一、内皮素转化酶抑制剂治疗脑血管痉挛的免疫组化研究（论文文献综述）
刘珊杉[1]（2021）在《平滑肌HuR在高血压和动脉粥样硬化中的作用及机制研究》文中提出研究背景:高血压在心血管疾病的发生发展中起着至关重要的作用,它是造成疾病死亡的主要危险因素。我国将收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg定义为高血压。目前我国高血压的知晓率和控制率相对较低,提高高血压的诊断和治疗刻不容缓。高血压的发病机制极为复杂,包括血管重构、内皮细胞功能受损、交感神经活动亢进、肾素-血管紧张素系统激活、肾钠潴留、胰岛素抵抗等。它们通过改变血容量、心输出量和外周阻力最终影响血压。其中,血管阻力取决于小动脉和微动脉平滑肌细胞的收缩和舒张。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在生物力学和血管活性物质的刺激下,通过控制血管直径直接驱动血管壁的收缩。血管平滑肌收缩状态的异常足以引起血压紊乱。细胞内钙离子（Ca2+）的增加是VSMCs收缩活性增加的关键步骤。Ca2+增加的途径包括:VSMCs膜去极化激活电压门控Ca2+通道,导致Ca2+内流;血管收缩激动剂与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）结合,激活磷脂酶C,从而催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇转化为二酰基甘油和1,4,5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3）。后者与肌浆网上的IP3受体结合,Ca2+通道打开。Ca2+从肌浆网释放,胞浆Ca2+浓度增加。胞浆内增加的Ca2+与钙调蛋白结合并激活肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase,MLCK）,从而导致平滑肌肌球蛋白的调节轻链磷酸化和随后的平滑肌收缩。MLCK的缺乏可导致平滑肌收缩功能受损和血压降低。GPCRs大量存在于心血管系统,在血管收缩等生理过程中发挥着至关重要的作用。G蛋白信号调节蛋白（regulators of G protein signaling,RGS）通过结合活化的Gα亚基,加速三磷酸鸟苷（guanosinetriphosphate,GTP）的水解,负向调控GPCRs信号通路。已知RGS蛋白参与神经系统、心血管系统的生理病理过程以及肿瘤的发生发展。心血管系统中许多负责血管收缩的GPCRs都与Gαq亚基耦合,Gαq是G蛋白家族Gq/11的成员。目前在哺乳动物中发现了至少30个RGS蛋白,其中有一半以上对Gαq表现出GTP酶活化蛋白（GTPase-activating protein,GAP）活性,因此有可能影响血管张力。RGS蛋白家族的3个成员:RGS2、RGS4和RGS5,是在心脏和血管中高度表达的蛋白,且编码这三种蛋白的基因均位于人和小鼠的1号染色体上与血压变异相关的区域。已知RGS2的缺失可增强血管紧张素受体诱导的G蛋白激活,从而导致血压增高。RGS4和RGS5是心肌肥厚和心肌纤维化的关键抑制蛋白。最近发现RGS5可以防止VSMCs的增殖和减弱新生内膜的形成。由于RGS蛋白是GPCRs信号通路的重要调控因子,RGS蛋白上游调节机制的研究至关重要,然而调控RGS表达的机制还有待进一步研究。已知基因表达调控发生在转录和转录后多个水平,我们主要研究mRNA的稳定性。人类抗原R（human antigen R,HuR）是胚胎致死视觉异常（embryonic lethal abnormal vision,ELAV）家族的成员,它普遍表达于真核生物的多种细胞并且参与机体许多生理和疾病病理过程。HuR通过高亲和性和选择性结合靶基因mRNA上富含腺嘌呤（A）和尿嘧啶（U）的元件（AU-rich elements,AREs）,增加mRNA的稳定性,从而增加其蛋白的表达。HuR可通过稳定多种编码生长因子和凋亡因子的mRNA,参与调节细胞周期、细胞存活和凋亡等生理过程。此外,HuR也参与许多疾病的病理过程,其中研究最为广泛的是HuR与肿瘤的关系。HuR在口腔肿瘤、胃癌、结直肠癌、肺癌、乳腺癌和皮肤癌中高度表达,与肿瘤发生发展及预后相关。HuR还涉及慢性炎症、心血管系统、神经系统和肌肉系统的病理生理过程。有文献报道HuR与心肌梗死、心肌纤维化相关,但HuR在心血管疾病中的作用机制尚不明确。为了研究HuR在VSMCs中的潜在作用,我们构建了平滑肌特异性敲除HuR小鼠。前期研究发现,平滑肌特异性敲除HuR可以导致小鼠出现高血压和心肌肥厚。于是我们检测了肠系膜动脉在血管活性药物刺激后的收缩反应,发现平滑肌HuR的缺失使肠系膜动脉的收缩增强。由于RGS蛋白在GPCRs介导的血管收缩中起了重要的作用,并且我们发现RGS基因的3’-非翻译区（untranslated regions,UTR）具有与HuR结合的AREs。因此,本研究提出如下假说:小鼠平滑肌特异性敲除HuR后,通过下调RGS蛋白,进而增加GPCRs介导的肠系膜动脉VSMCs收缩,导致外周阻力增加和血压升高。本研究将应用α-SMA-Cre/loxp系统构建平滑肌特异性HuR敲除小鼠,探究HuR在高血压和血管平滑肌收缩中的作用及机制,为临床上高血压的诊断和治疗提供新思路及新方法。研究目的:1.探讨平滑肌HuR在高血压中的作用2.探究平滑肌HuR在血管收缩中的作用及机制。研究方法:1.实验动物1.1.动物模型的构建:应用α-SMA-Cre/loxp系统构建平滑肌特异性HuR敲除（smooth muscle-specific HuR knockout,HuRSMKO）小鼠。1.2.自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHRs）与 Wistar 大鼠:10周龄约270-300g的雄性SHRs和Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。2.实验细胞2.1.小鼠平滑肌细胞系:购于美国ATCC公司。2.2.小鼠主动脉平滑肌原代细胞:分离4～6周CTR和HuRSMKO小鼠的胸主动脉,用贴块法提取原代平滑肌细胞。3.临床标本收集血管标本来自患有冠心病且需要手术切除部分血管的高血压和非高血压患者的血管组织,人体组织的使用经过山东大学齐鲁医院科研伦理委员会的审核批准。4.鉴定平滑肌特异性HuR敲除小鼠的敲除效率和组织特异性利用组织基因组DNA提取试剂盒提取鼠尾DNA,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增 HuR 和Cre 序列,2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。分离小鼠主动脉和肠系膜动脉进行蛋白免疫印迹实验（western blot）、免疫荧光、免疫组织化学染色用于检测HuR的表达水平。为了确定组织特异性,提取小鼠脑、心脏、肝脏、骨骼肌和脂肪组织进行western blot,检测HuR表达水平。5.探究平滑肌细胞敲除HuR对小鼠表型的影响监测小鼠体重、心率;采用小动物无创血压测量仪测量不同月龄以及不同性别的对照（control,CTR）和HuRSMKO小鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压。6.研究平滑肌HuR的缺失对心肌肥厚的影响采用超声测定CTR和HuRSMKO小鼠的射血分数、短轴收缩率、室间隔厚度、左室容积、二尖瓣内舒张早期血流速度与舒张早期峰值速度之比以及左室质量;测量小鼠的心脏重量与胫骨长度的比值;测量小鼠的心脏重量与体重的比值;心脏石蜡切片进行苏木素&伊红（haematoxylin and eosin,H&E）染色比较小鼠心脏大小;小鼠血管组织石蜡切片进行H&E染色以及免疫组化染色检测α-SMA用于观察比较血管中膜厚度。7.探究高血压患者和SHRs主动脉中HuR表达正常血压和高血压患者主动脉石蜡切片进行免疫组织化学染色检测HuR的表达;测量大鼠血压;Western blot分析Wistar大鼠和SHRs主动脉中HuR蛋白的表达。8.明确过表达HuR对HuRSMKO小鼠和SHRs的血压影响在小鼠尾静脉注射表达绿色荧光蛋白（green florescence protein,GFP）的对照病毒或HuR腺病毒,连续监测血压一周。取过表达GFP或HuR的小鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和Western blot检测HuR的表达水平;同样在Wistar大鼠和SHRs尾静脉注射GFP或HuR腺病毒,连续监测血压一周。取注射腺病毒一周后的大鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和western blot检测HuR的表达水平。9.探究HuR对外周血管收缩的影响取CTR和HuRSMKO小鼠肠系膜动脉二级血管,用去甲肾上腺素（norepinephrine,NE）、内皮素（endothelin-1,ET-1）、U46619 和血管紧张素 Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）刺激,检测肠系膜动脉对血管收缩药物的反应。10.探讨HuR对RGS蛋白的调节作用RNA免疫共沉淀实验验证HuR能否与RGS mRNA直接结合;半衰期实验明确平滑肌细胞过表达HuR是否影响RGS mRNA的稳定性。分离CTR和HuRSMKO小鼠的主动脉提取RNA和蛋白,实时定量PCR（RT-PCR）和western blot检测RGS2、RGS4和RGS5的表达水平。免疫组化检测小鼠主动脉平滑肌HuR与RGS2、RGS4和RGS5蛋白的表达。11.研究HuR对GPCRs介导的细胞内Ca2+的增加的调控作用用苯肾上腺素（phenylephrine,PE）刺激CTR和HuRSMKO小鼠原代平滑肌细胞,用Ca2+指示剂Fluo-4 AM检测细胞内Ca2+变化。在CTR和HuRSMKO小鼠原代平滑肌细胞中分别过表达RGS2、RGS4或RGS5,同样用PE刺激检测Ca2+变化。12.探究外源性RGS2和RGS5对HuRSMKO小鼠血压的影响在CTR和HuRSMKO小鼠尾静脉注射表达RGS2或RGS5的腺病毒,连续监测血压一周。取过表达RGS2或RGS5的CTR和HuRSMKO小鼠主动脉和肠系膜动脉进行免疫组化染色和western blot检测RGS2或RGS5的表达水平。13.研究过表达HuR对RGS2、RGS4、RGS5蛋白表达的影响在CTR和HuRSMKO小鼠尾静脉注射表达GFP或HuR的腺病毒,分离小鼠的肠系膜动脉进行western blot检测RGS2、RGS4、RGS5蛋白水平。14.统计分析所有数据采用均数±标准误表示。数据分析采用GraphPad Prism 6.0和SPSS 23.0（IBM软件）。所有数据都通过了正态分布和方差齐性检验。两组间均数比较采用独立样本t检验。两组连续血压变化比较采用重复测量方差分析。定义P<0.05为数据差异有统计学意义。研究结果:1.平滑肌特异性HuR敲除小鼠的构建我们将HuRflox/flox小鼠与α-SMA-Cre转基因小鼠杂交,最终获得HuRflox/floxα-SMA-Cre+小鼠,将该小鼠简称为HuRSMKO小鼠。而同窝出生的HuRflox/flox/α-SMA-Cre-小鼠作为对照,简称为CTR小鼠。我们分离了 CTR和HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉用于免疫荧光染色,检测HuR和α-SMA的表达。结果显示,HuRSMKO小鼠肠系膜动脉平滑肌层几乎没有HuR的表达。Western blot实验结果证明:HuRSMKO小鼠的主动脉和肠系膜动脉中HuR蛋白水平明显降低。CTR和HuRSMKO小鼠的脑、肝脏、心脏、骨骼肌和脂肪组织中HuR的蛋白水平没有明显差异。以上结果表明,HuRSMKO小鼠血管平滑肌中HuR的敲除效果显着,且具有明显的平滑肌特异性。2.HuRSMKO小鼠在3月龄后表现出血压升高和心肌肥厚CTR和HuRSMKO小鼠的体重和心率在2月龄和4月龄时均没有显着差异。2月龄的CTR和HuRSMKO小鼠的血压并没有表现出明显差异,然而从3月龄开始,HuRSMKO小鼠出现较为明显的血压升高。超声心动图显示3月龄的雄性HuRSMKO小鼠的左室质量和室间隔厚度增加。与CTR小鼠相比,3月龄的HuRSMKO小鼠的心脏重量与胫骨长度的比值以及心脏重量与体重的比值增大。H&E染色结果显示,3月龄的HuRSMKO小鼠与CTR小鼠相比心脏增大。而2月龄CTR和HuRSMKO小鼠的心脏形态和功能均没有显着差异。CTR和HuRSMKO小鼠主动脉的H&E染色和免疫组化检测α-SMA的结果证明:HuR的敲除没有影响血管中层厚度。以上结果表明血管平滑肌敲除HuR可导致血压升高和心肌肥厚。3.过表达HuR可以降低HuRSMKO小鼠和SHRs的高血压与正常血压者相比,高血压患者主动脉组织中HuR的表达水平降低。与血压正常的Wistar大鼠相比,具有稳定遗传性高血压的SHRs主动脉中HuR蛋白水平也明显降低。过表达HuR后,HuRSMKO小鼠和SHRs的血压下降。4.HuR的缺失使血管平滑肌的收缩反应增强NE、Ang Ⅱ、U46619（一种血栓素类似物）和ET-1刺激后,HuRSMKO的肠系膜动脉段与CTR相比收缩更为明显。我们进一步研究了小鼠肠系膜动脉对NE的剂量反应,在10、30和100μM的NE刺激时,HuR缺失的肠系膜动脉收缩反应明显大于CTR肠系膜动脉。然而,CTR和HuRSMKO的肠系膜动脉对124mM KCl刺激的收缩反应没有显着差异。以上结果证实HuR的缺失增强了小鼠肠系膜动脉对血管收缩剂的反应,而且HuR对血管收缩的调节可能是通过GPCRs通路而非细胞膜电位去极化。5.RGS2、RGS4和RGS5是HuR的靶基因RNA免疫共沉淀实验结果显示,HuR能与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合。RNA稳定性实验结果证明,与对照GFP相比,过表达HuR增加了 RGS2、RGS4和RGS5 mRNA的半衰期。我们还提取了 CTR和HuRSMKO小鼠主动脉平滑肌RNA进行RT-PCR。结果显示:HuR缺失导致RGS2、RGS4和RGS5 mRNA水平显着降低。Western blot和免疫组化染色结果显示,与CTR小鼠主动脉相比,HuRSMKO小鼠主动脉中RGS2、RGS4和RGS5蛋白水平显着降低。综上所述,HuR可以与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合并增加其稳定性,从而增加RGS2、RGS4和RGS5蛋白的表达。高血压患者主动脉平滑肌中RGS4、RGS5的蛋白表达降低,但RGS2蛋白表达反而增高。而SHRs主动脉平滑肌中RGS2和RGS4的蛋白水平降低,而RGS5的蛋白表达增高。这表明:高血压的发病机制非常复杂,RGS蛋白表达除了受HuR调控外,还受其他蛋白的调控。6.HuR是通过RGS抑制GPCRs介导的细胞内钙离子增加绿色荧光钙指示剂Fluo-4 AM孵育原代VSMCs30分钟后,加入1mM的PE刺激,通过绿色荧光变化观察细胞内Ca2+含量的变化。PE刺激后,不论对照还是HuR缺失的VSMCs均出现细胞内Ca2+的短暂增加。与对照相比,HuR缺失的VSMCs的荧光强度和增长幅度更大。而过表达RGS2、RGS4或RGS5明显降低了 HuRSMKO细胞中PE诱导的Ca2+增加。综上所述,HuR是通过RGS抑制GPCRs介导的细胞内Ca2+增加。7.RGS2和RGS5可以降低HuRSMKO小鼠的高血压过表达RGS2或RGS5使HuRSMKO小鼠的收缩压明显降低。免疫组化染色和western blot结果显示,在尾静脉注射相应腺病毒后HuRSMKO小鼠主动脉和肠系膜动脉平滑肌中RGS2或RGS5蛋白水平升高到野生型水平。我们发现HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉中不仅HuR蛋白水平可以通过HuR腺病毒升高到野生型水平,RGS2、RGS4和RGS5的蛋白与没注射HuR腺病毒的HuRSMKO小鼠肠系膜动脉相比也恢复到生理水平。研究结论:1.平滑肌敲除HuR导致小鼠出现明显的高血压和心肌肥厚;2.平滑肌HuR的缺失使血管平滑肌收缩增加;3.机制上,HuR与RGS2、RGS4和RGS5 mRNA结合并增加其稳定性,从而增加RGS2、RGS4和RGS5蛋白表达,负向调控GPCRs介导的细胞内钙离子增加;4.外源性HuR和RGS2、RGS5可以降低HuRSMKO小鼠的高血压。研究背景:动脉粥样硬化是冠状动脉、外周动脉和脑血管疾病最常见的病理基础。目前研究认为动脉粥样硬化起始于高脂血症、高血压等心血管危险因素引起的内皮功能障碍和血管炎症。血液中的脂蛋白从受损的内皮细胞进入动脉壁,炎症因子刺激巨嗤细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）吞嗤氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,ox-LDL）形成泡沫细胞并堆积于血管内膜。脂质代谢紊乱、炎症和内皮损伤在动脉粥样硬化中起着重要作用。VSMCs作为构成血管壁的主要细胞参与了动脉粥样硬化的进程。正常动脉中层的VSMCs是高度分化和静止的,但与骨骼肌和心肌细胞相比,它们保留了去分化潜能和可塑性,可以从收缩表型转变为合成表型。病理状态下,VSMCs发生表型转换,増殖迁移进入血管内膜参与泡沫细胞的形成。VSMCs还可以分泌大量细胞外基质,形成纤维帽,在动脉粥样硬化早期防止斑块破裂。VSMCs的死亡和衰老不仅参与动脉粥样硬化斑块的形成,而且还促进晚期斑块的不稳定性。越来越多研究开始关注VSMCs在动脉粥样硬化中的作用,但具体机制尚不明确。自噬是真核生物细胞生存和细胞器质量控制的关键步骤,它通过降解大分子、蛋白质和细胞器,并回收分解产物,进行物质与能量循环。自噬体的成核、扩张以及与溶酶体的融合、降解产物的转运需要多种自噬相关基因（autophagy-relatedgenes,ATGs）编码的蛋白参与。目前,在酵母基因中己鉴定出超过30种不同的ATGs,其中大多数基因在黏菌、植物、瞒虫、苍蝇和哺乳动物中高度保守。有许多研究证明自噬在心血管疾病中的重要作用,如自噬对心肌细胞轻度缺血具有保护性作用,自噬还参与心肌肥厚和心衰的发展过程。近年来,自噬与动脉粥样硬化的关系也备受关注。巨噬细胞中ATG5具有抗动脉粥样硬化作用,平滑肌特异性敲除ATG7可促进动脉粥样硬化,内皮细胞ATG5和ATG7的缺失也可导致动脉粥样硬化斑块的形成。然而自噬在动脉粥样硬化中的作用以及调节机制复杂,有待进一步研究。腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）是调节细胞代谢和能量稳态的关键蛋白。AMPK是由一个催化亚基和两个调节亚基组成的异源三聚体。AMPK的亚基都有多种亚型,不同的亚型组成影响AMPK的定位和功能。最近的研究表明,AMPK能够在酵母细胞和哺乳动物细胞中参与自噬的调节。AMPK可以直接磷酸化并激活ATG1同源物ULK1来诱导自噬。AMPK还可以通过抑制雷帕霉素靶蛋白（mammalian TargetofRapamycin,mTOR）活性,从而间接激活自唾。除此之外,AMPK还能磷酸化自噬通路核心蛋白如ATG9、Beclinl、VPS34和RACK1等来调控自噬。因此AMPK的调控在自噬和自噬相关疾病的研究中至关重要。目前关于AMPK各亚基表达的调控机制尚不清楚,需要进一步研究。基因表达的调控发生在转录和转录后等多个水平,人类抗原R（human antigen R,HuR）作为一种RNA结合蛋白,可与靶基因mRNA结合发挥转录后调控作用[25,26]。已知高血压是动脉粥样硬化的危险因素之一,我们的研究发现平滑肌HuR的缺失可引起血压增高,于是我们用平滑肌特异性的HuR敲除（HuRSMKG）小鼠构建动脉粥样硬化模型进一步探究平滑肌HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。前期研究中,我们发现HuRSMKG小鼠的动脉粥样硬化斑块面积与CTR小鼠相比明显增加,且HuR的缺失可导致自噬缺陷。由于AMPK参与了自噬的多个过程,并且我们发现AMPKal和AMPKa2 mRNA的3’-非翻译区（untranslated region,UTR）上有与HuR的结合位点。因此,本研究提出如下假说:小鼠平滑肌特异性敲除HuR后,通过下调AMPKal和AMPKot2蛋白,进而引起自噬缺陷,促进动脉粥样硬化。我们的研究为动脉粥样硬化的诊断和治疗提供了新思路。研究目的:1.探讨平滑肌HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。2.研究平滑肌HuR在自噬中的调控机制。研究方法:1.实验动物:1.1.平滑肌特异性敲除HuR小鼠动脉粥样硬化模型的构建:平滑肌特异性HuR敲除（HuRSMKQ）小鼠的构建如前述。8周龄雄性CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉单次注射表达D377Y突变的前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9的腺相关病毒（rAAV/D377Y-mPCSK9）,每只小鼠注射量1.5xl〇n vg,Paigen词料喂养12周后进行后续实验。1.2.载脂蛋白E（apolipoproteinE,ApoE）基因敲除小鼠:8周龄雄性ApoE—小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。ApoE^小鼠分为正常词料组（normal diet,ND）和高脂词料组（high fat diet,HFD）进行喂养。2.实验细胞:2.1.小鼠平滑肌细胞系:购于美国ATCC公司。2.2.小鼠主动脉平滑肌原代细胞:提取4?6周CTR与HuRSMK(M、鼠的胸主动脉平滑肌细胞。3.研究动脉粥样硬化斑块中HuR的表达:ApoE（?）小鼠分别给予ND和HFD喂养12周后,分离其主动脉并提取RNA和蛋白,RT-PCR和western blot检测HuR表达;将ND组和HFD组小鼠主动脉石蜡切片进行免疫组化染色确定动脉粥样斑块中HuR蛋白表达;ox-LDL刺激VSMCs后提取细胞蛋白进行western blot检测HuR表达。4.探究HuR对动脉粥样硬化的影响:注射rAAV/D377Y-mPCSK9后的CTR与HuRSMKG小鼠在Paigen饲料喂养12周后取血、分离主动脉和心脏。血液离心后取血清检测总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三醋（trig丨ycerides,TG）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol,LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cho丨esterol,HDL-C）;主动脉大体油红0染色以及主动脉根部冰冻切片油红O染色观察粥样硬化斑块面积;主动脉根部冰冻切片MOMA-2、a-SMA免疫组化检测巨噬细胞、平滑肌细胞含量;Masson染色检测胶原含量;主动脉根部冰冻切片TUNEL、a-SMA免疫荧光以及cleaved-caspase3免疫组化染色检测凋亡;主动脉提取蛋白检测MMP2和cleaved-caspase3的表达;计算斑块易损指数,公式如下:（脂质含量百分比+巨嗟细胞含量百分比）/（平滑肌细胞含量百分比+胶原含量百分比）。5.探究HuR对自睡的影响:电镜观察对照和过表达HuR的VSMCs中自噬体数量;VSMCs过表达或敲低HuR后,用GFP-mRFP-LC3II腺病毒感染VSMCs,通过绿色和红色荧光变化观察自噬体和自噬溶酶体数量。6.探究HuR对AMPKal和AMPKa2的调节作用:RNA免疫共沉淀实验明确HuR能否与AMPKal和AMPKa2 mRNA直接结合;半衰期实验观察VSMCs过表达或敲低HuR是否影响AMPKal和AMPKa2mRNA的稳定性。VSMCs过表达或抑制HuR后提取细胞蛋白进行western blot检测AMPKal和AMPKa2的表达;分离CTR和HuRSMKG小鼠的主动脉提取RNA和蛋白,RT-PCR和western blot检测AMPKal和AMPKa2的表达。免疫组化染色检测小鼠主动脉平滑肌AMPKal和AMPKct2的蛋白表达。7.探究HuR对自噬相关蛋白的调节作用:VSMCs过表达或抑制HuR后提取细胞蛋白进行western blot检测pAMPKa、P62和LC3II的表达;分离CTR和HuRSMKQ小鼠的主动脉提取组织蛋白进行western blot检测p-AMPKa、P62和LC3II的表达。VSMCs过表达或抑制HuR后,ox-LDL刺激VSMCs检测AMPKa和LC3II的表达。8.研究激活AMPK对自噬和动脉粥样硬化的影响:VSMCs敲低HuR后,用AMPK激动剂A769662刺激细胞,western blot检测p-AMPK和LC3II的表达;CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉注射rAAWD377YmPCSK9后Paigen饲料喂养并每日腹腔注射30mg/kg的A769662,12周后观察斑块面积、血脂及凋亡细胞数量变化。9.统计分析:数据采用均数±标准误表示,数据分析使用GmphPad Prism 6.0软件。所有数据均经过正态分布和方差齐性检验。两组间比较采用独立样本/检验,多组间两两比较采用单因素方差分析。P<〇.〇5为差异有统计学意义。研究结果:1.动脉粥样硬化斑块中HuR表达减少我们将ApoE（?）小鼠分为两组,分别给予ND和HFD喂养12周。Western blot结果显示HFD组主动脉中HuR蛋白表达减少。免疫组化染色结果显示,与ND组相比,HFD组动脉粥样硬化斑块中HuR蛋白表达减少。RT-PCR结果显示HFD组主动脉HuR mRNA水平显着降低。我们用ox-LDL刺激VSMCs并且在不同的时间提取细胞蛋白,western blot结果显示:在24、48、72和96小时oxLDL刺激后,VSMCs中的HuR蛋白表达水平下降。我们利用HuRs小鼠进一步研究HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制。Western blot和免疫荧光结果证实HuRSMK(M、鼠主动脉平滑肌中HuR蛋白表达降低。2.平滑肌HuR的缺失促进动脉粥样硬化CTR和HuRSMKG小鼠尾静脉单次注射rAAV/D377Y-mPCSK9并给予paigen词料喂养用来构建动脉粥样硬化模型。油红0染色结果说明:与CTR相比,HuRs小鼠的主动脉和主动脉根部粥样硬化斑块面积显着增加。免疫组化染色检测巨噬细胞标志物M0MA-2的表达,结果提示:HuR的缺失使主动脉根部巨噬细胞浸润增加。然而全血细胞流式结果显示CTR与HuRs小鼠总体单核细胞含量没有明显差异。Masson染色结果说明:平滑肌细胞HuR的敲除降低了小鼠主动脉根部的胶原含量。CTR与HuRSMKG小鼠主动脉根部的VSMCs含量无显着差异。HuRSMKQ小鼠的斑块易损指数增加且HuRSMKQ小鼠主动脉MMP2蛋白表达增加,这可能导致斑块的不稳定性增加。综上所述,平滑肌HuR的缺失促进动脉粥样硬化。3.HuR的敲除増加了平滑肌细胞死亡主动脉根部冰冻切片进行TUNEL和a-SMA的荧光染色结果显示:与CTR相比,HuRSMKG小鼠主动脉根部TUNEL阳性VSMCs数量増加。同时,免疫组化染色结果表明:HuRSMKQ小鼠主动脉根部凋亡相关蛋白cleaved-caspase3的表达增加。此外,我们提取原代平滑肌细胞蛋白进行western blot,结果显示HuR敲除的VSMCs中cleaved-caspase3表达水平升高。因此,我们认为HuR的缺失导致动脉粥样硬化中平滑肌细胞凋亡增加。我们还检测了CTR与HuRSMKG小鼠的血脂水平,HuRSMKCM、鼠血清TC、TG、LDL-C水平高于CTR小鼠。4.HuR的缺失导致了自应缺陷VSMCs感染对照LacZ或HuR腺病毒48小时后,使用透射电镜观察自噬体。结果显示:过表达HuR增加了自噬体的数量。根据荧光蛋白GFP和mRFP对PH值的敏感性不同,我们利用GFP-mRFP-LC3II腺病毒感染VSMCs,48h后通过荧光变化来观察VSMCs中自噬体和自噬溶酶体含量。结果显示:过表达HuR的VSMCs中GFP+/RFP+和GFP/RFP+的点状荧光数目增加。然而,HuR缺失的VSMCs中GFP+/RFP+和GFP/RFP+的点状荧光数目减少。综上所述,HuR过表达可增加自噬通量,相反HuR的缺失可导致自噬缺陷。5.AMPKal和AMPKa2是HuR的班基因RT-PCR结果显示,HuRSMKG小鼠主动脉中AMPKal和AMPKa2 mRNA水平降低。为了检测AMPKal和AMPKa2是否为HuR的靶基因,我们进行了RNA免疫共沉淀实验,结果证实HuR可直接与AMPKal和AMPKa2 mRNA结合。稳定性实验结果显示:当过表达HuR时,AMPKal和AMPKa2 mRNA的稳定性增加。相反,敲低HuR时,AMPKal和AMPKa2 mRNA的稳定性下降。HuR抑制剂CMLD-2或HuR siRNA降低VSMCs中HuR表达水平后,AMPKal和AMPKa2的蛋白表达也随之减少。相反,通过HuR腺病毒或HuR重组蛋白使VSMCs过表达HuR,AMPKal和AMPKa2的蛋白水平升高。Western blot和免疫组化染色结果显示,CTR与HuRSMKG小鼠主动脉中AMPKal和AMPKa2蛋白表达减少。因此,我们得出结论:AMPKal和AMPKa2是HuR的靶基因。6.HuR正向调控自噬CMLD-2或HuR siRNA抑制VSMCs中HuR表达后,p-AMPKa和LC3II的蛋白水平降低,而P62的蛋白表达增加。相反,过表达HuR后,VSMCs中的pAMPKa和LC3II的蛋白表达增加,但P62的蛋白水平降低。除此之外,与CTR小鼠相比,HuRSMKCM、鼠主动脉中的p-AMPKa和LC3II蛋白水平降低,P62的蛋白水平升高。在敲低或过表达HuR后,ox-LDL刺激VSMCs的western blot结果进一步证实了HuR对AMPKa和LC3II表达的影响。综上,我们认为HuR正向调节自噬。7.AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化VSMCs转染CTR siRNA或HuR siRNA后,用200 fiM AMPK激活剂A769662处理细胞。在对照和HuR缺失的VSMCs中,A769662使p-AMPKa和LC3II蛋白表达增加。CTR和HuRSMK（）小鼠在单次静脉注射rAAV/D377YmPCSK9后,每天腹腔注射30mg/kg的A769662并给予paigen饲料喂养12周。油红0染色结果显示,A769662处理后,CTR和HuRSMKG小鼠主动脉和主动脉根部的粥样硬化斑块面积显着减少。同时,凋亡细胞数量也明显减少,并且血清TC和LDL-C水平略有降低。我们得出结论:AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化。研究结论:1.动脉粥样硬化斑块中HuR表达降低;2.平滑肌敲除HuR促进小鼠动脉粥样硬化;3.平滑肌HuR的缺失引起自噬缺陷;4.AMPKal和AMPKa2是HuR的靶基因;5.AMPK的激活可抑制CTR和HuRSMKO小鼠的动脉粥样硬化。
张艳达[2]（2021）在《冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究》文中研究说明冠脉微循环障碍（Coronary microvascular dysfunction,CMD）在非阻塞性冠心病发病中起重要作用,也是其起病的重要机制,CMD引起的心血管事件严重影响患者的生活质量,疾病负担严重,已成为当前临床迫切需要解决的问题。作为临床上诊断相对容易的原发性CMD类型之一,冠脉慢血流现象（Coronary slow flow phenomenon,CSFP）是本课题的重点关注对象,纳入相关患者进行临床研究;脂肪乳输注诱导的小鼠CMD模型和棕榈酸（Palmitic acid,PA）干预的小鼠心脏微血管内皮细胞将被用于探究冠脉慢血流微循环障碍发病的深层机制。本课题将从临床到基础多层面探讨冠脉慢血流微循环障碍的可能发病机制和有效干预手段,为CMD的临床干预提供理论支撑。实验目的:对冠脉慢血流患者和对照组患者的外周血白细胞,进行全转录组测序和单细胞测序分析;比较两组患者的血浆生化指标,发现CSFP患者发病特点与规律。通过模拟CSFP患者临床特点诱导小鼠CMD模型、干预小鼠心脏微血管内皮细胞,探究脂肪乳输注诱导冠脉微血管功能障碍的深层机制。研究方法:1、冠脉慢血流患者白细胞全转录组及单细胞测序分析:对照组患者（n=28）和慢血流组患者（n=28）均来源于上海长征医院心内科2017年7月至2019年7月入院且行冠脉造影的患者。留取对照组和慢血流组患者血浆和白细胞,并收集患者低密度脂蛋白、甘油三酯、高密度脂蛋白和血压等临床化验检查结果。对冠脉慢血流组和对照组病人的外周血白细胞进行全转录组测序和单细胞测序分析。最后通过ELISA测定两组患者血浆中e NOS和s LOX-1水平,借助酶标仪测定血浆游离脂肪酸（Free fatty acids,FFAs）浓度。2、静脉输注脂肪乳诱导小鼠CMD模型及尼可地尔对CMD小鼠的改善作用:选取6周至8周C57雄性小鼠（20±2g）30只,随机分为假手术对照组（Control组）、CMD模型组（静脉输注脂肪乳诱导）（Model组）和模型联合尼可地尔干预组（Model+Nico组）。予以Control组小鼠输注生理盐水（0.1 m L/h）,路径为颈静脉,时间为6小时;予以Model组和Model+Nico组小鼠输注脂肪乳(20%Intralipid○R)和肝素（20 U/m L）混合溶剂（0.1 m L/h）,路径及输注时间同Control组。通过无创超声多普勒血流仪测定小鼠冠脉血流储备评估小鼠冠脉微循环功能和状态;通过Transdermal GFR Monitor检测小鼠肾小球滤过率改变;通过BX51显微镜评估小鼠提睾肌微循环血流状态,分析并记录提睾肌微血管的血流速度、白细胞粘附数量、白细胞滚动速度等微循环血流动力学指标。通过电镜分析小鼠心肌组织、肾脏组织超微结构,评估脂肪乳输注对小鼠心肌细胞、肾脏足细胞、心肌微血管和缝隙连接的影响。留取小鼠血浆,测定FFAs、IFN-γ、IL-1β、IL-6、NO、SOD和TNF-α浓度;留取小鼠外周血白细胞,进行定量PCR分析、ROS检测和流式分析等;留取小鼠心肌组织进行定量PCR、免疫组化和Western Blot明确AMPK-KLF2-e NOS信号通路的表达改变情况。3、脂肪乳输注诱导小鼠CMD的可能机制:通过密度梯度离心法分离获取小鼠外周血中性粒细胞,探究脂肪乳输注诱导中性粒细胞外网状陷阱释放。最后,在体验证中性粒细胞外网状陷阱消除对小鼠提睾肌白细胞粘附的影响。体外培养小鼠心脏微血管内皮细胞,建立PA干预细胞的浓度和时间梯度,通过CCK-8试剂盒和ROS检测试剂盒评估PA不同干预浓度和时间下小鼠微血管内皮细胞活力和心脏微血管内皮细胞氧化应激水平。通过Western Blot测定PA不同干预浓度或干预时间下小鼠心脏微血管内皮细胞AMPK-KLF2-e NOS信号通路表达改变。分别用AICAR、KLF2过表达质粒和尼可地尔干预心脏微血管内皮细胞,测定AMPK-KLF2-e NOS信号通路改变,探究AMPK激活、KLF2过表达或NO浓度升高时微血管内皮细胞活力和氧化应激水平,并验证AMPK激活对模型小鼠冠脉微循环障碍的影响。实验结果:1、人外周血白细胞全转录组测序分析发现,慢血流组共92个m RNA表达升高,共有129个m RNA表达降低,这些基因与脂类代谢、细胞粘附等生物过程密切相关。慢血流组上调lnc RNA共计738个,下调的共计472个。慢血流组上调circ RNA共计117个,下调的共计29个。单细胞转录组测序分析发现慢血流组调控生物粘附、抗氧化、免疫反应和代谢等生物过程的基因表达均发生了改变。与对照组相比,冠脉慢血流组血浆e NOS浓度降低,血浆FFAs、s LOX-1浓度升高（P<0.05）。冠脉慢血流组患者脂类代谢异常、血浆游离脂肪酸浓度升高和血管内皮功能障碍可能与冠脉微循环障碍的发生、发展相关。2、与Control组相比,Model组小鼠冠脉血流储备、肾小球滤过率显着降低,同时伴有提睾肌微小血管管壁白细胞粘附数量增加、滚动速度降低,外周血白细胞表面CD11b表达升高,白细胞KLF2 m RNA表达水平降低,ROS含量增高（P<0.05）。电镜分析提示Model组小鼠微血管内皮肿胀、心肌细胞缝隙连接断裂、足细胞足突融合。脂肪乳输注引起小鼠血浆FFAs、TNF-α和IL-6浓度升高。尼可地尔可显着改善脂肪乳静脉输注引起的小鼠冠脉血流储备和肾小球滤过率降低、提睾肌微血管内白细胞滚动速度降低、ROS和炎症因子产生增多,降低粘附于提睾肌微小血管管壁上的白细胞数量,下调外周血白细胞表面粘附分子CD11b的表达（P<0.05）。与Control组相比,Model组小鼠心肌组织AMPK-KLF2-e NOS通路抑制,而尼可地尔干预则可上调心肌组织e NOS的表达,升高NO浓度（P<0.05）。静脉输注脂肪乳可诱导小鼠CMD,其机制可能涉及AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制,而尼可地尔可能通过升高NO浓度来发挥改善CMD的作用。3、中性粒细胞外网状陷阱产生在脂肪乳诱导的微循环障碍中起着重要作用,中性粒细胞外网状陷阱清除可以降低提睾肌小血管壁白细胞粘附数量（P<0.05）。PA诱导的小鼠心脏微血管内皮细胞活力降低、氧化应激水平升高和AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制存在明显浓度和时间依赖。AMPK激活、KLF2过表达和e NOS激活都可以减轻棕榈酸引起的AMPK-KLF2-e NOS信号通路的抑制,改善细胞活力和氧化应激水平（P<0.05）。AMPK激活还可以改善CMD模型小鼠冠脉血流储备,减少提睾肌微小血管内白细胞粘附数量（P<0.05）。研究结论:全转录组和单细胞转录组测序分析发现慢血流患者外周血白细胞中与脂类代谢、抗氧化和粘附等相关的基因表达发生显着改变,且其血浆FFAs、s LOX-1浓度升高,血浆e NOS含量降低,提示脂肪酸代谢异常、白细胞粘附、内皮功能障碍可能与冠脉慢血流微循环障碍发病密切相关。升高FFAs浓度可以诱发小鼠CMD,其机制可能为AMPK-KLF2-e NOS信号通路抑制。升高NO浓度可通过减少炎症因子释放、降低细胞内ROS产生和抑制中性粒细胞外网状陷阱形成等来发挥其改善CMD作用。
王倩雯[3]（2021）在《滋肾固本法针刺改善乳腺癌内分泌治疗患者潮热的临床对照研究》文中研究表明目的:1.观察滋肾固本法针刺改善乳腺癌内分泌治疗患者潮热的有效性;2.探索滋肾固本法针刺对乳腺癌内分泌治疗患者的肾阴虚症候、生活质量及围绝经期症状的影响。研究方法:将40例符合纳入标准的乳腺癌潮热患者随机分为治疗组和对照组,两组患者各20例,对照组予以常规护理治疗,治疗组在对照组的基础上加以滋肾固本法针刺治疗。研究周期为10周,在入组时、治疗第5周、治疗第10周要求两组患者填写潮热日记;在入组时、治疗10周要求患者填写肾阴虚症候量表、乳腺癌功能评估量表（FACT-B）、癌症治疗-内分泌亚量表（FACT-ES）。研究结束后,对所有量表积分统计分析,进行疗效评价。记录治疗期间出现的不良反应。结果:1.潮热次数及严重程度:治疗5周后,两组治疗前后组内比较发现,潮热次数以及潮热严重程度均有改善;组间比较发现,两组在降低潮热发作次数及程度上疗效相当（P>0.05）。治疗10周后,两组治疗前后组内比较发现,潮热次数及潮热严重程度上均有改善;组间比较发现,治疗组疗效明显优于对照组（P<0.05）,滋肾固本法针刺治疗有明显优势。2.肾阴虚症候:治疗10周后,组内比较发现,两组患者肾阴虚症候总积分均较治疗前下降（P<0.05）,说明两组肾阴虚症候均有改善。治疗组的总有效率为75%,对照组的总有效率仅为40%,说明治疗组的疗效优于对照组,滋肾固本法针刺治疗具有一定优势。其中几个主要症状比较发现,治疗组在改善潮热汗出、腰膝酸软、五心烦热、失眠多梦症状上的疗效优于对照组,失眠多梦症状的改善尤为显着。3.生活质量:治疗10周后,两组治疗前后组内比较发现,各维度积分均有提高（P<0.05）。组间比较发现,治疗组在改善生理状况、社会/家庭状况、情感状况以及附加关注上的疗效优于对照组,滋肾固本法针刺治疗具有优势;而在改善功能状况上两组疗效相当。4.围绝经期症状:治疗10周后,治疗组治疗前后比较发现,阴道症状、体重增加、腹泻、关节痛症状未有改善;对照组治疗前后比较发现,阴道症状、性生活质量、体重增加、眩晕、恶心、腹泻、头痛、关节痛症状未有改善。组间比较发现,治疗组在改善性生活质量、眩晕、恶心、头痛、浑身发胀、（健侧）乳房敏感或触痛、情绪起伏、心情烦躁项目上的疗效优于对照组,滋肾固本法针刺治疗具有优势;两组在阴道症状、体重增加、腹泻及关节痛项目上未起到改善作用。结论:滋肾固本法针刺可以显着改善乳腺癌内分泌治疗患者的潮热症状,除此之外,还可以整体改善肾阴虚症候和缓解部分围绝经期症状,一定程度上提高了乳腺癌内分泌治疗患者的生活质量。
宋晶[4]（2020）在《基于TGF-β1/LIMK1信号通路研究解毒通络方对大鼠心肌纤维化的抑制作用》文中提出目的:以盐酸异丙肾上腺素腹腔注射法复制大鼠心肌纤维化（Myocardial fibrosis,MF）模型,用细胞分子生物学技术和方法,观察TGF-β1/LIMK1信号通路在心肌纤维化过程中的表达情况,观察解毒通络方对TGF-β1/LIMK1信号通路的调控方式及干预MF的作用机制。方法:实验一:50只SD雄性大鼠随机分为5组,正常对照组、3d组、7d组、14d组、28d组,正常对照组给予生理盐水注射,其他组给予异丙肾上腺素腹腔注射5mg.kg-1,分别于3天、3天、7天、14天、28天时,记录大鼠体重并乙醚麻醉状态下迅速取SD大鼠心脏,测量心脏重量后,取出心室部,放入4%多聚甲醛固定液,供组织学HE染色,免疫组化法测α-肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vim）阳性表达面积,取出心尖部迅速置于液氮中保存,分光光度法测羟脯胺酸含量。实验二:根据实验一结果,将60只SD雄性大鼠分为正常对照组、模型组、卡托普利组、中药低、中、高剂量组,正常对照组给予生理盐水注射,其他组给予异丙肾上腺素腹腔注射5mg.kg-1,中药组每日按10g、20g、30g.kg-1灌胃解毒通络方冲剂悬液;卡托普利组每日按5mg.kg-1灌胃卡托普利片悬液;正常对照组每日给予以等体积自来水灌胃。记录大鼠体重后乙醚麻醉状态下迅速取SD大鼠心脏,测量心脏重量计算心重指数;心尖部迅速置于液氮中保存,分光光度法测定羟脯胺酸含量。将心室部,放入4%多聚甲醛固定液,供组织学HE及MAasson染色,免疫组化法测I型胶原蛋白（Col I）、III型胶原蛋（Col III）、α-SMA、Vim、单丝氨酸蛋白激酶（LIMK1）阳性表达面积;眼球采血,收集血清并置于-20℃冰箱,收集的血清进行细胞分组培养。实验三:用提前制备的动物血清分正常对照组、模型组、卡托普利组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组培养成纤维细胞,Western-blot法检测各组成纤维细胞中α-SMA、Vim、ROCK1、LIMK1蛋白相对表达量;实时荧光定量PCR法检测成纤维细胞中TGF-β1、RhoA、ROCK1、LIMK1的mRNA含量;MTT法检测TGF诱导成纤维细胞增殖时相;用TGF刺激成纤维细胞后,实时荧光定量PCR法检测成纤维细胞中RhoA、ROCK1、LIMK1的mRNA含量。结果:实验一:大鼠心肌纤维化模型构建:1.HE染色结果:正常对照组心肌细胞横纹清晰,细胞和大小、间隙一致,胞浆染色清晰,注射异丙肾上腺素后3天、7天、14天、28天大鼠心肌组织细胞均出现细胞排列紊乱,坏死区细胞核固缩,胞浆减少或缺失,结缔组织增生。在3d组这种改变最明显,7d组、14d组相对减轻,28d组有所改善。2.心重指数:与正常对照组比较,3d组心重指数无明显差异,P>0.05。7d组、14d组、28d组心重指数下降,P<0.05。3.羟脯氨酸含量测定:与正常对照组比较,3d组、7d组、14d组、28d组羟脯胺酸含量明显增加,P<0.05,且随时间变化呈递增趋势。4.免疫组化结果:与正常对照组比较,3d组、7d组的大鼠心肌组织中,可见明显α-SMA、Vim蛋白阳性表达,且P<0.05。14d、28d组与正常对照组比较无显着差异P>0.05。实验二:解毒通络方动物体内药效学观察:1.心重指数:应用异丙肾上腺素制备大鼠心肌纤维化模型,采用注射后3天的造模方法。与正常对照组比较,模型组大鼠心重指数无明显增加,且P>0.05,与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组心脏指数无明显改变,且P>0.05。2.羟脯胺酸含量测定结果:与正常对照组比较,模型组羟脯氨酸含量明显增加,P<0.05;与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组羟脯氨酸含量明显下降,且P<0.05。3.HE染色:正常对照组细胞排列整齐,细胞间隙大小均一,胞浆染色均匀,模型组、卡托普利组以及各剂量中药组则出现不同程度的心肌纤维化表现,主要以细胞核固缩、心肌纤维溶解、断裂为主,细胞排列不规则,细胞结构破坏,细胞浆染色不均匀为主,卡托普利组与不同剂量中药组心肌纤维化程度较轻。4.Masson染色:与正常对照组比较,模型组、卡托普利组以及不同剂量中药组均出现不同程度的心肌组织损伤,具体表现为细胞核固缩,细胞排列紊乱,细胞间隙不规则,并出现大量蓝染的纤维胶原,并破坏心肌细胞,坏死部分有少量炎症浸润。与模型组比较,卡托普利组以及各剂量中药组心肌纤维化程度较轻。大鼠心肌组织中胶原纤维容积比（CVF）,与正常对照组比较,模型组明显增加,且P<0.05,与模型组比较,卡托普利组以及中药低、中、高剂量组明显减少,且P<0.05。5.免疫组化法测定ColI、ColIII、α-SMA、Vim、LIMK1蛋白阳性表达面积:（1）I型胶原蛋白及III型胶原蛋白在免疫组化染色中显示为棕色,与正常对照组比较,模型组I型胶原蛋白及III型胶原蛋白阳性表达面积明显高于正常对照组,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组及中药低、中、高剂量组阳性表达面积明显低于模型组。P<0.05。（2）α-SMA、Vim蛋白阳性表达表现为棕色,与正常对照组比较,模型组中α-SMA、Vim蛋白表达面积明显高于正常对照组,且P<0.05;与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组α-SMA、Vim蛋白表达面积明显下降,P<0.05;（3）与正常对照组比较,模型组LIMK1蛋白表达量明显高于正常对照组,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组明显低于模型组,P<0.05。实验三:解毒通络方对心肌成纤维细胞TGF-β1/LIMK1信号通路的作用1.Western-blot法检测各组成纤维细胞中α-SMA、Vim、ROCK1、LIMK1蛋白含量:（1）与正常对照组比较,模型组α-SMA、Vim蛋白表达量有所升高,有统计学差异P<0.05,卡托普利组与模型组比较表达量下降,具有显着差异,P<0.05。中药低、中、高剂量组与模型组比较有所下降,具有显着差异,P<0.05;（2）与正常对照组比较,模型组成纤维细胞中ROCK1蛋白表达含量明显增加,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组、中药低、中剂量组与中药高剂量组成纤维细胞中ROCK1蛋白表达含量明显下降,有统计学差异,P<0.05。（3）与正常对照组比较,模型组LIMK1蛋白表达量有所升高,有统计学差异,P<0.05,卡托普利组与模型组比较表达量下降,具有显着差异,P<0.05。中药低、中、高剂量组与模型组比较有所下降,且具有统计学差异,P<0.05;2.荧光定量PCR法检测成纤维细胞中TGF-β1、RhoA、ROCK1、LIMK1mRNA含量:（1）荧光定量PCR检测各组成纤维细胞中TGF-β1的mRNA表达量,与正常对照组比较,模型组中TGF-β1mRNA的表达量明显上升,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组中TGF-β1mRNA的表达量明显下降,P<0.05。（2）荧光定量PCR检测各组成纤维细胞中RhoA、ROCK1的mRNA的表达量:与正常正常对照组比较,模型组中RhoA、ROCK1的mRNA的表达量明显上升,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组中RhoA、ROCK1mRNA的表达量明显下降,P<0.05。（3）应用荧光定量PCR检测各组成纤维细胞中LIMK1mRNA的表达量,结果显示,与正常对照组比较,模型组中LIMK1mRNA的表达量明显上升,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组中LIMK1mRNA的表达量明显下降,P<0.05。3.MTT法检测TGF-β1诱导成纤维细胞增殖时相:用不同浓度的TGF-β1刺激成纤维细胞后,根据吸光值计算细胞增殖率,结果显示不同浓度的TGF-β1刺激成纤维细胞时,细胞表现出增殖现象,低浓度组、中浓度及高浓度组TGF-β1对细胞增殖均表现为24小时后出现增殖,48小时达到高峰,72小时后出现下降。而低浓度组在不同时间点均表现为最强的增殖率。中浓度组在各个时间点增殖率最低。所以在成纤维细胞增殖的研究中,选择低浓度(0.025 ng.ml-1)的TGF-β1为药物剂量,以48小时为时间点干预成纤维细胞。4.用TGF-β1刺激成纤维细胞后,荧光定量PCR法检测成纤维细胞中RhoA、ROCK1、LIMK1的mRNA含量:结果显示,（1）与正常对照组比较,模型组中RhoAmRNA含量明显增高。P<0.05。与模型组比较,卡托普利组与中药低、中、高剂量组中RhoAmRNA含量明显减少。P<0.05。（2）与正常对照组比较,模型组中ROCK1、LIMK1的mRNA含量明显增加,P<0.05。与模型组比较,卡托普利组以及中药低、中、高剂量组ROCK1、LIMK1的mRNA含量明显减少,P<0.05。结论:1.应用盐酸异丙肾上腺素注射液5mg.kg-1腹腔注射大鼠,3天后大鼠心肌组织病理形态改变,心肌组织中羟脯胺酸含量增加,心肌组织中α-SMA、Vim蛋白表达量增多,说明注射异丙肾上腺素3天后大鼠心肌纤维化模型制备成功。2.在应用解毒通络方干预大鼠心肌纤维化模型时,心肌纤维化有明显的改善。并通过抑制心肌胶原蛋白的分泌及沉积而实现抑制心肌纤维化。3.在体外应用解毒通络方干预大鼠成纤维细胞时,可通过下调TGF-β1/LIMK1信号通路中RhoA、ROCK1、LIMK1因子,抑制成纤维细胞中α-SMA、Vim蛋白表达,从而抑制心肌纤维化。4.在TGF-β1诱导大鼠成纤维细胞增殖时,解毒通络方可以抑制成纤维细胞增殖,并通过下调TGF-β1/LIMK1信号通路中RhoA、ROCK1、LIMK1因子而实现的。
李晋[5]（2019）在《细胞色素P450 4A11酶促血压调节相关研究》文中提出细胞色素P450 4s（CYP4s）,在人体多个器官有表达,能通过羟化作用将体内花生四烯酸（AA）代谢为脂肪酸20-羟基二十碳四烯酸（20-HETE）。CYP4s表达或活性改变可引起机体20-HETE量的变化。有研究认为,20-HETE可能作用影响血压调节的不同部位。20-HETE既是非常有效的血管收缩剂,它也能促进肾近曲小管和髓袢升支粗段的尿钠排泄,抑制钠重吸收而起到降血压作用。CYP4s是否有效调节血压且通过20-HETE,其效果及机制目前并不清楚。本课题为探索CYP4s促血压调节的效果及机制,且是否可能经20-HETE实现。为选择可能与原发性高血压（EH）更相关的CYP4s,首先考察了中国南方汉族EH人群与CYP4s家族中CYP4A11、CYP4F12、CYP4F2、CYP4F3及相关泛素连接酶Cullin3（CUL3）和Kelch样家族成员3（KLHL3）多个单核苷酸多态性（SNP）的相关性;最后发现CYP4A11、CYP4F3及CUL3和KLHL3有显着影响EH发病的SNPs,可能显着增加EH致病风险的有CYP4A11,故选其做目标酶深入考察,并通过动物、动物器官和细胞实验等3个不同角度去验证CYP4A11对血压的调节作用,以及是否通过20-HETE发挥该作用。首先是构建带绿色荧光的CYP4A11小鼠同源且功能也相似的Cyp4a10过表达慢病毒载体,并经测序、比对及在两种细胞系中转染验证,确定载体完整度及可用性。随后将载体经尾静脉注射稳定转染至C57BL/6J与eNOS（-/-）两种同源雄性小鼠体内,以建立Cyp4a10稳定过表达小鼠模型,并从荧光显色、免疫组化、多个重要器官中Cyp4a10蛋白和mRNA水平评价转染效果,结果证实Cyp4a10在小鼠体内过表达。同时对造模后小鼠与对照小鼠收缩压进行监测,考察Cyp4a10转染对血压的影响,是否受HET0016（20-HETE合成及Cyp4a酶特异性抑制剂）影响及小鼠体液中20-HETE的变化规律。结果发现Cyp4a10表达与血压正相关,且能被HET0016阻止,Cyp4a10表达与小鼠体液中的20-HETE也正相关,因此,Cyp4a10可能会促小鼠血压上升,且20-HETE发挥了作用,推测同源且功能接近的CYP4A11也可能有此作用。其次是通过上述模型小鼠离体主、肾动脉考察Cyp4a10对血管张力的影响及与20-HETE可能的关系,结果发现在用L-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）限制内皮功能后,Cyp4a10过表达后小鼠的主动脉被肾上腺素诱导收缩后弹性恢复明显弱于野生型小鼠的主动脉。同时考察Cyp4a10过表达后主动脉、肾动脉中血管紧张素I转化酶-1（ACE1）、血管紧张素II受体-1（AT1R）、内皮素-1（ET1）、内皮素-1受体（ETAR）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）（肾动脉额外考察了腺苷三磷酸酶alpha（ATPaseα））等多个血管张力调节因子的蛋白与mRNA水平的变化,结果发现在离体器官中显着上调血管收缩因子并下调血管舒张因子,且与20-HETE正相关,可以推测,同源且功能接近的CYP4A11酶可能显着改变小鼠主、肾动脉的张力表现,且对血管调节因子表达的影响是促血管收缩。最后是细胞试验,获取CYP4A11转染质粒并设计合成、筛选沉默CYP4A11表达的siRNA,随后各自转染以构建过度或沉默CYP4A11表达的4种细胞模型,再考察CYP4A11在人源EA.hy926与HK-2细胞系中过表达或沉默后细胞系中上述多个血管张力调节因子的变化,结果发现CYP4A11与多种血管张力调节因子的蛋白、mRNA表达正相关,在细胞中显着上调血管收缩因子并下调血管舒张因子,且证实是通过20-HETE发挥作用。经过动物整体、离体器官与细胞试验,本课题发现CYP4A11可以显着促血压调节,当其表达增加时,可促血管收缩与血压上升,且这个调节作用很可能是通过20-HETE实现的,也可能是CYP4A11的SNP与EH显着相关的机制所在。本课题为完善CYP4A11调节血压机制打下了一定基础,为EH的诊疗与防治提供了新思路与新策略。
程杰坤[6]（2016）在《RhoA/ROCK信号通路参与Iso诱导大鼠心肌肥厚及法舒地尔的干预研究》文中研究表明目的:研究异丙肾上腺素（Isoproterenol,Iso）诱导大鼠心肌肥厚（cardiac hypertrophy,CH）中RhoA/ROCK信号通路的作用及法舒地尔（Fasudil,Fas）的干预效应。方法:采用皮下注射Iso制备大鼠CH模型。Sprague-Dawley大鼠48只,体重180g200g,随机分为4组:正常对照组、Iso模型组、Fas低剂量组（L-Fas,5mg/kg/d）、Fas高剂量组（H-Fas,20mg/kg/d）,每组12只。除正常对照组外,其余3组大鼠均皮下注射Iso制备CH模型,Fas治疗组采用预防给药方式,L-Fas组同时给予Iso（皮下注射,5mg/kg/d）+Fas（腹腔注射5mg/kg/d）,H-Fas组同时给予Iso（皮下注射,5mg/kg/d）+Fas（腹腔注射,20mg/kg/d）,正常对照组及Iso模型组给予等量生理盐水,给药8周。疗程结束后,进行下列指标检测:（1）每组随机取6只大鼠进行超声心动图检测大鼠射血分数（EF）、缩短分数（FS）、左心室后壁厚度（LVPW）及室间隔厚度（IVS）;（2）每组随机选取6只大鼠,称量体重后,进行血流动力学检测,观察左心室收缩压（LVSP）、左心室末期舒张压（LVEDP）、左心室收缩最大速率（+dp/dtmax）和左心室舒张最大速率（-dp/dtmax）及心率（HR）变化;（3）血流动力学结束,经颈总动脉取血,检测血清一氧化氮合酶（NOS）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性、一氧化氮（NO）的水平,待取出心脏后检测心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）水平;（4）取血完毕,迅速取出心脏,清除血渍,称取心脏重量（HW）和左心室重量（LVW）,计算心脏重量指数（HWI）和左心室重量指数（LVWI）;（5）每组选取6例心脏,用石蜡包埋,制作组织病理切片,分别进行HE染色观察心肌组织病理学改变和Masson染色观察心肌纤维化程度,同时采用免疫组织化学方法观察各组大鼠心肌组织RhoA、ROCK1、ERK1/2和c-FLIP蛋白的表达。（6）剩余每组6例心脏,采用半定量RT-PCR法检测各组大鼠心肌组织中RhoA、ROCK1、ERK1/2和c-FLIP mRNA的表达变化。结果:（1）超声心动图检测。与正常对照组比较,Iso模型组大鼠LVPW（P<0.05）和IVS（P<0.01）显着增加,而EF和FS显着下降（P<0.01）。与Iso模型组比较,L-Fas组IVS显着下降（P<0.05）,而EF显着升高（P<0.05）,LVPW和FS无明显差异;H-Fas组LVPW（P<0.05）、IVS（P<0.01）显着降低,EF（P<0.01）、FS（P<0.05）显着升高。（2）血流动力学变化。与正常对照组比较,Iso模型组的HR（P<0.05）和LVEDP（P<0.01）明显增加,而LVSP和±dp/dtmax显着下降（P<0.01）。与Iso模型组对比,L-Fas组LVSP显着升高（P<0.05）;H-Fas组HR和LVEDP明显下降（P<0.05）,而LVSP和±dp/dtmax明显升高（P<0.05）。（3）血液及心肌组织生化指标测定。与正常对照组比较,Iso模型组NO含量及NOS、SOD和GSH-PX活性显着降低（P<0.01）,而MDA含量显着升高（P<0.01）。与Iso模型组比较,L-Fas组NO（P<0.05）含量和NOS（P<0.05）、SOD（P<0.01）、GSH-PX（P<0.01）活性显着升高,MDA含量显着降低（P<0.01）;H-Fas组NO（P<0.05）含量和NOS（P<0.05）、SOD（P<0.01）、GSH-PX（P<0.01）活性显着升高,MDA含量显着降低（P<0.01）。（4）心重指数的测定。与正常对照组比较,Iso模型组的HW、LVW、HWI、LVWI显着升高（P<0.01）;与Iso模型组比较,L-Fas组HW、LVW、HWI、LVWI显着降低（P<0.05）;H-Fas组HW、LVW、HWI、LVWI显着降低（P<0.01）。（5）心肌组织病理学及免疫组化检测。HE、Masson染色后,与正常对照组比较,Iso模型组心肌细胞体积变大,细胞间隙增大,细胞排列紊乱,心肌间质纤维化程度严重;Fas给药后,细胞体积减小,细胞间隙变小,细胞排列整齐,纤维化程度明显减小。免疫组化发现Iso模型组大鼠RhoA、ROCK1和ERK1/2蛋白表达量显着增加（P<0.01）,c-FLIP蛋白表达量显着下降（P<0.01）。与Iso模型组比较,L-Fas组RhoA、ROCK1和ERK1/2蛋白表达量显着下降（P<0.01）,c-FLIP蛋白表达量显着增加（P<0.01）,H-Fas组RhoA、ROCK1和ERK1/2蛋白表达量显着下降（P<0.01）,c-FLIP蛋白表达量显着增加（P<0.01）。（6）心肌组织RhoA、ROCK1、c-FLIP和ERK1/2 mRNA的表达。与正常对照组比较,Iso模型组的RhoA、ROCK1和ERK1/2 mRNA表达明显上调（P<0.01）,c-FLIP mRNA表达明显下调（P<0.01）。与Iso模型组比较,L-Fas组RhoA（P<0.05）、ROCK1和ERK1/2mRNA表达明显下调（P<0.01）,c-FLIP mRNA表达显着上调（P<0.01）,L-Fas组RhoA、ROCK1mRNA表达量显着减小（P<0.01）,c-FLIP mRNA表达量显着增加（P<0.01）。结论:RhoA/ROCK、ERK1/2信号通路,参与了Iso诱导的大鼠CH,Fas对CH具有保护作用,其作用机制可能与Fas阻断RhoA/ROCK、ERK1/2信号通路,调节RhoA、ROCK1、c-FLIP、ERK1/2蛋白表达,清除氧自由基,抑制脂质过氧化,促进NO释放有关。
旷仁钊[7]（2014）在《丹红注射液对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛防治作用的实验研究》文中指出目的：观察大鼠蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）模型的脑血管形态学变化及血管壁蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）的表达情况，探讨丹红注射液对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛（Cerebralvasospasm,CVS）的防治作用及机制。方法：将56只SD大鼠随机分为4组：正常对照组（n=8），生理盐水组（n=16），SAH组（n=16）及SAH后丹红注射液治疗组（治疗组，n=16）。正常对照组不予任何处理，7天后处死；生理盐水组以枕大池注入生理盐水后分别于3、7天处死（各8只）；SAH组及SAH后丹红注射液治疗组均采用自体股动脉血枕大池二次注射法建模，建模后SAH组亦于3、7天处死（各8只）；治疗组于每日腹腔注射丹红注射液后分别于3、7天处死（各8只）。建模后分别按各时间点取出动物基底动脉脑桥段，切片后观察血管壁的厚度及血管壁的形态变化，采用免疫组化法测定血管壁PKC的表达情况，结果进行统计学分析。结果：1.HE染色：正常对照组和生理盐水组基底动脉管壁平滑,内皮细胞结构完整,内弹力板未见皱褶或断裂。SAH组术后第3、7天均有基底动脉管腔缩小，血管壁增厚且结构紊乱；内膜出现皱褶或断裂,厚薄不均，内皮细胞变形、肿胀；中、外膜变厚，平滑肌细胞肥大，出现炎性细胞浸润，以第7天时更严重。治疗组各时间点基底动脉管腔缩小、血管壁增厚、内膜皱褶及炎性细胞浸润等病理变化均较SAH组有所减轻。基底动脉内径与管壁厚度：正常组与生理盐水组比较基底动脉内径与管壁厚度无明显变化（P<0.05）；SAH组和治疗组的基底动脉内径较正常组均有缩小,管壁厚度较正常组均有增加。SAH组与治疗组均出现基底动脉内径缩小、管壁厚度增加，SAH组第7天比第3天更明显，而治疗组第3天比第7天稍明显。在各时间点，SAH组与生理盐水组比较，基底动脉内径及管壁厚度有显着差异（P<0.05）；治疗组与SAH组比较，基底动脉内径较大，管壁较薄，差异有统计学意义（P<0.05）。2.免疫组化：在正常组和生理盐水组探测到很弱的PKC免疫阳性反应；在SAH组和治疗组均可见PKC的免疫阳性反应可以在血管内膜，平滑肌层内观察到，呈棕黄或棕褐色，定位于细胞胞浆内和胞膜上。PKC的免疫阳性反应在SAH组第7天时最为显着，第3天时次之；正常组和生理盐水组PKC表达比较无统计学意义（P>0.05），治疗组PKC表达各时间点较SAH组明显减弱，且均有统计学意义（P<0.05）。结论：1.蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛时基底动脉PKC的活性表达有明显的升高，其程度与脑血管痉挛形态学改变的程度一致，表明PKC的活性增加在脑血管持续痉挛中有着重要作用。2.丹红注射液可能是通过抑制PKC的活性来缓解蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛。
王彦宏[8]（2013）在《重度颅脑损伤后脑血管痉挛与NO及内皮素水平的研究》文中进行了进一步梳理目的：脑血管痉挛是颅脑损伤的基本病理改变之一。内皮素（ET）和一氧化氮（NO）是脑内两种重要的神经递质,可能是促发脑血管痉挛（Cerebral vasospasm, CVS）的重要物质。目前国内外对ET和NO在神经系统的作用以自发性蛛网膜下腔出血、脑缺血的研究为主,而对颅脑损伤后ET和NO作用的基础与临床研究较少。本文探讨重型颅脑外伤后血管痉挛与脑脊液NO及内皮素水平变化随时间变化的关系。方法：重型颅脑外伤患者68例,入院时GCS<8分。患者入院后1天、第3天、第5天及第7、10天分别进行双侧大脑中动脉、颈内动脉颅外段TCD脑血流速度检测,同时留取脑脊液标本,采用放射免疫方法测定脑脊液中ET含量,采用硝酸还原酶法测定脑脊液中NO含量。依据经颅多普勒结果把68例患者分为脑血管痉挛组与非痉挛组,将所测数值进行统计学分析；依据脑血管痉挛的程度分成脑血管痉挛轻中症组、脑血管痉挛重症组和非脑血管痉挛组,将所测三组病人脑脊液中ET和NO的数值及正常对照组所测数值进行统计学分析。结果：患者（68例）中有54.4%（37例）发生脑血管痉挛：重度脑血管痉挛16例、中度脑血管痉挛11例和轻度脑血管痉挛10例。实验结果发现,重型颅脑损伤后患者脑脊液内皮素浓度均升高,而NO水平却明显下降（平<0.05）。脑血管痉挛组ET与NO水平变化与经颅多普勒检查结果时间节点相一致。脑血管痉挛组脑脊液中ET浓度于伤后进行性升高,第3天达到高峰,此后维持较高水平,与非脑血管痉挛组之间存在显着性差异（P<0.05）,且重度脑痉挛组中ET浓度明显高于轻中度脑痉挛组（P<0.01）。脑血管痉挛组脑脊液中NO含量低于正常对照组,有显着性差异,但非脑痉挛组脑脊液中NO含量与正常对照组比较在第3,5天有显着性差异（P<0.05）。脑痉挛组脑脊液中NO浓度于伤后进行性下降,于伤后3天最明显,此后逐渐回升,伤后脑痉挛组与非脑痉挛组脑脊液中NO浓度有显着性差异（P<0.05）,且重度CVS组NO浓度于伤后3天内明显低于轻中度CVS组。结论：重度颅脑损伤容易发生脑血管痉挛,并且脑血管痉挛可能与脑脊液中内皮素水平升高和NO水平降低有关,脑血管痉挛程度与内皮素和NO变化水平在时间节点上相一致。
程浩峰[9]（2009）在《褪黑素在大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的脑保护作用实验研究》文中进行了进一步梳理目的:研究褪黑素在蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛中的脑保护作用。材料与方法:采用枕大池注血法制备蛛网膜下腔出血模型,选用健康成年SD大鼠120只随机分成A、B、C、D4组,根据设计时间点不同每组分5亚组,每个亚组6只。A组为假手术对照组,仅进行相关血管游离后缝合切口,分别再饲养1h、6h、12h、24h及72h;B组为SAH+NS对照组,B1、B6、B12、B24及B72亚组分别为SAH+NS模型制作成功后再饲养1h、6h、12h、24h及72h;C组为SAH组,C1、C6、C12、C24及C72亚组分别为SAH模型制作成功后再饲养1h、6h、12h、24h及72h;D组为SAH+MT组,D1、D6、D12、D24及D72亚组分别SAH+MT模型制作成功后再饲养1h、6h、12h、24h及72h。A组、B组、C组和D组均在饲养时间完成后即断头取脑。在视交叉后1mm及4mm处冠状切面取切片行H-E染色、Bax和Bcl-2免疫组化染色,分别观察海马区神经元的存活情况及Bax和Bcl-2的表达,采用SPSS13.0软件对实验数据进行进行统计学分析。结果:H-E染色切片于光镜下见A组基底动脉管壁平滑无增厚,结构完整,B、C组血管直径变小,内皮细胞变性、肿胀明显,D组血管轻微收缩,内皮细胞轻微肿胀。H-E染色切片于光镜下计数海马CA1区存活神经元密度,A组偶见神经元凋亡;B组和C组可见大量锥体细胞凋亡。D组海马CA1区神经细胞凋亡程度较B、C组同时间点轻。免疫组化染色切片观察见:Bcl-2和bax阳性细胞主要为胞质着色,棕黄色,均匀弥漫染色。（1）Bcl-2免疫阳性细胞观察结果如下:在A组,bcl-2阳性细胞在海马神经元中有很微弱的表达,B、C、D组海马CA1区bcl-2表达明显,D组与B、C组相比,阳性细胞数多且较强。（2）bax免疫阳性细胞观察结果如下:在假手术A组,bax阳性细胞在海马神经元中有很微弱的表达,B、C、D组海马CA1区bax表达明显。B、C组与D组相比,阳性细胞数多且较强。经过统计学处理分析后,各组之间两两对比显示神经元存活数目及Bcl-2和bax表达强度存在显着性差异。结论:1、单纯切口损伤和NS对血管内皮细胞及脑组织中Bcl-2、Bax的表达无明显影响。2、SAH可使脑组织中Bcl-2、Bax的表达升高。3、褪黑激素（MT）可能通过促进了SAH大鼠抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达,抑制了促凋亡基因Bax蛋白的表达,从而抑制细胞凋亡来发挥脑神经组织及脑血管保护作用。4、褪黑激素（MT）对SAH后CVS有扩血管的作用,但其机制不清,有待进一步研究探讨。
宋锦宁[10]（2008）在《内皮素受体A（ETRA）和降钙素基因相关肽在兔SAH脑血管的表达与新型ETRA拮抗剂的设计合成及其生物活性研究》文中认为研究目的:（1）探讨蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管内皮素受体A（ETRA）及降钙素基因相关肽（CGRP）的表达,以及二者与迟发性脑血管痉挛（DCVS）之间的关系。（2）探索设计、合成新型多肽类选择性ETRA拮抗剂的方法,通过对合成和纯化过程中关键步骤及参数的比较,为固相合成多肽类选择性ETRA拮抗剂提供一条简单、可行的途径。并在实验性SAH活体模型观察新型多肽的生物活性。研究方法:（1）根据内皮素-1（ET-1）的构效关系,应用随机噬菌体肽库筛选技术,结合lasergene等计算机软件辅助设计,经过对目标序列的系统结构分析,最终确定筛选设计出5条新型内皮素受体A拮抗六肽;然后应用固相合成方法,并采用质谱检测及反相高效液相色谱纯化策略,对这5种新型六肽进行分离纯化;最后在兔实验性SAH模型活体观察其对脑血管痉挛的拮抗作用。（2）将日本大耳白家兔290只进行随机分组:其中空白对照组35只,假手术对照组35只,盐水对照组35只,SAH模型组35只,新型六肽ETRA拮抗剂组150只。实验各组内又根据不同的时间段分为5个亚组,分别为造模后1 h、3 d、5 d、7 d、10 d组,每亚组中5做ETRA与CGRP免疫组织化学染色,2只做脑血管超微结构研究;其中ETRA拮抗剂组内又分为标准拮抗剂（BQ-485）对照组、SC-01拮抗剂组、SC-02拮抗剂组、SC-03拮抗剂组、SC-04拮抗剂组、SC-05拮抗剂组共6个亚组,每亚组5只兔。（3）采用枕大池二次注血法制作SAH模型,灌注处死后取基底动脉制成切片。使用SABC免疫组织化学染色和HE染色光镜,以及电子显微镜,观察基底动脉ETRA与CGRP的表达和病理结构变化,并用图像分析方法测量血管周长,观察新型ETRA拮抗剂对脑血管痉挛的拮抗作用,使用方差分析进行统计学检验。实验结果:（1）基底动脉周长在SAH后均发生明显缩窄,其中在5 d时缩小最强烈:SAH可导致脑血管超微结构会发生损害,并在病程发展中呈明显的动态改变。（2）ETRA在正常组、穿刺组和盐水组的基底动脉内有少量表达;SAH组基底动脉内ETRA的表达在3 d组和5 d组表现为高表达,其中以3 d组最强烈,其中血管内皮细胞表达最强烈,平滑肌也有表达,10 d组的表达强度仍然较重。（3）CGRP在穿刺组、正常对照组和盐水组的基底动脉内也有散在不规则表达。在SAH组基底动脉内CGRP表达的动态变化规律为,CGRP的表达在1 h时最明显,在3 d、5 d依次表达减少,5 d达到最低点,7 d后开始逐渐升高,10 d时表达相对比较明显,但未能达到正常水平。（4）在合成的5种新型六肽类选择性ETRA拮抗剂中,SC-01拮抗剂的效果明显好于标准拮抗剂（BQ-485）对照组和其他拮抗剂（P＜0.05）,SC-05拮抗剂的效果仅次于SC-01（P＜0.05）,SC-02,SC-03,SC-04拮抗剂与标准拮抗剂之间没有明显的差别（P＞0.05）。SC-01与SC-05拮抗剂对蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛有明显的缓解作用。结论:（1）SAH后脑血管CGRP和ETRA表达呈现明显的动态改变,但二者的变化趋势并不同步;CGRP和ETRA在DCVS的发生发展中起重要的作用。（2）新型六肽类选择性ETRA拮抗剂SC-01与SC-05可以有效地缓解蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛。
二、内皮素转化酶抑制剂治疗脑血管痉挛的免疫组化研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、内皮素转化酶抑制剂治疗脑血管痉挛的免疫组化研究（论文提纲范文）
（1）平滑肌HuR在高血压和动脉粥样硬化中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 论文Ⅰ 平滑肌HuR在高血压和血管平滑肌收缩中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 创新性与限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 论文Ⅱ 平滑肌HuR在动脉粥样硬化中的作用及机制研究 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 创新性与限制性 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 文献综述 人类抗原R在心血管系统中的作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文Ⅰ |
| 英文论文Ⅱ |
（2）冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 冠脉慢血流患者外周血细胞测序分析 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 脂肪乳输注诱导小鼠冠脉微循环功能障碍 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 脂肪乳输注诱导冠脉微循环障碍的机制 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 冠脉微循环障碍:非阻塞性冠心病潜在发病机制 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）滋肾固本法针刺改善乳腺癌内分泌治疗患者潮热的临床对照研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 一、中医对乳腺癌内分泌治疗后相关症状的认识及干预 |
| 1.中医对乳腺癌内分泌治疗后相关症状的认识 |
| 2.中医对乳腺癌内分泌治疗后相关症状的干预 |
| 二、中医对乳腺癌术后内分泌治疗患者潮热症状的认识 |
| 1.潮热的定义与发病机理 |
| 1.1 潮热的定义 |
| 1.2 潮热的发病机理 |
| 2.内分泌治疗后类围绝经期综合征的定义 |
| 3.内分泌治疗后类围绝经期潮热的病因病机 |
| 3.1 肾虚为根本 |
| 3.2 心肝脾功能失调 |
| 三、中医对乳腺癌术后内分泌治疗患者潮热症状的治疗 |
| 1.中药辨证治疗 |
| 2.针刺治疗 |
| 2.1 针刺治疗方式 |
| 2.2 针刺选穴规律 |
| 3.其他中医治法 |
| 四、现代医学对乳腺癌术后内分泌治疗患者潮热症状的认识 |
| 1.乳腺癌内分泌治疗药物及不良反应 |
| 2.内分泌治疗后潮热的发生机制 |
| 3.潮热对乳腺癌患者生活质量的影响 |
| 五、现代医学对乳腺癌术后内分泌治疗患者潮热症状的治疗 |
| 1.激素替代治疗 |
| 2.非激素治疗 |
| 3.认知行为疗法 |
| 第二部分 临床研究 |
| 1.临床资料 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 剔除及脱落标准 |
| 1.6 剔除与脱落病例处理 |
| 1.7 终止标准 |
| 2.研究方法 |
| 2.1 分组设计 |
| 2.2 研究周期 |
| 2.3 治疗方案 |
| 2.4 针刺异常情况及处理方法 |
| 3.观察内容及指标 |
| 3.1 一般临床资料 |
| 3.2 主要观察指标 |
| 3.3 次要观察指标 |
| 4.治疗的安全性分析 |
| 5.信息分析方法 |
| 5.1 描述性分析 |
| 5.2 对比分析 |
| 6.统计分析方法 |
| 第三部分 研究结果与分析 |
| 1.治疗前两组一般情况比较结果 |
| 1.1 治疗前两组患者年龄、手术部位、肿瘤分期及内分泌治疗药物的对比 |
| 1.2 治疗前两组患者潮热次数、潮热程度、中医症候、生活质量、围绝经期症状的对比 |
| 2.治疗期间实验结果比较 |
| 2.1 两组潮热次数治疗前后比较 |
| 2.2 两组治疗前后潮热程度比较 |
| 2.3 两组平均潮热分数治疗前后比较 |
| 2.4 两组中医症候积分治疗前后比较 |
| 2.5 两组生活质量治疗前后比较 |
| 2.6 两组围绝经期症状治疗前后比较 |
| 3.不良反应观察 |
| 第四部分 讨论 |
| 1.结果分析 |
| 2.本研究治疗方案的设计 |
| 2.1 针刺治疗潮热的理论依据 |
| 2.2 滋肾固本法选穴依据 |
| 3.疗效评价指标的选择 |
| 3.1 每日潮热笔记(DHFD) |
| 3.2 肾阴虚症候积分表 |
| 3.3 乳腺癌功能评估量表(FACT-B) |
| 3.4 癌症治疗-内分泌亚量表(FACT-ES) |
| 4.结论 |
| 5.优势总结 |
| 6.不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩略词表 |
| 附录2 潮热笔记(DHFD) |
| 附录3 肾阴虚中医症状积分表 |
| 附录4 乳腺癌生活质量量表FACT-B |
| 附录5 癌症治疗-内分泌亚量表(FACT-ES) |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（4）基于TGF-β1/LIMK1信号通路研究解毒通络方对大鼠心肌纤维化的抑制作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一 心肌纤维化的现代研究 |
| 1 心肌纤维化概念 |
| 2 心肌纤维化发病机制 |
| 3 心肌纤维化的现代治疗 |
| 4 小结 |
| 综述二 心肌纤维化的中医研究进展 |
| 1 从中医角度探讨心肌纤维化病因病机 |
| 2 毒伤血络学说 |
| 3 中医药治疗心肌纤维化 |
| 4 解毒通络方药的现代研究 |
| 5 小结 |
| 实验研究 |
| 第一章 心肌纤维化大鼠模型的构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 解毒通络方对大鼠心肌纤维化抑制作用的体内研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 解毒通络方对心肌成纤维细胞TGF-β1/LIMK1信号通路的研究 |
| 1 实验材料 |
| 第一部分 解毒通络方对大鼠体外细胞的作用及机制 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 第二部分 解毒通络方抑制大鼠成纤维细胞增殖机制 |
| 4 实验方法 |
| 5 实验结果 |
| 6 讨论 |
| 7 小结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（5）细胞色素P450 4A11酶促血压调节相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 细胞色素P450(CYP)酶系 |
| 1.1.1 CYP概述 |
| 1.1.2 CYP功能 |
| 1.2 高血压及危险因素 |
| 1.2.1 高血压定义 |
| 1.2.2 高血压危险因素 |
| 1.3 血管张力调节因子 |
| 1.4 CYP与高血压的相关性 |
| 1.4.1 原发性高血压(EH) |
| 1.4.2 继发性高血压 |
| 1.4.3 高血压合并其它疾病 |
| 1.4.4 人种、性别、体重指数(BMI)的影响 |
| 1.5 CYP、内源性物质与高血压内在联系 |
| 1.5.1 内源性物质经CYP影响血压 |
| 1.5.2 高血压经CYP影响内源性物质表达 |
| 1.5.3 CYP参与内源性物质诱导的高血压 |
| 1.6 CYP4s及其代谢产物与血压调节的关系 |
| 1.6.1 CYP4s代谢特点 |
| 1.6.2 CYP4s代谢物20-HETE病生功能 |
| 1.7 高血压啮齿动物模型 |
| 1.7.1 常见非基因模型 |
| 1.7.2 常见基因模型 |
| 1.7.3 与CYP相关的高血压模型 |
| 1.8 血压调节研究技术 |
| 1.8.1 血压与血管张力测定技术 |
| 1.8.2 分子生物学技术 |
| 1.9 本课题目的、意义和主要内容 |
| 1.9.1 本课题目的、意义 |
| 1.9.2 本课题主要内容 |
| 第二章 CYP4s基因多态性与人原发性高血压相关性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料、试剂与仪器 |
| 2.2.1 主要仪器与耗材 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 实验溶液 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 目标SNPs选择 |
| 2.3.2 病例选择与样本采集 |
| 2.3.3 血液DNA提取与浓度测定 |
| 2.3.4 DNA SNPs位点检测 |
| 2.3.5 统计与分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 目标SNPs选择 |
| 2.4.2 试验对象选择 |
| 2.4.3 全血DNA提取与测定 |
| 2.4.4 DNA位点扩增与检测 |
| 2.4.5 DNA位点SNPs与高血压关联性分析 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 CYP4A11 对模型小鼠血压的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料、试剂与仪器 |
| 3.2.1 实验对象 |
| 3.2.2 主要仪器与耗材 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验溶液、培养基和饲料 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 构建小鼠Cyp4a10 慢病毒载体与验证 |
| 3.3.2 小鼠Cyp4a10 慢病毒稳定转染验证实验 |
| 3.3.3 Cyp4a10 与小鼠血压相关性研究 |
| 3.3.4 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 构建Cyp4a10 慢病毒载体与初步验证 |
| 3.4.2 小鼠Cyp4a10 慢病毒稳定转染验证 |
| 3.4.3 Cyp4a10 与小鼠血压相关性研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 CYP4A11 影响血管张力及相关调节因子的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料、试剂、仪器 |
| 4.2.1 实验对象 |
| 4.2.2 主要仪器与耗材 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验溶液与培养基 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 Cyp4a10 对小鼠血管张力影响 |
| 4.3.2 HET0016 对肾动脉、主动脉张力的影响 |
| 4.3.3 Cyp4a10 对小鼠器官血压调节蛋白影响的蛋白检测 |
| 4.3.4 Cyp4a10 对小鼠器官血压调节蛋白影响的mRNA检测 |
| 4.3.5 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 小鼠血管张力测定 |
| 4.4.2 小鼠器官血管张力相关因子蛋白表达检测 |
| 4.4.3 小鼠器官血管张力相关因子mRNA检测 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 CYP4A11 影响血管张力调节因子的细胞学研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料、试剂和仪器 |
| 5.2.1 实验对象 |
| 5.2.2 主要仪器与耗材 |
| 5.2.3 实验试剂 |
| 5.2.4 实验溶液与培养基 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 CYP4A11 siRNA筛选与验证 |
| 5.3.2 细胞系血管张力调节因子蛋白表达检测 |
| 5.3.3 细胞系血管张力调节因子mRNA检测 |
| 5.3.4 细胞上清20-HETE检测 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 CYP4A11 siRNA筛选与验证 |
| 5.4.2 细胞系血管张力调节因子蛋白表达检测 |
| 5.4.3 细胞系血管张力调节因子mRNA检测 |
| 5.4.4 细胞上清的20-HETE检测 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 答辩委员会对论文评语 |
（6）RhoA/ROCK信号通路参与Iso诱导大鼠心肌肥厚及法舒地尔的干预研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词简表 |
| 第一章 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 CH的发病机制 |
| 1.2.1 机械性因素 |
| 1.2.2 神经体液因素 |
| 1.2.3 细胞因子 |
| 1.2.4 其他因素 |
| 1.3 CH相关信号通路介绍 |
| 1.3.1 G蛋白家族信号通路 |
| 1.3.2 MAPK信号通路 |
| 1.3.3 蛋白激酶C(PKC)信号通路 |
| 1.3.4 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路 |
| 1.3.5 Ca~(2+)介导的信号通路 |
| 1.3.6 小G蛋白途径 |
| 1.4 CH药物治疗进展 |
| 1.4.1 血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI) |
| 1.4.2 血管紧张素受体拮抗剂(ARB) |
| 1.4.3 Ca~(2+)拮抗剂(CCB) |
| 1.4.4 β受体阻滞剂 |
| 1.4.5 利尿剂 |
| 1.4.6 他汀类药物 |
| 本章小结 |
| 第二章 RhoA/ROCK信号通路参与Iso诱导大鼠心肌肥厚及法舒地尔的干预作用 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 药物 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.2.5 溶液及药品配制 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 心肌肥厚模型的建立及给药 |
| 2.3.2 超声心动图检测 |
| 2.3.3 血流动力学检测 |
| 2.3.4 心指数测定 |
| 2.3.5 血液及心肌组织生化指标检测 |
| 2.3.6 心肌组织病理学检测 |
| 2.3.7 心肌组织免疫组化检测 |
| 2.3.8 心肌组织RT-PCR检测 |
| 2.3.9 统计方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 动物一般情况 |
| 2.4.2 超声心动图检测结果 |
| 2.4.3 血流动力学检测结果 |
| 2.4.4 心指数检测结果 |
| 2.4.5 血液及心肌组织生化指标检测结果 |
| 2.4.6 心肌组织病理学检测结果 |
| 2.4.7 心肌组织免疫组化检测结果 |
| 2.4.8 心肌组织RT-PCR半定量RhoA、ROCK1、ERK1/2、c-FLIP m RNA表达结果 |
| 本章小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
（7）丹红注射液对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛防治作用的实验研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述：药物治疗蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（8）重度颅脑损伤后脑血管痉挛与NO及内皮素水平的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词简表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 经颅多普勒血流速度测定 |
| 2.2.2 NO浓度的测定 |
| 2.2.3 内皮素测定 |
| 2.2.4 对照组样本的采集与检测 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 重型颅损伤后脑血管痉挛发生及时间进程 |
| 3.2 重型颅脑损伤后CSF的NO浓度 |
| 3.3 重型颅脑损伤后CSF的内皮素浓度 |
| 3.4 附图 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间主要研究成果 |
| 致谢 |
（9）褪黑素在大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的脑保护作用实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用英文缩写词 |
| 前言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 试剂及仪器 |
| 1.2 大体步骤 |
| 1.3 实验分组及动物模型制备 |
| 1.4 褪黑素及其它药物用法 |
| 1.5 脑组织的获取及切片制作 |
| 1.6 脑基底池的大体观察 |
| 1.7 HE染色步骤 |
| 1.8 免疫组化操作步骤 |
| 1.9 H-E切片观察 |
| 1.10 免疫组化结果观察 |
| 1.11 试验动物及标本的筛选 |
| 1.12 统计学处理 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 脑基底池大体观察 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 免疫组化染色观察结果 |
| 2.4 实验结果分析 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 动物模型的制作 |
| 3.2 实验动物的筛选 |
| 3.3 SAH后CVS |
| 3.4 SAH后CVSBcl-2、Bax蛋白的表达及与细胞凋亡的关系 |
| 3.5 褪黑素(MT)对SAH后CVS神经元凋亡的影响 |
| 3.6 褪黑素(MT)对SAH后CVS Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述·一 蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的机制和治疗现状 |
| 参考文献 |
| 综述·二 褪黑素的脑保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（10）内皮素受体A（ETRA）和降钙素基因相关肽在兔SAH脑血管的表达与新型ETRA拮抗剂的设计合成及其生物活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 背景回顾 |
| 2.1 SAH后DCVS发病机制与研究近况 |
| 2.1.1 脑血管紧张度的分子调节 |
| 2.1.2 SAH对血管内皮细胞的影响 |
| 2.1.3 SAH对平滑肌细胞的影响 |
| 2.1.4 溶血产物对血管壁的作用 |
| 2.1.5 氧合血红蛋白的作用 |
| 2.1.6 一氧化氮的作用 |
| 2.1.7 蛋白激酶C(PKC) |
| 2.1.8 K通道活性改变 |
| 2.1.9 SAH对脑微循环的影响 |
| 2.1.10 SAH后的高凝状态 |
| 2.1.11 免疫炎症反应相关机制 |
| 2.1.12 CVS与血管壁的凋亡 |
| 2.1.13 磷酸二脂酶-V(PDE-V) |
| 2.1.14 血管壁细胞的增殖 |
| 2.2 内皮素与内皮素受体对血管的作用机理及在SAH致DCVS的作用 |
| 2.2.1 内皮素的发现及结构 |
| 2.2.2 ET的产生及分布 |
| 2.2.3 内皮素的合成 |
| 2.2.4 ET在中枢神经系统的分布及在SAH致DCVS的作用 |
| 2.2.5 内皮素受体的分布及在SAH致DCVS中的作用 |
| 2.3 CGRP对血管作用机理及在SAH致DCVS中的作用 |
| 2.3.1 CGRP在中枢神经系统的分布 |
| 2.3.2 CGRP对血管的作用及机理 |
| 2.3.3 CGRP对血管内皮细胞的作用及其机制 |
| 2.3.4 CGRP研究新进展 |
| 2.4 内皮素受体拮抗剂的设计、合成与研究进展 |
| 2.4.1 肽类内皮素受体阻滞剂的合成 |
| 2.4.2 非肽类内皮素受体阻滞剂的合成 |
| 2.4.3 内皮素受体拮抗剂的治疗应用 |
| 2.5 SAH动物模型的制作方法及现状 |
| 2.5.1 动物的选择 |
| 2.5.2 选择兔作为实验对象的可行性 |
| 2.5.3 动物模型制作的方法简介 |
| 第三章 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验仪器及设备 |
| 3.1.3 实验试剂及药品 |
| 3.1.4 手术器械 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 选择性ETRA拮抗剂多肽的设计、合成与纯化 |
| 3.2.2 实验分组 |
| 3.2.3 脑血管ETRA、CGRP免疫组化与结构变化主要液体的配制 |
| 3.2.4 动物模型的建立 |
| 3.2.5 标本取材及处理 |
| 3.2.6 石蜡包埋及切片的制作方法及步骤 |
| 3.2.7 HE染色方法及步骤 |
| 3.2.8 免疫组织化学染色方法及步骤 |
| 3.2.9 透射电镜超薄切片标本的制作方法及步骤 |
| 3.2.10 统计方法及图象分析 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 实验动物的一般观察 |
| 4.2 脑组织大体标本观察 |
| 4.3 SAH后ETRA在脑血管的表达结果 |
| 4.4 SAH后CGRP在脑血管的表达结果 |
| 4.5 蛛网膜下腔出血后基底动脉血管内皮的光镜下结构变化 |
| 4.6 蛛网膜下腔出血后基底动脉血管内皮的电镜下超微结构变化 |
| 4.7 SAH后基底动脉周长的变化 |
| 4.8 结果分析 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 ETRA在SAH后脑血管的表达及意义 |
| 5.2 CGRP在SAH后脑血管的表达及意义 |
| 5.3 内皮素受体拮抗剂与脑血管痉挛 |
| 5.4 选择性RTRA拮抗剂多肽类药物的设计与合成技术 |
| 第六部分 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、内皮素转化酶抑制剂治疗脑血管痉挛的免疫组化研究（论文参考文献）
- [1]平滑肌HuR在高血压和动脉粥样硬化中的作用及机制研究[D]. 刘珊杉. 山东大学, 2021(11)
- [2]冠脉慢血流微循环障碍的机制和干预研究[D]. 张艳达. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [3]滋肾固本法针刺改善乳腺癌内分泌治疗患者潮热的临床对照研究[D]. 王倩雯. 南京中医药大学, 2021(01)
- [4]基于TGF-β1/LIMK1信号通路研究解毒通络方对大鼠心肌纤维化的抑制作用[D]. 宋晶. 长春中医药大学, 2020(08)
- [5]细胞色素P450 4A11酶促血压调节相关研究[D]. 李晋. 华南理工大学, 2019(06)
- [6]RhoA/ROCK信号通路参与Iso诱导大鼠心肌肥厚及法舒地尔的干预研究[D]. 程杰坤. 浙江工业大学, 2016(05)
- [7]丹红注射液对蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛防治作用的实验研究[D]. 旷仁钊. 川北医学院, 2014(08)
- [8]重度颅脑损伤后脑血管痉挛与NO及内皮素水平的研究[D]. 王彦宏. 中南大学, 2013(05)
- [9]褪黑素在大鼠蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的脑保护作用实验研究[D]. 程浩峰. 中南大学, 2009(04)
- [10]内皮素受体A（ETRA）和降钙素基因相关肽在兔SAH脑血管的表达与新型ETRA拮抗剂的设计合成及其生物活性研究[D]. 宋锦宁. 西北大学, 2008(08)