一、共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究（论文文献综述）
杨博文[1]（2021）在《白介素2相关基因表达预测头颈部鳞癌免疫亚型及相关机制研究》文中指出目的:过去10年中,免疫治疗似乎成为了攻克头颈部鳞癌的新希望之一。目前针对头颈部鳞癌患者的免疫治疗方案的制定和疗效预测,主要依赖FDA推荐的免疫疗效生物学标志物,如PD-L1、错配修复功能缺陷（d MMR）或微卫星不稳定（MSI-H）等。但是这些单一的免疫疗效或预后生物学标志物预测头颈部鳞癌患者的免疫疗效的效能还需要进一步提升。随着二代测序技术的发展和计算机算力的提升,研究人员更倾向于通过更多组学信息描述头颈部鳞癌患者的免疫微环境特征,探索多维度的生物学标志物进而预测患者的免疫疗效和预后。本研究旨在通过生物信息学分析技术筛选影响头颈部鳞癌患者预后的重要生物学标志物,并构建新算法建立可以识别头颈部鳞癌患者免疫亚型的预测模型并描述其内在的生物学意义。研究方法:一、基于多组学筛选头颈部鳞癌预后信号通路及构建免疫亚型预测模型1、本研究通过多组学预后分析,筛选影响头颈部鳞癌预后的重要信号通路和生物学标志物。研究方法如下:1)下载TCGA中头颈部鳞癌多组学数据（包括:转录组数据、基因突变数据、基因拷贝数变化数据和基因甲基化数据）和临床相关数据。转录组学数据为TCGA Level3 Counts,通过公式标准化为TPM数据,删除表达量为0的比例大于20%,或表达量中位值为0的基因,基因类型根据Vega的标准进行注释;甲基化数据使用VEP软件对体细胞突变位点进行注释;拷贝数变化数据,数据通过GISTIC2软件根据CNV来评估基因的变化情况。所有数据均进行归一化、标准化处理。2)通过MOSClip多组学分析筛选影响头颈部鳞癌预后的信号通路及生物学标志物。3)通过Reactome数据库进行注释细胞生物学功能。4)回顾性收集本医院头颈部鳞癌患者的临床病理学参数,随访获得患者的生存相关数据。5)利用免疫组织化学染色验证头颈部鳞癌患者肿瘤组织中IL2RG的表达情况。6)通过甲基化特异PCR实验（MSP）验证头颈部鳞癌患者肿瘤组织中LCK甲基化水平。2、利用白细胞介素2（IL-2）相关基因构建预测免疫亚型的数学模型,研究方法如下:1)通过1000次Lasso-Logistic分析筛选免疫亚型相关重要基因。2)通过单因素和多因素Cox回归模型筛选头颈部鳞癌预后相关基因。3)通过R包Consensus Cluster Plus实现一致性无监督聚类分析。4)采用单样本基因富集分析评价肿瘤相关信号通路及肿瘤免疫细胞的浸润丰度。5)通过Estimate算法评估头颈部鳞癌样本的肿瘤纯度。6)采用非负矩阵分解法和自重抽样算法构建头颈部鳞状细胞癌免疫亚型预测IRIM模型（IL2 Family Signaling pathway related immune subtypes model）。7)通过免疫疗效相关数据库（IMvigor210、GSE35640、GSE78220、GSE63557和GSE91061）验证IRIM模型与免疫分型及免疫疗效之间的关系。8)通过R语言编写代码实现IRIM模型的可视化,并且部署在shinyapps.io服务器上。二、IRIM模型在头颈部鳞癌肿瘤免疫分型中的生物学意义1)本研究分析采用头颈部鳞癌单细胞测序数据GSE103322,通过细胞质量评价删除了测序过程中产生的“双细胞”和低质量的细胞。2)通过Seurat包中的Normalize Data函数对基因的表达量进行标准化,数据的批间差校正通过harmony包完成。3)主成分分析采用HVGs算法,选取了前25个主成分进行t SNE和UMAP降维分析。通过DBClust Dimension函数删除了聚类细胞数少于30个的亚群。4)细胞类型注释通过两种形式:（1）通过Single R包进行注释;（2）通过各种类型基因的生物学标志物进行注释。5)通过Seurat包中的“Find Variable Genes”函数计算各个细胞亚群之间的差异基因。6)通过单细胞功能富集分析注释细胞亚群的生物学功能。7)运用R软件进行统计分析,服从正态分布的定量数据以均数±标准差来表示,组间比较采用T test检验,不服从正态分布的定量数据以中位数及四分位间距来表示,组间比较采用Wilcoxon检验。定量变量符合正态分布选择定量变量的平均数为截断值,定量变量不符合正态分布选择定量变量的中位数为截断值。采用Kaplan-Meier法生成各数据集中各亚组的生存曲线,采用Log-rank检验确定差异的统计显着性,对于生存曲线相交的数据采用Landmark分析。P<0.05认为差异具有显着的统计学意义。结果:1、利用多组学数据筛选头颈部鳞癌预后生物学标志物,研究纳入TCGA转录组数据、基因突变数据、甲基化数据和拷贝数变化数据。结果显示:共有45条通路与头颈部鳞癌患者的预后相关。这45条信号通路在头颈部鳞癌中主要在人体免疫功能方面发挥作用。2、分别按照预后相关通路和预后相关通路中的基因模块的P值进行排序、筛选。结果显示:Interleukin-2 family signaling信号通路及其基因共表达模块1与头颈部鳞癌预后关系最为密切。3、我们采用Kaplan-meier曲线对Interleukin-2 family signaling通路及其基因共表达模块1进行生存分析。结果显示:该信号通路中基因表达量较低且甲基化水平较高的头颈部鳞癌患者预后较好,差异有统计学意义。4、通过一致性聚类分析发现Interleukin-2 family signaling通路相关基因可以将头颈部鳞癌患者分为两个亚群。5、通过Wilcoxon检验分析发现,两个亚群中T细胞含量、B细胞含量、WNT通路评分、IFNG通路评分、PDL1表达均有统计学差异。基于既往研究两个亚群分别显示了免疫炎症型及非免疫炎症型的特征。6、为了验证Interleukin-2 family signaling相关基因在免疫分型中的作用,我们在IMvigor210数据集中进行验证。结果显示:IL21R、IL2RG、LCK、INPP5D、JAK3和PIK3R3的基因表达量可以区分免疫炎症型患者并且与患者免疫治疗疗效有关。7、为了更好的描述上述6个关键基因与免疫分型的关系,我们设计了IRIM算法,并且构建了头颈部鳞癌免疫亚型预测模型（IRIM模型）。结果显示:在头颈部鳞癌中上述6个关键基因中如果有3个或3个以上基因发挥作用,即可以认定该头颈部鳞癌患者为“免疫炎症型”,AUC为0.8146,准确率为74.3%。8、通过其他免疫治疗相关数据集（GSE35640、GSE78220、GSE63557和GSE91061）进行验证,结果表明IRIM模型在其他数据集中均可以提示免疫治疗疗效。9、通过Estimate及相关性分析发现,此6个关键基因均主要表达在肿瘤微环境中,所以我们猜测IRIM模型无肿瘤器官特异性,因此我们在不同癌种中进行了验证。结果显示:IRIM模型在肺鳞癌、乳腺癌、宫颈鳞癌、食管鳞癌等多数实体肿瘤中均可以识别“免疫炎症型”患者。10、为了验证此6个关键基因和Interleukin-2 family signaling信号通路与头颈部鳞癌患者预后的关系,我们通过主成分分析筛选出代表基因IL2RG和LCK。11、GEPIA数据库分析显示,IL2RG是头颈部鳞癌的预后保护因素（P=0.015）。12、回顾性收集本中心头颈部鳞癌患者肿瘤标本79例,通过随访调查患者的生存情况及总生存时间,IL2RG的免疫组织化学染色分析结果显示,IL2RG免疫组化结果为阳性的患者预后良好（P=0.0017）。通过MSP实验评价本中心头颈部鳞癌患者LCK甲基化状态,并联合IL2RG免疫组化结果分析与头颈部鳞癌患者预后的关系,结果发现LCK未发生甲基化且IL2RG表达阳性的患者长期生存期明显优于LCK发生甲基化且IL2RG表达阴性的患者,差异有统计学意义（P=0.0075）13、通过对头颈部鳞癌单细胞数据集进行分析,结果表明IRIM模型评分与T细胞密切相关。14、T细胞亚群分析结果表明,IRIM模型评分主要可以提示头颈部鳞癌患者肿瘤微环境的耗竭型T细胞聚集。结论:1.IL2RG转录组水平和LCK甲基化水平共同参与的Interleukin-2 family signaling信号通路是头颈部鳞癌预后的危险因素。IL2RG是头颈部鳞癌患者的保护因素,LCK甲基化是头颈部鳞癌患者的危险因素。2.IRIM模型是提示头颈部鳞癌免疫分型的重要预测模型,其可以筛选免疫炎症型头颈部鳞癌患者,有效预测免疫检查点抑制剂的治疗疗效。
徐光[2]（2020）在《布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析》文中认为背景:布鲁氏菌感染后能依靠特定的免疫逃逸机制受到保护并在宿主的吞噬细胞内繁殖和生存。既能在感染灶的周围形成局部肉芽肿,也可以由吞噬细胞携带感染全身各组织器官,引起严重病变甚至死亡。布鲁氏菌的胞内生活方式使宿主难以从体内彻底清除,并引起宿主体内一系列复杂的免疫反应,辅助性T细胞（T helper cells,Th）及其相关的细胞因子、趋化因子参与宿主对抗布鲁氏菌免疫防御过程,并且与MO/Mf细胞和NK细胞等多种免疫细胞相互作用,影响临床表现和参与疾病的进展。然而,各种免疫细胞,尤其是Th22淋巴细胞亚群在布病感染过程中的具体免疫效应和作用机制尚未完全明确。而趋化因子和抑制性受体在布病中的作用也需要进一步深入研究。目的:1.研究布病患者体内Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群以及相关的细胞因子在布病中的动态变化趋势;探索Th22淋巴细胞亚群在布病中的免疫作用及机制;2.研究趋化因子及其受体在布病病程中的免疫作用和机制;3.研究免疫细胞基因和蛋白的差异表达及其在布病发病机制中的作用,探讨免疫耗竭对于布病慢性化进展的可能影响。方法:1.通过流式细胞术对布病患者外周血中Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群的表型及分布情况进行分析,通过微量样本多指标流式蛋白定量技术（Cytometric Bead Array,CBA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测血清中细胞因子的水平。通过随访来观察研究免疫指标的动态变化趋势。2.通过流式细胞术对布病患者外周血中Th淋巴细胞表面趋化因子受体的表达情况进行分析,通过随访来观察其动态变化趋势。3.应用RNA测序（RNA-seq）及差异基因表达分析方法测定T淋巴细胞、MO/Mf细胞和NK细胞转录组表达谱,研究基因和蛋白的差异表达以及其与布病免疫状态之间的关系,用q PCR的方法验证转录组分析结果。分析免疫细胞之间的相关性和相互作用机制,探讨可能影响布病慢性化进展的关键因素。结果:布病患者外周血内的Th1淋巴细胞亚群在疾病早期比健康对照组明显升高,予以规范治疗后,约在病程6个月左右升至高峰,在病程6-12个月虽有下降,但始终维持在高于正常的水平。Th17淋巴细胞数在疾病早期高于健康人,经治疗后缓慢下降,6个月时已经下降至健康水平以下,病程12个月时仍无恢复趋势。Th22淋巴细胞亚群在疾病早期即开始下降,整个病程（12个月内）呈持续下降趋势,12个月左右仍无恢复。而且Th1和Th17细胞亚群的分布及活化状态,会影响Th22细胞的表达与活化。Th22淋巴细胞在布鲁氏菌感染后对IL-22的表达明显增强。在疾病早期,布病患者体内重要的Th淋巴细胞亚群（Th1、Th17和Th22）表面趋化因子受体的表达整体减低,而且在一段时间内（6个月左右）表现出持续性下降的趋势,病程6个月后趋化因子受体水平虽开始缓慢升高,但在12个月的时候仍未回升至正常水平。证实在患者的T细胞、MO/M?细胞和NK细胞中多项趋化因子及受体的m RNA表达水平明显降低,并受抑制性受体（FOXP3、TIGIT、PD-L1和LAG3）的调控。多种抑制性受体分子的表达水平明显升高,伴随着活化免疫细胞的功能降低。免疫细胞活化指标、趋化因子以及趋化因子受体与抑制性受体分子的表达水平之间存在着相关性。且抑制性受体各分子之间存在协同作用。结论:1.布病患者外周血内的Th1、Th17淋巴细胞数量在感染早期增加,Th1在布病急性期（6个月内）始终维持较高水平。Th17淋巴细胞高水平表达的状态维持时间较短。Th1和Th17细胞亚群的分布及活化情况,会影响Th22细胞的表达与活化。在布病中,宿主的Th22淋巴细胞起到保护靶器官,对抗组织损伤的作用,尤其在布病所致骨关节损伤中。Th22淋巴细胞的数量在布病的急性期中呈现整体减少的趋势,因此在感染布鲁氏菌后易于出现骨关节损伤。2.布鲁氏菌感染令宿主多种免疫细胞的趋化功能受损,导致免疫细胞向感染部位的募集功能减弱。3.布鲁氏菌感染后,T细胞、MO/M?细胞和NK细胞表达抑制性受体分子的水平升高,可以调控多项趋化因子及受体的表达水平降低,使免疫细胞向病灶处募集的数量减少;而且抑制性受体分子还能相互协同作用,共同抑制布病患者体内活化免疫细胞的功能,诱导病灶处免疫耗竭的发生,促使布病进展为慢性化病程。
曹韪凡[3]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中认为近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
马丽[4]（2020）在《基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究》文中研究说明慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是世界范围内的重要公共卫生问题,中医药对CHB的防治已显示其独特优势,进一步提高中医药防治能力,深入阐述CHB的证候生物学基础,似为其主要一环。四川地区CHB常见的中医证候为脾胃湿热证与肝郁脾虚证,课题组前期从mi RNA对上述两证候的生物学基础进行了初步研究。有文献表明DNA甲基化参与CHB的发生发展,且DNA甲基化与中医证候的形成在理论上似有契合之处,此或许能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证生物学基础的研究提供新的思路。目的:本研究基于前期相关mi RNA研究,多维度综合观察CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化水平的差异表达,探讨上述两证候的生物学基础是否是通过DNA甲基化与mi RNA相互调控,影响表观遗传,进而调节基因表达,形成不同的证候,以期初步证实DNA甲基化的差异表达是否为CHB证候差异的主要表观遗传机制之一,为上述两种CHB中医证候的客观化与规范化提供部分实证依据。方法:1.招募CHB脾胃湿热证（Spleen-stomach damp heat syndrome,SSDHS）患者7例SSDHS组),肝郁脾虚证（Liver depression and spleen deficiency syndrome,LDSDS）患者7例（LDSDS组）和健康志愿者6例（健康对照组（Healthy control,HC））。2.采集所有受试者清晨空腹、无菌环境下外周静脉血,检测各组间肝功能相关指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量。3.用ELISA法检测各组间DNA甲基化相关蛋白DNMT1、Me CP2的表达水平及HBV相关蛋白P53、E-cad、P16的表达水平。4.及时分离外周静脉血血清,提取DNA,用Illumina Bead Array TM Infinium850K甲基化芯片检测各组间DNA甲基化差异表达的情况,对差异甲基化位点相关基因进行GO功能富集和KEGG pathway富集分析。5.利用Target Scan7.2与miRDB数据库对不同中医证候中部分相同mi RNAs靶基因进行预测,采用Cytoscape3.6软件构建DNA甲基化基因与mi RNAs预测靶基因共表达网络图。结果:1.SSDHS、LDSDS组分别与HC组相比,在DNMT1、p16表达水平、性别、年龄、病程、生化指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量检测结果方面均无显着性差异（P>0.05）;E-cad表达水平均有显着性差异（P<0.05）,Me CP2、P53表达水平在SSDHS组中无显着性差异（P>0.05）,在LDSDS组中有显着性差异（P<0.05）。2.Illumina Bead Array TM Infinium 850K甲基化芯片检测结果显示CHB患者组与HC组有7868个显着差异甲基化位点,其中高甲基化位点2310个,低甲基化位点5558个;经过筛选高甲基化差异程度最高的位点为cg03278611位于基因NLGN4Y,低甲基化差异程度最高的位点为cg03670113位于基因TAZ;差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、脂肪颗粒、各种酶等;KEGG pathway主要富集在类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等。3.SSDHS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg21898358位于基因LILRA3,低甲基化差异程度最高的位点为cg09323788位于基因CHTF18,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在T细胞共刺激、Rho蛋白信号转导、Rho GTPases相关的功能等;KEGG pathway主要富集在ABC转运蛋白、AMPK信号通路及肿瘤相关通路;LDSDS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg09857096位于基因BMPR1B,低甲基化差异程度最高的位点为cg09972436位于基因LCE3C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在树突棘、丝氨酸/苏氨酸激酶、Rac GTPase等;KEGG pathway主要富集在苯丙氨酸代谢、氮代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路;SSDHS组与LDSDS组间最显着的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2,最显着的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在肌动蛋白相关细胞及组织,KEGG pathway主要富集在Erb B信号通路及代谢通路等。4.SSDHS、LDSDS组差异甲基化位点相关基因分别与mi R-122-5p、mi R-1228-3p、mi R-191-3p预测靶基因进行对比分析:两证候差异甲基化位点相关基因与mi R-122-5p预测靶基因均有6个基因重合,其中SSDHS组独有基因为RIMS1,LDSDS组独有基因为SLC41A1;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有21个基因重合,该组独有基因为OTUB、AMPH、SEMA3C、ZC3H12B、PCGF3、JAKMIP3,LDSDS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有17个基因重合,该组独有基因为ARID1B、NUDT7;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-191-3p预测靶基因有2个基因重合,该组独有基因为MPP7、LDSDS组差异甲基化基因与mi R-191-3p预测靶基因有3个基因重合,该组独有基因为SPTB2、CCNY。结论:1.Me CP2、P53可能通过影响DNA甲基化修饰参与CHB肝郁脾虚证的形成;E-cad可能是CHB脾胃湿热证或肝郁脾虚证形成的物质基础之一。2.CHB患者存在DNA甲基化的差异表达,具体机制可能与NLGN4Y、TAZ等基因的甲基化及蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等有关。3.CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证均存在DNA甲基化的差异表达,同时分别具有各自特有的DNA甲基化谱。LILRA3、CHTF18等基因的甲基化及T细胞共刺激诱导肝脏炎症等,可能是CHB脾胃湿热证的分子生物学基础;BMPR1B、LCE3C等基因的甲基化及树突棘的改变和物质代谢异常等,可能是CHB肝郁脾虚证的分子生物学基础,提示DNA甲基化可能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证差异的表观遗传机制之一。4.不同证候出现部分相同mi RNA的原因可能与其影响不同靶基因甲基化水平的差异性有关,具体调控机制尚需进一步研究证实。
田龙[5]（2020）在《HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群和血浆细胞因子研究》文中进行了进一步梳理人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）侵入人体造成CD4+T细胞减少是导致获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS）的根本原因。近年来随着 HAART（Highly active antiretroviral therapy,HAART）的普及和治疗方案的改进绝大多数HIV感染者血浆病毒载量得到很好的控制,外周血CD4+T细胞计数也可以维持在正常水平。但是随着患者年龄增高和高效抗逆转录病毒治疗时间的延长HIV感染者患非HIV定义性疾病（Non-AIDS-defining diseases,NAD）的风险越来越高,且已经成为影响HIV感染者生存质量重要因素的因素之一。越来越多的证据证明非艾滋病相关性疾病的风险与感染者体内免疫激活和炎症水平密切相关。对此,我们进行了以下几部分的研究。第一部分:HAART治疗感染者与未感染者差异基因的筛选及生物信息学分析.HIV病毒感染以后长期潜伏以及病人长期服药导致机体处于复杂的免疫激活和炎症状态,这造成很难通过体量有限的体内及体外实验获得比较全面的免疫激活和炎症结果。而生物信息学技术可以通过数据库收集整理多个实验中艾滋病感染者的基因检测数据。按照感染毒株,感染时间,给药情况,性别,年龄,种族背景和组织样本进行重新分组可以在展开实验室实验前精确的预测实验验证的重点方向和使用的样本量。本研究筛选了 HAART治疗的HIV感染者与未感染者CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、单核细胞以及HAART治疗的HIV感染者与未治疗的精英感染者PBMC间的差异基因并对差异基因进行了基因本体（Gene Ontology,GO）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）和 PPI 网络（蛋白互作网络,Protein protein interaction network）分析在生物信息学水平上系统的研究了HAART治疗的艾滋病感染者淋巴细胞免疫激活所涉及的主要基因以及这些基因的功能。此外,本实验还在miRNA水平上分析了 HIV感染者与健康对照的差异。结果显示HAART治疗可以降低多数炎症基因的表达但也会升高CD4+T中趋化受体IL-7R和CX3CR1,CD8+T细胞中NFKBIA以及单核细胞内CXCL10等促进免疫激活和炎症基因的表达。HAART治疗后各淋巴细胞亚群通过不同的途径调节免疫激活和炎症状态。CD4+T淋巴细胞主要是下调白细胞活化的调节通路和白细胞激活的负调节基因的表达。CD8+T淋巴细胞下调固有免疫的正向调节、αβCD8+T细胞活化。单核细胞则通过上调细胞因子介导的信号通路、淋巴细胞趋化性作用基因,下调适应性免疫应答、细胞防御应答、NK细胞介导的免疫基因来影响HIV感染者的免疫激活过程。此外还发现HAART治疗能改变SERPINA1、S100A9、IFIT2和CD247等肿瘤发生相关的基因的表达,以及对胰岛素抵抗、神经元凋亡等通路的影响。第二部分:HAART治疗SIVmac239感染恒河猴血浆细胞因子表达水平及其与疾病特征的相关性分析.通过生物信息学技术的筛查获得了 HAART治疗改变感染者基因表达的数据,那么能否在建立的实验动物模型体内检测到能反映炎症状态的细胞因子水平发生相对应的改变?本实验通过Luminex液相芯片技术对HAART治疗的SIVmac239感染恒河猴的这几类细胞因子在感染前、慢性感染期、HAART治疗和停药状态下的血浆浓度进行研究并分析这些细胞因子变化与疾病特征的相关性。实验结果显示本研究发现在静脉注射SIVmac239的恒河猴在感染的慢性期血浆中细胞因子的浓度均有所升高。在HAART治疗期间,TGF-β1和IP-10的浓度无论变化趋势还是与疾病特征的相关性都与临床相符合,IL-1β和IL-6的血浆浓度没有随着病毒水平的下降而降低,反而在停止HAART治疗后才逐渐下降并基本维持在HAART治疗前的水平。第三部分:HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群变化及其与疾病特征的相关性分析.检测血浆中细胞因子的浓度变化可以很好的了解炎症动态但是不能很好的反应HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫激活状态。也不能系统的知道免疫激活与炎症之间的联系。因此,本实验通过多色流式技术检测了 HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群的数量和比例的变化并分析了这些免疫细胞亚群与细胞因子表达水平的相关性。实验结果显示分化程度较高的CD4+TEMRA、CD4+TCM和CD4+TEM细胞亚群在艾滋病疾病进程中呈下降的趋势而分化程度较低CD4+naiveT细胞在艾滋病疾病进程中比例呈上升的趋势。HAART治疗也没有改变HIV感染后CD8TEMRA细胞亚群比例持续减少CD8’naiveT 比例持续增加变化的总体趋势.HAART治疗并不能有效恢复CD8+TCM细胞的水平.PD-1作为程序性死亡分子在终末分化的CD4+TEMRA和CD8+TEMRA细胞表而高度表达这在相应的naiveT细胞表面低水平表达。HAART治疗降低PD-1分子在CD8+T记忆细胞亚群表面的表达只发生在治疗的前期。给药112天BI细胞在外周血中比例上升,且外周血中具有吞噬功能的经典型单核细胞和激活的CD14+CD169+单核细胞比例也发生明显增多。CD8+CD38+T作为外周血CD4+T计数恢复的指标在HAART治疗SIVmac239感染恒河猴模型体内得到了验证。
王炳花[6]（2019）在《类风湿性关节炎多水平潜在生物标志物的筛选与评价》文中进行了进一步梳理类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种导致关节炎症和破坏的慢性滑膜疾病,其残疾率高、预后差、治愈率低,给社会和家庭带来沉重的负担,已成为国内外重要的公共卫生问题。RA的发病机制复杂,环境、遗传、感染和内分泌等因素均可影响该病的发生发展,其中遗传学因素可以解释RA大约50-60%的易感性。在多个水平都存在RA的生物标志物,从遗传学角度研究RA的发病机理和寻找新的早期易感标志物是目前风湿病学界的研究热点和方向。循环细胞因子是非常有前景的一类潜在标志物,而蛋白芯片技术可以快速、高效、准确的分析血浆细胞因子表达谱,利用此方法可以系统地筛选RA相关的血浆潜在生物标志物。此外,GWAS问世以来已经鉴定了很多功能性的遗传位点,这些位点可以作为潜在生物标志物,需要对它们进行进一步的筛选与评价。这些SNP大部分都处于非编码区,关于非编码区SNPs的功能机制尚不清楚,很多与RA有关的功能性SNPs还没有被挖掘出来,因此有必要对RA的GWAS结果进行全面的功能注释来挖掘RA有关的遗传位点。另外,GWAS已经鉴定出一百多个与RA相关的SNPs,但这些SNPs对RA产生影响的基因或功能性DNA元件往往是未知的,eQTL数据库只能分析SNPs与mRNA的关联性,所以需要一种新的手段或方法（SMR）将现有的GWAS和eQTL数据综合分析来筛选RA相关的新的易感基因并探讨其潜在的功能意义。第一章目的:利用细胞因子芯片技术检测RA有关的血浆细胞因子表达谱并进一步探讨其在RA发病过程中所起的作用。材料和方法:首先用人细胞因子抗体440芯片对18名受试者（9例RA病例和9例对照）进行了血浆细胞因子蛋白芯片分析;然后用ELISA对筛选的差异血浆细胞因子在新的独立样本（40例RA病例和40例对照）中验证;接下来在类风湿性关节炎纤维样滑膜细胞（MH7A）和T淋巴细胞（Jurkat）中进行体外功能实验,明确血浆细胞因子对RA的致病机理;最后利用ROC曲线和曲线下面积（AUC）对血浆细胞因子进行评价。结果:细胞因子芯片从RA病例和对照血浆中共筛选到7个差异细胞因子,根据信号强度及统计学差异我们最终选择PDGF-BB进行后续实验。ELISA结果显示RA病例中PDGF-BB的表达水平明显高于对照组（P=0.005）,细胞实验结果显示,PDGF-BB可以明显促进MH7A细胞的增殖,可能是通过抑制细胞凋亡和改变细胞周期进程实现的,此外还可以明显促进细胞迁移。PDGF-BB对Jurkat细胞的功能要弱于MH7A,虽然可以促进Jurkat细胞增殖,但对细胞凋亡、周期和活化没有明显的影响,不过PDGF-BB可以明显促进炎症因子分泌来影响T细胞功能。ROC曲线及AUC表明PDGF-BB评估RA的准确性不高。结论:本研究评估了与RA相关的血浆细胞因子表达谱,并结合ELISA的方法证实了 PDGF-BB在RA中高表达。体外实验证实PDGF-BB可以通过促进Jurkat细胞增殖和炎症因子分泌来影响T细胞活性;同时通过促进滑膜细胞的增殖和迁移、抑制其凋亡和改变周期进程来影响RA的发病及进展。PDGF-BB用于评估RA的诊断价值比较低,不足以作为RA的潜在生物标志物。第二章目的:对GWAS研究中RA有关的SNPs进行全面的功能注释以探寻新的遗传位点并阐明其生物学功能。材料和方法:从公共数据库中下载RA有关的GWAS数据,按照P<5×10-8的标准筛选有意义的SNPs,然后利用在线工具UCSC对这些SNPs进行注释以确定其功能分区。编码区的SNPs主要分析错义突变的SNPs对蛋白质的损伤作用;3’-UTR区的SNPs,利用MirSNP数据库预测与UTR序列的结合亲和力;内含子区域的SNPs,首先确定这些SNPs是否处于增强子区域,然后针对启动子和增强子区域的所有SNPs,利用在线工具SNP2TFBS预测可以影响转录因子结合的SNPs,并观察这些SNPs主要富集的转录因子。最后将富集的转录因子在我们的内部样本中（RA病例和对照）观察差异表达情况。结果:我们根据基因位置对11179个亚洲特异性和22959个欧洲特异性的SNPs进行了注释。在编码区共鉴定了 19个亚洲特异性和32个欧洲特异性的错义突变的SNPs在一种算法中可能对蛋白质有损伤,其中有3个SNPs:rs3819268、rs34536443和rs14398用三种算法都可以检测到对蛋白质的损伤。亚洲人群和欧洲人群3’-UTR区分别鉴定了 36和37个SNPs与miRNA结合影响基因靶向调控。其中亚洲人群中的SNP rs9104可能通过与miRNA hsa-miR-4474-5p结合来调控靶基因BTN3A2,而欧洲人群鉴定到的遗传位点rs1573298可能是通过与miRNA hsa-miR-664a-3p的结合来对TRIM10基因进行调控。启动子区域分别有9个亚洲特异性和43个欧洲特异性的SNPs可以影响转录因子结合,分别富集于7/7个不同的转录因子上。内含子区域分别有1162个亚洲特异性和3261个欧洲特异性的SNPs具有增强子活性,可以影响转录因子结合的分别有281个（亚洲）和839个（欧洲）,这些SNPs分别富集于8/21个转录因子上。富集的转录因子在内部样本（25个RA病例和18个对照）中差异表达的分别有6个（亚洲）和8个（欧洲）。结论:我们从亚洲人群共鉴定了 19个错义SNPs,36个3’-UTR SNPs,9个启动子SNPs和281增强子SNPs,这些功能性SNPs影响的基因有6个可以在RA病例对照间差异表达。在欧洲人群共鉴定了 32个错义SNPs,37个3’-UTR SNPs,43个启动子SNPs和839增强子SNPs,共有8个对应的基因在RA病例和对照之间差异表达。第三章目的:利用基于综合数据的孟德尔随机化（summary data-based Mendelian randomization,SMR）的方法鉴定RA有关的新的易感基因,并探讨其生物学意义。材料和方法:GWAS数据库来源于最大的一项关于RA的meta分析,四个eQTL数据库分别来自Westra等人对外周血样本完成的一项meta分析中包含的数据、GAGE的外周血样本数据、来自GTEx项目的10个脑区的meta分析的eQTL数据和来自Geuvadis等人总结的淋巴细胞系的eQTL数据。利用SMR将GWAS数据库和eQTL数据库的信息进行分析,然后将得到的基因进行富集分析和蛋白交互作用分析,最后在三个RA有关的GEO数据库和我们自己的内部样本（RA病例和对照）进行验证。结果:用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。这些基因中,三个人群分别有2、18和9个基因在GWAS研究中的P值大于5×10-8,可能是GWAS分析中遗漏的RA有关的新的易感基因。所有筛选的基因中,在GEO数据库和我们自己的内部样本中得到验证有42个,其中高度验证的有11个,包括2个亚洲特异性（PADI4和HLA-DQB1）、6个欧洲特异性（FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、ABCF1 和 CD40）和 9 个跨种族基因（IFNAR2、CD226、FADS1、FCRL3、ABCF1、SYNGR1、FLOT1、CD40 和 PADI4）,6 个基因（FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226）在GWAS研究中不属于顶端基因,即P值大于5×10-8,只有IFNAR2在以往的研究中没有被报道过与RA关联。此外,还有一些基因虽然没有在GEO数据库和内部样本中得到验证,但也不能排除与RA无关联,这些基因包括3个亚洲特异性、8个欧洲特异性和9个跨种族基因。结论:本研究用SMR的方法分别从亚洲、欧洲和跨种族人群中筛选到8、34和32个RA有关的易感基因。在GEO数据库和内部样本库中可以得到验证的基因共有42个,其中高度证实的有11个,包含2个亚洲特异性、6个欧洲特异性和9个跨种族基因。其中P值大于5×10-8的基因包括FCRL3、FADS1、SYNGR1、TRAF1、IFNAR2和CD226。该结果不仅大大提高了我们对RA遗传易感性的认识,而且为两个种族类风湿性关节炎的种族遗传同质性和异质性研究提供了重要的见解。
任静强[7]（2014）在《美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究》文中研究指明当前，美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（NA-type PRRSV）已经在我国广泛流行，但近年来的数据分析表明，欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（EU-typePRRSV）也已经传入我国，且有证据表明两种基因型不同毒株之间可以发生内部重组。因此，根据当前形势，我国不仅要考虑美洲型PRRSV的预防，同时又要加强欧洲型PRRSV的防控。另外，临床上PRRSV与2型猪圆环病毒（PCV2）混合感染十分普遍，现已证明PCV2和PRRSV均能感染单核细胞系细胞，PRRSV可增强PCV2的复制能力，使血液中PCV2含量的增加，增强IL-10的表达量，抑制了T细胞的免疫反应，导致PCV2逃避宿主的免疫应答。目前商业化的疫苗尚不能有效的防治PRRSV和PCV2的混合感染。本实验以美洲型PRRSV CC株的ORF3、ORF5基因，欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2ORF2基因为基础，构建了欧洲型PRRSV重组核酸苗（pVAX1-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组核酸苗（pVAX1-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组核酸苗（pVAX1-ORF2-EU-ORF3-ORF5），同时利用同源重组的理论和技术，以痘苗病毒天坛株（E3L）作为改造对象，构建TK基因缺失型天坛株痘苗病毒减毒疫苗，成功构建了欧洲型PRRSV重组痘苗病毒（rVV-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组痘苗病毒（rVV-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5）、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组痘苗病毒（rVV-ORF2-EU-ORF3-ORF5）。利用筛选标记对重组痘病毒进行筛选、鉴定，最后通过小鼠和猪体动物实验，分析其免疫特性，检测这些疫苗诱导动物机体产生的特异性体液和细胞免疫应答能力，筛选出具有良好应用前景的治疗性疫苗，并建立有效的免疫策略。结果得出所构建的核酸疫苗和重组痘病毒疫苗具有良好免疫原性和反应原性，能诱导小鼠和猪体特异性体液和细胞免疫应答，猪体用PRRSV（LV株和NM12株）和PCV2攻毒后能够提供有效的免疫保护。另外证明prime-boost疫苗免疫策略可以增强体液和细胞免疫应答，尤其是用重组痘病毒疫苗rVV-EU-ORF3-ORF5首次免疫，DNA疫苗（pVAX1-EU-ORF3-ORF5）加强免疫的方法可以更好的抵抗PRRSV的感染，并能在体内抑制病毒的复制。最后，通过实验动物表明选择适宜的佐剂和合适DNA递送系统可以增强prime-boost的免疫反应。QuilA疫苗佐剂在PRRSV疫苗产生的免疫反应和保护效率方面具有良好的前景，DNA疫苗用壳聚糖包裹，以DNA-壳聚糖纳米粒的递送方式进行免疫可能是个很好的选择。总之，未来的PRRSV和PCV2疫苗在抵抗病毒感染方面必须更安全，更有效，更有潜力。
刘向阳[8]（2014）在《湿邪与HIV携带者免疫指标的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的：通过观察自然病程中感染湿邪的HIV携带者免疫指标水平的变化，揭示湿邪对自然病程中HIV携带者免疫功能低下的影响，并探讨HIV携带者CD4+T淋巴细胞、HIVVL、免疫指标与中医病性证素湿的关系及可能相关性。方法：本研究在前期临床及实验研究工作的基础上，通过对40例随机入组的HIV携带者的症状和体征的调查，结合中医辨证理论，运用证素辨证分析方法，分析证素积分湿的等级分布，并检测其免疫指标CD4+T淋巴细胞、IL-2、IL-6、IL-8水平状况及HIVVL的水平。建立数据库，结果采用SPSS17.0软件进行分析比较CD4+T淋巴细胞计数、HIVVL、IL-2、IL-6、IL-8在不同等级组间的差异及与湿邪病性证素积分的相关性。结果：1.随机入组的HIV携带者中近半数受检者湿邪病性证素积分属于3级,但是有15%受检者为0级，15%受检者属于1级，20%受检者属于2级；并且此病患中存在饮食偏嗜（偏热较多）及五味偏嗜（偏甜较多）。2.各检测指标在湿邪病性证素积分组间的分布情况：CD4+T淋巴细胞、IL-2在湿邪病性证素积分的组别之间均无显着差异（P＞0.05）,无统计学意义，但随着湿邪病性证素积分的增加，CD4+T淋巴细胞、IL-2呈小幅度下降趋势。HIVVL、IL-6、IL-8在0级与3级湿邪病性证素积分组别之间差异显着（P＜0.05），有统计学意义；且HIVVL随着湿邪病性证素积分的增加，病毒载量呈明显升高趋势。IL-6、IL-8在1级与3级湿邪病性证素积分组别之间差异显着（P＜0.05），有统计学意义；IL-8在2级与3级湿邪病性证素积分组别之间差异显着（P＜0.05），有统计学意义。各指标与湿邪病性证素积分的相关性结果显示：HIVVL、IL-6、IL-8均与湿邪病性证素积分呈正相关关系；而CD4+T淋巴细胞、IL-2与湿邪病性证素积分均无统计学意义上的相关性。3.各级别中各指标与湿邪病性证素积分的相关性分析：感染湿邪程度的不同，其指标与湿邪病型证素积分的相关性各异。无感染湿邪和轻度感染湿邪中各指标与湿邪病型证素积分均无统计学意义上的相关性；中度感染湿邪组IL-6与湿邪病型证素积分呈正相关关系；重度感染湿邪组IL-2与湿邪病型证素积分呈负相关关系。结论：1.本研究结果表明在自然病程中HIV携带者中感染湿邪偏多，为临床中医病因病机，辨证论治提供依据。饮食五味的偏嗜可以为HIV携带者日常生活习惯提供一种参考，应少食甜腻辛辣之品，以免助湿。2.本研究表明CD4+T淋巴细胞、HIVVL、IL-2、IL-6、IL-8与HIV携带者病情变化关系密切，还可以作为了解HIV携带者体内免疫激活状态，并可视为其治疗效果及预后判断的重要指标之一。3.本研究提示HIV携带者的CD4+T淋巴细胞、HIVVL、IL-2、IL-6、IL-8与湿邪病性证素积分关系密切，其各指标水平变化在一定程度上受湿邪变化的影响，感染湿邪的程度对各指标水平的变化有一定的预测性，但其各指标与湿邪病型证素积分之间不能完全相互反映。4.本研究还提示CD4+T淋巴细胞、HIVVL、IL-2、IL-6、IL-8各指标间存在一定相关性，其之间的相关性对HIV携带者病程的进展或药物疗效的判定有一定价值，可以作为参考指标之一，但机制尚不明确，有待进一步研究。
王常荣[9]（2013）在《黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究》文中提出大型真菌作为天然活性成分的重要来源,其代谢产物种类丰富,具有多种独特的化学结构和生理活性。本实验以食用真菌为研究对象,围绕其抗氧化活性成分的分离纯化,抗HIV-1和免疫调节活性以及相关作用机制进行研究。本研究首先利用红细胞溶血和脂质过氧化抑制实验,对64株大型真菌的粗提物进行了抗氧化活性测定,确定以黄伞（Pholiota adiposa）子实体作为研究对象。然后利用乙醇提取、乙酸乙酯萃取、NKA大孔吸附树脂、Sephadex G-15和Sephadex LH-20分子筛凝胶层析以及高效液相色谱（HPLC）等层析方法,首次从黄伞中分离纯化得到三个小分子活性成分PB3、HEB和PC3-3。通过定性试验、质谱、红外光谱以及与相应标准品HPLC保留时间的比对,确定第一个成分为腺苷（adenosine, C10H13N5O4, PB3）,第二个成分为没食子酸甲酯（methyl gallate, C8H8O5, HEB）,第三个成分为甾体皂苷类化合物（steroidal saponins,PC3-3）。反应浓度为250μg/ml时,PC3-3和HEB对红细胞氧化溶血的抑制率为26.9%和82.4%,抑制脂质过氧化率达88.2%和17.3%,PC3-3和HEB分别在不同的体外检测体系中显示出极强的抗氧化活性。此外,HEB对超氧阴离子和DPPH自由基都具有较强的清除活性,250μg/ml浓度下清除率分别达到71.4%和85.6%。为了大规模筛选具有胞内抗氧化活性的化合物,本实验将具有氧化还原敏感性质的绿色荧光蛋白（redox-sensitive green fluorescent protein, croGFP）基因在大肠杆菌中进行表达,构建了能够通过GFP荧光强度水平定量表征细菌胞内氧化还原水平的检测模型。鉴于抗氧化与抗HIV-1之间的密切关系,进一步将croGFP基因在HIV-1病毒宿主细胞系TZM-BL中进行表达,TZM-BL细胞基因组内整合了HIV-LTR调控的荧光素酶基因luc序列,从而得到了通过GFP荧光强度表征胞内氧化还原水平、荧光素酶活性表征病毒LTR激活水平的抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型。利用大肠杆菌胞内抗氧化筛选模型（E. coli-croGFP）,对具有体外抗氧化活性的真菌提取物进行再次检测发现,仅有包括黄伞、红菇、NK2100、猴头、褐孔菌和早北c滑在内的六种食用菌菌丝浸提物能够显示一定的胞内抗氧化活性,证明体外抗氧化成分并不一定能够进入细胞内发挥活性。利用抗氧化、抗HIV-1细胞检测模型（TZM-BL-croGFP）,通过流式细胞仪和发光检测仪对细胞内的GFP荧光强度和Luc酶活性进行检测发现,活性氧刺激使细胞内氧化还原水平升高会直接激活HIV-1启动子LTR调控的下游基因表达,证实了氧化应激与HIV-LTR转录激活之间的直接关系。HEB能够有效地抑制双氧水诱导的胞内氧化应激,抑制率IC50达26.0μM；并且抑制了由于细胞内氧化水平升高引起的HIV-LTR激活,能够将200μM H2O2刺激指示细胞系产生的信号从18.2%降低到2%左右；HEB还能够抑制HIV-1假病毒感染TZM-BL细胞的复制增殖,其抑制率IC50达到11.9μM,证明了抗氧化剂HEB具有抗HIV-1活性。这两个胞内检测模型具有接近生理状态、成本低、操作简单快速、重复性好等优点,适合用于抗氧化、抗HIV-1活性成分的大规模筛选。’为进一步对HEB的抗氧化、抗HIV-1作用机制进行研究,本实验利用Western blot对细胞内核转录因子NF-κB活化情况进行检测发现,H202能够激活细胞内NF-κB活化,促进阻遏蛋白IκB降解,使NF-κB与IκB解离并进入细胞核内行使功能。天然抗氧化成分HEB能够有效抑制NF-κB的活化入核,并防止IκB降解,从而抑制H202引起的氧化应激导致的NF-κB信号途径活化,阻止NF-κB与HIV-1启动子LTR上的κB靶序列结合,抑制病毒复制转录。本研究发现,抗氧化成分HEB具有生物多效性,能够通过多个靶点抑制HIV-1病毒复制。与病毒感染2h完成进入过程后给药相比,HEB预保护能够更好地抑制HIV-LTR激活,证明HEB对病毒感染的进入过程具有一定的抑制作用,但又不仅限于此。进一步利用实验室已有的HIV-1三大关键酶活性检测体系进行实验发现,抗氧化剂HEB对HIV-1逆转录酶和整合酶活性都有不同程度的抑制作用,抑制率IC50分别达到80.1μM和228.5μM,并且在200μM浓度下对HIV-1蛋白酶的抑制率也达到17%左右。所以HEB对HIV-1生长周期中包括病毒进入、逆转录、整合和成熟蛋白加工在内的多个过程产生影响。细胞因子在免疫系统中作用十分重要,黄伞中的活性成分能够调节细胞因子的转录。通过小鼠腹腔给药体内实验,实时定量PCR检测脾细胞内细胞因子的mRNA变化情况,结果发现HEB能够显着提高IFN-γ的表达到两倍以上,同时下调Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达至50%左右,有利于调节艾滋病患者体内Th1/Th2型细胞因子失衡的状态。而PB3则通过提高细胞因子合成抑制因子IL-10的表达至约1.5倍,以及不同程度的下调包括IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-6在内的多种细胞因子的表达,体现出较强的抗炎症作用。综上所述,本研究从抗氧化、抗HIV-1和免疫调节三方面对黄伞中的活性成分进行了检测,并且对其活性作用靶点和作用机制进行了研究,同时构建了两种新型抗氧化、抗HIV-1活性胞内检测模型,并对这两种活性之间的关系进行了研究和探讨。具有生物安全性和多效性的天然活性成分为克服HIV-1病毒耐药性提供了新的方向,也为开发新型抗艾滋药物奠定了基础,具有十分重要的研究意义和良好的应用前景。
王宇航[10]（2012）在《TE3L/TE4L缺失型天坛株痘苗病毒的构建及免疫原性分析》文中研究指明自1982年痘苗病毒（Vaccinia Virus, VACV）作为载体首次用于表达外源基因以来，痘苗病毒广泛应用于外源基因的表达、重组活病毒载体疫苗的研究。痘苗病毒在不断地发展历程中，经历了野生型痘苗病毒、经组织培养后的野生型痘苗病毒、连续传代进行减毒的痘苗病毒、基因工程修饰型痘苗病毒，但目前研究的重点依然是增加病毒疫苗或载体应用安全性的同时保持或增强免疫原性。痘苗病毒自然感染人类产生较轻微的症状，但接种免疫抑制人群可能引起脑炎、进行性痘病毒扩散等严重的不良反应。然而由于痘苗病毒具有较长的应用历史、可允许大量的外源基因插入、蛋白表达高效及免疫原性较好等优点，因此，构建一株安全、高效的痘苗病毒载体在基因工程疫苗等研究中具有重要意义。本研究通过同源重组技术缺失痘苗病毒毒力相关基因，旨在构建一株减低痘苗病毒毒力但不影响甚至提高免疫效力的病毒载体。以中国天坛株痘苗病毒（Vaccinia virus Tian Tan, VTT）为基础，设计TE3L/TE4L基因侧翼重组臂基因，通过同源重组靶向完全敲除VTT基因组中的TE3L/TE4L基因。以增强型绿色荧光蛋白（enhance green fluorescent protein, EGFP）作为筛选标记，筛选得到重组EGFP的痘苗病毒天坛株，经PCR方法鉴定正确后利用Cre/LoxP系统敲除标记基因，获得基因缺失型VTT （TE3/4L-VTT）。然后对病毒的生物学特性如病毒的形态、复制等方面进行检测，以便为了解基因的缺失对于病毒复制及形态发生的影响。另外，本研究还对TE3/4L-VTT的毒力进行了体内外分析。首先在BHK-21、Vero、HeLa、MDCK、PK15五种细胞中对TE3/4L-VTT和野生型VTT的扩散能力及细胞毒性通过结晶紫染色和MTT分析进行检测。然后，以BALB/c小鼠和新西兰白兔为动物模型，通过不同的感染途径分析TE3/4L-VTT和野生型VTT的体内毒力，即通过鼻腔和颅内感染小鼠，监测小鼠体重变化及死亡率；皮内感染家兔皮肤分析不同滴度的TE3/4L-VTT对家兔皮肤的损伤。进而，以BALB/c小鼠为模型，分析TE3/4L-VTT和野生型VTT的免疫原性。通过脾T淋巴细胞体外转化增殖试验、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群、ELISPOT试验以及ELISA检测血清中IL-2、IL-4含量和特异性抗体水平等试验，分析免疫后小鼠机体的免疫应答状态，进而评价基因缺失型痘苗病毒的免疫原性。结果表明，利用痘苗病毒穿梭载体、EGFP及Cre-LoxP系统，成功构建了缺失TE3L/TE4L基因的天坛株痘苗病毒，具有良好的遗传稳定性。电镜观察痘苗病毒的形态和形态发生结果显示TE3L/TE4L基因的缺失对病毒的形态发生没有影响。以Vero和BHK-21为宿主细胞，分析病毒的复制能力，结果显示TE3/4L-VTT具有和VTT一样的复制能力，说明TE3L和TE4L基因的缺失不影响病毒的正常复制。但结晶紫染色和MTT实验检测结果发现TE3/4L-VTT在细胞中的扩散速度较野生型VTT弱，对细胞的损伤减弱。鼻腔感染小鼠结果表明，TE3/4L-VTT对小鼠体重的影响较小，而野生型VTT致使小鼠体重显着降低。颅内感染小鼠发现TE3/4L-VTT感染小鼠14天内甚至更长时间内均没有死亡现象，而VTT感染小鼠表现出精神萎靡、被毛凌乱，有死亡现象。TE3/4L-VTT皮内感染家兔皮肤没有出现明显痘斑，注射后仅在接种部位出现微红，很快恢复正常；但是VTT感染部位皮肤红肿并形成溃烂斑，并需要长时间恢复。综合以上结果表明，TE3L和TE4L的缺失没有影响病毒的形态发生及复制，但显着降低了痘苗病毒天坛株的毒力。另外，对特异性抗体、细胞因子、T细胞亚型、T细胞增殖活性及IFN-γ分泌能力等各项指标的检测结果显示，TE3/4L-VTT可诱导机体分泌IFN-γ的T细胞数量的产生，CD4+和CD8+T细胞数增加，且脾T细胞在体外接受灭活的VTT刺激下活化增殖。而且还可诱导较高的VTT特异性抗体水平，以及IL-2和IL-4的分泌。加强免疫后60天时，ELISPOT检测结果显示，痘苗病毒可诱导免疫记忆的产生。综合以上结果，基因缺失型痘苗病毒可激发机体细胞和体液免疫应答，与野生型VTT的免疫原性没有显着差异。以上结果表明，TE3L/TE4L基因的缺失在不影响免疫原性的基础上减弱了痘苗病毒的毒力，提高了病毒的安全性。该病毒载体有望成为重组痘苗病毒载体疫苗或疫苗株的研究提供了新材料。
二、共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究（论文提纲范文）
（1）白介素2相关基因表达预测头颈部鳞癌免疫亚型及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 基于多组学筛选头颈部鳞癌预后信号通路及构建免疫亚型预测模型 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据的收集与处理 |
| 2.1.1 数据来源及排除纳入标准 |
| 2.1.2 头颈部鳞癌多组学数据下载与整理 |
| 2.1.3 免疫检查点抑制剂治疗疗效相关数据集下载与整理 |
| 2.1.4 本中心头颈部鳞癌患者临床信息及生存随访数据收集 |
| 2.2 细胞过程功能注释 |
| 2.3 主成分分析(Principal component analysis,PCA) |
| 2.4 聚类分析(Cluster analysis) |
| 2.5 重抽样交叉验证 |
| 2.6 筛选免疫亚型相关基因 |
| 2.6.1 K-means无监督一致性聚类分析 |
| 2.6.2 1000次Lasso-Logistic回归分析 |
| 2.7 头颈部鳞癌免疫亚型预测算法(IRIM algorithm) |
| 2.7.1 5000 次自助法重抽样分析(Bootstrapping) |
| 2.7.2 模拟“投票”机制构建免疫亚型分类算法 |
| 2.8 肿瘤纯度分析(Estimate) |
| 2.9 单样本基因富集分析(ss GSEA) |
| 2.10 免疫组化化学染色 |
| 2.10.1 主要试剂 |
| 2.10.2 主要仪器 |
| 2.10.3 实验方法 |
| 2.11 甲基化特异PCR(MSP)检测 |
| 2.12 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 数据的下载与整理 |
| 3.2 多组学通路(Pathway)分析 |
| 3.2.1 预后通路分析 |
| 3.2.2 预后关键通路生存分析 |
| 3.3 多组学基因模块(Module)分析 |
| 3.4 Interleukin-2 family signaling通路核心基因聚类特征分析 |
| 3.5 Interleukin-2 family signaling通路核心基因与免疫分型及免疫疗效的关系 |
| 3.6 IRIM免疫预测模型的构建 |
| 3.7 IRIM免疫预测模型在头颈部鳞癌中的应用 |
| 3.8 IRIM免疫预测模型在泛癌中的应用 |
| 3.9 IRIM模型&Interleukin-2familysignaling通路中关键基因的实验验证 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 IRIM模型在头颈部鳞癌肿瘤免疫分型中的生物学意义 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据的收集与处理 |
| 2.1.1 数据来源 |
| 2.1.2 数据质量控制与归一化 |
| 2.2 主成分分析（PCA） |
| 2.3 细胞聚类 |
| 2.4 各个细胞亚群之间的差异基因 |
| 2.5 细胞类型注释 |
| 2.5.1 Single R包进行细胞类型注释 |
| 2.5.2 标签基因进行细胞类型注释 |
| 2.6 通路富集分析 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞聚类与注释 |
| 3.2 IRIM模型识别的细胞类型 |
| 3.3 T细胞亚群注释 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 生物信息学技术在免疫治疗头颈部恶性肿瘤中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 布病与宿主的免疫细胞 |
| 1.2.1 布病与固有免疫反应 |
| 1.2.2 布病与适应性免疫反应 |
| 1.3 布病中Th细胞相关趋化因子的作用 |
| 1.3.1 布病中的趋化因子受体CXCR3 |
| 1.3.2 布病中的趋化因子受体CCR4和CCR6 |
| 1.3.3 布病中的趋化因子受体CCR10 |
| 1.4 布病中的免疫耗竭 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 研究对象组成 |
| 2.2 主要仪器 |
| 2.3 主要试剂 |
| 2.4 实验方法 |
| 第一部分:布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群及相关因子免疫动态分析 |
| 2.4.1 样本采集 |
| 2.4.2 外周血单个核细胞(PBMC)分离制备 |
| 2.4.3 流式细胞术测定Th细胞亚群 |
| 2.4.4 微量样本多指标流式蛋白定量技术(Cytometric Bead Array,CBA)检测血清IFN-g、IL-17、TNF-α细胞因子水平 |
| 2.4.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)方法测样本血清中IL-22 的浓度 |
| 第二部分:布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NK cells)转录组表达和免疫细胞相互作用的分析 |
| 2.4.6 实时定量聚合酶链反应(q PCR)检测 |
| 2.4.7 RNA测序(RNA-seq)及差异基因表达分析 |
| 2.5 统计学方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 第一部分:布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群及相关因子、趋化因子受体的免疫动态分析 |
| 3.1 布病患者的一般情况和临床资料 |
| 3.1.1 布病患者组和健康对照组的一般情况 |
| 3.1.2 布病患者组和健康对照组的临床资料 |
| 3.2 布病患者外周血Th1,Th17,Th22淋巴细胞亚群的表达情况 |
| 3.2.1 布病患者外周血各淋巴细胞亚群的表达 |
| 3.2.2 布病患者组与健康对照组外周血各淋巴细胞亚群表达情况的差异 |
| 3.2.3 布病患者治疗前和治疗后外周血淋巴细胞亚群表达频率的变化趋势 |
| 3.2.4 Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群分布的相关性 |
| 3.2.5 非重症组、重症组患者与健康对照组外周血淋巴细胞亚群表达频率的差异 |
| 3.2.6 根据布病患者靶器官损伤情况,分析Th1、Th17和Th22淋巴细胞亚群的分布 |
| 3.2.7 小结 |
| 3.3 布病患者外周血细胞因子IFN-g、IL-17A和IL-22水平,以及其与临床指标的相关性分析 |
| 3.3.1 布病患者外周血细胞因子IFN-g、IL-17A和IL-22水平 |
| 3.3.2 布病患者组与健康对照组外周血清中细胞因子IL-10水平的差异 |
| 3.3.3 布病患者外周血细胞因子水平与临床指标的相关性 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 布病患者外周血Th1、Th17、Th22细胞亚群的相关趋化因子及受体表达情况 |
| 3.4.1 布病患者Th1细胞亚群中趋化因子受体CXCR3的表达水平 |
| 3.4.2 布病患者组Th17细胞亚群中趋化因子受体CCR4、CCR6的表达水平 |
| 3.4.3 布病患者组Th22细胞亚群中趋化因子受体CCR4、CCR6和CCR10的表达水平 |
| 3.4.4 布病患者治疗前和治疗后外周血Th淋巴细胞亚群中趋化因子受体表达的变化趋势 |
| 3.4.5 根据细胞表面表达的趋化因子受体水平重新定义Th细胞亚群,验证各Th细胞亚群分布情况 |
| 3.4.6 Th1细胞亚群与Th2细胞亚群失衡 |
| 3.4.7 小结 |
| 第二部分:布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NK cells)转录组表达和免疫细胞相互作用的分析 |
| 3.5 布病患者T淋巴细胞、单核细胞(MO cells)和自然杀伤细胞(NKcells)转录组表达谱的检测 |
| 3.5.1 mRNA的质量检测与控制 |
| 3.5.2 基因表达数据的筛选和质控 |
| 3.5.3 基因表达定量分析 |
| 3.5.4 差异表达基因分析 |
| 3.5.5 qPCR验证差异表达基因 |
| 3.5.6 布病患者T细胞和MO细胞差异表达基因相关性分析 |
| 3.5.7 小结 |
| 第4章 结论与创新点 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附件1 纳入布病患者确诊标准 |
| 附件2 患者靶器官损伤及分组情况 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
（4）基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 文献研究一 慢性乙型肝炎中医证候客观化规范化研究概述 |
| 1 中医对CHB病名的认识 |
| 1.1 肝着 |
| 1.2 肝毒 |
| 1.3 胁痞 |
| 1.4 异湿 |
| 2 中医对CHB病因病机的认识 |
| 2.1 湿热疫毒是本病的始动因素 |
| 2.2 毒损肝络是本病的病机关键 |
| 2.3 正气之盛虚决定本病的转归及预后 |
| 2.4 发则有证可辨,伏则无机可循为本病的发病特点 |
| 3 CHB中医证候分型指南与标准 |
| 4 影响CHB中医证候分布的相关因素 |
| 4.1 不同地域的CHB证候分布具有差异性 |
| 4.2 体质类型与CHB证候分布具有相关性 |
| 4.3 情志及生存质量的改变是部分CHB证候分布的易感性因素 |
| 5 中医证候的客观化规范化研究 |
| 5.1 肝功能指标 |
| 5.2 肝组织病理分级分期 |
| 5.3 肝脏硬度及肝纤维化值 |
| 5.4 细胞因子及免疫蛋白 |
| 5.5 HBV基因型 |
| 5.6 基因组学 |
| 5.7 转录组学 |
| 5.8 蛋白组学 |
| 5.9 代谢组学 |
| 6 小结 |
| 文献研究二 DNA甲基化在中医证候的应用研究 |
| 1 DNA甲基化概述 |
| 2 DNA甲基化在CHB发病机制中的作用 |
| 2.1 DNA甲基化与HBV |
| 2.2 Cp G岛与HBV基因型 |
| 2.3 DNMTs与 HBV |
| 2.4 甲基化相关蛋白与CHB |
| 3 DNA甲基化在中医证候的应用 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化及HBV相关蛋白的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规检测方法 |
| 2.2 ELISA检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般资料收集结果 |
| 3.2 乙肝两对半定性检测结果 |
| 3.3 生化指标检测结果 |
| 3.4 HBV定性定量检测结果 |
| 3.5 DNA甲基化及HBV相关蛋白检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医证候与DNMT1间关系的探讨 |
| 4.2 中医证候与MeCP2间关系的探讨 |
| 4.3 中医证候与P53间关系的探讨 |
| 4.4 中医证候与E-cad间关系的探讨 |
| 4.5 中医证候与P16间关系的探讨 |
| 5 小结 |
| 实验二 慢性乙型肝炎全基因组DNA甲基化的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集 |
| 2 方法 |
| 2.1 Infinium Human Methylation850K甲基化芯片简介 |
| 2.2 DNA抽提 |
| 2.3 DNA样本质检 |
| 2.4 DNA甲基化芯片实验流程 |
| 2.5 DNA甲基化芯片数据分析流程 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNA样本质检结果 |
| 3.2 实验质控结果 |
| 3.3 样本beta值密度曲线 |
| 3.4 数据归一化 |
| 3.5 差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.6 GO功能富集结果 |
| 3.7 KEGG pathway富集结果 |
| 3.8 差异甲基化区域结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 差异甲基化位点结果分析 |
| 4.2 差异甲基化位点相关基因GO功能富集结果分析 |
| 4.3 差异甲基化位点相关基因KEGG pathway富集分析 |
| 5 小结 |
| 实验三 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.2 不同中医证候GO功能富集结果 |
| 3.3 不同中医证候KEGG pathway富集结果 |
| 3.4 不同证候差异甲基化区域分布结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脾胃湿热证与肝郁脾虚证是四川地区CHB常见的中医证候 |
| 4.2 中医证候与DNA甲基化在理论上有共通之处 |
| 4.3 不同中医证候差异甲基化表达分析 |
| 5 小结 |
| 实验四 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化与mi RNA联合分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候中4条相同miRNA靶基因预测结果 |
| 3.2 不同中医证候差异甲基化位点相关基因筛选结果 |
| 3.3 miRNA预测靶基因与差异甲基化位点相关基因联合分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mi RNA与 DNA甲基化间存在相互调控关系 |
| 4.2 miR-122-5p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.3 miR-1228-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.4 miR-191-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中药干预DNA甲基化修饰的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群和血浆细胞因子研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HAART治疗感染者与未感染者差异基因的筛选及生物信息学分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第二部分 HAART治疗SIVmac239感染恒河猴血浆细胞因子与疾病特征的相关性分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 第三部分 HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群与疾病特征的相关性分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 艾滋病免疫激活研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人基本情况 |
| 硕士期间论文发表情况 |
（6）类风湿性关节炎多水平潜在生物标志物的筛选与评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 RA有关的血浆细胞因子的筛选及功能验证 |
| 研究背景 |
| 第一节 蛋白芯片筛选类风湿性关节炎相关的血浆细胞因子 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第二节 血浆细胞因子PDGF-BB的ELISA验证 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第三节 血浆细胞因子PDGF-BB的功能验证 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 第四节 血浆细胞因子PDGF-BB的评价 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 RA易感SNPS的综合功能注释 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三章 运用SMR的方法筛选与RA有关的易感基因 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 类风湿性关节炎生物标志的多组学研究 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间本人公开发表的论着 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（7）美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 美洲型、欧洲型 PRRSV 分子生物学特性和免疫学研究进展 |
| 第2章 PCV 分子生物学特性及免疫学研究进展 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 欧洲型、美洲型 PRRSV ORF3、ORF5 基因及 PCV2 ORF2基因的克隆与序列分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 欧洲型PRRSV及PCV2二联核酸疫苗的构建及小鼠实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价核酸疫苗和欧洲型 PRRSV、PCV2 二联核酸疫苗猪体实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 欧洲型、美洲型 PRRSV 二价重组痘病毒疫苗和欧洲型PRRSV、PCV2 二联重组痘病毒疫苗的构建及猪体实验免疫研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（8）湿邪与HIV携带者免疫指标的相关性研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 一、研究背景 |
| 1.艾滋病的现代免疫学研究 |
| 2.中医学理论在 HIV/AIDS 免疫学研究进展 |
| 二、对象与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 研究方案设计 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 1. 湿邪病性证素积分的等级分布 |
| 2. 各组别调查对象人口学特征 |
| 3. 各检测指标在湿邪病性证素积分的组间分布情况 |
| 4. 各指标间的相关性分析 |
| 5. 各等级湿邪病型证素积分中指标间的相关性分析 |
| 四、讨论 |
| 1. 现代医学对 HIV 携带者的认识 |
| 2. 祖国医学对 HIV 携带者的认识 |
| 3. 湿邪致病与其对各监测指标的影响 |
| 4. 存在的问题及展望 |
| 五、结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录一 病性证素为“湿”的无症状 HIV 感染者判定表 |
| 附录二 综述 |
| 参考文献 |
（9）黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第一节 菇类的抗氧化活性 |
| 1.1.1 菇类抗氧化活性研究概况 |
| 1.1.2 黄伞的研究情况 |
| 第二节 氧化还原水平与NF-κB信号途径 |
| 1.2.1 氧自由基与氧化损伤 |
| 1.2.2 抗氧化剂 |
| 1.2.3 抗氧化活性检测方法 |
| 1.2.4 NF-κB信号途径在氧化应激中的作用 |
| 第三节 HIV-1与抗艾滋病药物 |
| 1.3.1 艾滋病及HIV的分子生物学 |
| 1.3.2 抗艾滋病靶点及药物研究现况 |
| 第四节 选题依据与研究意义 |
| 1.4.1 抗氧化与抗HIV-1之间的关系 |
| 1.4.2 抗氧化、抗HIV-1活性成分筛选模型 |
| 1.4.3 黄伞中天然活性成分的多效性 |
| 第二章 黄伞中活性物质的分离纯化及结构分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 64株大型真菌的抗氧化活性测定及实验菌株的选择 |
| 2.3.2 黄伞中活性成分的提取途径和方法 |
| 2.3.3 黄伞中小分子活性物质的分离纯化 |
| 2.3.4 黄伞子实体中活性物质的结构鉴定 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 2.4.1 抗氧化活性的检测方法 |
| 2.4.2 黄伞子实体中活性成分的有效提取 |
| 2.4.3 黄伞子实体中活性物质的分析 |
| 第三章 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 表达具有氧化还原敏感性质GFP的基因工程大肠杆菌的构建 |
| 3.3.2 胞内抗氧化筛选模型E.coli BL21(pET-croGFP)的应用 |
| 3.3.3 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建 |
| 3.3.4 细胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的应用 |
| 第四节 分析与讨论 |
| 3.4.1 抗氧化成分筛选模型的比较 |
| 3.4.2 胞内抗氧化活性成分筛选模型的构建与应用 |
| 3.4.3 胞内抗氧化、抗HIV-1检测模型的构建与应用 |
| 3.4.4 黄伞中成分抗氧化与抗HIV-1活性之间的关系 |
| 3.4.5 天然活性成分的毒性评价 |
| 第四章 黄伞中抗氧化活性成分的抗HIV-1作用机制的研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.3.2 黄伞子实体活性成分的抗HIV-1作用机制 |
| 4.3.3 黄伞活性成分对SOD酶和细胞因子表达水平的影响 |
| 第四节 分析讨论 |
| 4.4.1 黄伞子实体抗氧化活性成分的作用机制 |
| 4.4.2 黄伞活性成分抗HIV-1作用靶点分析 |
| 4.4.3 活性成分对细胞因子表达的调节作用 |
| 第五章 结论与展望 |
| 第一节 结论 |
| 第二节 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）TE3L/TE4L缺失型天坛株痘苗病毒的构建及免疫原性分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 痘苗病毒在生物治疗中的发展 |
| 1.1 第一代 VACV 疫苗和全球天花的根除 |
| 1.2 疫苗接种的特性和疫苗接种并发症 |
| 1.3 野生型痘苗病毒的复制及其免疫原性 |
| 1.4 第二代疫苗：新形式的野生型 VACV |
| 1.5 第三代疫苗：通过连续传代减毒 |
| 1.6 第四代疫苗：通过基因工程手段减毒 |
| 1.7 暴露后免疫 |
| 1.8 结论 |
| 2 基因工程痘苗病毒的安全性及免疫效能 |
| 2.1 痘苗病毒在全球天花消灭之前的发展 |
| 2.2 痘苗病毒使用的安全性 |
| 2.3 疫苗载体的免疫效能 |
| 2.4 正痘病毒属抗原之间交叉反应及复制策略 |
| 2.5 IFN 抗感染作用 |
| 2.6 基因缺失型痘苗病毒 |
| 2.7 结论 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 基因缺失型痘苗病毒的构建和筛选 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 基因缺失病毒生物学特性及毒力分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 基因缺失型痘苗病毒免疫原性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
四、共表达HIV-1CN与IL-2基因产物免疫鼠T淋巴细胞亚群的研究（论文参考文献）
- [1]白介素2相关基因表达预测头颈部鳞癌免疫亚型及相关机制研究[D]. 杨博文. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]布鲁氏菌病患者Th淋巴细胞亚群的免疫动态评估及抑制性受体对免疫功能的影响分析[D]. 徐光. 吉林大学, 2020(01)
- [3]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020
- [4]基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究[D]. 马丽. 成都中医药大学, 2020(01)
- [5]HAART治疗SIVmac239感染恒河猴免疫细胞亚群和血浆细胞因子研究[D]. 田龙. 北京协和医学院, 2020(05)
- [6]类风湿性关节炎多水平潜在生物标志物的筛选与评价[D]. 王炳花. 苏州大学, 2019(06)
- [7]美洲型、欧洲型PRRSV及PCV2基因工程疫苗构建及实验免疫研究[D]. 任静强. 吉林大学, 2014(09)
- [8]湿邪与HIV携带者免疫指标的相关性研究[D]. 刘向阳. 河南中医学院, 2014(01)
- [9]黄伞中抗氧化成分的分离鉴定及其抗HIV-1作用机制研究[D]. 王常荣. 南开大学, 2013(06)
- [10]TE3L/TE4L缺失型天坛株痘苗病毒的构建及免疫原性分析[D]. 王宇航. 吉林大学, 2012(09)