基因,但所筛选的基因数目庞大,且差异较大,这为从中选择少数关键基因而进行后续的功能研究带来了不便。因此,需要在筛选方法上进行创新。基于CRISPR的筛选系统可实现多靶点的基因组编辑,同时在基因功能的鉴定方面被大规模的应用,包括对细胞耐药性、细胞增殖等相关基因的筛选。因此,本研究利用CRISPR聚焦型文库,通过在陕北白绒山羊DPCs中实现基因敲除,进而鉴定DPCs增殖的必需基因（essential genes）。试验过程及具体结果如下:（1）设计并构建CRISPR聚焦型文库。选择本实验室前期所鉴定的以及NCBI上已公布的绒山羊皮肤和毛囊差异表达基因,共822个基因用于文库的构建。该文库包含4910条sg RNA,其中40条为非靶向山羊基因组的阴性对照sg RNA,另外4870条sg RNA分别靶向822个蛋白编码基因。通过高通量测序技术对文库质量进行评估,发现文库中85%的sg RNA具有最佳的GC含量;97.85%的sg RNA靶向所有Ref Seq同工型共有的外显子;86%的sg RNA靶向基因内mRNA的5’端。以上结果表明CRISPR聚焦型文库具有高度的编辑活性,可用于高质量筛选。（2）毛乳头细胞的鉴定。显微镜下观察细胞,可见该细胞具有凝集性生长特性、呈扁平状和多角形等特征;对细胞进行免疫荧光染色,发现α-SMA和Vimentin毛乳头细胞分子标记物免疫荧光呈阳性表达,表明该细胞为DPCs。（3）毛乳头细胞增殖必需基因的筛选。在MOI值为0.5的条件下对DPCs进行慢病毒文库感染,48 h后使用嘌呤霉素进行筛选,而后转入正常的细胞培养,分别在药筛后第0天（D0）、第9天（D9）和第15天（D15）收集存活的细胞用于高通量测序。利用高通量测序及生物信息学技术筛选DPCs增殖的必需基因,最终共获得57个候选基因。结合GO分析和KEGG通路分析发现这些候选基因与细胞生长、细胞周期和细胞凋亡有关。（4）必需基因的功能验证。在排名前10的候选基因中选择SBDS、HJURP以及FNDC5进行功能验证。利用siRNA干扰SBDS、HJURP以及FNDC5基因在DPCs中的表达,通过CCK8增殖试验、Ed U和流式细胞仪检测细胞周期技术等检测其对DPCs增殖的影响。结果表明干扰SBDS基因和HJURP基因的表达抑制了DPCs的增殖;干扰FNDC5基因的表达促进了DPCs的增殖。本试验以陕北白绒山羊背部皮肤为原材料分离纯化DPCs,根据实验室前期以及NCBI上已公布的与皮肤毛囊生长有关的差异基因构建CRISPR聚焦型敲除文库,利用慢病毒将CRISPR文库导入DPCs,进而实现基因敲除,随后基于阴性筛选策略利用高通量测序技术以及生物信息学技术筛选并鉴定DPCs增殖过程中的必需基因。本论文为进一步挖掘和鉴定在绒山羊中具有重要研究和育种价值的关键基因提供了新的研究方法,同时为动物功能基因组学研究提供了参考。
韦张其[10]（2021）在《DDIT3基因对奶牛产奶性状的遗传效应分析及功能验证》文中认为挖掘与鉴定影响奶牛产奶性状的关键基因是改善牛奶品质的关键步骤。课题组前期基于转录组测序确定DNA损伤诱导转录因子3（DNA damage induced transcript 3,DDIT3）（p=4.01E-05）为奶牛产奶性状重要的候选基因。因此,本研究首先通过大群验证对DDIT3进行遗传效应分析,进一步通过DDIT3干扰实验验证其功能,结果如下:（1）遗传效应分析:通过混池测序检测DDIT3的多态性,在启动子区发现2个SNPs位点,进一步与中国荷斯坦牛的5个产奶性状（产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）进行关联分析,确定SNP位点的遗传效应。发现DDIT3基因2个位点均与乳脂性状极显着关联（p=0.0001;p=0.0006）,与产奶量关联显着（p=0.0063）,且这2个SNPs完全连锁。（2）干扰片段筛选:首先利用Crispr-CAS9成功构建了p GBCas9-2A-puro-2A-GFP载体,通过脂质体转染奶牛乳腺上皮细胞,但转染效率非常低,故进一步实验采用慢病毒干扰技术对DDIT3基因进行干扰。通过设计合成sh RNA,连接至慢病毒载体质粒LV3（H1/GFP&Puro）,构建DDIT3基因的重组慢病毒干扰载体,转化后提取质粒通过酶切和测序进行阳性克隆的鉴定。将鉴定正确的重组慢病毒载体质粒分别与包装质粒（p Gag/Pol、p Rev、p VSV-G）共转染293T细胞,获得的重组慢病毒,将DDIT3慢病毒sh RNA干扰载体感染奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）,成功获得DDIT3基因的慢病毒重组干扰载体DDIT3-LV3-D287（干扰效率60%）。（3）DDIT3基因的功能验证:将阴性对照组与DDIT3-LV3-D287实验组转染MAC-T细胞,72h后提取总RNA,基于RNA-seq筛选出显着差异基因3838个,其中包含1989个上调基因,1949个下调基因,并对筛选的差异基因并进行GO和Pathway富集分析,富集结果显示DDIT3基因主要影响细胞的增殖、细胞凋亡、免疫炎症方面的相关通路。同时,与脂质代谢相关的基因SCD、ELOVL6、ACSL6等基因在不同处理组显着差异性表达（p<0.001）。因此,DDIT3基因可能通过影响脂质代谢相关基因的表达及介导细胞免疫、凋亡等进一步调控奶牛的产奶性状。
二、RNA干扰与基因功能研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干扰与基因功能研究（论文提纲范文）
（1）马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略语表 Abbreviations |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物MAPK级联途径 |
| 1.1.1 植物MAPK级联途径组成 |
| 1.1.2 植物中的MAPKKK |
| 1.1.3 植物中的MAPKK |
| 1.1.4 植物中的MAPK |
| 1.2 植物MAPK级联途径参与植物激素信号转导 |
| 1.2.1 乙烯信号转导 |
| 1.2.2 脱落酸信号转导 |
| 1.2.3 茉莉酸信号转导 |
| 1.2.4 水杨酸信号转导 |
| 1.2.5 生长素信号转导 |
| 1.2.6 油菜素甾醇信号转导 |
| 1.2.7 赤霉素信号转导 |
| 1.3 MAPK级联参与调控植物非生物胁迫 |
| 1.3.1 盐胁迫 |
| 1.3.2 干旱胁迫 |
| 1.3.3 温度胁迫 |
| 1.3.4 氧化应激响应 |
| 1.3.5 臭氧胁迫 |
| 1.3.6 创伤响应 |
| 1.3.7 重金属胁迫 |
| 1.4 植物中磷酸化蛋白组学研究的应用 |
| 1.5 研究内容及目的意义 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究目的意义 |
| 第二章 马铃薯StMAPKs的差异表达分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 生化试剂 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 植物材料及处理 |
| 2.1.4.1 非生物胁迫和植物激素处理 |
| 2.1.4.2 马铃薯植株不同组织器官的取样 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 2.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 2.1.5.3 实时荧光定量qRT-RCR分析StMAPKs表达谱 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 非生物胁迫及植物激素处理下的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.2.1.1 脱落酸处理 |
| 2.2.1.2 干旱处理 |
| 2.2.1.3 乙烯处理 |
| 2.2.1.4 赤霉素处理 |
| 2.2.1.5 H_2O_2处理 |
| 2.2.1.6 高温处理 |
| 2.2.1.7 生长素处理 |
| 2.2.1.8 茉莉酸处理 |
| 2.2.1.9 低温处理 |
| 2.2.1.10 NaCl处理 |
| 2.2.1.11 PEG处理 |
| 2.2.1.12 水杨酸处理 |
| 2.2.2 不同组织器官中的StMAPKs差异表达分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 马铃薯StMAPK3 抗盐和渗透胁迫相关的功能研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 生化试剂 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 引物 |
| 3.1.4 植物材料及处理 |
| 3.1.5 试验方法 |
| 3.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 3.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 3.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 3.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.1.5.5 回收目的片段 |
| 3.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 3.1.5.7 马铃薯StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.1.5.8 酵母双杂试验 |
| 3.1.5.9 双分子荧光互补试验 |
| 3.1.5.10 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 3.1.5.11 盐和渗透胁迫条件下生理指标分析 |
| 3.1.5.12 盐和渗透胁迫条件下生长指标和气孔的分析 |
| 3.1.5.13 盐和渗透胁迫条件下光合指标的分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK3 基因的分离 |
| 3.2.2 载体的构建 |
| 3.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk3 的构建 |
| 3.2.2.3 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK3 的构建 |
| 3.2.2.4 酵母双杂表达载体的构建 |
| 3.2.2.5 双分子荧光互补(BiFC)表达载体的构建 |
| 3.2.3 StMAPK3 的亚细胞定位 |
| 3.2.4 酵母双杂交筛选与StMAPK3 互作蛋白 |
| 3.2.4.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK3 毒性与自激活检测 |
| 3.2.4.2 StMAPK3 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 3.2.4.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 3.2.5 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 3.2.6 转基因马铃薯的植株的获得与检测 |
| 3.2.7 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生理指标分析 |
| 3.2.8 NaCl、甘露醇和PEG处理下的光合指标分析 |
| 3.2.9 NaCl、甘露醇和PEG处理下的生长指标及气孔分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 马铃薯StMAPK11 抗旱胁迫相关的功能研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 生化试剂 |
| 4.1.2 培养基 |
| 4.1.3 引物 |
| 4.1.4 植物材料及处理 |
| 4.1.4.1 马铃薯材料及处理 |
| 4.1.4.2 烟草材料及处理 |
| 4.1.4.3 拟南芥材料及处理 |
| 4.1.5 试验方法 |
| 4.1.5.1 植物总RNA的提取 |
| 4.1.5.2 反转录cDNA第一链的合成 |
| 4.1.5.3 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5.4 PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.1.5.5 回收目的片段 |
| 4.1.5.6 植物表达载体构建 |
| 4.1.5.7 马铃薯StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.1.5.8 原核表达马铃薯StMAPK11 蛋白 |
| 4.1.5.9 原核表达马铃薯StMAPK11 重组蛋白抗体制备 |
| 4.1.5.10 Western blot |
| 4.1.5.11 酵母双杂试验 |
| 4.1.5.12 双分子荧光互补试验 |
| 4.1.5.13 马铃薯遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.14 烟草遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.15 拟南芥遗传转化及鉴定 |
| 4.1.5.16 干旱胁迫条件下马铃薯植株生理指标分析 |
| 4.1.5.17 干旱胁迫条件下烟草的生理指标分析 |
| 4.1.5.18 干旱胁迫条件下拟南芥的生理指标分析 |
| 4.1.5.19 干旱胁迫条件下马铃薯植株的生物量和生长指标分析 |
| 4.1.5.20 干旱胁迫条件下光合指标的分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 马铃薯中与渗透和盐胁迫相关的StMAPK11 基因的分离 |
| 4.2.2 载体的构建 |
| 4.2.2.1 过表达载体pCPB-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.2 RNA干扰表达载体pCPB121-miRmapk11 的构建 |
| 4.2.2.3 拟南芥和烟草表达载体pART-CAM-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.4 亚细胞定位载体pCAM35s-GFP-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.5 原核重组表达载体pET28b-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.6 酵母双杂表达载体pGBKT7-StMAPK11 的构建 |
| 4.2.2.7 双分子荧光互补(BiFC)试验表达载体的构建 |
| 4.2.3 原核表达StMAPK11 及抗体制备 |
| 4.2.3.1 原核重组StMAPK11 蛋白表达 |
| 4.2.3.2 间接ELISA法检测兔抗StMAPK11 抗血清效价 |
| 4.2.3.3 兔抗StMAPK11 抗血清的Western blot鉴定 |
| 4.2.4 StMAPK11 的亚细胞定位 |
| 4.2.5 酵母双杂交筛选与StMAPK11 互作蛋白 |
| 4.2.5.1 诱饵载体pGBKT7-StMAPK11 毒性与自激活检测 |
| 4.2.5.2 StMAPK11 诱饵蛋白筛选马铃薯cDNA文库及分析 |
| 4.2.5.3 酵母双杂交验证蛋白互作 |
| 4.2.6 双分子荧光互补试验(BiFC)验证结果 |
| 4.2.7 转基因马铃薯植株的获得与检测 |
| 4.2.8 转基因烟草植株的获得与检测 |
| 4.2.9 转基因拟南芥植株获得与检测 |
| 4.2.10 干旱胁迫下的生理指标分析 |
| 4.2.10.1 干旱胁迫下马铃薯植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.2 干旱胁迫下烟草植株的生理指标分析 |
| 4.2.10.3 干旱胁迫下拟南芥植株的生理指标分析 |
| 4.2.11 干旱胁迫下的光合指标分析 |
| 4.2.12 干旱胁迫下的生长指标及生物量分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 马铃薯StMAPK3 磷酸化修饰定量蛋白组学分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 植物材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 总蛋白提取 |
| 5.1.2.2 蛋白质检 |
| 5.1.2.3 蛋白酶解 |
| 5.1.2.4 磷酸化修饰多肽富集 |
| 5.1.2.5 液质检测 |
| 5.1.2.6 蛋白质的鉴定和定量 |
| 5.1.2.7 蛋白质和差异表达蛋白质的功能分析 |
| 5.1.2.8 基序分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 磷酸化蛋白质组学数据质控与鉴定 |
| 5.2.2 磷酸化蛋白功能注释 |
| 5.2.3 磷酸化修饰位点分析 |
| 5.2.4 磷酸化蛋白差异分析 |
| 5.2.5 差异磷酸化蛋白生物信息学分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读博士期间发表论文 |
| 导师简介 |
（2）菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 PDV的发现与形态 |
| 1.1 PDV的命名及分类 |
| 1.2 PDV的形态特征 |
| 2 PDV的生活史 |
| 2.1 复制与组装过程 |
| 2.2 成熟及侵染传播 |
| 3 PDV的起源 |
| 3.1 PDV环状基因组部分的起源 |
| 3.2 PDV前病毒中非基因组部分的起源 |
| 3.3 BV和IV是独立起源的 |
| 4 PDV及杆状病毒复制和组装基因功能的研究 |
| 4.1 杆状病毒复制及组装的核心基因 |
| 4.2 BV和IV复制及组装相关的基因 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 基本材料与方法 |
| 1 基本实验材料 |
| 1.1 养虫设备 |
| 1.2 供试材料 |
| 2 实验仪器和软件系统 |
| 2.1 常用仪器 |
| 2.2 软件系统 |
| 3 常用实验试剂和配制方法 |
| 3.1 LB培养基 |
| 3.2 抗生素 |
| 3.3 PBS |
| 3.4 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 |
| 3.5 感受态大肠杆菌的制备 |
| 3.6 电镜固定液的配置 |
| 3.7 常用试剂盒 |
| 3.8 其它试剂 |
| 4 常用实验方法 |
| 4.1 全基因组DNA提取 |
| 4.2 TRIzol法提取总RNA |
| 4.3 cDNA第一链的合成 |
| 4.4 普通PCR |
| 4.5 荧光定量PCR(qPCR) |
| 4.6 TA连接 |
| 4.7 转化 |
| 4.8 琼脂糖凝胶电泳和切胶回收 |
| 4.9 质粒提取 |
| 第三章 CvBV在卵巢内的复制及组装动态 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试昆虫 |
| 2.2 寄生蜂不同发育时期卵巢的解剖 |
| 2.3 卵萼细胞核的染色 |
| 2.4 图片采集和处理 |
| 2.5 不同发育时期卵巢基因组DNA的提取 |
| 2.6 透射电子显微镜(TEM)样品制备 |
| 2.7 qPCR检测成环的粒子的丰度 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CvBV形成与卵巢发育的关系 |
| 3.2 卵巢内CvBV丰度动态 |
| 3.3 CvBV组装过程 |
| 4 讨论 |
| 第四章 CvBV复制与组装相关基因的鉴定及表达分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 全长转录组的c DNA文库构建和测序 |
| 2.3 Illumina cDNA文库构建和卵巢转录组测序 |
| 2.4 全长转录组数据处理 |
| 2.5 卵巢转录组数据处理 |
| 2.6 基因表达差异和富集分析 |
| 2.7 CvBV组装相关基因的鉴定 |
| 2.8 CvBV病毒粒子的质谱样品准备 |
| 2.9 CvBV组装相关基因的质谱分析 |
| 2.10 CvBV组装相关基因的进化分析 |
| 2.11 CvBV组装相关基因的表达谱分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菜蛾盘绒茧蜂基因组注释的更新 |
| 3.2 卵巢转录组测序及差异表达基因鉴定 |
| 3.3 差异基因GO和KEGG富集分析 |
| 3.4 CvBV复制及组装基因的序列鉴定与表达分析 |
| 3.5 CvBV复制与组装基因的表达谱 |
| 3.6 萼液及CvBV病毒粒子蛋白质谱分析 |
| 4 讨论 |
| 第五章 CvBV复制及组装相关基因的功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 显微注射样品收集 |
| 2.2 dsRNA合成 |
| 2.3 显微注射 |
| 2.4 检测寄生时间的行为学实验 |
| 2.5 干扰效率检测 |
| 2.6 透射电子显微镜 |
| 2.7 qPCR检测成环的病毒粒子丰度 |
| 2.8 统计方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 RNAi体系的建立 |
| 3.2 整合酶和解旋酶基因的功能鉴定 |
| 3.3 病毒转录相关基因的功能鉴定 |
| 3.4 CvBV衣壳蛋白功能鉴定 |
| 3.5 CvBV囊膜蛋白功能鉴定 |
| 3.6 CvBV组装相关基因功能鉴定 |
| 3.7 CvBV组装过程的其它基因功能探究 |
| 4 讨论 |
| 第六章 20E抑制CvBV组装过程晚期基因的表达 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 样品收集 |
| 2.2 Illumina cDNA文库构建和卵萼转录组测序 |
| 2.3 卵萼转录组数据生物信息分析 |
| 2.4 差异基因鉴定和GO、KEGG富集分析 |
| 2.5 卵巢体外培养 |
| 2.6 基因克隆和表达分析 |
| 2.7 dsRNA合成 |
| 2.8 显微注射 |
| 2.9 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 卵萼转录组测序 |
| 3.2 差异基因鉴定及GO、KEGG富集 |
| 3.3 20E参与CvBV组装过程基因的调控 |
| 3.4 E93抑制衣壳蛋白及组装基因的表达 |
| 4 讨论 |
| 第七章 总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 本研究的创新之处 |
| 3 本研究的不足之处 |
| 4 今后的研究方向 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Summary |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1 大麦条纹病害的研究进展 |
| 1.1 大麦条纹病害的发生 |
| 1.1.2 大麦条纹病害的防治 |
| 1.2 大麦条纹病病原菌的研究 |
| 1.2.1 大麦条纹病病原菌的生物学特性 |
| 1.2.2 大麦条纹病病原菌的致病性 |
| 1.3 丝状真菌基因功能的研究方法 |
| 1.3.1 基因敲除技术 |
| 1.3.2 基因干扰技术 |
| 1.3.3 基因的过表达 |
| 1.3.4 农杆菌侵染的转基因技术 |
| 1.3.5 瞬时表达转化体系 |
| 1.3.6 亚细胞定位 |
| 1.4 植物免疫机制研究进展 |
| 1.4.1 病原菌与寄主植物互作模型与假说 |
| 1.4.2 抗病基因(R)与无毒基因(Avr)的互作机理 |
| 1.4.2.1 直接相互作用模式 |
| 1.4.2.2 间接相互作用模式 |
| 1.4.3 病原真菌效应基因研究进展 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 Pgr07060 基因功能的初步分析 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 目的基因的克隆 |
| 2.1.3 农杆菌瞬时表达载体的构建及转化 |
| 2.1.4 亚细胞定位载体的构建及转化 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 大麦条纹病菌基因Pgr07060的RNA提取及克隆分析 |
| 2.2.2 大麦条纹病菌基因Pgr07060 编码产物的生物信息学分析 |
| 2.2.3 Pgr07060 基因瞬时表达载体的构建 |
| 2.2.4 PVX:Pgr07060 的农杆菌转化及鉴定 |
| 2.2.5 基因Pgr07060 在烟草中的瞬时表达 |
| 2.2.6 亚细胞定位载体的构建 |
| 2.2.7 PCAMBIA1300-GFP:Pgr07060 的农杆菌转化及鉴定 |
| 2.2.8 基因Pgr07060 在本氏烟草中亚细胞定位的分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 Pgr07060 基因干扰载体的构建及其功能研究 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 基因Pgr07060 干扰片段的克隆分析 |
| 3.2.2 干扰载体p Silent-1:Pgr07060 的构建与鉴定 |
| 3.2.3 干扰转化株的筛选与验证 |
| 3.2.4 营养培养基生长分析 |
| 3.2.5 显微结构观察 |
| 3.2.6 致病性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 Pgr07060 基因过表达载体的构建及功能研究 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果分析 |
| 4.2.1 过表达载体p BARGPE1:Pgr07060 的构建与验证 |
| 4.2.2 过表达转化株的筛选与验证 |
| 4.2.3 营养培养基生长分析 |
| 4.2.4 显微结构观察 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
（4）热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 高温胁迫对昆虫的影响 |
| 1.1.1 高温胁迫对存活的影响 |
| 1.1.2 高温胁迫对生长发育的影响 |
| 1.1.3 高温胁迫对繁殖的影响 |
| 1.1.4 高温胁迫对昆虫生理生化的影响 |
| 1.2 昆虫耐热性研究进展 |
| 1.2.1 昆虫耐热性评价方法 |
| 1.2.2 昆虫耐热性机制 |
| 1.2.3 昆虫耐热性的研究意义 |
| 1.3 热激蛋白研究进展 |
| 1.3.1 热激蛋白家族的分类与结构特性 |
| 1.3.2 热激蛋白家族的互作关系研究进展 |
| 1.3.3 昆虫高温胁迫响应与热激蛋白 |
| 1.3.4 昆虫热激蛋白研究的局限性 |
| 1.4 松墨天牛研究进展 |
| 1.4.1 松墨天牛与松材线虫病 |
| 1.4.2 温度对松墨天牛的影响 |
| 1.5 研究意义和研究内容 |
| 1.5.1 研究目的和意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 高温胁迫下松墨天牛成虫的存活及繁殖特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 仪器与设备 |
| 2.1.2 供试昆虫 |
| 2.1.3 连续性高温胁迫 |
| 2.1.4 周期重复性高温胁迫 |
| 2.1.5 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 连续高温胁迫下成虫的致死中时间 |
| 2.2.2 周期重复性高温胁迫下成虫的存活情况 |
| 2.2.3 周期重复性高温胁迫下成虫的取食量 |
| 2.2.4 周期重复性高温胁迫下成虫的产卵量 |
| 2.2.5 周期重复性高温胁迫后松墨天牛的子代适合度 |
| 2.3 结论与讨论 |
| 第三章 松墨天牛热激蛋白基因的克隆及进化分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂及仪器设备 |
| 3.1.2 供试昆虫 |
| 3.1.3 松墨天牛成虫RNA制备 |
| 3.1.4 松墨天牛成虫DNA提取 |
| 3.1.5 松墨天牛成虫cDNA合成 |
| 3.1.6 松墨天牛热激蛋白基因cDNA序列克隆 |
| 3.1.7 松墨天牛热激蛋白基因组DNA序列克隆 |
| 3.1.8 松墨天牛热激蛋白序列基本特征分析 |
| 3.1.9 松墨天牛热激蛋白系统进化树构建与保守Motif分析 |
| 3.1.10 松墨天牛HSP蛋白结构预测 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 松墨天牛热激蛋白序列基本特征分析 |
| 3.2.2 松墨天牛热激蛋白序列进化分析 |
| 3.2.3 松墨天牛HSP蛋白结构分析 |
| 3.3 结论与讨论 |
| 第四章 松墨天牛热激蛋白对高温胁迫的转录响应 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 所用试剂及设备 |
| 4.1.2 供试昆虫 |
| 4.1.3 高温胁迫处理 |
| 4.1.4 RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA合成 |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR |
| 4.1.7 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 松墨天牛HSP20对高温胁迫的转录响应 |
| 4.2.2 松墨天牛HSP40对高温胁迫的转录响应 |
| 4.2.3 松墨天牛HSP70对高温胁迫的转录响应 |
| 4.3 结论与讨论 |
| 第五章 松墨天牛HSP20和HSP70基因的原核表达及分子伴侣活性验证 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 所用试剂及仪器 |
| 5.1.2 原核表达载体构建 |
| 5.1.3 松墨天牛热激蛋白诱导表达 |
| 5.1.4 松墨天牛热激蛋白纯化及透析浓缩 |
| 5.1.5 热激蛋白分子伴侣活性验证 |
| 5.1.6 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MaltHSP20和MaltHSP70的原核表达及纯化 |
| 5.2.2 MaltHSP20s分子伴侣活性验证 |
| 5.2.3 MaltHSP70-2分子伴侣活性验证 |
| 5.3 结论与讨论 |
| 第六章 松墨天牛HSP20和HSP70基因的蛋白印迹及免疫荧光定位分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 所用仪器及设备 |
| 6.1.2 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2多抗血清制备及效价测定 |
| 6.1.3 试虫饲养 |
| 6.1.4 实验样品准备 |
| 6.1.5 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2的Western blot检测 |
| 6.1.6 石蜡组织切片及HE染色 |
| 6.1.7 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2免疫荧光染色 |
| 6.1.8 数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 MaltHSP20-5、MaltHSP20-11和MaltHSP70-2的WB分析 |
| 6.2.2 松墨天牛精巢管叶的HE染色分析 |
| 6.2.3 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2在松墨天牛精巢叶中的IF分析 |
| 6.3 结论与讨论 |
| 第七章 基于RNA干扰对MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因的功能验证 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 主要试剂及仪器设备 |
| 7.1.2 供试昆虫 |
| 7.1.3 RNA的制备及cDNA的合成 |
| 7.1.4 双链RNA合成 |
| 7.1.5 松墨天牛的RNA干扰处理 |
| 7.1.6 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2的干扰效应检测 |
| 7.1.7 松墨天牛成虫耐热性测定 |
| 7.1.8 数据分析 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 双链RNA的合成 |
| 7.2.2 MaltHSP20-5和MaltHSP70-2的RNA干扰效应 |
| 7.2.3 松墨天牛HSP基因的互作关系 |
| 7.2.4 干扰MaltHSP20-5和MaltHSP70-2基因对成虫耐热性的影响 |
| 7.3 结论与讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| 不足与展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）飞蝗DEAD-box家族基因及分子功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 RNA解旋酶 |
| 1.1.1 DEAD-box蛋白概述 |
| 1.1.2 DEAD-box蛋白结构 |
| 1.1.3 DEAD-box蛋白的生化功能 |
| 1.2 DEAD-box基因的研究进展 |
| 1.2.1 DEAD-box基因的生物学功能 |
| 1.2.2 DEAD-box蛋白与人类疾病 |
| 1.2.3 昆虫DEAD-box基因 |
| 1.3 飞蝗肠道和生殖系统发育 |
| 1.3.1 飞蝗肠道发育 |
| 1.3.2 雌性飞蝗生殖发育 |
| 1.4 本文研究内容及意义 |
| 1.4.1 研究内容 |
| 1.4.2 研究目的和意义 |
| 1.4.3 技术路线图 |
| 第二章 飞蝗DEAD-box家族基因分离和分子特性研究 |
| 2.1 实验方法 |
| 2.1.1 LmDDXs序列获得和命名 |
| 2.1.2 LmDDXs基因组结构分析 |
| 2.1.3 LmDDXs氨基酸推导与功能域分析 |
| 2.1.4 DDXs系统发育树构建 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 LmDDXs序列搜索 |
| 2.2.2 LmDDXs氨基酸序列推导与分析 |
| 2.2.3 LmDDXs基因结构分析 |
| 2.2.4 LmDDXs的系统发育分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 飞蝗DEAD-box家族基因的表达特性及功能分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 飞蝗饲养 |
| 3.1.2 实验药品及主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 不同发育龄期飞蝗的收集 |
| 3.2.2 飞蝗不同组织解剖 |
| 3.2.3 RNA提取 |
| 3.2.4 飞蝗不同龄期和不同组织cDNA模板制备 |
| 3.2.5 RT-qPCR引物设计 |
| 3.2.6 LmDDXs基因的表达分析 |
| 3.2.7 dsRNA合成引物设计 |
| 3.2.8 dsRNA体外合成 |
| 3.2.9 dsRNA注射 |
| 3.2.10 LmDDXs基因沉默效率检测及表型观察 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 LmDDXs基因在飞蝗不同发育阶段的表达分析 |
| 3.3.2 LmDDXs基因在飞蝗不同组织部位的表达分析 |
| 3.3.3 LmDDXs基因的功能分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 LmDDX47在飞蝗肠道中的功能分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫及果蝇S2 细胞培养 |
| 4.1.2 实验仪器及试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 LmDDX47的mRNA表达特性 |
| 4.2.2 S2细胞瞬时转染LmDDX47及亚细胞定位观察 |
| 4.2.3 肠道的组织学观察 |
| 4.2.4 RNA原位杂交 |
| 4.2.5 透射电镜观察 |
| 4.2.6 LmDDX47RNA干扰 |
| 4.2.7 TUNEL凋亡检测 |
| 4.2.8 Histone3细胞增殖检测 |
| 4.2.9 Western blot |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 干扰LmDDX47对飞蝗肠道发育的影响 |
| 4.3.2 LmDDX47在中肠组织中的mRNA表达特性 |
| 4.3.3 LmDDX47的亚细胞定位 |
| 4.3.4 下调LmDDX47导致飞蝗肠道的组织学变化 |
| 4.3.5 下调LmDDX47导致肠道上皮细胞过度凋亡 |
| 4.3.6 下调LmDDX47引起飞蝗肠道干细胞增殖变化 |
| 4.3.7 下调LmDDX47后飞蝗肠道细胞的超微结构变化 |
| 4.3.8 下调LmDDX47导致飞蝗肠道蛋白修饰的变化 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 飞蝗DEAD-box家族基因在卵巢发育中的研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 飞蝗饲养 |
| 5.1.2 实验药品及主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 成虫飞蝗组织解剖 |
| 5.2.2 不同发育天数成虫飞蝗卵巢的收集 |
| 5.2.3 cDNA模板制备 |
| 5.2.4 RNA干扰及表型分析 |
| 5.2.5 RT-qPCR检测与数据分析 |
| 5.2.6 卵巢和卵小管图像采集 |
| 5.2.7 苏木精伊红染色 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 LmDDXs基因在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.3.2 LmDDX3在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.3.3 LmDDX6在飞蝗卵巢发育中的功能 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简况及联系方式 |
（6）淡色库蚊Met基因的表达模式及其在生殖、吸血和吡丙醚抗性中的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 昆虫保幼激素研究进展 |
| 1.1 昆虫保幼激素的发现 |
| 1.2 昆虫保幼激素的种类与结构 |
| 1.3 昆虫保幼激素的功能 |
| 2 昆虫保幼激素受体(Met)的研究进展 |
| 2.1 昆虫保幼激素受体(Met)的发现 |
| 2.2 昆虫保幼激素受体(Met)的结构特征 |
| 2.3 昆虫保幼激素受体(Met)的功能 |
| 2.4 昆虫保幼激素受体(Met)与其它蛋白的相互作用功能 |
| 3 保幼激素类几丁质合成抑制剂吡丙醚研究进展 |
| 4 研究目的和意义 |
| 第二章 淡色库蚊Met基因的克隆和序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.4 RT-PCR扩增 |
| 1.5 PCR产物胶回收 |
| 1.6 连接转化 |
| 1.7 菌落PCR鉴定 |
| 1.8 序列分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 淡色库蚊CpMet全长cDNA克隆 |
| 2.2 CpMet系统发生分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 淡色库蚊Met基因的表达分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CpMet在淡色库蚊不同发育阶段的表达分析 |
| 2.2 CpMet在淡色库蚊不同组织部位的表达分析 |
| 2.3 CpMet在烯虫酯和20E处理后的表达分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 淡色库蚊Met基因在生殖和吸血行为中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA干扰CpMet基因效率分析 |
| 2.2 RNA干扰CpMet基因后对淡色库蚊存活率的影响 |
| 2.3 RNA干扰CpMet基因后对淡色库蚊生殖的影响 |
| 2.4 RNA干扰CpMet基因后对淡色库蚊吸血行为的影响 |
| 3 讨论 |
| 第五章 淡色库蚊Met基因在吡丙醚抗性中的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 敏感品系和抗性品系CpMet基因表达量测定 |
| 2.2 不同剂量吡丙醚处理淡色库蚊后CpMet基因表达量测定 |
| 2.3 RNA干扰CpMet基因后对吡丙醚的敏感性测定 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）家蚕味觉受体的RNA干扰条件摸索及BmGr63相关功能初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 鳞翅目昆虫化学感受系统 |
| 1.2 鳞翅目昆虫味觉受体 |
| 1.2.1 味觉受体的作用 |
| 1.2.2 味觉受体识别植物中的化学物质 |
| 1.3 家蚕的食性 |
| 1.3.1 家蚕的食性 |
| 1.3.2 家蚕味觉受体 |
| 1.4 RNAi在昆虫基因功能研究中的应用 |
| 1.4.1 RNAi |
| 1.4.2 RNAi的发现及发展 |
| 1.4.3 dsRNA导入昆虫体内的常用方法 |
| 1.4.4 dsRNA的制备方法 |
| 1.4.5 RNAi在昆虫中的应用 |
| 1.5 钙离子成像 |
| 1.5.1 钙离子成像原理 |
| 1.5.2 钙离子指示剂 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 研究技术路线 |
| 第三章 味觉受体基因BmGr63 的克隆及表达 |
| 3.1 实验材料与试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要使用试剂 |
| 3.1.3 主要溶剂配制方法 |
| 3.1.4 主要使用仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 进化树的构建 |
| 3.2.2 家蚕味觉受体BmGr63 的克隆 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 进化树分析 |
| 3.3.2 BmGr63 跨膜结构域分析 |
| 3.3.3 家蚕味觉受体BmGr63 的克隆及组织表达谱 |
| 3.3.4 BmGr63 配体物质的初探 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 dsRNA介导的家蚕BmGr63 的干扰 |
| 4.1 实验材料与试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要使用试剂 |
| 4.1.3 主要溶剂配制方法 |
| 4.1.4 主要使用仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 L4440-BmGr63 干扰片段载体构建 |
| 4.2.2 T7体外转录合成 dsRNA |
| 4.2.3 饲喂dsRNA-BmGr63 |
| 4.2.4 家蚕组织的解剖 |
| 4.2.5 BmGr63 基因表达水平检测 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 体外合成dsRNA |
| 4.3.2 添食dsRNA造成的BmGr63 表达量下降 |
| 4.3.3 添食dsRNA对家蚕幼虫的影响 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在读期间发表文章及参研课题 |
| 致谢 |
（8）花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 花绒寄甲及其生物防治研究概述 |
| 1.1.1 花绒寄甲的分类地位及分布 |
| 1.1.2 花绒寄甲的形态学特征 |
| 1.1.3 花绒寄甲生活史 |
| 1.1.4 花绒寄甲生物学特征 |
| 1.1.5 花绒寄甲的室内扩繁技术 |
| 1.1.6 花绒寄甲的生物防治效果 |
| 1.2 菊酯类农药研究概述 |
| 1.2.1 拟除虫菊酯类杀虫剂使用现状 |
| 1.2.2 昆虫对氯氰菊酯的抗性机理 |
| 1.3 昆虫细胞色素P450 研究现状 |
| 1.3.1 昆虫细胞色素P450 |
| 1.3.2 细胞色素P450 的研究进展 |
| 1.4 农药对天敌的影响研究 |
| 1.5 转录组测序技术、实时荧光定量技术与RNAi技术概述 |
| 1.5.1 转录组测序技术 |
| 1.5.2 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.5.3 RNA干扰技术 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 1.7 研究技术路线 |
| 第二章 花绒寄甲在氯氰菊酯处理下的转录组测序及分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要试剂与仪器 |
| 2.1.2 供试昆虫的饲养 |
| 2.1.3 氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力测定方法 |
| 2.1.4 转录组测序实验样品的准备 |
| 2.1.4.1 供试昆虫的处理 |
| 2.1.4.2 总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA文库构建及Illumina测序 |
| 2.1.6 花绒寄甲在氯氰菊酯处理下的转录组测序 |
| 2.1.6.1 转录组数据质量评估 |
| 2.1.6.2 参考基因组比对 |
| 2.1.6.3 基因预测 |
| 2.1.6.4 定量分析 |
| 2.1.6.5 差异分析 |
| 2.1.6.6 富集分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 氯氰菊酯对花绒寄甲的毒力测定结果 |
| 2.2.2 转录组数据质量评估结果 |
| 2.2.3 参考基因组比对结果 |
| 2.2.4 定量分析结果 |
| 2.2.5 差异基因分析 |
| 2.2.6 富集分析结果 |
| 2.3 分析与讨论 |
| 第三章 氯氰菊酯处理下花绒寄甲P450 相关基因表达变化 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要试剂与仪器 |
| 3.1.2 供试昆虫与处理 |
| 3.1.3 各处理昆虫总RNA提取及第一链cDNA的合成 |
| 3.1.3.1 总RNA提取 |
| 3.1.3.2 第一链cDNA的合成 |
| 3.1.4 转录组数据中花绒寄甲P450 表达差异基因的确定 |
| 3.1.4.1 花绒寄甲转录组数据中P450 候选基因的筛选与确定 |
| 3.1.4.2 花绒寄甲转录组数据中P450 表达差异基因的筛选 |
| 3.1.5 相关P450 基因特异性引物的设计与合成 |
| 3.1.6 相关P450 基因特异性引物的验证 |
| 3.1.7 实时荧光定量绘制P450 相关基因的标准曲线并建立回归方程 |
| 3.1.8 实时荧光定量检测P450 基因差异表达 |
| 3.1.9 实时荧光定量数据的处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 P450 候选基因的确定 |
| 3.2.2 基因标准曲线回归方程 |
| 3.2.3 实时荧光定量结果 |
| 3.3 分析与讨论 |
| 第四章 花绒寄甲P450 相关基因的RNAi研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 主要试剂与仪器 |
| 4.1.2 花绒寄甲RNAi基因的确定 |
| 4.1.3 花绒寄甲3 条候选基因RNAi引物的设计、合成与验证 |
| 4.1.4 dsRNA的合成与纯化 |
| 4.1.4.1 含T7 启动子模板的制备 |
| 4.1.4.2 GFP质粒模板的制备 |
| 4.1.4.3 dsRNA的合成 |
| 4.1.5 注射dsRNA方法 |
| 4.1.6 单一基因干扰 |
| 4.1.6.1 dsRNA最佳注射量与最佳干扰时间的确定 |
| 4.1.6.2 分别注射3 条基因的dsRNA后基因的表达 |
| 4.1.6.3RNAi后花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.1.7 两条基因混合干扰 |
| 4.1.7.1 dsRNA最佳注射量与最佳干扰时间的确定 |
| 4.1.7.2 两两混合干扰后基因的表达 |
| 4.1.7.3 两条基因混合干扰后花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.1.8 三条基因混合干扰 |
| 4.1.8.1 三条基因混合干扰后基因的表达 |
| 4.1.8.2 三条基因混合花绒寄甲对氯氰菊酯的敏感性检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 单一基因干扰后相关实验结果 |
| 4.2.2 两条基因混合干扰后相关实验结果 |
| 4.2.3 三条基因混合干扰后相关实验结果 |
| 4.3 分析与讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 毛囊相关概述 |
| 1.1.1 毛囊的结构与生理功能 |
| 1.1.2 毛囊的发育与周期性生长 |
| 1.1.3 毛乳头细胞的形成与功能 |
| 1.1.4 绒山羊皮肤毛囊发育相关基因研究现状 |
| 1.2 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术概述 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术基本原理 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术的应用 |
| 1.3 高通量筛选技术相关概述 |
| 1.3.1 高通量筛选技术的发展 |
| 1.3.2 CRISPR高通量筛选技术的分类 |
| 1.3.3 CRISPR高通量筛选技术的应用 |
| 1.4 目的与意义 |
| 第二章 CRISPR聚焦型文库筛选毛乳头细胞增殖必需基因 |
| 2.1 试验材料与方法 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 毛乳头细胞的分离鉴定 |
| 2.1.5 CRISPR聚焦型文库的构建 |
| 2.1.6 毛乳头细胞培养条件的确定 |
| 2.1.7 CRISPR聚焦型文库感染毛乳头细胞 |
| 2.1.8 sgRNA序列扩增 |
| 2.1.9 高通量测序与生物信息学分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 CRISPR聚焦型文库的构建 |
| 2.2.2 CRISPR聚焦型文库的质量评估 |
| 2.2.3 毛乳头细胞的鉴定 |
| 2.2.4 细胞嘌呤霉素筛选浓度的确定 |
| 2.2.5 CRISPR聚焦型文库感染毛乳头细胞 |
| 2.2.6 sgRNA序列扩增 |
| 2.2.7 高通量测序结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 毛乳头细胞增殖必需基因的功能验证 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞株 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 siRNA的设计与合成 |
| 3.2.2 Lipofectamine~(TM)3000 介导的siRNA转染 |
| 3.2.3 qPCR法检测细胞中各基因的mRNA表达 |
| 3.2.4 qPCR检测Ki67 基因和PCNA基因的mRNA表达水平的变化 |
| 3.2.5 细胞增殖检测 |
| 3.2.6 细胞凋亡检测 |
| 3.2.7 细胞周期检测 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 差异基因富集分析结果 |
| 3.3.2 siRNA对 SBDS基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.3 siRNA对 HJURP基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.4 siRNA对 FNDC5 基因的干扰效率筛选 |
| 3.3.5 siRNA干扰SBDS和 HJURP表达对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.6 siRNA干扰FNDC5 基因表达对细胞增殖和凋亡的影响 |
| 3.3.7 qPCR检测Ki67 基因和PCNA基因的mRNA表达水平的变化 |
| 3.3.8 siRNA干扰SBDS和 HJURP基因表达对细胞周期的影响 |
| 3.3.9 siRNA干扰FNDC5 基因表达对细胞周期的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 总结 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 4.3 下一步的研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）DDIT3基因对奶牛产奶性状的遗传效应分析及功能验证（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1.1 奶牛产奶性状的研究进展 |
| 1.1.1 奶牛产奶性状功能候选基因的鉴定 |
| 1.1.2 奶牛产奶性状候选基因的遗传效应分析 |
| 1.1.3 奶牛产奶性状候选基因的功能研究 |
| 1.1.4 DDIT3 基因作为奶牛产奶性状候选基因的研究背景 |
| 1.2 DDIT3 基因的研究进展 |
| 1.2.1 DDIT3 基因结构与特征 |
| 1.2.2 DDIT3 的调控机制 |
| 1.3 DDIT3 与脂质代谢研究 |
| 1.4 慢病毒载体介导的RNAi的研究进展 |
| 1.4.1 RNAi技术的研究进展 |
| 1.4.2 慢病毒载体的研究进展 |
| 1.5 基因编辑技术 |
| 1.6 乳腺上皮细胞的体外培养 |
| 1.6.1 牛乳腺上皮细胞的建立 |
| 1.6.2 MAC-T细胞 |
| 1.6.3 乳腺上皮细胞的培养条件 |
| 1.7 转录组测序 |
| 1.7.1 转录组测序技术简介 |
| 1.7.2 转录组测序原理和技术优势 |
| 1.7.3 转录组测序技术的应用前景 |
| 1.8 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 DDIT3 基因与产奶性状的遗传效应分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 性状表型记录 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 DDIT3 基因多态性的检测 |
| 2.2.2 飞行质谱分型技术 |
| 2.2.3 数据的统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 SNP的检测 |
| 2.3.2 DDIT3 基因与产奶性状的遗传效应分析 |
| 第三章 DDIT3 基因干扰片段的筛选 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 MAC-T细培养方法 |
| 3.2.2 CRISPR-CAS9 敲除DDIT3 基因载体的构建与鉴定 |
| 3.2.3 DDIT3-sh RNA慢病毒载体的构建与鉴定 |
| 3.2.4 表达干扰DDIT3的sh RNA慢病毒包装 |
| 3.2.5 表达干扰DDIT3的sh RNA慢病毒滴度检测 |
| 3.2.6 MAC-T细胞感染 |
| 3.2.7 实时荧光定量PCR筛选慢病毒RNA干扰高效率片段 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 CRISPR-CAS9 敲除DDIT3 基因载体的构建与鉴定 |
| 3.3.2 DDIT3 基因靶向sh RNA序列 |
| 3.3.3 LV3 载体的线性化 |
| 3.3.4 阳性克隆的鉴定与测序 |
| 3.3.5 慢病毒滴度检测 |
| 3.3.6 实时定量RT-PCR检测干扰效率 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 DDIT3 基因的功能验证 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样品的收集与准备 |
| 4.2.2 RNA质量检测 |
| 4.2.3 构建c DNA文库 |
| 4.2.4 上机测序 |
| 4.2.5 数据分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 RNA质量检测 |
| 4.3.2 测序质量控制 |
| 4.3.3 样本间相关性 |
| 4.3.4 差异表达基因筛选 |
| 4.3.5 差异基因的GO富集分析 |
| 4.3.6 差异基因的KEGG富集分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结果与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 本研究存在的问题 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的学术活动及成果情况 |
四、RNA干扰与基因功能研究（论文参考文献）
- [1]马铃薯中与胁迫相关StMAPKs基因的分离及功能研究[D]. 朱熙. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [2]菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒复制及组装机制研究[D]. 周悦南. 浙江大学, 2021(01)
- [3]大麦条纹病菌基因Pgr07060的功能研究[D]. 郭铭. 甘肃农业大学, 2021(09)
- [4]热激蛋白在松墨天牛响应高温胁迫中的功能研究[D]. 李慧. 南京林业大学, 2021(02)
- [5]飞蝗DEAD-box家族基因及分子功能研究[D]. 王俊秀. 山西大学, 2021(01)
- [6]淡色库蚊Met基因的表达模式及其在生殖、吸血和吡丙醚抗性中的功能研究[D]. 周长印. 扬州大学, 2021(09)
- [7]家蚕味觉受体的RNA干扰条件摸索及BmGr63相关功能初探[D]. 刘凯. 西南大学, 2021(01)
- [8]花绒寄甲P450参与氯氰菊酯胁迫响应分子机制研究[D]. 裴培. 西北农林科技大学, 2021
- [9]利用CRISPR文库鉴定绒山羊毛乳头细胞增殖的必需基因研究[D]. 李岚. 西北农林科技大学, 2021
- [10]DDIT3基因对奶牛产奶性状的遗传效应分析及功能验证[D]. 韦张其. 合肥工业大学, 2021(02)