一、Downregulation of wild-type p53 protein by HER-2/neu mediated PI3K pathway activation in human breast cancer cells: its effect on cell proliferation and implication for therapy（论文文献综述）
陈震[1]（2021）在《Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究》文中提出研究背景和目的宫颈癌（Cervical Carcinoma,CC）是由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起的常见的妇科恶性肿瘤。我国是CC患病人数最多的国家之一,CC的预防和治疗任务繁重。HPV疫苗和宫颈涂片筛查虽然能够有效的预防CC发生,但晚期CC预后通常很差。环状RNA（circRNAs）在肿瘤的发生和发展中发挥着重要作用,这也包括在CC中。此外,由于具有高稳定性,特异性表达等特点,circRNAs在肿瘤的治疗与诊断中前景可期。然而,当前很大一部分circRNAs的表达和功能尚不清楚。本研究旨在探讨hsa＿circ＿0006332（Hsa＿circ00063322）和hsa＿circ＿0000069（Hsa＿circ0000069）在CC发展中的作用及其表达升高的相关分子机制。研究方法1.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069环状性质验证及其在宫颈癌细胞和组织中的表达通过RnaseR消化实验和基因组DNA扩增实验验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的环状结构。放线菌素D实验和核质分布实验检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的高稳定性和细胞分布。采用实时定量聚合酶链反应（qPCR）法分别检测CC和正常组织与细胞中Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达,以确定宫颈组织癌变后Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的表达变化。2.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069表达升高的机制研究通过数据库分析,发现Hsa＿circ00063322表达可能受转录因子FOXA1调控,而Hsa＿circ0000069表达受RNA m6A甲基化修饰调控。通过染色质免疫共沉淀实验验证FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子结合;qPCR法检测FOXA1对Hsa＿circ00063322表达的调节;荧光素酶实验确认了FOXA1与Hsa＿circ00063322启动子区的结合位点。m6A RNA免疫共沉淀（Me-RIP）检测CC和正常细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平,以及METTL3敲低后Hsa＿circ0000069的m6A修饰变化。qPCR法验证METTL3对Hsa＿circ0000069表达的调节。放线菌素D实验检测METTL3敲低对Hsa＿circ0000069稳定性的影响,以及两个m6A修饰位点处m6A修饰分别对Hsa＿circ0000069稳定性的影响。制备Hsa＿circ0000069 m6A修饰位点单突变体和双突变体,然后通过Me-RIP和qPCR实验检测Hsa＿circ0000069两处m6A修饰之间的关系。3.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069的细胞功能制备并通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069稳定敲低的细胞。制备Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069瞬间过表达细胞。采用细胞计数试剂盒-8（CCK8）和5-乙基-2′-脱氧尿苷（Ed U）检测Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的增殖能力。将Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞进行顺铂和氟尿嘧啶处理,采用流式细胞术检测细胞凋亡,采用划痕和Transwell实验检测Hsa＿circ0000069敲低和过表达细胞的迁移能力。4.Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别靶向调节miR-548q和miR-4426,miR-548q靶向抑制L2的表达通过qPCR验证Hsa＿circ00063322和Hsa＿circ0000069分别对miR-548q和miR-4426的调节关系,以及miR-548q对HPV16小衣壳蛋白L2的调节关系。荧光素酶实验验证Hsa＿circ00063322与miR-548q,Hsa＿circ0000069与miR-4426,以及miR-548q与L2的结合位点。qPCR检测肿瘤和正常组织中miR-548q,miR-4426和L2的表达。5.Hsa＿circ00063322/miR-548q/L2和Hsa＿circ0000069/miR-4426信号通路的验证采用qPCR检测Hsa＿circ00063322过表达以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时过表达或者Hsa＿circ00063322敲低以及Hsa＿circ00063322和miR-548q同时敲低后L2表达变化,采用免疫荧光（IF）、Ed U、流式和Transwell实验检测miRNA过表达以及circRNA和miRNA同时过表达或者miRNA敲低以及circRNA和miRNA同时敲低后细胞的功能表型变化。研究结果1.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ00063322的表达显着上调,利用Hsa＿circ00063322表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（ROC分析AUC=0.8597）。Hsa＿circ00063322具有高稳定性,主要分布在胞浆中。FOXA1是Hsa＿circ00063322的转录因子,与MYBL2（Hsa＿circ00063322亲本基因）启动子区在两个位点结合。2.制备Hsa＿circ00063322稳定敲低细胞系。Hsa＿circ00063322敲低可显着抑制CC细胞的增殖能力,并增加其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性;而Hsa＿circ00063322瞬时过表达可促进其增殖能力,并削弱其对顺铂和氟尿嘧啶的敏感性。3.Hsa＿circ00063322可与miR-548q靶向结合,并且调节miR-548q的表达。与癌旁正常组织相比,宫颈癌组织中miR-548q的表达显着降低,且miR-548q和Hsa＿circ00063322的组织表达水平负相关。4.miR-548q与L2转录本在两个位点结合,介导了Hsa＿circ00063322对L2表达的调节。Hsa＿circ00063322过表达阻遏了miR-548q的抑癌活性,而Hsa＿circ00063322敲低抑制了miR-548q抑制剂的促癌活性。5.CC组织和细胞中环状RNA Hsa＿circ0000069的表达显着上调,利用Hsa＿circ0000069表达能够准确的区分肿瘤和正常组织（AUC=0.7901）。Hsa＿circ0000069具有高稳定性,主要分布在胞浆中。6.相比正常宫颈细胞,CC细胞中Hsa＿circ0000069的m6A修饰水平显着升高。m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069稳定性。Hsa＿circ0000069转录本中存在两处m6A修饰位点,二者的作用相互协同。7.制备Hsa＿circ0000069稳定敲低细胞系。Hsa＿circ0000069敲低显着抑制了CC细胞的增殖和迁移能力,而Hsa＿circ0000069瞬时过表达促进了CC细胞的增殖和迁移能力。8.Hsa＿circ0000069可与miR-4426靶向结合,并且调节miR-4426的表达。Hsa＿circ0000069过表达阻遏了miR-4426的抑癌活性,而Hsa＿circ0000069敲低抑制了miR-4426抑制剂的促癌活性。研究结论1.CC中,转录因子FOXA1促进了Hsa＿circ00063322的表达,Hsa＿circ00063322通过吸附miR-548q,防止了L2被降解,并促进了CC细胞的增殖能力,削弱了CC细胞对化疗药物的敏感性。2.CC中,m6A修饰提高了Hsa＿circ0000069的稳定性,Hsa＿circ0000069通过吸附miR-4426,促进了CC细胞的增殖和迁移能力。
闫欢[2]（2020）在《基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究》文中指出研究背景卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,世界范围内,其发病率在发达国家为9.1/10万,在发展中国家为5.0/10万,死亡率居妇科恶性肿瘤之首。卵巢上皮性癌（ovarian epithelial cancer）占卵巢癌的85～90%,在早期诊断时,卵巢癌患者可以采用手术联合化疗药物治疗,5年生存率接近90%,由于卵巢癌的频繁复发和转移,晚期患者5年生存率降至30%左右。肿瘤的起始和进展与多种抑癌基因失活或者促癌“诱导”基因的过度激活密切相关。近年来,分子靶向治疗发展迅猛,以分子靶向药物治疗为代表的生物治疗模式可以从分子水平调控肿瘤进展,为改善卵巢癌患者预后带来希望。因此,迫切需要探索卵巢癌发生和转移相关的分子机制,探究卵巢癌分子靶向治疗的潜在靶点,提高卵巢癌患者早期诊断率。抑癌基因p53位于17号染色体17p13.1的位置,p53是人类癌细胞中突变率最高的基因。以往的研究发现,p53功能缺陷(p53-/-)在诱导小鼠卵巢上皮细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞的形态和功能中发挥重要作用。促癌基因c-Myc位于8号染色体8q24.21位点,在早期应答中发挥重要作用。c-Myc过表达可使细胞出现无限增殖、分化以及恶性转化。研究发现,约30%的卵巢肿瘤存在c-Myc扩增。蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK2）,又称局灶性粘附激酶（focal adhesion kinase,FAK）,位于染色体8q24.3位点。PTK2在人类多种实体瘤中表达上调,发挥着促癌的作用。研究发现,PTK2过表达与p53突变在人乳腺癌中高度相关,PTK2 N端结构域与p53 N端反式激活结构域可相互作用。PTK2和c-Myc协同调控肿瘤细胞侵袭,抑制整合素/PTK2信号轴和c-Myc可以协同调控卵巢癌恶性生物学行为。有趣的是,我们分析了癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）,发现在同一组卵巢浆液性癌患者中,包括PTK2、c-Myc和p53在内的三种基因同时发生异常改变,其中88%的卵巢癌患者p53基因发生突变,45%的卵巢癌患者c-Myc基因上调或扩增,同时,超过60%的卵巢癌患者PTK2上调或扩增。因此,我们提出猜想,在p53功能缺陷(p53-/-)的小鼠卵巢上皮细胞中,将癌基因c-Myc和PTK2同时过表达（p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达）,是否可以促使卵巢上皮细胞发生转化,使其获得卵巢癌恶性生物学功能,是否可以模拟卵巢癌的发生和进展过程,形成卵巢癌细胞?如果该细胞株构建成功,希望能广泛应用于人类卵巢上皮性癌起始和转移的分子机制研究。本研究试图通过基因修饰构建一种小鼠卵巢癌细胞株。课题组利用CRISPR/Cas9系统敲除p53基因,构建了p53敲除质粒,同时构建了c-Myc和PTK2过表达质粒,本研究利用慢病毒载体系统包装质粒并将修饰后的目的基因,以单个或组合方式转染小鼠卵巢上皮细胞,观察其细胞功能性改变,将具有潜在肿瘤生成作用的细胞株种植到小鼠卵巢组织内,建立小鼠卵巢癌模型,进一步观察其在小鼠体内的成瘤效果和肿瘤转移情况。卵巢癌的分子靶向治疗近年来引起人们的广泛关注以及深入研究。基于本课题以上研究,我们看到PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中发挥重要作用,那么,以PTK2为治疗靶点的研究将指导我们更好地理解卵巢癌发生和发展的过程,为卵巢癌的分子靶向治疗带来新的思路。GSK2256098是一种靶向抑制PTK2激酶活性以及Y397位点磷酸化的小分子抑制剂。本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除PTK2基因,同时选用GSK2256098靶向抑制PTK2 Y397位点的磷酸化,首次评估敲除和靶向抑制PTK2对卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为的影响及可能机制,以及对卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移的作用。通过以上研究,希望为卵巢癌的分子靶向治疗及分子机制研究提供研究基础和理论支持。本课题分为三个部分,对以上内容进行探讨。第一部分基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建目的本部分旨在构建小鼠卵巢癌细胞株,并利用该细胞株建立小鼠卵巢原位移植瘤模型进行功能验证。材料与方法1.材料1.1细胞株:C57BL/6小鼠卵巢上皮细胞,购自美国Cell Biologics公司。1.2质粒:在实验前期,课题组成功构建了p53基因敲除质粒、c-Myc基因过表达质粒以及PTK2基因过表达质粒。1.3动物:选用4周大小的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Sz J（NSG）免疫缺陷雌性小鼠,购自Jackson实验室。2.方法2.1将成功构建的质粒进行转化和提取,利用慢病毒载体系统包装p53敲除质粒、c-Myc过表达质粒以及PTK2过表达质粒。2.2建立稳定转染细胞株及分组将包装后的质粒以单个、两两组合、三者组合的形式分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞,共分为8组:p53敲除组(p53-/-组)、c-Myc过表达组（c-Myc组）、PTK2过表达组（PTK2组）、p53敲除+c-Myc过表达组(p53-/-+c-Myc组)、p53敲除+PTK2过表达组(p53-/-+PTK2组)、PTK2过表达+c-Myc过表达组（PTK2+c-Myc组）、p53敲除+c-Myc过表达+PTK2过表达组(p53-/-+c-Myc+PTK2组)以及空质粒载体转染组（对照组）。Western blot方法检测8组细胞p53、c-Myc以及PTK2蛋白水平。2.3 MTT方法、单层细胞克隆形成试验和软琼脂细胞克隆形成试验检测8组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力和细胞克隆形成能力。细胞迁移和侵袭实验检测8组基因修饰细胞迁移和侵袭能力。2.4筛选出具有潜在肿瘤生成能力的基因修饰细胞株,将该组细胞种植到免疫缺陷NSG小鼠卵巢组织,观察其成瘤效果及转移情况。2.5采用SPSS 22.0进行统计分析,结果统计采用（x±s）表示,进行正态性检验,两组比较采用独立样本t检验,超过两组采用单因素方差分析。以α=0.05为检验水准。结果1 PTK2、c-Myc和p53蛋白在基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的表达与对照组（0.06±0.02）相比,PTK2蛋白在PTK2组（1.22±0.11）、PTK2+c-Myc组（1.11±0.11）、p53-/-+PTK2组（0.86±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.34±0.16）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.08±0.02）相比,c-Myc蛋白在c-Myc组（0.56±0.04）、PTK2+c-Myc组（1.01±0.12）、p53-/-+c-Myc组（0.76±0.09）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（1.23±0.15）基因修饰细胞株表达水平升高,差异均具有统计学意义（P<0.001）。与对照组（0.45±0.05）相比,p53蛋白在p53-/-组（0.01±0.01）、p53-/-+c-Myc组（0.02±0.01）、p53-/-+PTK2组（0.03±0.01）及p53-/-+c-Myc+PTK2组（0.04±0.01）基因修饰细胞株表达水平下降,差异均具有统计学意义（P<0.001）。2基因修饰小鼠卵巢上皮细胞增殖能力与对照组及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力显着上升,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-+PTK2组、p53-/-+c-Myc组及PTK2+c-Myc组细胞增殖能力上升（P<0.01）。与对照组相比,p53-/-组、c-Myc组及PTK2组细胞增殖能力在整个测定期内均无统计学差异（P>0.05）。3基因修饰小鼠卵巢上皮细胞克隆形成结果与对照组（4.33±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组单层细胞克隆形成数量（93.67±6.11）显着增加（P<0.001）。与对照组（4.33±1.53）相比,p53-/-组（15.00±0.07）、p53-/-+PTK2组（23.33±3.06）及p53-/-+c-Myc组（36.00±2.65）单层细胞克隆形成数量增加,差异有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,PTK2+c-Myc组、PTK2组及c-Myc组单层细胞克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（6.67±1.53）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞软琼脂中克隆形成数量显着增加（82.67±6.81）,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组相比,其他6组基因修饰细胞软琼脂中克隆形成数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。4基因修饰小鼠卵巢上皮细胞迁移和侵袭结果与对照组（16.00±1.00）及其他6组基因修饰细胞相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞迁移数量（85.33±5.03）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-+PTK2组（26.00±2.00）和p53-/-+c-Myc组（34.00±3.60）细胞迁移数量增加（P<0.01）。与对照组（16.00±1.00）相比,p53-/-组（15.33±1.53）、PTK2组（14.00±2.00）、c-Myc组（18.67±2.08）及PTK2+c-Myc组（17.33±1.53）细胞迁移数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。与对照组（11.00±1.00）及其他6组基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株相比,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞侵袭数量（60.30±6.11）显着增加,差异有统计学意义（P<0.001）。与对照组（11.00±1.00）相比,p53-/-组（20.33±2.52）、PTK2+c-Myc组（21.00±3.46）、p53-/-+PTK2组（20.67±3.06）及p53-/-+c-Myc组（21.00±2.65）细胞侵袭数量增加（P<0.05）。与对照组（11.00±1.00）相比,PTK2组（12.33±0.58）和c-Myc组（14.00±1.00）细胞侵袭数量无明显增加,差异无统计学意义（P>0.05）。5基因修饰小鼠卵巢上皮细胞株的筛选诱发小鼠原代细胞发生转化,使其获得肿瘤细胞特征,能在悬浮状态下成簇生长是本研究能否成功的关键。p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞增殖能力、细胞克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力显着高于对照组和其他6组基因修饰细胞株（P<0.01）。虽然p53-/-+PTK2组和p53-/-+c-Myc组单层细胞克隆形成、细胞侵袭和迁移数量高于对照组（P<0.05）,然而p53-/-+PTK2和p53-/-+c-Myc组软琼脂细胞克隆形成数量与单基因修饰组相比,无统计学差异（P>0.05）,而p53-/-+c-Myc+PTK2组软琼脂细胞克隆形成数量显着多于其他各组（P<0.001）。软琼脂中克隆形成试验结果可以反应细胞锚定非依赖性生长能力,即悬浮状态下细胞成簇生长能力,可以作为评判细胞是否具有肿瘤生长特性的金标准。结果说明只有p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞获得了肿瘤细胞锚定非依赖性生长的特性。因此,我们认为在8组基因修饰组合细胞中,p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞具有潜在成瘤能力,本课题筛选出p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株进行小鼠卵巢原位移植瘤模型构建。6荧光素酶基因标记小鼠卵巢上皮细胞利用慢病毒载体包装荧光素酶基因,分别转染正常小鼠卵巢上皮细胞和p53-/-+c-Myc+PTK2组细胞株,传代培养后测定细胞荧光强度值,结果显示两组细胞的荧光值均大于106,说明荧光素酶基因已经整合到小鼠细胞DNA中,可以进行后续移植瘤模型的构建。7基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在NSG小鼠成瘤将p53-/-+c-Myc+PTK2细胞在显微镜下种植到NSG小鼠单侧卵巢组织,构建小鼠卵巢原位移植瘤模型。每周进行荧光强度值监测,12周后可以观察到基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠卵巢组织形成肿瘤。处死小鼠,发现基因修饰p53-/-+c-Myc+PTK2小鼠出现血性腹水。剥离卵巢,发现卵巢组织周围出现肿瘤组织。查看肿瘤转移情况,发现p53-/-+c-Myc+PTK2组小鼠出现广泛腹腔转移,转移的脏器包括肝脏、脾脏和肠等。结论本部分成功构建了p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株,并应用p53-/-+c-Myc+PTK2细胞株成功建立了小鼠卵巢癌模型,模拟了卵巢癌体内形成和转移的过程,该细胞株有望用于卵巢癌发生和发展的分子机制研究。第二部分PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为中的作用。材料与方法1材料1.1细胞株:SKOV3、OVCAR8细胞购于美国菌种中心。1.2质粒:PTK2基因敲除质粒。2方法2.1统计分析Kaplan Meir Plot数据库PTK2在卵巢癌组织中的表达情况及与预后的关系;采用免疫荧光方法检测卵巢癌组织及癌旁组织中PTK2的表达。2.2利用慢病毒载体包装PTK2基因敲除质粒。建立PTK2基因敲除质粒稳定转染细胞株,对照组为空质粒转染组。同时采用小分子抑制剂GSK2256098抑制PTK2关键激活位点（p-FAK）Y397,进行靶向抑制PTK2活化,对照组为DMSO对照。2.3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,MTT方法、细胞克隆形成实验检测细胞增殖、克隆形成能力变化情况。Transwell迁移/侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力变化情况。2.4统计方法见第一部分。结果1 PTK2在卵巢癌组织中高表达且与卵巢癌患者预后相关PTK2高表达组患者生存期显着低于PTK2低表达组（P<0.05）。PTK2在肿瘤细胞胞浆中强染色,与癌旁组织相比,PTK2在卵巢癌组织中高表达。2敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞中PTK2蛋白及磷酸化水平敲除PTK2基因,在SKOV3和OVCAR8细胞系中均检测不到PTK2的表达。检测GSK2256098对PTK2的主要激活位点Y397的抑制效果,GSK2256098给药浓度分别为0、5、10、20、40μmol/L,作用时间24 h。与对照组相比,当GSK2256098浓度为40μmol/L时对卵巢癌细胞中p-FAK抑制效果显着,差异具有统计学意义（P<0.001）。3敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的增殖能力与敲除对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在PTK2敲除组显着降低（P<0.05）。与加药对照组相比,卵巢癌SKOV3和OVCAR8细胞的增殖能力在GSK2256098组显着降低（P<0.05）。4敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的克隆形成能力与敲除对照组（75.67±5.50）、（46.33±6.50）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（18.67±4.50）、（11.00±4.60）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（53.67±4.16）、（34.00±4.00）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞单层克隆形成数量（17.00±4.00）、（13.7±4.04）显着降低（P<0.05）。5敲除PTK2或使用GSK2256098抑制PTK2活性后,降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力与敲除对照组（106.30±8.50）、（39.67±8.08）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（43.70±8.50）、（20.67±4.51）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（73.33±8.02）、（55.00±7.21）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞迁移数量（27.67±3.51）、（28.00±7.00）显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验结果表明,与敲除对照组（79.33±6.03）、（42.00±4.58）相比,PTK2敲除组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（19.00±2.00）、（23.00±3.00）显着降低（P<0.05）。与加药对照组（80.30±8.96）、（36.33±5.69）相比,GSK2256098组SKOV3和OVCAR8细胞侵袭数量（22.67±2.52）、（18.33±2.52）显着降低（P<0.05）。结论PTK2在卵巢癌中发挥促癌作用;PTK2敲除或靶向抑制降低了卵巢癌细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力;PTK2有望成为卵巢癌的早期治疗靶点。第三部分PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用研究目的研究PTK2在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用。材料与方法1材料动物:实验选用4周大小的NSG免疫缺陷雌性小鼠。2方法2.1敲除PTK2基因后,构建人卵巢癌SKOV3细胞NSG免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.2将人卵巢癌细胞OVCAR8种植到小鼠卵巢组织,随机分成两组,一组采用GSK2256098治疗（灌胃,75 mg/kg/d,每周治疗5天,共4周）,另一组采用DMSO进行对照治疗,每周使用Xenogen在体成像系统监测肿瘤生长和转移情况。2.3统计方法同第一部分。结果1 PTK2敲除后抑制卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与敲除对照组相比,PTK2敲除组卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离肿瘤组织,与敲除对照组相比,PTK2敲除组小鼠卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。对照组小鼠肝脏、脾脏和肠等多个器官均出现肿瘤组织转移,而PTK2敲除组小鼠未发现肿瘤组织转移情况。2抑制PTK2活性后降低卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠卵巢肿瘤组织平均最大荧光强度值显着降低（P<0.001）。分离小鼠肿瘤组织,与治疗对照组相比,GSK2256098治疗组小鼠原位卵巢肿瘤组织重量显着降低（P<0.001）。治疗对照组出现肝脏、脾脏及肠肿瘤组织转移,而GSK2256098治疗组未发现肿瘤组织转移现象。结论PTK2敲除或靶向抑制降低卵巢癌小鼠原位移植瘤的形成和转移能力
李莹雪[3]（2020）在《丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用》文中研究说明丹参酮ⅡA（TanⅡA）是中药丹参的主要成分之一,具有多种生物活性和抗肿瘤功效,且毒性较低。但其受制于水溶性差,抗肿瘤功效不足等缺陷而难以应用到临床。本文以Tan ⅡA为目标化合物,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,在细胞水平筛选出与Tan ⅡA具有协同抗肿瘤作用的天然化合物穿心莲内酯（Andro）和芹菜素（Api）。通过组合物之间的协同作用,增强Tan ⅡA的抗肿瘤活性,为开发天然低毒复方抗肿瘤药物及功能食品提供新的候选药物组合。本文重点进行Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api两组化合物协同作用机制研究,同时进行体内抗肿瘤功效评价。研究方法、结果与结论如下:（1）与丹参酮ⅡA联用具有协同抗肿瘤作用的中药化合物筛选采用MTT法,以抑制肿瘤细胞增殖为指标,通过筛选实验发现Tan ⅡA与Andro以及Tan ⅡA与Api联合给药对MCF7、BGC823和SMMC7721等肿瘤细胞株的增殖具有协同抑制作用。Tan ⅡA（25 μM）与Andro（100μM）对MCF7细胞的联用指数（CI）为 0.26±0.02;Andro 单用对 MCF7 细胞的 IC50为 183.23 μM,Tan ⅡA 单用对 MCF7 细胞的IC50为51.46 μM;两化合物联用时对MCF7细胞的IC50为Andro 38.45μM和TanⅡA9.61 μM。TanⅡA（25μM）与 Api（50μM）对 BGC823 细胞联用指数 CI 为 0.28±0.01;单用于 BGC823 细胞时,Api 的 IC50为 131.28μM,Tan ⅡA 的 IC50为 61.46μM,两化合物联用时的 IC50 值为 Api 22.30μM 和 Tan ⅡA 11.15 μM。（2）丹参酮ⅡA与穿心莲内酯联用协同抑制人乳腺癌MCF7细胞通过AV-PI双染实验,证实Tan ⅡA与Andro联用对MCF7细胞具有显着协同促凋亡作用。研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）能够拮抗Andro对MCF7细胞的毒性以及两种化合物的协同作用,但无法拮抗Tan ⅡA对MCF7细胞的毒性,初步探明ROS积累是TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞协同作用的关键因素之一。进一步实验发现两种氧化剂L-丁硫氨酸-亚砜亚胺（BSO）和砷试剂（DETC）与Tan ⅡA联用均具有协同抗肿瘤效果,并且能够被NAC拮抗,进一步证实ROS是两化合物发挥协同效用的关键因子。利用液相色谱和质谱方法,证实Andro与还原型谷胱甘肽（GSH）类似物NAC能够发生共价结合。采用5,5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）氧化法测定GSH活性,进一步证实该反应封闭了 GSH上的-SH,在胞内降低了 GSH的还原力。采用2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和二氢乙啶（DHE）染料探针检测细胞内H2O2和超氧化物阴离子水平,结果发现与单独给药比较,TanⅡIA与Andro联用显着提高胞内ROS水平。上述结果证实ROS是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的关键因子。采用蛋白印迹法检测Tan ⅡA和Andro作用后,MCF7细胞内p53及其下游蛋白Bax和PUMA的含量变化。结果显示,Andro与Tan ⅡA联用时,细胞内p53,Bax和PUMA的表达显着提高;使用p53抑制剂Pifithrin-α（Pft-α）预处理MCF7细胞后,TanⅡA与Andro联用对MCF7细胞毒性减低一倍左右,联用指数从0.26±0.02提高到1.18±0.15,两者之间的协同作用消失。说明p53是Andro与TanⅡA协同抗肿瘤的另一关键因子。综上所述,Tan ⅡA与Andro联用于MCF7细胞,p53和ROS信号被显着增强,ROS与p53两个信号通路相互激活是Tan ⅡA与Andro协同抗肿瘤作用的核心机制。（3）丹参酮ⅡA与芹菜素联用协同抑制人胃癌BGC823细胞采用AV-PI双染和蛋白印迹方法,证实TanⅡA与Api联用使细胞内p53表达水平显着上调,胞内Bcl-2/Bax 比值显着降低,细胞凋亡显着增强。研究证实NAC不能够拮抗Api和Tan ⅡA单用及联用对BGC823细胞的毒性。说明ROS不是两化合物对BGC823细胞协同作用的关键因子。采用PI染色法和蛋白印迹实验考察TanⅡA与Api单用和联用,对BGC823细胞周期及胞内细胞周期蛋白（Cyclin）B1和D1含量的影响。结果表明当两种化合物联用时,细胞周期随时间推移依次阻滞在G2/M期（24h）,G1及G2/M期（48 h）和S期（72 h）,表现出多个细胞检查点上的周期阻滞,且周期阻滞更加严重。细胞周期蛋白含量也随细胞周期发生相应改变。采用圆二色和DNA热变性曲线法研究TanⅡA和Api与DNA的相互作用,结果表明:Api与DNA产生沟槽结合和外部堆积,Tan ⅡA改变DNA骨架的碱基堆积结构。DNA热变性实验发现:Tan ⅡA及Api与DNA结合,热变性曲线发生较大变化,说明Tan ⅡA及Api与DNA结合后对DNA的稳定性产生显着影响。上述实验结果证实TanⅡA以改变DNA碱基堆积的方式与DNA结合,Api与DNA沟槽外部结合,两者共同作用于DNA,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。S180荷瘤鼠体内实验结果表明:Api（60mg/kg）和TanⅡA（30mg/kg）单用口服无显着的抑瘤效果,联合使用的抑瘤效果显着,抑瘤率为37.6%。两化合物联用抑瘤效果与阳性药物环磷酰胺（30mg/kg）抑瘤效果相当,且毒性低于环磷酰胺（30mg/kg）。综上所述,本研究首次发现TanⅡA与Andro具有显着协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Andro分别作用于p53与ROS两个信号通路,两个信号通路相互激活是协同作用产生的核心机制。本研究首次发现Tan ⅡA与Api具有显着协同抗肿瘤作用,TanⅡA与Api分别以改变DNA骨架碱基堆积以及外部沟槽结合方式与DNA结合,加剧细胞周期阻滞,促进细胞凋亡,是二者产生协同作用的核心机制。
王晓蕊[4]（2020）在《乳腺癌不同分子分型中新型致癌基因PNO1的表达及功能研究》文中提出背景及目的:近年来,乳腺癌发病率和死亡率占全球女性全部恶性肿瘤的构成有所增加,严重威胁女性健康。乳腺癌的侵袭和转移是引起乳腺癌死亡的主要原因,也是临床上导致肿瘤复发和影响预后的关键因素,随着乳腺癌基因组学的快速发展,乳腺癌作为一种高度异质性的疾病呈现出不同的表型,针对其不同分子分型而进行的个体化精准治疗一直是临床努力的方向,因此,从分子水平上鉴定乳腺癌发生发展过程中的关键调控基因,发现可靠和特异性高的诊断及预后生物标记物,并不断寻找新的靶标进而研发新型治疗手段对于降低发病率和死亡率至关重要。PNO1（Partner of NOB1 homolog）是一种核糖体调控因子,有研究证实,其作为核糖体结合蛋白,参与了核糖体的生物发生,与人类疾病及肿瘤发生发展相关,PNO1在肿瘤中的作用及相关研究较少,有少量研究表明PNO1高表达与肿瘤不良预后相关。其作为一种潜在的癌基因,参与了肿瘤生长和进展。本研究在此基础上开展了其在乳腺癌中的作用,利用公共数据库生物信息学分析、临床样本验证表达特征及体外功能学实验发现其生物学功能,为寻找新的乳腺癌分子治疗靶点和治疗药物奠定基础。研究方法:（1）利用生物信息学方法对TCGA数据库中不同类型乳腺癌的PNO1表达水平进行分析;利用Kaplan-Meier生存分析探讨其与生存预后的相关性;（2）利用免疫组化方法从蛋白水平上验证195例临床样本PNO1的表达以及不同进展阶段PNO1的表达;利用Kaplan-Meier生存分析证实PNO1高表达与不良预后相关,进一步根据收集的临床资料利用单变量和多变量Cox回归分析影响乳腺癌患者预后的相关性和危险因素。（3）构建PNO1过表达和降表达质粒,利用慢病毒感染建立相应MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌细胞系,进行细胞功能学实验,通过CCK8和平板克隆实验,评估PNO1对乳腺癌细胞系增殖能力的影响,通过划痕试验、Transwell迁移侵袭实验,评估PNO1对两种细胞系的迁移和侵袭能力的影响。结果:（1）乳腺癌公共数据库中PNO1m RNA及蛋白在癌组织中的表达程度明显高于其配对的癌旁组织,并且在不同的病理组织学分型及分子分型中表达不同,差异有统计学意义（p<0.001）;其中浸润性导管癌的PNO1表达水平高于浸润性小叶癌（p<0.001）,少见亚型中以髓样癌表达最高（p<0.001）;HR（Hormone receptor,激素受体）阳性（+）HER2（人表皮生长因子受体2）阴性（-）乳腺癌分型的表达水平低于其他分型（p<0.01）。HER2阳性乳腺癌患者PNO1表达水平高于HER2阴性患者（p<0.01）;PNO1高表达与患者总生存（p=0.004）和无病生存（p=0.014）均相关,亚组分析显示PNO1高表达与浸润性导管癌患者预后不良相关,总生存（P=0.009）和无病生存（p=0.003）均相关;PNO1低表达患者预后在HR+型（总生存,p=0.028）及HER2-（总生存,p=0.005,无病生存p=0.013）乳腺癌这两种分型中优于PNO1高表达患者;（2）临床样本免疫组化结果显示乳腺癌患者中PNO1的阳性表达率显着高于癌旁组织（P<0.001）,PNO1在正常组织、不典型增生、导管内癌及癌和癌旁的表达存在差异,且PNO1高表达组无论在DFS（p=0.011）还是OS（p=0.0064）预后均较低表达组差;单因素分析显示,ER、PR、及Ki67状况可作为影响患者生存的独立因素,多因素分析显示,PR及Ki67以及PNO1的表达情况是影响患者生存的独立预后因素,并且PNO1高表达组在DFS及OS上均存在明显的统计学差异;PNO1与ER的表达存在负相关,ER阴性组中,PNO1的表达高于ER阳性组,同时PNO1高表达组与ER阴性患者的预后不良相关;（3）细胞功能学实验表明,PNO1过表达明显促进MDA-MB-231乳腺癌细胞系的增殖能力,增强其克隆形成,并明显增强其趋化和侵袭能力;而PNO1降表达后,MCF-7细胞增殖和定向迁移能力明显减弱。结论:PNO1在乳腺癌组织中高表达,其表达同乳腺癌发生存在一定联系;在不同病理组织分型和分子分型的乳腺癌中,PNO1表达情况与乳腺癌的恶性程度存在正相关。同时PNO1高表达与患者不良预后明显相关,提示PNO1可作为不同分子分型乳腺癌患者的良好预后标志物,可作为影响患者生存的独立危险因素;可进一步遴选出预后较差的亚型并进行有效治疗。PNO1过表达可促进乳腺癌细胞系的增殖、侵袭,而降表达PNO1可抑制乳腺癌细胞增殖和降低迁移能力,在肿瘤生长中起重要作用,可能成为乳腺癌以及其他癌症治疗的一个有吸引力的治疗靶点。
杜江[5]（2020）在《MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究》文中认为目的:分别观察miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin在三阴性乳腺癌、癌旁组织中的表达情况以及相互关系,验证miRNA-451与c-Myc表达之间可能存在的调控关系,通过慢病毒转染,观察miRNA-451不同表达水平下c-Myc、E-cadherin蛋白表达变化,以及调控c-Myc表达对三阴性乳腺癌细胞增殖活性、细胞迁移、侵袭能力以及细胞周期、凋亡的影响。方法:（1）收集2016-08至2018-02新疆医科大学附属肿瘤医院三阴性乳腺癌标本16例,采用自身配对的方式对乳腺癌组织以及癌旁组织中作为实验组以及对照组PCR方法和Western Blot检测miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因、蛋白表达水平;（2）首先构建c-Myc 3’UTR野生及突变质粒,生物信息方法分析并预测可能的转录因子结合位点,PCR方法扩增c-Myc基因3’-UTR序列,连接于荧光素酶报告检测各组荧光素酶活性,以海肾荧光素酶作为对照,检测细胞干预前后萤光素酶变化情况。双荧光素酶报告结果,以萤火虫/海肾荧光素酶比值表示;（3）构建稳定的MDA-MB-231细胞,培养稳定传代2-3代后,分为五组:1)BLANK组（不转染任何质粒）;2)miRNA-451-mimics-NC（拟似物阴性对照组）;3)miRNA-451-mimics4（拟似物组）;4)miRNA-451-inhibitor-NC（抑制物阴性对照组）;5)miRNA-451-inhibitor（抑制物组）,使用PCR方法和Western Blot分别检测各组中miRNA-451、c-Myc及E-cadherin的基因及蛋白表达水平,CCK8方法检测细胞增殖,Transwell法检测细胞迁移侵袭,流失细胞仪检测细胞周期变化和凋亡情况。结果:1)三阴性乳腺癌组织中c-Myc表达水平显着高于癌旁组织（t=-2.447,P=0.022）,三阴性乳腺癌组织中miRNA-451表达水平显着低于癌旁组织（t=3.799,P=0.001）,三阴性乳腺癌组织中E-cadherin表达水平显着低于癌旁组织（t=2.309,P=0.028）,c-Myc、miRNA-451与E-cadherin存在负相关关系（相关系数=-2.489,P=0.021）,c-Myc、miRNA-451以及E-cadherin表达情况与临床资料统计分析未见明显相关性（P>0.05）。2)数据库检测结果显示miRNA--451与c-Myc存在互补结合位点,荧光素酶活性检测结果表明miRNA-451mimic能够与c-Myc基因3’-UTR结合并抑制荧光素酶活性;与对照组相比,野生型载体中的报告荧光活性显着下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。miRNA-451与c-Myc基因存在互补区域,miRNA-451通过结合c-Myc3’UTR区下调c-Myc的表达,c-Myc是miRNA-451抑制乳腺癌EMT和侵袭转移的主要靶标基因。3)RT-PCR以及Western Blot检测显示,与空白对照组相比,三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞系转染miRNA-451-mimics后,c-Myc表达量显着降低（P<0.05）,E-cadherin表达量显着升高（P<0.05）;转染miRNA-451-inhibitor后,c-Myc表达量显着升高（P<0.05）,E-cadherin表达量显着降低（P<0.05）。三阴性乳腺癌细胞过表达miRNA-451后,不仅明显抑制细胞的增殖能力、迁移、侵袭能力,流式细胞检测提示细胞G0/G1期比例增加,从而促进细胞凋亡。三阴性乳腺癌中miRNA-451过表达可抑制肿瘤活性。c-Myc在高转移潜能的三阴性乳腺癌中过表达,miRNA-451的过表达可抑制肿瘤细胞EMT和侵袭转移。结论:（1）三阴性乳腺癌组织中c-Myc呈高表达状态,三阴性乳腺癌组织中miR-451以及E-cadherin呈低表达状态,并呈负向相关的关系;（2）miRNA-451与c-Myc具有互补结合位点,并存在负向靶标调节关系,c-Myc是miRNA-451的下游靶基因;（3）在三阴性乳腺癌中,miRNA-451的表达沉默可导致c-Myc的过表达,从而下调E-cadherin的表达,导致EMT以及肿瘤侵袭转移的发生。
李琦玮[6]（2020）在《益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨》文中指出研究背景:乳腺癌居于全球女性癌症死亡原因的首位。三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一种亚型,其分子表型呈雌激素受体（ER）阴性、孕激素受体（PR）阴性以及人类表皮生长因子受体2（HER2）阴性,约占全部乳腺癌的10-20%。TNBC由于缺乏有效的治疗靶点,往往预后不佳。乙酰肝素酶（HPSE）是哺乳动物体内唯一一种用于切割硫酸乙酰肝素（HS）侧链的β-D-葡萄糖内切糖苷酶,通过切割HS侧链过程重塑细胞外基质（ECM）结构,释放具有生物活性的小分子物质,如生长因子、细胞因子等,协助肿瘤的侵袭与转移,促进肿瘤血管生成,有助于肿瘤的发展。HPSE在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的恶性进展呈正相关。有研究发现,乙酰肝素酶具有调控细胞基础自噬过程的作用。自噬是一种进化保守的细胞通过溶酶体进行物质降解代谢的过程,一般认为,自噬在肿瘤的发生、发展过程中具有双刃剑的效果。在肿瘤产生之前,自噬可以清除损伤的细胞器或异常合成的蛋白质,减轻炎症反应,避免DNA损伤,预防肿瘤的发生;当体内出现肿瘤细胞时,自噬可以激活免疫细胞的抗原呈递功能,激活T细胞,增强免疫应答功能清除肿瘤细胞。然而肿瘤发生之后,肿瘤细胞可利用自噬作为其必要的生存机制,通过自噬过程为肿瘤细胞的生存和发展提供营养物质和能量支持,以此应对外周环境压力,获得增殖或转移的机会。由于TNBC目前仍然缺乏有效的治疗靶点,且易对治疗产生抵抗,寻找有效的辅助治疗手段提高TNBC的疗效十分重要。研究者对于包括传统中医药在内的补充替代治疗日益关注。千百年来,中药被广泛用于包括癌症在内的各种疾病的治疗。中药结合常规现代治疗有助于提高肿瘤疗效,减轻治疗毒副作用,改善肿瘤患者的生存质量。郁仁存教授、王笑民教授根据多年临证经验总结“益气活血解毒法”,并据此治则创立相关方剂,在临床上治疗各类恶性肿瘤取得了良好的疗效。基于益气活血解毒法,我们选择四种中药单体联合应用并评价其疗效。这些单体包括黄芪甲苷（提取自黄芪,代表“益气”）,龙葵碱（提取自植物龙葵,代表“解毒”）,莲心碱（提取自莲子,代表“解毒”）,川芎嗪（提取自川芎,代表“活血化瘀”）。我们将这四种单体组合简称“SANT”,并对其在肿瘤体内外模型中进行研究。研究目的:评价益气活血解毒中药单体组合SANT对MDA-MB-231 Hpa/Mock肿瘤的影响并分析相关机制。研究方法:在本研究中,我们首先利用数据库进行肝素酶表达与乳腺癌患者生存的相关性分析。利用MTS、trans-well和划痕实验评价SANT对肿瘤细胞增殖、迁移的影响。共聚焦实验用于观察SANT处理后231-Hpa细胞中GFP-RFP-LC3蛋白的变化。免疫印迹实验用于检测相关蛋白标志物表达。动物实验用于评价SANT在体内的疗效与安全性。最后我们采用人类自噬相关PCR微阵列和血管生成蛋白微阵列用于相关机制探索。研究结果:1.HPSE在多种癌症类型中高表达,乳腺癌中HPSE mRNA表达水平超过正常乳腺组织2倍以上。HPSE高表达的乳腺癌患者无复发生存期（P=1.7e-12）与总生存期（P=0.00016）都显着短于HPSE低表达的乳腺癌患者。TNBC患者的HPSE转录效率高于非三阴性乳腺癌患者。2.肿瘤细胞231-Hpa具有显着上调的肝素酶水平,231-Hpa细胞内LC3B-I/-Ⅱ转化率也显着高于231-Mock细胞（P=0.0003）。在乳腺癌原位移植瘤模型中,免疫荧光显示231-Hpa移植瘤HPSE表达显着升高;231-Hpa组肿瘤负荷（0.608g 与 0.437g,每组≥6 只,P=0.0242）,肺重（0.167g 与 0.148g,每组≥6只,P=0.0164）均显着高于对照组。231-Hpa组Ki-67染色与CD31染色均显着高于 231-Mock 组。3.体外实验:经过24小时处理,龙葵碱在0-64μM浓度范围将231-Mock细胞生存率降低近50%,231-Hpa细胞生存率降低约60%;经过48小时处理,龙葵碱对于231-Mock细胞抑制率为68.93%,对231-Hpa细胞抑制率为81.06%。甲基莲心碱（NEF）处理细胞24-48h后也达到60-80%的抑制率。黄芪甲苷和川芎嗪对肿瘤细胞增殖影响不明显。在Trans-well实验中,与对照组相比,SANT对231-Hpa细胞迁移的抑制率达79%,对231-Mock细胞迁移抑制率达72%。划痕实验也取得类似的结果,经过24小时SANT处理,231-Hpa细胞的划痕愈合面积下降了 51.5%,231-Mock细胞的划痕愈合面积下降了 40.6%。SANT在免疫印迹实验中可轻度降低活性形式HPSE的表达,对惰性形式HPSE的影响不明显。SANT和PI-88（肝素酶抑制剂）在体外均可轻微降低肝素酶活性带的表达。在荧光共聚焦观察实验中,转入GFP-RFP-LC3B标记的231-Hpa细胞经过SANT药物处理12h后,可以观察到大量LC3蛋白与溶酶体融合形成的黄色斑点,表示自噬过程的发生。Western实验可见,SANT处理细胞不同时间后引起了 LC3B-Ⅱ表达的升高,SANT与自噬抑制剂CQ联用可使LC3B-Ⅱ表达进一步升高,表明自噬流量的发生。4.体内实验中,SANT与PI-88均可以显着抑制肿瘤的生长（SANT与对照组,360.59 与 598.32mm3,P=0.0381;PI-88 与对照组,3 64.93 与 598.32mm3,P=0.0344）。SANT、PI-88组肿瘤重量较对照组也明显下降（SANT与对照组,0.29与 0.54g,P=0.0046;PI-88 与对照组,0.37 与 0.54g,P=0.0262）。肿瘤组织的免疫组化染色中,与对照组相比,SANT显着降低了 Ki-67表达（17.76±3.41%与7.52±2.02%,P<0.0001）,效果优于PI-88组。SANT明显抑制了微血管（MVD）（57%,P<0.0001）与血管生成拟态（VM）（33%,P=0.0019）的形成,但 PI-88抑制血管生成的效果更佳。安全性评价中,SANT在体内对小鼠的生化指标无明显影响。5.机制探索:对肿瘤组织进行人类自噬相关基因PCR微阵列检验结果显示,SANT处理显着上调了部分自噬过程相关基因,包括ATG10,ATG16L1,ATG16L2,ATG4B,ATG4D,ATG9A等,而PI-88处理组显着下调了一些自噬相关基因如AMBRA1,ATG16L1,ATG4D,BAD,BCL2L1等。肿瘤血管生成相关蛋白微阵列研究结果显示,SANT治疗组中HB-EGF,thrombospondin-2,amphiregulin,leptin,IGFBP-9,EGF,coagulation factor Ⅲ,MMP-9（前体及活性形式）表达上升,serpin E1,platelet factor 4表达下降。结论:肝素酶（HPSE）高表达常见于侵袭性乳腺癌患者中,与不良预后相关。HPSE促进肿瘤增殖,引起小鼠体内肺转移增多,在体外提高了肿瘤细胞自噬水平。体外研究中,SANT抑制肿瘤细胞的增殖与迁移,并增强肿瘤细胞的自噬水平。体内实验中,SANT在小鼠体内抑制肿瘤生长与血管生成过程。SANT对自噬相关基因或血管生成相关蛋白表达具有调控作用,可能与其肿瘤抑制作用相关。SANT是一种具有前景的用于三阴性乳腺癌辅助治疗的药物,这种药物组合研究拓展了天然化合物的应用思路。
塔依尔·吐尔松[7]（2020）在《LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2信号轴调控乳腺癌进程的机制研究》文中认为目的:乳腺癌是妇科常见的恶性肿瘤,是女性癌症死亡的主要原因之一。为了发现LINC00536在乳腺癌细胞系增殖和迁移中的作用,以及LINC00536在乳腺癌细胞系中的作用及其分子机制,本研究分为四个部分。1)基于生物信息学方法探索乳腺癌进程关键基因的筛选。2)长链非编码RNA LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2在乳腺癌组织中的表达及临床病理特征分析。3)LINC00536在乳腺癌中的异常表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响。4)LINC00536的下游分子miR-204-5p和TGFBR2在乳腺癌细胞中三者之间的靶向作用验证。方法:1)在TCGA数据库共下载1222份乳腺癌患者的RNA-seq数据;2)基于miRcode和miRTarBase数据库构建了乳腺癌ceRNA网络。前10位lncRNA采用Cox回归分析;3)生存分析采用KM（Kaplan-Meier）曲线分析;4)从TCGA数据库下载LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2单基因数据和临床数据,采用单基因分析方法,分析乳腺癌组织及相应邻近正常组织标本中的表达情况及临床特征;5)采用qRT-PCR方法检测30对乳腺癌组织中LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2的表达,采用双变量相关分析验证LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2表达与年龄,肿瘤大小,临床分期,肿瘤部位,TNM分期的相关性;6)免疫组织化学法检测TGFβ-2在乳腺癌组织和相应的邻近正常乳腺组织的表达情况;7)酶联免疫吸附法（ELISA法）测定乳腺癌患者血液样品中TGFBR2相关指标表达量;8)用1H-NMR血浆代谢组学法分析不同代谢产物;9)针对人乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-453,TD-47D和SK-RB-3细胞进行常规培养后,通过qRT-PCR进行目标基因即LINC00536表达水平检测,筛选LINC00536上调和下调的细胞系;10)对LINC00536基因沉默的T47D和MDA-MB-453细胞系和LINC00536过表达的MDA-MB-231和MCF-7细胞系进行增殖实验（CCK8检测）;11)利用EdUApollo?567体外成像试剂盒检测T47D、MDA-MB-453、MDA-MB-231和MCF-7的增殖情况,分别用Hoechst染色、Apollo染色细胞核和细胞质;12)划痕实验和平板克隆形成实验检测T47D和MDA-MB-453细胞系的增殖、生长和伤口愈合能力;13)利用生物信息学分析预测LINC00536和miRNA-204-5p,miRNA-204-5p和TGFBR2的潜在相互作用;14)构建报告基因重组载体pmir GLO-Wt3’UTR-LINC00536,pmirGLO-Mt3’UTR-LINC00536,pmirGLO-Wt3’UTR-TGFBR2和pmirGLO-Mt3’UTR-TGFBR2。采用双荧光素酶报告实验验证TGFBR2、miRNA-204-5p、LINC00536调控关系;15)Western-blot检测T47D细胞TGF-β信号通路相关蛋白的表达情况。结果:1)我们鉴定了1028个与乳腺癌相关的lncRNA和89个miRNA（fold change>2,P<0.05）;其中,93个lncRNA和19个miRNA和27个mRNA构成ceRNA网络;2)我们选择了10个lncRNA并分析了它们的总生存期;最终发现了5个lncRNA（ADAMTS9-AS1,AL513123.1,C10orf126,LINC00536,WT1-AS）与总生存期显着相关（log-rank P<0.05）;3)单基因分结果显示,乳腺癌组织中LINC00536的表达水平高于正常组织,miR-204-5p的表达水平在乳腺癌组织中的表达低于正常组织,乳腺癌组织中TGFBR2的表达下调。乳腺癌患者性别、初步诊断无显着性差异,但人种、民族、诊断年龄、肿瘤分期程度与患者生存情况有关（P<0.05）。在1081例乳腺癌患者回归单因素分析中,人种、民族、诊断年龄、初步诊断与LINC00536表达水平有关（P<0.05）。在1070例乳腺癌患者回归单因素分析中,人种、民族、诊断年龄、初步诊断与miR-204-5p表达水平有关（P<0.05）。在1090例乳腺癌患者回归单因素分析中,人种、诊断年龄、初步诊断、肿瘤分期程度与TGFBR2表达水平有关（P<0.05）;4)qRT-PCR检测结果显示,与正常组织相比,LINC00536在乳腺癌组织中的表达水平明显上调（P<0.05）。miR-204-5p/TGFβ-2在乳腺癌组织中的表达水平下调（P<0.05）。LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2表达与年龄,肿瘤大小,临床分期,肿瘤部位,TNM分期均无统计学意义（P>0.05）;5)免疫组织化学检测结果显示,与正常乳腺组织相比,乳腺癌组织中的TGFBR2阳性细胞、胞质染色和胞外阳性染色均降低（P<0.05）;6)在乳腺癌组TGFBR1、Smad2水平升高,TGFBR2,Smad3,Smad4水平显着降低;7)与正常组比较,乳腺癌组丙酮酸、柠檬酸、胆固醇、甘氨酸、乙酰乙酸、甲胺、二甲胺、天冬酰胺、亮氨酸、β-葡萄糖升高;8)在MDA-MB-231、T47D、MCF-7、MDA-MB-453和SKBR-3细胞系中检测到LINC00536表达,在T47D和MDA-MB-453细胞中明显升高;MDA-MB-231和MCF-7细胞系中下调;9)CCK8法检测结果显示在T47D和MDA-MB-453细胞中,si-LINC00536组细胞较空白组和无关序列对照组吸光度显着减少,且随着时间的持续,差异越来越大,差异具有统计学意义（P<0.05）;LINC00536表达上调后,乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的活力较对照组明显增加（P<0.05）。10)利用EdUApollo?567染色T47D和MDA-MB-453细胞,si-LINC00536组细胞较空白组和无关序列对照组阳性染色细胞数明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;EdU细胞实验结果显示,与对照组相比,LINC00536过表达组乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞阳性细胞数量明显增加（P<0.05）。11)划痕实验检测结果显示在T47D和MDA-MB-453细胞中,si-LINC00536组细胞较空白组和无关序列对照组划痕愈合能力降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;12)平板克隆形成实验结果显示在T47D和MDA-MB-453细胞中,si-LINC00536组细胞较空白组和无关序列对照组细胞克隆形成数显着降低,差异有统计学意义（P<0.05）;13)生物信息学分析推测miRNA204-5p与LINC00536和TGFBR2存在潜在的相互作用的种子区（seed region）区有特异结合位点;14)双荧光素酶报告实验显示TGFBR2是miRNA-204-5p的一个靶基因,miRNA-204-5p与LINC00536有结合位点;15)乳腺癌细胞中异常高表达的LINC00536可下调miR-204-5p的表达,并通过影响TGFBR2的表达量其发挥生物学作用。结论:生信分析筛选出93个lncRNA和19个miRNA和27个mRNA构成乳腺癌相关的ceRNA网络。发现了5个lncRNA（ADAMTS9-AS1,AL513123.1,C10orf126,LINC00536,WT1-AS）与总生存期显着相关。体外下调乳腺癌细胞LINC00536可以抑制细胞生长,降低细胞迁移能力。LINC00536通过负调控miRNA-204-5p来影响TGFBR2的表达,从而发挥其生物学功能。LINC00536具有促进肿瘤生长的作用,有望成为乳腺癌基因治疗的新靶点。
高祎婷[8]（2020）在《BF12对宫颈癌和乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制初探》文中提出目的:研究苯并呋喃类化合物--BF12[（E）-3-（6-甲氧基-2-（1-（3,4,5-三甲氧基苯基）乙烯基）苯并呋喃-5-基）甲酸]对宫颈癌细胞（SiHa、HeLa）和乳腺癌细胞（MCF-7、MDA-MB-231）增殖、凋亡的影响及机制初探。方法:（1）MTT试验对四种癌细胞进行IC50测定;（2）BF12处理后,PI检测细胞周期分布,Western Blot（WB）及免疫荧光（IF）检测细胞内微管聚合情况;（3）小管成形实验及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测BF12对肿瘤血管影响;（4）Hoechst观察细胞形态,Annexin V-FITC/PI检测凋亡诱导作用;（5）WB检测PI3K/Akt/mTOR通路及凋亡相关蛋白表达,Autodock vina软件对BF12和PI3K（α、γ、δ、β）进行分子对接,划痕实验观察乳腺癌细胞迁移情况;（6）IF、电镜及WB检测乳腺癌细胞自噬现象。结果:（1）BF12对SiHa/HeLa/MCF-7/MDA-MB-231的IC50分别是1.10/1.06/0.89/4.77μM;（2）BF12选择性阻滞细胞分裂周期于G2/M期,IF观察到MCF-7细胞纺锤体形成异常,SiHa、HeLa、MDA-MB-231细胞微管骨架遭到破坏,且聚合态α-、β-型微管蛋白表达水平减少（p<0.05）;（3）BF12能够破坏人脐静脉内皮细胞（HUVECs）构建的肿瘤血管网,降低VEGF分泌量（p<0.05）;（4）BF12诱导细胞凋亡,并伴随典型的凋亡形态特征;（5）BF12下调p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K、bcl-2,上调bax、p53、caspase-3/-9表达水平,且能抑制乳腺肿瘤细胞迁移。同时BF12与PI3K的四个亚基均能稳定结合,结合自由能分别为-8.0、-7.7、-7.8、-6.9 kcal/mol;（6）镜下观察到自噬体及自噬荧光点强度,与自噬标识蛋白LC3、beclin 1表达水平一致。结论:BF12通过抑制细胞微管聚合和PI3K/Akt/mTOR信号通路,协同发挥抗宫颈癌和乳腺癌细胞增殖作用;BF12还能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路而激发乳腺癌细胞自噬,抑制其迁移,进一步揭示其促乳腺癌细胞凋亡作用机制。
张婕[9]（2020）在《FAM53A以p53依赖性的方式影响乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭》文中研究指明目的:乳腺癌是影响妇女健康最常见的恶性肿瘤之一,据预测其发病率和死亡率将在几年内显着增加,其中年龄小于45岁的女性人群中乳腺癌发病率增加明显,表明乳腺癌已是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管乳腺癌的早期诊断和治疗已取得实质性进展,但其难治性和复发率的上升仍值得关注。因此,我们有必要提高对乳腺癌的进一步认识。探寻乳腺癌发病与进展的机制有助于乳腺癌的筛查诊断和靶向治疗,同时也可以为乳腺癌的预后判断提供新的思路和依据。丝裂原细胞外信号调节激酶（mitogen extracellular signal—regulated kinase,MEK）/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）信号转导途径是进化保守的信号转导途径,在肿瘤发生中至关重要的。该通路通常在多种恶性肿瘤中异常激活,通过三级激酶级联的形式在肿瘤侵袭和转移的过程中将信号放大。MEK/ERK信号通路的异常激活导致肿瘤细胞分化和凋亡丧失,同时增加了其增殖和侵袭的能力,从而引起肿瘤的发生和后期的转移。Ras在细胞膜上激活了MEK/ERK途径,后者激活了Raf,启动了磷酸化级联反应,从而导致了MEK1/2和ERK1/2的顺序激活。乳腺癌组织中ERK的表达明显高于良性增生性乳腺组织,并且与良性增生性乳腺组织相比,在严重的非典型增生和乳腺癌组织中ERK的磷酸化水平增加,这表明异常增加的ERK激活在非典型增生发展为癌症中起着重要作用,并且可以促进乳腺癌细胞的增殖。磷酸化的ERK（p-ERK）进入细胞核后会磷酸化某些特定的转录因子,例如c-Myc和c-Jun。p-ERK减少会降低基质金属蛋白酶MMP1和MMP9的表达,从而显着抑制乳腺癌的侵袭性。在乳腺癌细胞中,ERK失活伴随着细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和BCL2失活,从而导致细胞凋亡。FAM基因（family with sequence similarity,家族序列相似性基因）是近年来新发现的一类基因,它们的蛋白质序列具有相似性。这类基因已被证实与多种肿瘤的发生有关,包括乳腺癌,非小细胞肺癌,肺腺癌,肾细胞癌,前列腺癌,结肠直肠癌和食道鳞状细胞癌,它们在增殖,凋亡,迁移和侵袭方面起着重要的作用。FAM53家族是脊椎动物特有的蛋白质家族,可与调节细胞增殖的转录调节因子结合,影响神经管发育。该家族由三个同源基因编码:FAM53A,FAM53B和FAM53C。FAM53A,也称为背神经管核蛋白,通过指定神经管内背细胞的命运,被认为在神经发育中起重要作用。在基于TP53的相互作用分析中鉴定出FAM53A的表达定量性状基因座变异体与乳腺癌治疗药物阿霉素的使用相关联。在三阴性,TP53错义突变型的乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,FAM53A的下调增加了乳腺癌细胞对阿霉素的抗性。然而,在luminal B、TP53截短突变型的乳腺癌细胞系MDA-MB-361和luminal A、TP53野生型的乳腺癌细胞系MCF7中,FAM53A的下调反而导致乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性增加。然而,FAM53A在乳腺癌中的作用尚不清楚,并且其与乳腺癌的临床病理学相关性也尚未报道。在这项研究中,我们检测了FAM53A在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中的表达和定位。然后,我们上调或下调两种乳腺癌细胞系中FAM53A的表达,以探究其对乳腺癌细胞的生物学行为的影响,以及FAM53A如何影响乳腺癌的具体的分子生物学机制。研究方法:1.免疫荧光将乳腺癌细胞接种细胞于24孔板中的玻片上,用4%多聚甲醛固定15分钟,在5%BSA中封闭2小时,然后与抗FAM53A抗体（1:100）在4℃孵育过夜。第二天,将细胞与荧光二抗在室温避光条件下孵育2小时,DAPI染核。使用荧光显微镜激发目标光,进行观察并拍照。2.免疫组织化学染色实验我们选取了199位患者的原发性肿瘤标本进行临床病理相关性分析。上述全部患者标本均取自女性乳腺癌患者,年龄在36至87岁之间,均被诊断为浸润性导管癌,在2011年至2013年之间于中国医科大学附属第一医院完成手术切除。这199位参与此次病理相关性分析的乳腺癌患者手术前均未行任何放化疗或内分泌等辅助治疗。关于肿瘤大小分类,我们选取五厘米为分界线。肿瘤直径小于等于五厘米的病例有92例,大于五厘米的病例有107例。依据2009年AJCC乳腺癌分期标准进行TNM分期,以及患者病理档案资料显示,Ⅰ期和Ⅱ期患者共计109例,Ⅲ期患者共计90例。未发生淋巴结远处转移的病例有119例,发生淋巴结远处转移的病例有80例。所有病例中p53染色阴性的有115例,p53染色阳性的病例有84例。ER、PR、HER-2三阴的乳腺癌病例有23例,而非三阴性乳腺癌的病例有176例。将手术切除的肿瘤标本固定在10%中性福尔马林里,包埋在石蜡中,并连续切成4μm厚的切片。通过免疫组织化学染色,进行FAM53A的染色。使用免疫反应评分（IRS）半定量评价FAM53A染色的强度,其计算如下:IRS=PP×SI。PP:0=无染色;1=1-25%;2=26-50%;3=51-75%;和4=76-100%。SI:0=无染色;1=弱;2=中等;3=强染色。将每个肿瘤样本的得分相乘,得到0到9的最终得分。评分>3的肿瘤样本被认为显示出高FAM53A表达,而评分≤3的肿瘤样本被认为显示低FAM53A表达。通过使用SPSS 16.0软件进行分析,选取单样本配对t检验方法,分析FAM53A的表达水平与各个临床病理相关因素之间的统计学关系。P值小于0.05界定为具有统计学意义。3.细胞培养MCF-10A,MCF-7,T47D,MDA-MB-231,BT-474和BT-549细胞株获自中科院上海细胞库（中国上海）,并通过短串联重复（STR）DNA分析进行鉴定。收到后,将细胞培养传代并冻存细胞株。将MCF-10A细胞在补充有5%马血清,10μg/ml胰岛素和20 ng/ml EGF的DMEM/F12（1:1）中培养。MDA-MB-231细胞在补充有10%FBS的L15中培养。MCF7,T47D细胞常规培养在补充有10%FBS的DMEM中。BT-474和BT-549细胞株在补充有10%FBS的RPMI-1640中培养。所有细胞均在无菌培养瓶中培养,用0.25%胰蛋白酶进行胰蛋白酶消化,每两天进行传代培养。上述细胞株均保持在37℃的5%CO2培养箱中培养。4.质粒转染和si RNA干扰质粒p CMV6-ddk-myc和p CMV6-ddk-myc-FAM53A使用Xfect转染试剂,严格根据制造商的说明书进行细胞转染。转染前一天,细胞接种于2 m L完全生长培养基中,当细胞浓度为50–70%融合时进行转染。FAM53A（sc-88998）和非靶向对照（NC;sc-37007）si RNA使用Hi Per Fect干扰试剂,依据说明书进行。将细胞铺在2 m L完全生长培养基中,旨在si RNA转染时,细胞达到30-50%的融合度。通过上调和下调FAM53A蛋白表达,为后续细胞功能学实验、以及寻找FAM53A在乳腺癌中的相关通路提供基础。5.细胞增殖和集落形成测定将细胞于无菌六孔培养板中培养,转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平,运用MTT试验检测FAM53A对乳腺癌细胞增殖能力的影响。经MTT处理后检测其在490 nm波长的吸光度值,绘制生长曲线。对于集落形成实验,将细胞于无菌六孔培养板中培养,改变FAM53A的蛋白表达水平,然后进行细胞计数,将细胞以1000个细胞/皿的密度接种在40mm的培养皿中并孵育10-15天。每3天更换相应的含有10%胎牛血清的培养基。收取培养皿,经过固定、染色等步骤,计数细胞集落形成的数量和大小,以此来衡量FAM53A对乳腺癌细胞增殖能力的影响。在相同条件下至少进行3次独立实验。6.细胞迁移和侵袭实验将细胞于无菌细胞六孔培养板中培养,转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平,准备无菌的孔径为8μm的24孔transwell小室进行细胞迁移和侵袭实验。对于细胞迁移实验测定,将上述细胞进行计数,按组间相同的乳腺癌细胞数量铺于transwell小室的上室,将补充有10%FBS的培养基作为化学引诱剂添加到下室中。18小时后取出transwell小室,用棉签去除上室细胞,经过固定、染色等步骤,对下室细胞进行计数,下室细胞数量的多少反映出FAM53A对乳腺癌细胞迁移能力的影响。对于细胞侵袭实验测定,将transwell小室上室用100μL基质胶包被,同样对上述细胞进行计数,按组间相同的乳腺癌细胞数量铺于transwell小室的上室,将补充有10%FBS的培养基作为化学引诱剂添加到下室中。继续培养18小时之后,取出transwell小室,步骤同上。在相同条件下,所有实验独立重复至少三次。7.Western blot检测转染或干扰FAM53A,改变其蛋白表达水平后,收集细胞加入细胞裂解液保持在冰上裂解。蛋白浓度采用Bradford方法进行总蛋白浓度测定。配样后,用等量蛋白上样,运用SDS-PAGE进行蛋白分离,然后转印至PVDF膜上。室温下封闭2小时,一抗4°C孵育过夜。第二天,二抗室温孵育2小时,用ECL发光并拍照。结果用Image J软件进行条带灰度值测定。通过Western blot检测对细胞增殖、迁移、侵袭有关的蛋白进行检测和分析,找出FAM53A影响乳腺癌的相关通路。8.通过分析Western blot检测结果,我们找出FAM53A可能通过MEK/ERK信号通路影响乳腺癌,为了证实FAM53A的确是通过MEK/ERK信号通路发挥作用,在已有的对该信号通路作用的基础上,选取特异性MEK/ERK信号通路抑制剂PD98059,来抑制该通路对下游功能的影响,从而反向验证我们的结论。结果:1.FAM53A定位于细胞质和细胞核中,在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中低表达,而在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231高表达。临床病理相关性分析中,FAM53A水平与野生型p53呈负相关。2.在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,FAM53A过表达时,细胞的增殖,迁移和侵袭能力显着降低,而当FAM53A表达下调时,则导致MCF-7的增殖,迁移和侵袭增强。FAM53A能够调控MCF-7细胞增殖,迁移,侵袭相关功能蛋白。3.在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231中,FAM53A过表达促进了细胞的增殖,迁移和侵袭,而下调FAM53A抑制MDA-MB-231的增殖,迁移和侵袭。FAM53A能够调控MDA-MB-231细胞增殖,迁移,侵袭相关功能蛋白。4.在p53野生型乳腺癌细胞MCF-7中,FAM53A负向调控EMT相关蛋白,而在p53突变型乳腺癌细胞MDA-MB-231中,FAM53A促进EMT。5.FAM53A通过MEK/ERK途径影响乳腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭,并调控EMT。6.改变MCF-7和MDA-MB-231细胞的p53状态,原有的对细胞增殖,迁移和侵袭以及对EMT的影响也随之改变。结论:1.FAM53A在乳腺癌细胞中的表达与p53呈负相关2.FAM53A抑制p53野生型乳腺癌细胞MCF-7的增殖,迁移和侵袭;而促进p53突变型乳腺癌细胞系MDA-MB-231的增殖,迁移和侵袭3.FAM53A通过MEK/ERK信号通路调节乳腺癌细胞4.FAM53A对MCF-7和MDA-MB-231细胞相反的调控作用取决于它们p53的状态。
黄盼盼[10]（2020）在《PLSCR1激活STAT1信号通路促进基底样乳腺癌的发生发展》文中研究说明乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的一类恶性肿瘤。乳腺癌的全球发病率从上世纪70年代末开始呈持续上升趋势,已成为当前社会的重大公共卫生问题。在我国,乳腺癌的发病率也逐年上升,每年有20万左右的女性被确诊。当前乳腺癌已成为我国女性第一大杀手。乳腺癌是一种异质性疾病,根据基因表达的不同可以分为四种亚型:管腔上皮A型、管腔上皮B型、Her2过表迖型及基底样型。其中基底样乳腺癌具有迁移、侵袭和增殖能力强等特征,对化疗易耐药,又缺少相应的靶向治疗方法,预后是最差的。因此,针对基底样乳腺癌发生发展的特征,找出关键靶点和调控信号对乳腺癌的临床诊断和治疗具有较高的指导意义。磷脂爬行酶1（Phospholipid scramblase 1,PLSCR1）是一种Ca2+结合的棕榈酰化II型膜蛋白,非棕榈酰化的PLSCR1可转运到细胞核与基因组DNA序列结合。最初的研究认为PLSCR1主要功能是通过磷脂爬行酶的活性在细胞激活、损伤或凋亡的过程中促进膜磷脂的翻转重排。然而越来越多的研究发现PLSCR1的生物学功能并不局限于细胞膜磷脂分子的跨膜运动;甚至有报道称它并不具有磷脂转运子的功能,可能在细胞内发挥其它的作用。有数据显示PLSCR1与乳腺癌患者的分期、转移和预后有密切的关系,但在乳腺癌中的功能和作用机制尚不清楚。因此,本课题对PLSCR1在乳腺癌中的表达、生物学功能和机制进行研究。我们首先分析多个乳腺癌患者的基因表达数据库及肿瘤样本,发现与其他亚型相比PLSCR1在基底样乳腺癌中的表达显着增加。通过半定量RT-PCR、实时荧光定量PCR和Western Blot检测PLSCR1在乳腺癌细胞系中的表达情况,并对不同亚型肿瘤组织进行蛋白核质分离,结果表明PLSCR1的m RNA和蛋白表达在基底样乳腺癌中明显升高。为研究PLSCR1在乳腺癌中的生物学功能,在基底样乳腺癌细胞中敲降PLSCR1的表达并外源过表达野生型或者磷脂爬行酶活性位点突变的PLSCR1,在管腔型乳腺癌细胞中则过表达野生型或者突变型的PLSCR1。用CCK-8和Transwell小室迁移、侵袭实验探究PLSCR1对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果发现乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力与PLSCR1的表达量成正相关,而与其磷脂爬行酶的活性无关。PLSCR1的表达分布于细胞膜、细胞质和细胞核。然而,在正常的细胞培养条件下,PLSCR1在细胞核中所检测到的比例较小。而在EGF刺激时PLSCR1可与EGFR发生相互作用。为研究EGFR信号通路对PLSCR1亚细胞定位的影响,我们应用激光共聚焦分析在EGF刺激下PLSCR1的亚细胞定位,在细胞核质蛋白分离后用Western Blot进行检测。结果表明EGF刺激可以促进PLSCR1进入细胞核。由于EGF可以促进PLSCR1酪氨酸（Tyr 69/74）的磷酸化,为验证该磷酸化位点是否影响PLSCR1的核移位,我们将这两个磷酸化位点进行突变（PLSCR1-Y69,74F）。敲降乳腺癌细胞系内源表达的PLSCR1,再外源过表达野生型或磷酸化位点突变的PLSCR1。通过Western Blot和免疫荧光实验,我们发现Tyr 69/74的磷酸化有助于PLSCR1转运到细胞核。在敲降内源PLSCR1表达的细胞中,我们过表达棕榈酰化位点和磷酸化位点都突变的PLSCR1,然后通过免疫荧光检测PLSCR1亚细胞定位的变化。结果表明,EGF诱导的PLSCR1核移位需要PLSCR1 Tyr69和Tyr74的磷酸化参与。为探究PLSCR1在乳腺癌中的潜在分子机制,我们在基因表达数据集中对PLSCR1与其他基因进行共表达分析,发现PLSCR1的表达与STAT1成正相关。通过Western Blot实验检测基底样乳腺癌细胞系和管腔型乳腺癌细胞系中PLSCR1与STAT1的表达,我们发现PLSCR1和STAT1的表达在基底样细胞系中升高而在管腔型细胞系中降低。为探究PLSCR1和STAT1的关系,我们在乳腺癌细胞系中过表达或者敲降PLSCR1,结果显示STAT1表达也相应升高或者下降。这些数据表明PLSCR1可调节STAT1的表达。为探究STAT1与PLSCR1在基底样乳腺癌中紧密联系的机制,我们通过免疫沉淀和质谱联用（IP-MS）,来寻找与PLSCR1相互作用的蛋白,并结合已有的报道和生物信息学分析找出几个关键蛋白,然后用免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步验证。我们发现PLSCR1可与STAT3发生相互作用,且PLSCR1 Tyr 69/74的磷酸化影响两者的结合。在乳腺癌细胞中高表达STAT3则STAT1的表达上调,敲降STAT3则STAT1的表达下调。由于磷酸化修饰影响PLSCR1的核移位和与STAT3的结合,我们在乳腺癌细胞系中分别高表达野生型或磷酸化位点突变的PLSCR1,结果发现PLSCR1 Tyr69和Tyr74的磷酸化影响STAT1的表达。通过染色质免疫沉淀（Ch IP）技术及半定量PCR和实时荧光定量PCR分析,我们发现Tyr69和Tyr74磷酸化的PLSCR1与STAT3在细胞核内相互作用,并结合到STAT1的启动子区调控STAT1的表达。为阐明PLSCR1在乳腺癌细胞中的作用机制,我们用PLSCR1敲降或野生型过表达或磷脂爬行酶活性位点突变过表达的乳腺癌细胞株进行细胞悬浮培养成球实验,并通过流式细胞仪检测这些细胞株中CD44high/CD24low的变化。结果表明PLSCR1的表达与乳腺癌细胞成球能力及CD44high/CD24low细胞数量成正相关。由于肿瘤干细胞具有较高的致瘤和转移特性,我们首先用相应的乳腺癌细胞进行软琼脂克隆形成实验,发现敲降PLSCR1表达的细胞株克隆形成能力下降,过表达野生型或者磷脂爬行酶活性位点突变的PLSCR1的细胞株则克隆则形成能力提高。进而,我们使用敲降PLSCR1表达的乳腺癌细胞系进行小鼠原位成瘤实验,结果发现敲降PLSCR1表达的肿瘤生长能力明显降低。为了探索PLSCR1的表达对乳腺癌进展的临床意义,我们首先在多个数据库中评估PLSCR1表达与肿瘤大小、分级的相关性,发现PLSCR1表达量越高则肿瘤体积越大、分级越高。为在动物体内检测PLSCR1与乳腺癌转移的相关性,我们将敲降PLSCR1表达的乳腺癌细胞株通过尾静脉注射构建肺转移模型,结果发现抑制PLSCR1表达能够显着降低乳腺癌细胞的肺转移能力。此外,我们分析了乳腺癌病人临床样本数据库,发现PLSCR1表达越高则肿瘤远端转移能力越强。我们还通过乳腺癌病人数据库分析PLSCR1表达与化疗敏感性的关系,发现具有化疗抗性的肿瘤中PLSCR1表达量更高。最后,我们通过Kaplan-Meier生存分析多个数据集,评估PLSCR1的表达与患者生存期的关系,发现PLSCR1高表达患者的无远处转移生存（DMFS）、无复发生存（RFS）和总生存（OS）期均更短。基于以上研究结果,我们得出以下结论:1.PLSCR1在基底样乳腺癌中高表达,且与患者的不良预后成正相关。2.PLSCR1的磷酸化修饰促进其核移位及与STAT3的结合。3.PLSCR1的核移位能够激活STAT1信号传导,维持BLBC干细胞的特性,从而增强致瘤性和转移性。综上所述,本课题的研究揭示了PLSCR1促进BLBC进展的关键机制,提出了针对这种具有挑战性的疾病的潜在预后指标和治疗靶标。
二、Downregulation of wild-type p53 protein by HER-2/neu mediated PI3K pathway activation in human breast cancer cells: its effect on cell proliferation and implication for therapy（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Downregulation of wild-type p53 protein by HER-2/neu mediated PI3K pathway activation in human breast cancer cells: its effect on cell proliferation and implication for therapy（论文提纲范文）
（1）Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 Hsa_circ00063322 吸附miR-548q促进宫颈癌细胞增殖、减弱药物敏感性并调节HPV L2 表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 2.1.2 实验步骤与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 宫颈癌中Hsa_circ00063322 的表达特征及转录调节 |
| 2.2.2 Hsa_circ00063322 影响CC细胞增殖和药物敏感性,以及在体肿瘤生长 |
| 2.2.3 Hsa_circ00063322 作为miRNAs海绵吸附miR-548q |
| 2.2.4 Hsa_circ00063322 通过miR-548q调节L2 表达,以及细胞增殖和药物敏感性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 相关实验仪器及材料 |
| 3.1.2 实验步骤与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 宫颈癌中Hsa_circ0000069 的表达特征 |
| 3.2.2 m6A修饰提高了Hsa_circ0000069 转录本的稳定性 |
| 3.2.3 Hsa_circ0000069 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.2.4 Hsa_circ0000069 通过吸附miR-4426 促进宫颈癌细胞增殖和迁移 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 妇科肿瘤分子标志物及其个体化精准医疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间学术成果 |
| 致谢 |
（2）基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 基因修饰小鼠卵巢癌细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 PTK2在卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭中的作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 PTK2 在卵巢癌小鼠原位移植瘤形成和转移中的作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 本课题创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 PTK2在肿瘤中的研究新进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号(缩写词)表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 丹参酮ⅡA抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.1.1 丹参酮ⅡA抗肿瘤作用的主要靶点 |
| 1.1.2 丹参酮ⅡA与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.2 穿心莲内酯抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.2.1 穿心莲内酯抗肿瘤作用的主要靶点 |
| 1.2.2 穿心莲内酯与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.3 芹菜素抗肿瘤机制研究现状 |
| 1.3.1 芹菜素抗肿瘤机制研究的主要靶点 |
| 1.3.2 芹菜素与其他化合物合用的抗肿瘤作用及机制 |
| 1.4 天然产物协同作用的发生机制 |
| 1.4.1 多靶点相互作用 |
| 1.4.2 提高口服生物利用度 |
| 1.4.3 逆转耐药性 |
| 1.4.4 消除不良反应 |
| 1.5 复方药物的设计策略 |
| 1.5.1 多组分药物组合 |
| 1.5.2 天然化合物之间的协同作用 |
| 1.5.3 靶向多因素疾病的不同信号通路 |
| 1.6 相关信号通路简介 |
| 1.6.1 ROS信号通路与胞内抗氧化防御机制 |
| 1.6.2 ROS与p53信号通路的相互作用 |
| 1.7 立题依据和研究内容 |
| 1.7.1 立题依据 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.8 研究目的和意义 |
| 2 与丹参酮ⅡA联用具有协同抗肿瘤作用的中药化合物筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 小鼠脾细胞制备 |
| 2.3.3 MTT与MTS法检测细胞增殖 |
| 2.3.4 联用指数CI的计算 |
| 2.3.5 统计学分析 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 丹参酮ⅡA与38种中药单体化合物抗肿瘤协同作用筛选 |
| 2.4.2 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素配比优化 |
| 2.4.3 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯联用对不同肿瘤细胞协同抗肿瘤作用 |
| 2.4.4 丹参酮ⅡA与芹菜素联用对不同肿瘤细胞协同抗肿瘤作用 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 3 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯对人乳腺癌MCF7细胞的协同作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 MTT法检测细胞增殖 |
| 3.3.3 细胞形态学观察 |
| 3.3.4 细胞凋亡检测 |
| 3.3.5 液相色谱法检测Andro与NAC之间的化学反应 |
| 3.3.6 液质联用表征反应产物 |
| 3.3.7 胞内和无细胞体系内GSH的活性测定 |
| 3.3.8 DCFH-DA测定细胞内的H2O2水平 |
| 3.3.9 DHE测定细胞内超氧化物阴离子水平 |
| 3.3.10 Western blot检测信号蛋白表达 |
| 3.3.11 联用指数CI的计算 |
| 3.3.12 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与分析 |
| 3.4.1 丹参酮ⅡA与穿心莲内酯的联合作用 |
| 3.4.2 抗氧化物拮抗Andro与TanⅡA的协同作用 |
| 3.4.3 DETC和BSO与丹参酮ⅡA的联合作用 |
| 3.4.4 Tan ⅡA与Andro、BSO和DETC联用对胞内ROS积累的影响 |
| 3.4.5 Tan ⅡA与Andro联用对p53信号通路的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 4 丹参酮ⅡA与芹菜素对人胃癌BGC823细胞的协同作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验设备 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 MTT实验 |
| 4.3.2 细胞凋亡检测 |
| 4.3.3 细胞周期检测 |
| 4.3.4 DNA结合实验 |
| 4.3.5 DNA热变性曲线 |
| 4.3.6 Westen Blot检测信号蛋白表达 |
| 4.3.7 S180肿瘤模型抑瘤实验 |
| 4.3.8 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与分析 |
| 4.4.1 丹参酮ⅡA与芹菜素的联合作用 |
| 4.4.2 NAC对Tan ⅡA与Api细胞毒的影响 |
| 4.4.3 Tan ⅡA与Api联用对BGC823细胞周期阻滞作用 |
| 4.4.4 Tan ⅡA与Api与DNA的相互作用 |
| 4.4.5 Tan ⅡA与Api联用对荷瘤鼠的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 5 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
（4）乳腺癌不同分子分型中新型致癌基因PNO1的表达及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、PNO1在公共数据库中不同分型乳腺癌组织中的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 TCGA数据库资料下载与整理 |
| 1.1.2 Kaplan-Meier Plotter 数据库进行患者生存分析 |
| 1.1.3 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 TCGA数据库肿瘤组织癌与癌旁的差异 |
| 1.2.2 不同病理分型及分子分型PNO1表达情况 |
| 1.2.3 PNO1表达与乳腺癌患者术后总生存及无进展生存之间的相关性 |
| 1.3 结果与讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、PNO1在不同分型乳腺癌临床样本中的表达与预后的关系 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要仪器设备 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 乳腺癌样本临床特征 |
| 2.2.2 乳腺癌肿瘤组织及其癌旁组织中PNO1表达及预后的关系 |
| 2.2.3 PNO1表达在乳腺癌发生发展的不同阶段存在差异 |
| 2.2.4 PNO1在不同分型乳腺癌中的表达存在差异 |
| 2.2.5 影响乳腺癌生存的单因素及多因素分析 |
| 2.2.6 PNO1表达与不同临床病理因素间的相关性分析 |
| 2.2.7 数据库二次验证PNO1表达对不同亚组乳腺癌生存的影响 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、不同PNO1表达水平对乳腺癌细胞系增殖、侵袭、迁移功能的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器和设备 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 主要试剂配置 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.1.6 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 过表达和降表达稳转细胞株的构建 |
| 3.2.2 PNO1 过表达对MDA-MB-231 细胞增殖能力的影响 |
| 3.2.3 PNO1 降表达对MCF-7 细胞增殖能力的影响 |
| 3.2.4 PNO1对MDA-MB-231 细胞体外趋化侵袭能力的影响 |
| 3.2.5 PNO1对MCF-7 乳腺癌细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 乳腺癌分子分型与靶向治疗研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 三阴性乳腺癌、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc与 E-cadherin的检测以及临床资料分析 |
| 1 研究内容及方法 |
| 1.1 聚合酶链反应PCR法检测三阴性乳腺癌组织、癌旁组织中miRNA-451、c-Myc以及E-cadherin基因 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 验证miRNA-451与c-Myc靶向调控关系 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 miRNA-451 基因对细胞功能影响的研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验方法及步骤 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（6）益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一 天然药物调控自噬治疗肿瘤及基于益气活血解毒理论的应用 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 自噬影响肿瘤发生与转移的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三 肝素酶与血管生成相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述四 三阴性乳腺癌肿瘤异质性与治疗研究进展 |
| 辨文献 |
| 第二部分 乙酰肝素酶对MDA-MB-231乳腺癌肿瘤生长、自噬、血管生成的干预作用 |
| 实验一 乙酰肝素酶对乳腺癌患者生存情况的影响分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 乙酰肝素酶对MDA-MB-231细胞自噬水平的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 MDA-MB-231乳腺癌乳垫原位移植瘤模型建立以及乙酰肝素酶表达水平对体内肿瘤生长及血管生成的干预作用 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 第三部分 益气活血解毒中药对HPSE高表达乳腺癌体内外的干预作用及自噬及血管生成方面的机制研究 |
| 实验一 SANT对乳腺癌细胞生长的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验二 SANT对乳腺癌细胞迁移的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验三 SANT对乳腺癌细胞肝素酶表达及自噬的影响 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验四 SANT对小鼠肿瘤生长的抑制作用及安全性评价 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验五 SANT对肿瘤血管生成的干预作用及机制分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 实验六 SANT对肿瘤组织自噬相关基因表达的影响及分析 |
| 1. 材料 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2信号轴调控乳腺癌进程的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 基于生物信息学方法探索乳腺癌进程关键基因的筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究人群 |
| 1.2 筛选差异表达基因 |
| 1.3 构建乳腺癌相关ceRNA网络 |
| 1.4 筛选乳腺癌中异常表达的前10个lncRNA |
| 1.5 用GEPIA数据库分析lncRNA |
| 1.6 cBioPortal分析 |
| 1.7 生存分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 长链非编码RNALINC00536 在乳腺癌组织中的表达及临床病理特征分析 |
| 1 研究内容和方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 LINC00536 在乳腺癌中的异常表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移能力的影响 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 LINC00536 的下游分子miR-204-5p和 TGFBR2 在乳腺癌细胞中三者之间的靶向作用验证 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究内容 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.3 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）BF12对宫颈癌和乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.BF12 对宫颈癌细胞增殖、凋亡的研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞株 |
| 1.1.2 仪器 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 主要试剂的配制 |
| 1.2 内容与方法 |
| 1.2.1 技术路线图 |
| 1.2.2 细胞培养 |
| 1.2.3 待测化合物的抗肿瘤细胞增殖实验 |
| 1.2.4 凋亡形态 |
| 1.2.5 细胞凋亡实验 |
| 1.2.6 细胞周期实验 |
| 1.2.7 免疫荧光实验 |
| 1.2.8 分子对接 |
| 1.2.9 WB实验 |
| 1.2.10 统计学方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 2.BF12 对乳腺癌细胞增殖、凋亡的研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.2 内容与方法 |
| 2.2.1 技术路线图 |
| 2.2.2 细胞生长曲线 |
| 2.2.3 自噬免疫荧光实验 |
| 2.2.4 电镜实验 |
| 2.2.5 小管形成实验 |
| 2.2.6 ELISA |
| 2.2.7 划痕实验 |
| 2.2.8 WB实验 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 指导教师评阅意见表 |
（9）FAM53A以p53依赖性的方式影响乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、材料和实验仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 相关抗体 |
| 2.1.3 主要材料 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 临床资料和伦理声明 |
| 2.3 主要方法 |
| 2.3.1 免疫荧光 |
| 2.3.2 免疫组织化学染色及评分 |
| 2.3.3 细胞培养 |
| 2.3.4 质粒转染和siRNA干扰 |
| 2.3.5 细胞增殖和集落形成测定 |
| 2.3.6 细胞迁移和侵袭实验 |
| 2.3.7 Western Blot检测 |
| 2.3.8 MEK/ERK信号通路抑制剂PD98059 |
| 3 结果 |
| 3.1 FAM53A在乳腺癌细胞中的表达与p53相关 |
| 3.2 FAM53A抑制p53 野生型乳腺癌细胞MCF-7 的增殖,迁移和侵袭 |
| 3.3 FAM53A促进p53 突变型乳腺癌细胞系MDA-MB-231 的增殖,迁移和侵袭 |
| 3.4 FAM53A影响上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达 |
| 3.5 FAM53A通过MEK/ ERK信号通路调节乳腺癌细胞 |
| 3.6 FAM53A对 MCF-7和MDA-MB-231 细胞相反的调控作用取决于它们p53的状态 |
| 4 讨论 |
| 本研究创新性自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）PLSCR1激活STAT1信号通路促进基底样乳腺癌的发生发展（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 2 主要仪器设备和试剂 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.3.1 细胞培养所用试剂 |
| 2.3.2 质粒构建所用试剂 |
| 2.3.3 慢病毒包装及感染所用试剂 |
| 2.3.4 免疫共沉淀及免疫荧光实验所用试剂 |
| 2.3.5 蛋白质免疫印迹(Western bloting)所用试剂 |
| 2.3.6 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)所用试剂 |
| 2.3.7 细胞功能学实验所用试剂 |
| 2.3.8 苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)实验 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养、质粒构建、慢病毒包装及感染 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 质粒构建 |
| 3.1.3 慢病毒包装及感染 |
| 3.2 质粒位点定点突变 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 目标质粒扩增 |
| 3.2.3 目标质粒扩增反应 |
| 3.2.4 扩增产物DpnI消化,去除甲基化模板质粒 |
| 3.2.5 进行重组反应 |
| 3.2.6 反应产物转化、涂板、克隆鉴定 |
| 3.3 细胞核蛋白分离提取 |
| 3.4 免疫荧光法(immunofluorescence assay,IFA)检测 |
| 3.5 染色质免疫共沉淀实验(ChIP) |
| 3.5.1 细胞交联和样本制备 |
| 3.5.2 细胞核制备和染色质消化 |
| 3.5.3 染色质消化和浓度分析 |
| 3.5.4 染色质免疫沉淀 |
| 3.5.5 将染色质从偶联抗体的Protein G磁珠上洗脱并解交联 |
| 3.5.6 纯化DNA |
| 3.5.7 使用PCR定量DNA |
| 3.6 免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 3.7 细胞克隆成球实验(Tumorsphere-formation) |
| 3.8流式细胞术检测细胞膜表面蛋白CD24/CD44 |
| 3.9 细胞及组织中蛋白样品的制备及Western blotting |
| 3.9.1 细胞蛋白样品的制备 |
| 3.9.2 组织蛋白样品的制备 |
| 3.9.3 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.9.4 Western blotting |
| 3.10 Real-time PCR检测目的基因m RNA的表达 |
| 3.10.1 细胞总RNA提取 |
| 3.10.2 RNA纯度的测定和RNA的定量 |
| 3.10.3 RNA反转录实验 |
| 3.10.4 qPCR实验 |
| 3.11 细胞功能学实验 |
| 3.11.1 CCK-8检测细胞增殖 |
| 3.11.2 Transwell迁移实验检测细胞迁移 |
| 3.11.3 Transwell侵袭实验检测细胞侵袭 |
| 3.11.4 Soft-agar软琼脂克隆形成实验 |
| 3.11.5 小鼠成瘤实验 |
| 3.11.6 小鼠肿瘤转移活体成像实验 |
| 3.11.7 苏木素-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)实验 |
| 3.11.8 生物信息学分析 |
| 3.11.9 数据统计分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 在基底样乳腺癌中PLSCR1呈现高表达 |
| 4.2 PLSCR1的表达影响乳腺癌细胞的增殖 |
| 4.3 PLSCR1的表达能够影响乳腺癌细胞的转移能力 |
| 4.4 PLSCR1的磷酸化有利于其向细胞核内转运 |
| 4.5 STAT1与PLSCR1 的表达成正相关 |
| 4.6 PLSCR1与STAT3 两者间相互作用 |
| 4.7 PLSCR1 通过调节STAT3 介导的STAT1 的表达增强肿瘤细胞的干性 |
| 4.8 PLSCR1在乳腺癌形成中的作用 |
| 4.9 PLSCR1在乳腺癌转移中的作用 |
| 5 讨论 |
| 5.1 PLSCR1 入核激活STAT1 介导的乳腺癌细胞干性 |
| 5.2 PLSCR1的核转位由其磷酸化介导 |
| 5.3 PLSCR1是基底样乳腺癌的潜在预后指标和治疗靶点 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 STAT3在乳腺癌细胞中的组成性激活 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
四、Downregulation of wild-type p53 protein by HER-2/neu mediated PI3K pathway activation in human breast cancer cells: its effect on cell proliferation and implication for therapy（论文参考文献）
- [1]Hsa＿circ0006332和Hsa＿circ0000069调控宫颈癌发展的机制研究[D]. 陈震. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]基因修饰卵巢癌细胞株的构建及PTK2对卵巢癌细胞生物学行为影响的研究[D]. 闫欢. 郑州大学, 2020(02)
- [3]丹参酮ⅡA与穿心莲内酯及芹菜素协同抗肿瘤作用[D]. 李莹雪. 大连理工大学, 2020(07)
- [4]乳腺癌不同分子分型中新型致癌基因PNO1的表达及功能研究[D]. 王晓蕊. 天津医科大学, 2020(06)
- [5]MiRNA-451调控c-Myc在三阴性乳腺癌侵袭转移作用的研究[D]. 杜江. 新疆医科大学, 2020(07)
- [6]益气活血解毒中药对三阴性乳腺癌的干预作用及机制探讨[D]. 李琦玮. 北京中医药大学, 2020(04)
- [7]LINC00536/miR-204-5p/TGFβ-2信号轴调控乳腺癌进程的机制研究[D]. 塔依尔·吐尔松. 新疆医科大学, 2020(07)
- [8]BF12对宫颈癌和乳腺癌细胞增殖、凋亡的影响及机制初探[D]. 高祎婷. 新疆医科大学, 2020(07)
- [9]FAM53A以p53依赖性的方式影响乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭[D]. 张婕. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]PLSCR1激活STAT1信号通路促进基底样乳腺癌的发生发展[D]. 黄盼盼. 浙江大学, 2020(01)