一、Alteration of cadherin isoform expression and inhibition of gap junctions in stomach carcinoma cells（论文文献综述）
朱西[1]（2021）在《靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究》文中认为抗体药物偶联物（Antibody-drug conjugates,ADCs）通过化学接头将高效的细胞毒性分子与靶向肿瘤细胞表面特定抗原的单克隆抗体偶联,形成了一种新型的靶向药物递送策略。基于抗原抗体的特异性结合特征,ADCs能够选择性地向肿瘤细胞递送毒剂而不伤害正常细胞,极大程度地解决了化疗药物全身暴露及剂量限制性毒性问题,克服了传统细胞毒抗肿瘤药物治疗的主要临床障碍,具有传统化疗药物无法实现的特异性和疗效。以往,ADCs的开发大多围绕抗原分化特征明确的血液系统肿瘤及人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）阳性的实体瘤展开;随着对肿瘤生物学的深入了解以及病理分析技术的迅速发展,越来越多的具有高度差异性表达特征的细胞表面抗原被鉴定出来,ADCs的研发布局逐渐多元化起来。细胞间粘附分子Claudin 18.2和Nectin-4都是构成细胞间连接的重要跨膜蛋白,同时也是目前极具潜力的ADCs靶标。本论文构建了多种稳定表达人Claudin18.2以及人Nectin-4的肿瘤细胞模型,并以此为基础研究了分别靶向Claudin 18.2和Nectin-4的ADCs LZ1904和LMA282的抗肿瘤作用及机制。Claudin是构成紧密连接（Tight Junctions,TJs）的重要跨膜蛋白家族,具有不同的组织特异性表达模式。作为其中一员,Claudin 18.2仅在已分化的胃细胞中广泛表达,并在细胞恶性转化过程中得以保留。同时,研究发现,Claudin 18.2还在其他多种上皮来源的肿瘤中频繁异位激活。这种在正常细胞与肿瘤细胞间显着差异化表达特点促使Claudin 18.2成为极具潜力的肿瘤靶向治疗靶点。作为最早报道也是目前进展最快的以Claudin 18.2为靶点的药物,单克隆抗体IMAB362无论是作为单药还是与化疗药物联用,在临床上均显示出强大的抗肿瘤活性。因此,开发Claudin 18.2靶向药物具有巨大的临床意义。LZ1904是由靶向Claudin 18.2的单克隆抗体LZ1903与拓扑异构酶Ⅰ抑制剂9106-IM-2通过可裂解的连接子偶联而成的新型ADC。研究发现,LZ1904能够选择性地与Claudin 18.2阳性细胞结合,并被细胞内吞转运到溶酶体内,阻滞细胞周期在G2/M期、诱导细胞凋亡,对Claudin 18.2阳性胃癌、胰腺癌细胞具有显着的选择性增殖抑制作用。与此同时,LZ1904还能够通过旁观者效应杀伤邻近的Claudin 18.2阴性的肿瘤细胞,以及通过抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）直接杀伤Claudin 18.2阳性肿瘤细胞。总体而言,LZ1904在体外评价中显示出显着的选择性抗肿瘤作用,值得进一步体内抗肿瘤疗效评价。Nectin是属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,Ig SF）的细胞间粘附分子,是构成黏着连接（Adherens Junctions,AJs）的重要跨膜蛋白。与Nectin其他家族成员在正常成年人各组织中广泛表达不同,Nectin-4的表达通常局限于胎盘,且在成年人健康组织中表达受限。但是,研究发现,Nectin-4在多种人类癌症中异常过表达,尤其是在膀胱癌、乳腺癌、肺癌中,阳性患者比例均超过50%。同时,作为介导麻疹病毒入侵细胞的受体,Nectin-4本身具有显着的介导内吞能力。鉴于以上两点特征,Nectin-4是极具潜力的ADC靶标。事实上,以Nectin-4为靶点的ADC PADCEV?已于2019年成功获批上市,应用于尿路上皮癌（urothelial carcinoma,UC）的治疗,进一步证明了针对Nectin-4进行药物研发的可行性及巨大的临床潜力。LMA282是以Nectin-4为靶点开发的ADC,由特异性靶向人Nectin-4的单克隆抗体LM282和微管抑制剂MMAE偶联而成。结果显示,LMA282选择性地结合Nectin-4阳性细胞,并被内吞转运到溶酶体内,抑制细胞微管聚集、阻滞细胞周期在G2/M期、诱导细胞凋亡,最终实现对Nectin-4阳性细胞显着的选择性增殖抑制作用。同时,在人膀胱癌、乳腺癌、肺癌小鼠移植瘤模型中,LMA282显示出与PADCEV?相当甚至更优异的体内抗肿瘤作用。这些结果提示,LMA282在多种潜在适应症上具有显着的抗肿瘤活性,为进入临床应用提供了支撑。综上所述,LZ1904与LMA282在多种适应症中显示出了显着的选择性抗肿瘤作用,是很有前景的新型ADCs,具有极大的临床应用潜力。此外,本论文还对PARP抑制剂TSL-1502的抗肿瘤作用及机制进行了研究。PARP酶在DNA损伤应答反应中具有重要作用,抑制其活性会在同源重组（Homologous recombination,HR）缺陷型细胞中产生协同致死效应。目前,已有6款PARP抑制剂获批应用于多种HR缺陷型癌症治疗。但是,这些PARP抑制剂会造成严重的血液系统毒性,极大程度地限制其临床应用。TSL-1502是一种高效的新型PARP抑制剂葡糖醛酸前药,可经肿瘤组织中富含的β-葡萄糖醛酸苷酶水解释放活性母体药物TSL-1502M。结果显示,TSL-1502M能够有效抑制PARP1/2酶活性,促进HR缺陷型肿瘤细胞中双链断裂（Double Strand Breaks,DSBs）积累,诱导细胞G2/M期阻滞及细胞凋亡,抑制细胞增殖,且活性显着优于Olaparib。与此同时,虽然TSL-1502本身并没有对PARP酶直接的抑制活性,但是TSL-1502能够选择性地在肿瘤组织处释放活性代谢物TSL-1502M,在HR缺陷型移植瘤模型中显示出比Olaparib更显着的抗肿瘤作用。总体而言,TSL-1502是一款极具创新及临床应用潜力的新型PARP抑制剂。基于其显着的抗肿瘤活性和选择性释放特性,TSL-1502已在国内开展Ⅰ期临床试验。
顾慧杰[2]（2021）在《薯蓣提取物-薯蓣皂苷抑制胃癌侵袭转移的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞增殖及迁移能力的影响目的:薯蓣皂苷对胃癌细胞增殖及迁移能力的影响的分析。方法:选取AGS和SGC-7901胃癌细胞,（1）分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2、4、8μM）,通过MTT实验探讨薯蓣皂苷对胃癌细胞增殖能力的影响;（2）分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2μM）,划痕实验和Transwell被用来分析薯蓣皂苷对胃癌细胞迁移能力的影响;（3）分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2μM）,通过Western-Blot实验检测MMP-2、MMP-9等转移相关蛋白的表达探讨薯蓣皂苷对胃癌细胞迁移能力的影响。结果:（1）MTT实验示:薯蓣皂苷浓度越高,作用时间越久,胃癌细胞的增值率越低（P<0.05）;（2）划痕实验示:薯蓣皂苷浓度越高,细胞迁移量越少（P<0.05）;（3）Transwell实验示:薯蓣皂苷浓度越高,细胞迁移量越少（P<0.05）;（4）Western-Blot实验示:薯蓣皂苷浓度越高,MMP-2、MMP-9等转移相关蛋白的表达越低（P<0.05）。结论:薯蓣皂苷能够抑制胃癌细胞的增殖和迁移。第二部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞上皮间质转化的影响目的:探讨薯蓣皂苷对胃癌细胞上皮间质转化的影响。方法:选取AGS和SGC-7901胃癌细胞,分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2μM）,通过Western-Blot 检测 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 及 Snail-1 等上皮间质转化相关蛋白的表达探讨薯蓣皂苷对胃癌细胞上皮间质转化的影响。结果:Western-Blot结果示:薯蓣皂苷上调E-cadherin蛋白的表达,同时下调N-cadherin、Vimentin 及 Snail-1 的表达（均P<0.05）。结论:薯蓣皂苷抑制胃癌细胞的上皮间质转化。第三部分 缝隙连接蛋白43在胃癌中的表达与临床病理特征及预后相关性目的:分析缝隙连接蛋白43的表达与患者临床病理特征及预后相关性。方法:从2015年3月开始,截止于2017年2月,共计68例胃癌患者组织和癌旁正常组织（离肿瘤切缘>5cm）,来源于在郑州大学附属洛阳中心医院胃肠外科行胃癌根治术治疗的患者,前瞻性地记录相关临床病理资料以回顾性分析,随访至2020年08月。经免疫组化检测标本中Cx43的表达水平,通过卡方检验分析其与临床病理特征的关系。Kaplan-Meier构建生存曲线,患者预后的独立影响因素采用Cox回归分析评价。结果:胃癌中Cx43的表达相较于癌旁组织来说要低（95.58%vs51.47%,P<0.001）。Cx43表达水平与肿瘤浸润深度（P=0.012）、肿瘤最大直径（P=0.004）存在显着相关。此外,Cox回归分析示:胃癌组织中Cx43表达、肿瘤最大直径、浸润深度及肿瘤分化程度（均P<0.05）可作为检测预后的指标。结论:在胃癌中,患者普遍存在Cx43低表达,Cx43可作为潜在的预后指标。第四部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞缝隙连接蛋白43表达的影响和抑制胃癌侵袭转移可能的机制目的:分析薯蓣皂苷对胃癌细胞Cx43表达的影响及抑制胃癌侵袭转移可能的机制。方法:选取AGS胃癌细胞,（1）分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2μM）、阳性对照组,通过Western-Blot检测Cx43的表达探讨薯蓣皂苷对胃癌细胞Cx43表达的影响。（2）分Ctrl组、Dio组（0.5、1、2μM）、阳性对照组,通过 Westen-Blot 检测 P-PI3K/PI3K、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR的表达,以探讨薯蓣皂苷对PI3K/Akt信号通路的作用。结果:（1）薯蓣皂苷浓度越高,胃癌细胞Cx43的表达越高（P<0.05）。（2）薯蓣皂苷浓度越高,胃癌细胞中P-PI3K、P-Akt及P-mTOR蛋白的表达越低（P<0.05）,同时P-Akt/Akt也随薯蓣皂苷浓度的上调而降低。结论:薯蓣皂苷通过上调Cx43抑制Akt信号通路的激活抑制上皮间质转化,抑制侵袭转移。
邹兆伟[3]（2021）在《抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究》文中研究指明脓毒症是一种危及生命的综合症,其常引起多器官功能受损或衰竭,是重症监护病房最为常见的死亡原因。而胃肠道是脓毒症最常累及的器官,目前脓毒症所致的肠损伤在人体的作用机制尚不明确,因此我们对其潜在的机制进行研究并制定新的治疗策略,以改善脓毒症患者的预后。间隙连接（gap junction,GJ）功能在损伤放大和组织恶化过程中起到重要作用,且研究表明,活性氧（reactive oxygen species,ROS）的胞内累积会诱导脓毒症肠黏膜细胞损伤。在本次研究中我们重点探讨了 GJ功能调节蛋白缝隙连接蛋白43（connexin43,Cx43）与脓毒症肠损伤的相关性以及Cx43通过转移活性氧,ROS)在脓毒症所致肠损伤中的具体作用机制。目的:1.探讨脓毒症肠损伤的可能机制,明确Cx43、ROS以及JNK1/Sirt1/FOXO3a信号通路介导的细胞凋亡在脓毒症肠损伤发生发展中的作用。2.验证以下研究假说是否成立:即在脓毒症肠损伤过程中,Cx43通道是否介导ROS转移调节JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路活性,进而导致促凋亡蛋白Bim和Puma的转录翻译以及脓毒症所致肠损伤的加重。方法:1.盲肠结扎穿刺法（CLP）构造脓毒症大鼠模型,收集小肠组织及血清,检测不同时间点中小肠组织Cx43蛋白表达水平,同时测定对应大鼠小肠组织的损伤病理评分以及肠道损伤指标LDH、DAO和IFABP的水平,探索Cx43表达水平与脓毒症肠损伤之间的相关性;2.选择IEC-6细胞,以脂多糖LPS预处理建立脓毒症细胞模型,使用小干扰RNA对IEC-6进行转染,观察Cx43表达水平与细胞模型中肠损伤指标LDH、DAO和IFABP水平的相关性;3.分别使用Cx43抑制剂（18-α-GA）、抗氧化剂（NAC）对体内外模型进行干预,测定肠损伤指标LDH、DAO和IFABP水平,观察Cx43与ROS对肠损伤的影响。4.分别使用抗氧化剂（NAC）、Fox03a抑制剂、Sirt1抑制剂（烟酰酸）对体内模型进行干预,Western Blot检测JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路关键因子表达水平;5.在脓毒症细胞模型中分别使用双荧光素酶和染色质免疫共沉淀ChIP检测FoxO3a对促凋亡蛋白Bim和Puma的调控作用。结果:1.在体内脓毒症大鼠模型中,Cx43的表达水平与肠道损伤严重程度呈现正相关,且在术后24小时左右达到峰值,且与LDH、DAO、IFABP水平变化相协调。2.在体内外脓毒症模型中,Cx43可以促进ROS的转移及胞内累积,从而激活JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路导致脓毒症肠损伤。3.双荧光素酶及染色质共沉淀实验表明了 Cx43的下游调控因子FoxO3a可以直接结合凋亡相关蛋白Bim和Puma从而诱导细胞凋亡导致脓毒血症肠损伤。结论:CX43可以促进ROS转移及胞内累积,从而激活JNK1/Sirt1/FoxO3a信号通路进而诱导细胞凋亡加重脓毒症所致的肠损伤。
柳颖[4]（2020）在《杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制》文中研究说明目前,农药残留问题仍然是食品安全领域的焦点问题,迫切需要建立快速、可靠的残留分析方法。免疫分析方法以其灵敏度高、检测迅速、易操作等特点,在快速诊断领域占有巨大市场。杂交瘤细胞作为制备免疫分析法的核心元件单抗的主要工程细胞,具有制备技术成熟、抗体表达量多、抗体特异性高等优势。本研究对体外培养条件下,杂交瘤细胞表达农药特异性抗体及其调控机制进行探究,为提高杂交瘤细胞的稳定性以及抗体表达量提供理论基础。研究内容与结果:（1）以百菌清（BJQ）特异性杂交瘤细胞为研究对象,表征了培养过程中出现不分泌特异性抗体的转阴现象,表现为增殖加快、不表达抗体轻链和/或重链蛋白,并对抗体基因及其转录表达进行比对分析,发现阴性细胞特异性抗体基因序列丢失或未丢失但表达量显着下调。（2）选择BJQ抗体基因表达量显着下调的对数生长期的D4细胞株与阳性细胞株E2进行转录组比较分析,发现D4癌基因Pet2上调,抑癌基因Lrig1下调;RNAi验证发现与囊泡转运相关基因Vapa、浆细胞分化关键因子Prdm1以及转录因子Foxb1与抗体表达显着相关。（3）利用CRISPR library对百菌清杂交瘤细胞进行全基因组基因编辑,利用农药压力筛选和流式分选方式对CRISPR敲除细胞文库进行抗体表达升高和降低的全生长周期细胞筛选,对富集的功能基因进行分析和归纳:调控杂交瘤细胞抗体表达的主要“油门”基因为抑癌基因Hivep3、Lrig1,MAPK通路基因Grap、Kras,转录调控因子Cebpb、Foxb1、Prdm1、Prdm2、Pax5,囊泡转运相关蛋白Rab12、Vapa、Vapb;主要“刹车”基因为促癌基因Pet2、Rad51、Rad50、Wnt2、Relb,抑制凋亡的基因Ucp2、Perp,促进周期进程的基因cdc25b、Id1、Plk2、Cdkl2,细胞周期进程中的周期蛋白和激酶,胞间信号传导相关的基因Rabgef1,MAPK及上游受体通路基因Rgs4、Gapt、Ralb、Rasef,PI3k/Akt通路中的基因Akt3。其中Foxb1、Prdm1、Vapa为si RNA干扰验证基因,与抗体表达成显着正向关,Pet2、Ccnd2为sh RNA干扰验证基因,与抗体表达呈显着负相关;并通过Erk/MAPK信号通路调控细胞周期和抗体基因表达。（4）对百菌清免疫各阶段的小鼠脾脏细胞进行转录组分析,发现百菌清刺激后,B细胞激活、增殖和分化为浆细胞的过程主要通过BCR级联的Ras-Erk/MAPK信号通路,启动细胞生长及抗体基因表达,与杂交瘤细胞主要通路一致。（5）对杂交瘤细胞抗体表达及调控机制进行归纳:杂交瘤细胞融合了B细胞表达特异性抗体的基因功能及SP2/0细胞不断增殖分裂的功能,在体外培养阶段两者同步进行并互相制约,通过Erk/MAPK通路及上下游相关调控因子进行细胞生长及抗体表达的调控;平台生长期细胞增殖的抑制可以促进抗体的表达,而因基因突变导致的细胞增殖异常加快会抑制抗体的表达。本研究表征了杂交瘤细胞抗体基因及其表达的多样性,探讨了百菌清特异性杂交瘤细胞抗体的表达及调控机制,明确了主要关键调控因子和信号通路,该研究为进一步提高杂交瘤细胞特异性抗体表达的稳定性及产量提供一定的理论基础。
徐丹[5]（2020）在《大蒜素对胃癌细胞EMT的作用及对NF-κB活化的影响》文中研究指明目的:探讨大蒜素对白细胞介素-6（IL-6）诱导的胃癌细胞上皮-间质转化（EMT）的抑制作用及机制的初步研究,在分析大蒜素对胃癌细胞体外作用的基础上进一步研究大蒜素对胃癌细胞发生EMT后的增殖、迁移、侵袭的作用及对E-钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及核因子κB P65（NF-κB P65）的表达影响,为深入研究大蒜素调控NF-κB信号通路对EMT的发生发展作用机制奠定基础,为胃癌浸润转移的阻断治疗提供理论依据。方法:常规用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养人胃癌细胞株HGC-27,应用大蒜素（3μg/L）联合IL-6（50 ng/mL）、大蒜素（3μg/L）、IL-6（50 ng/mL）培养胃癌细胞株HGC-27,另设阴性对照组,运用CCK-8（Cell Counting Kit-8）实验、细胞划痕（Wound Healing）实验、细胞侵袭实验分别检测大蒜素对胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移和侵袭能力;实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测大蒜素干预前后胃癌HGC-27细胞E-cadherin、Vimentin及NF-κB P65的mRNA表达。结果:1.大蒜素对胃癌HGC-27细胞体外作用的研究CCK-8实验结果显示,与阴性对照组相比,大蒜素组对胃癌HGC-27细胞具有明显的抑制作用,且随着作用时间的增加,抑制作用更加明显（P<0.05）。划痕实验示:在划痕0 h,阴性对照组与大蒜素组划痕无明显差异性（p>0.05）,随着加药后时间的推演,与阴性对照组相比,12、24 h胃癌细胞经大蒜素组干预后的迁移能力明显减弱,差异有统计学意义（P<0.05）。细胞侵袭实验示:相对于阴性对照组而言,大蒜素组侵袭数目减少,差异有统计学意义。RT-qPCR示:相对于阴性对照组而言,加入3μg/mL大蒜素后E-candherin的mRNA表达上调,Vimentin及NF-κB的mRNA表达下调,P<0.05,差异具有统计学意义。2.大蒜素对胃癌HGC-27细胞发生EMT后体外作用的研究2.1在倒置显微镜下发现,阴性对照组中胃癌HGC-27细胞间连接紧密,呈极性状态,符合典型的上皮细胞特性;当加入50 ng/mL IL-6处理细胞后,我们发现细胞改变原来的细胞形态,逐渐变成长梭形,细胞散在分布,呈现间质细胞特性;当在50 ng/mL IL-6基础上再加入3μg/mL大蒜素继续培养48 h,细胞之间慢慢聚拢连接,长势转好。2.2 CCK-8实验检测发现IL-6诱导后细胞具有明显的增殖优势,而联合大蒜素后可抑制这种优势。细胞划痕实验发现:与IL-6组相比,大蒜素联合IL-6组划痕愈合百分比缩小,尤其是作用24 h后,IL-6组划痕处几乎被迁移细胞遮盖,而在此基础上加用大蒜素后细胞的迁移能力明显减弱。细胞侵袭实验示:与阴性对照组相比,IL-6侵袭数目明显增多,且大蒜素联合IL-6组细胞的侵袭能力较对IL-6组明显减弱。RT-qPCR示:相对于阴性对照组来说,IL-6组E-cadherin的mRNA表达下调,Vimentin及NF-κB P65的mRNA表达上调。而且,相对于IL-6组而言,大蒜素联合IL-6组E-candherin的mRNA表达上调,而Vimentin的mRNA表达下调,同时NF-κB的mRNA表达下调,P<0.05,差异均具有统计学意义。结论:1.大蒜素能够抑制胃癌HGC-27细胞的增殖、迁移及侵袭,并能抑制其发生EMT;2.大蒜素对IL-6诱导的胃癌细胞EMT现象也有明显的抑制作用;3.大蒜素对胃癌细胞EMT的作用过程可能与NF-κB信号通路有关。
张哲[6]（2020）在《Beclin1调控斑马鱼肠道炎症的功能研究》文中进行了进一步梳理斑马鱼（Danio rerio）是一种亚热带的硬骨鱼类,属鲤形目鲤科。斑马鱼具有基因组注释完整、性成熟期短、体外受精和发育、早期鱼体透明等特点。目前,运用众多的免疫细胞标记的转基因品系,可以轻松实现各组织器官中免疫反应的追踪;斑马鱼幼年时期只具备先天免疫的功能,相对来说较为简单;斑马鱼肠道功能与哺乳动物极其相似;因此斑马鱼是研究肠道炎症和损伤分子机制的理想的动物模型。诱导斑马鱼产生肠炎的方式有两种,药物刺激和遗传改造,这些模型的出现,为肠炎的研究工作提供许多有价值的信息。斑马鱼肠道形态发生可分为三个阶段:肠腔形成、肠上皮细胞极化以及肠上皮细胞重构与分化。胚胎受精5天以后,卵黄完全吸收,肠道具有功能,斑马鱼可以通过进食吸收营养物质。根据形态和基因特异性的表达,斑马鱼幼鱼肠道可分为前肠、中肠和后肠。前肠和中肠主要是负责营养物质的吸收,后肠主要负责水分的吸收以及调节渗透压。斑马鱼肠上皮主要有四种细胞类型:吸收性肠细胞、肠内分泌细胞、杯状细胞和空泡化细胞。其中,吸收性肠细胞是主要的细胞类型,但斑马鱼不具有哺乳动物经典的M细胞（membranous cell）。与哺乳动物相比,斑马鱼肠道结构更为简单,斑马鱼肠上皮缺少隐窝结构,肌肉层直接黏附于粘膜层,不具有组织化的淋巴组织,神经细胞体分布于平滑肌层之间。Beclin1蛋白的结构和功能在多种物种间高度保守。在斑马鱼中,beclin1基因位于12号染色体上,含12个外显子。Beclin1蛋白有447个氨基酸,约为52kDa,含有四个结构域,分别是BH3（Bcl-2 homolog3）域、卷曲螺旋结构域（coiled-coiled domain,CCD）、进化保守结构域（evolutionarily conserved domain,ECD）和核输出结构域（NES）,Bcl-2、Vps34、UVRAG、ATG14等均能够与Beclin1上不同的结构域相结合。Beclin1是重要的自噬相关蛋白,与其他蛋白形成复合体参与调控自噬的发生和成熟。Beclin1还能发挥非自噬依赖的功能,主要是调控细胞的内体循环,涉及一些细胞膜上受体的内吞和重新利用。此外,还可以通过参与染色体的稳定、DNA修复、细胞周期、细胞凋亡等方式调控肿瘤的发生和发展。自噬是细胞内重要的降解途径之一,能够清除受损或衰老的细胞器和入侵病原体,降解长寿蛋白,同时也对饥饿、激素失衡和氧化应激等外部环境改变做出适应性调整。已有许多研究表明,自噬参与维持肠道的稳态。自噬可以增强肠上皮细胞的紧密连接,参与黏附连接蛋白的降解,维持肠道抵御病原微生物的第一道屏障。自噬可以通过抑制炎症小体而负调控炎症反应。此外,还可以调控T细胞、B细胞的发育和分化,调控MP细胞（mononuclear phagocytic cell）呈递抗原的过程。肠上皮细胞正常功能的维持离不开自噬,肠上皮杯状细胞的分泌功能和吸收性肠细胞天然的抵御细菌的能力都需要自噬参与。自噬与人类炎症性肠病有密切关联,通过全基因组关联分析,自噬相关基因如ATG16L是人类炎症性肠病的易感基因。本课题旨在研究Beclin1在斑马鱼肠道炎症中的功能。实验主要依托两个转基因品系Tg（mpeg1:eGFP）和Tg（lyz:e GFP）,通过免疫组化和荧光实时定量PCR检测肠道炎症相关的指标。同时使用自噬抑制剂-氯喹,辅以荧光标记的小分子化合物dextran等,探究Beclin1发挥调控肠炎的功能是否依赖于自噬途径。本课题以斑马鱼为模式生物,通过CRISPR/Cas9技术敲除了beclin1基因,经筛选得到了突变体。beclin1突变体早期肠道形态和结构基本正常,但在6.5dpf（days post fertilization）肠上皮屏障功能损坏,部分突变体出现肠腔狭窄的表型。在7.5dpf,肠腔狭窄的表型比例显着上升。前肠组织学上的变化主要是肠绒毛结构受到破坏,排列稀疏,上皮细胞多分布在基底侧,细胞核由原来的纺锤状变为圆形,表型严重时还会出现肠道肌肉层增厚。突变体肠道组织发生炎症反应,表现在中性粒细胞和巨噬细胞大量积累,中性粒细胞浸润,免炎症关因子mmp9、tnf-α等转录水平的上调。使用抗生素处理突变体后,免疫细胞的数量和肠腔狭窄的表型有所恢复,但无法挽救肠上皮屏障功能,这提示肠道菌群应该是诱发炎症的主要因素。自噬抑制剂氯喹处理野生型斑马鱼,无法模拟肠上皮屏障损坏的表型。因此Beclin1缺失诱发的肠上皮屏障功能损坏可能不依赖于自噬通路,但这一部分结论还有待进一步验证。本课题中,Beclin1缺失最直接影响是破坏肠上皮屏障的功能,肠上皮功能损坏后肠道菌群入侵导致炎症发生。由于幼鱼个体差异以及肠道炎症发生有强弱之分,所以并不是所有的beclin1突变体都表现肠腔狭窄。Beclin1在肠上皮屏障功能中的作用还有待进一步研究,根据目前的数据,通过自噬途径参与的可能性较小,非自噬依赖途径的可能性较大。人类炎症性肠病有两种亚型,克罗恩病和溃疡性肠炎。根据疾病发生的表型特点,beclin1突变体与克罗恩病在一定程度上相类似,所以beclin1突变体可以对于研究克罗恩病提供一些参考作用。除此以外,Beclin1非自噬功能的研究目前多局限于肿瘤细胞中,在组织器官中研究的内容还较少,本课题可以丰富Beclin1在肠道稳态维持中非自噬功能的内容。
孔令玉[7]（2020）在《启膈方调控Gas6/Axl信号传导通路抑制食管癌细胞迁移和侵袭的研究》文中认为食管癌（Esophageal Cancer,EC）是高发的消化道肿瘤之一,在恶性肿瘤中死亡率较高。食管癌发病主要分为2个病理类型,食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）大约占4/5,其余为食管腺癌（Esophageal Adenocarcinoma,EAC）。美国等西方国家食管癌主要是腺癌,亚洲地区和中国主要是鳞癌。中国是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家,河南林州、河北磁县以及涉县等食管癌高发区,发病率甚至达世界平均水平的10倍。全球癌症生存情况监测报告2010-14（CONCORD-3）,大多数国家和地区的食管癌患者5年生存率在10-30%之间,而中国食管癌患者的5年生存率仍然较低。ESCC仍然严重威胁人类的健康。侵袭和转移是恶性肿瘤的基本生物学特征,是最终导致食管癌患者死亡的主要原因。目前的ESCC西医治疗方案对侵袭和转移没有良好效果,即使手术切除或者广泛应用全身放化疗,患者总生存率仍然不容乐观。食管癌的侵袭和转移主要原因是ESCC细胞迁移和侵袭的过程十分复杂,许多机理尚不十分清楚。因此,探寻ESCC迁移和侵袭的调控过程显得尤为重要。启膈方（Qigefang,QGF）是启膈散化裁而成,启膈散由中国清代名医程钟龄所创制,他的着作《医学心悟》记载主要用于噎膈治疗。河北省是中国食管癌最高发区域之一,因此我们临床接诊了大量食管癌患者,结合食管癌的病因病机和患者临床表现,启膈方广泛用于食管癌治疗。临床研究表明QGF能够明显改善食管癌术后患者症状,并显示出抑制食管癌复发转移的趋势。但QGF抑制食管癌细胞侵袭和迁移的具体机制仍然不是很清楚。有研究表明生长抑制特异性基因6（Growth arrest-specific 6,Gas6）和受体酪氨酸激酶Aexelekto（Axl）在口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC）等肿瘤组织和细胞高表达,而Gas6与Axl的结合改变了细胞的功能,包括迁移、增殖和存活;最近的一些研究表明Gas6/Axl影响前列腺癌细胞骨髓转移过程中的侵袭和存活,还有报道显示Gas6/Axl在胃癌、肺癌的侵袭和转移中起到促进作用。有研究报道Gas6/Axl–PI3K/AKT通路促进OSCC侵袭,Gas6/Axl-NF-κB通路增强OSCC细胞侵袭/迁移能力。然而,Gas6/Axl如何介导食管癌细胞迁移和侵袭的过程还不清楚,是否通过增强相关信号通路而发挥促进作用有待进一步研究。本研究前期蛋白芯片结果显示QGF能够降低食管癌细胞Gas6的表达。有报道表明Gas6在食管癌形成中的促进作用。所以我们假设QGF是通过抑制Gas6蛋白,调控Gas6/Axl信号传导通路进而抑制PI3K/AKT和NF-κB等下游蛋白表达,同时影响上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）发生,来抑制食管癌细胞侵袭和迁移功能。本研究旨在探讨QGF对食管癌细胞Gas6/Axl及下游信号通路的调控,以及抑制细胞侵袭和迁移的作用,为QGF治疗食管癌提供理论依据。为探讨上述问题,本研究选取食管癌患者术后癌组织和癌旁组织,以及人鳞状上皮食管癌细胞ECA109、TE1、TE13作为研究对象,分为三部分来进行实验研究。第一部分人食管鳞状细胞癌组织Gas6和Axl的表达目的:观察人食管癌组织和癌旁组织中Gas6和Axl的表达及与肿瘤标志物相关性。方法:1.随机选取人食管癌组织和癌旁组织制作病理切片。2.HE染色检测确认食管癌病理诊断和类型。3.免疫组织化学法测定食管癌组织和癌旁组织Gas6蛋白表达。4.免疫荧光法和激光共聚焦显微镜测定Axl在食管癌组织和癌旁组织的表达。5.电化学发光法测定食管癌患者肿瘤标志物。结果:1.食管癌组织和癌旁组织经HE染色观测,镜检显示食管癌组全部为鳞癌,与癌旁组织相比,细胞变性、膨大,且呈不规则性和显着的异型性,细胞核变大且染色较深;2.食管癌和癌旁组织Gas6的免疫组化结果显示:食管癌组织和癌旁组织的Gas6表达均增加,并且ESCC组Gas6的表达量显着高于癌旁组织NC组。食管癌患者Gas6表达水平与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1表现正相关性;3.食管癌和癌旁组织免疫荧光和激光共聚焦观察显示:Axl在ESCC癌组织和癌旁组织免疫荧光表达增加,而且ESCC组Axl的表达量显着高于癌旁组织NC组。食管癌患者Axl表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1呈正相关性。小结:人食管鳞状细胞癌病理组织中Gas6和Axl的表达及活性显着增加,然而癌旁组织的表达不明显或者较少表达。食管癌患者Gas6和Axl表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1表达呈正相关关系。第二部分启膈方通过调控Gas6/Axl抑制食管癌细胞的移动能力目的:将食管癌Eca109、TE1细胞作为实验对象,对Gas6/Axl进行细胞共定位,验证QGF对Gas6/Axl复合物的调控作用,影响磷酸肌醇激酶3（Phosphoinositide 3-kinases,PI3K）,蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）与核转录因子B（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）等下游信号通路,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。方法:1.应用CCK-8实验检测分析QGF对食管癌细胞细胞毒性影响,从而选择细胞迁移和侵袭相关实验干预浓度。2.使用Perkin-Elmer高内涵细胞成像系统及Harmony图像分析软件对食管癌细胞的运动能力和运动距离进行检测。3.免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测Gas6、Axl以及Gas6/Axl在食管癌细胞的定位和结合情况,以及QGF干预的调节作用。4.用免疫荧光法和激光共聚焦显微镜检测PI3K,AKT和NF-κB在食管癌细胞的定位和表达,以及QGF干预后对PI3K,AKT的影响和NF-κB入核的变化。5.Western blotting检测食管癌细胞Gas6、Axl、PI3K、AKT、NF-κB,及金属基质蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase-2,MMP2）和金属基质蛋白酶9（Matrix Metalloproteinase-9,MMP9）的蛋白表达情况,及QGF干预后的变化。6.QGF对食管癌细胞迁移能力的测定选用体外划痕方法。7.QGF对食管癌细胞侵袭能力的作用采用Transwell实验方法。结果:1.QGF实验干预药物浓度确定。CCK-8分析QGF浓度选择实验证明,QGF对食管癌细胞ECA109和TE1干预后,400μg/ml呈现出对细胞增殖的抑制（细胞毒性作用）,而200μg/ml及以下则没有;培养时间48小时表现出抑制细胞增殖（细胞毒作用）,24小时则没有。因此,确定≤200μg/ml为适合干预浓度,时间为24小时;2.QGF降低食管癌细胞的移动速度和移动距离。高内涵细胞成像实验显示,QGF的刺激能够显着的降低食管癌细胞ECA109和TE1的运动速度,且能够减少食管癌细胞的有效运动距离,而这些抑制作用表现出明显的浓度依赖性趋势。3.QGF调控Gas6和Axl在细胞膜的表达及Gas6/Axl复合体的结合。免疫荧光和激光共聚焦结果显示,食管癌细胞中Gas6和Axl主要表达在细胞膜,并在膜形成复合体;QGF干预食管癌细胞后,能够明显抑制Gas6和Axl在细胞膜的结合,并出现分离的趋势,而且随着干预浓度的加大,调控作用越来越明显。4.QGF抑制PI3K/AKT和NF-κB的表达。实验通过免疫荧光方法检测食管癌细胞PI3K/AKT和NF-κB,结果表明与对照组相比,QGF组能够明显抑制PI3K和AKT的表达,降低NF-κB进入到细胞核,并且这些抑制作用呈现出一定的浓度依赖趋势。5.QGF抑制Gas6/Axl下游信号通路的蛋白表达。Western blotting的结果显示,QGF的刺激显着降低了食管癌细胞Gas6、Axl的表达并显示出浓度依赖性趋势。QGF刺激显着降低了P-PI3K,P-AKT和P-NF-κB的蛋白表达,并显示了浓度依赖的趋势。QGF刺激显着降低了MMP2和MMP9的蛋白质表达,并随着浓度加大而增强。在食管癌细胞ECA109和TE1中发现了相同的浓度依赖趋势。6.QGF抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。划痕实验结果表示,与对照组相比,QGF浓度为200μg/ml,明显抑制了TE1细胞在12h内的细胞迁移。更重要的是,我们观察到100,200μg/ml组与对照组相比,在24 h时能显着抑制细胞迁移,两种细胞的趋势相同。7.Transwell实验结果显示,与对照组相比,QGF浓度为100,200μg/ml,逐渐减少了通过Transwell小室的细胞数量,并显示出浓度依赖性,两种细胞的趋势相同,但是200μg/ml的效果好于100μg/ml组。小结:在食管癌细胞ECA109和TE1中Gas6和Axl高表达。QGF通过调控Gas6和Axl在细胞膜的结合,抑制下游蛋白表达,降低NF-κB的入核,阻断该信号通路传导,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力。第三部分启膈方调节Gas6/Axl抑制EMT影响食管癌细胞迁移和侵袭的研究目的:观察QGF通过调控Gas6/Axl抑制食管癌上皮间质转化（EMT）发生影响肿瘤细胞迁移和侵袭的机制方法:1.免疫双荧光共定位检测食管癌细胞Eca109,TE13的Gas6和Axl共定位并检测启膈方的干预作用。2.Western blotting检测EMT标志物E-Ca,N-Ca和Snail1的蛋白表达及QGF的干预作用。3.免疫荧光检测QGF对食管癌细胞EMT标志物E-Ca,N-Cad和Snail定位。4.鬼笔环肽细胞骨架实验测定QGF对食管癌细胞形态的干预作用。5.划痕和Transwell方法测定QGF对食管癌细胞运动能力的作用。结果:1.QGF抑制Gas6/Axl复合物的结合。免疫荧光实验结果表明,食管癌细胞Eca109和TE13中对照组Gas6和Axl主要在细胞膜形成复合物;与对照组相比,QGF干预食管癌细胞后,能够明显抑制Gas6和Axl在细胞膜的绑定结合,Gas6/Axl出现分离的趋势,而且随着干预浓度加大,调控作用越来越明显;2.QGF抑制食管癌细胞EMT的形成免疫荧光和激光共聚焦显微镜观察显示,与对照组相比,随着QGF的干预,E-ca在细胞膜的表达逐渐升高,呈现浓度依赖性。与E-ca相反,QGF的刺激浓度增加,N-ca和Snail在细胞膜的表达逐渐降低,呈现浓度依赖性,在两种食管癌细胞也观察到大致相同的趋势。Western blotting测定结果表示,与对照组相比,QGF干预能显着增加E-ca蛋白的表达,显着降低N-ca和Snail蛋白的表达,并且在两种细胞系表现出同样的趋势,呈现浓度依赖性;3.QGF能够促进食管癌细胞微丝骨架的重排。细胞微丝骨架染色实验表明,与对照组相比,QGF刺激食管癌细胞后,细胞中的微丝排列变得更加规则,细胞的微丝骨架同向性更强,细胞形态也更加规则,并且呈现出浓度依赖的趋势;4.QGF抑制ECA109和TE13细胞的迁移和侵袭。划痕实验结果表示,不同浓度QGF干预食管癌细胞24小时,与对照组相比,QGF明显抑制了细胞的迁移能力,呈现明显的浓度依赖性,且在两种细胞系观察到同样的趋势。Transwell实验结果显示,与空白组相比,随着QGF浓度的增加,通过Transwell小室的细胞数量逐渐减少,两种细胞趋势相同,但200μg/ml的效果明显好于100μg/ml组。小结:QGF能够显着调节食管癌细胞Eca109和TE13中Gas6/Axl的表达和抑制复合体在细胞膜形成,抑制肿瘤细胞上皮间质转化的形成,进而影响食管癌细胞的迁移和侵袭。结论:1.ESCC癌组织中Gas6和Axl的表达及活性显着增加,并且Gas6和Axl的表达与肿瘤标志物CEA、SCC和CYFRA21-1的值呈正相关性。2.QGF能够调控食管癌细胞Gas6/Axl信号通路和蛋白表达。3.QGF的能够降低Gas6的表达,抑制Gas6/Axl的结合,并减少NF-κB进入细胞核,降低下游蛋白的表达,从而抑制食管癌细胞的迁移和侵袭。4.QGF通过调控Gas6/Axl信号传导通路进而抑制EMT形成,影响食管癌细胞迁移和侵袭,从而防止食管癌转移。
吴佩[8]（2020）在《腹膜间皮细胞衰老在胃癌腹膜转移中作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:根据最新的年度统计结果,胃癌在癌症引起的死亡中位居第三位。由于胃癌发生时其临床症状不明显,导致大多数患者一经诊断便已是中晚期。晚期胃癌常见腹膜转移,然而腹膜转移的发生也是导致胃癌手术失败的主要原因,从而加重了胃癌晚期患者不良的预后。近些年因为腹膜微环境概念的逐渐深入,让我们对胃癌腹膜转移相关过程与机制有了更多新的认识。腹膜的组织结构很简单;由单层间皮细胞（MCs）排列,少量成纤维细胞,肥大细胞,巨噬细胞和血管结缔组织组成的紧密区域,腹膜间皮细胞细胞是覆盖于腹膜表面的主要细胞,由于其结构及生物活性,健康的腹膜间皮细胞也是阻碍肿瘤腹膜转移发生的第一道屏障。然而由于肿瘤的发生,导致腹膜环境随着发生相应改变。根据“种子土壤学说”理论推理,由于腹膜微环境的改变,性质发生改变的腹膜间皮细胞可由屏障变成更适合肿瘤生长的土壤。腹膜间皮细胞衰老则是其中的一种改变。衰老本身是一种正常的生命过程,然而衰老的不正常发生常常与肿瘤的发生密切相关。本研究首先模拟腹膜环境通过胃癌上清对腹膜间皮细胞进行直接诱导,从衰老的各个表现解释腹膜微环境诱导腹膜间皮细胞发生衰老的表现。此外还比较了腹膜间皮细胞衰老发生前后胃癌细胞粘附、迁移、侵袭能力的变化,进而进一步明确腹膜间皮细胞衰老在胃癌腹膜转移中的重要地位。方法:1.从人正常腹膜组织中提取腹膜间皮细胞,并利用来源于胃癌细胞的条件培养基对间皮细胞进行诱导,围绕衰老发生的各个过程去测量相关指标的表达,譬如衰老相关β半乳糖苷酶表达情况,用western blotting检测了CX43蛋白表达情况,并且用免疫荧光测量了γ-H2A.X表达情况,RT-PCR测量了P16表达情况。2.为探索腹膜间皮细胞衰老后促进胃癌腹膜转移发生的具体作用过程。体外实验用年轻腹膜间皮细胞和衰老腹膜间皮细胞分别对胃癌细胞诱导,从而通过对比两者黏附、迁移、侵袭能力的差异来明确衰老腹膜间皮细胞促进胃癌细胞腹膜转移的具体过程。结果:1.胃癌上清诱导腹膜间皮细胞后出现了衰老相关β半乳糖酶表达增加,缝隙蛋白43表达减少,DNA损伤相关蛋白γ-H2A.X表达增加,衰老相关基因P16表达增加。2.相较于年轻腹膜间皮细胞,衰老腹膜间皮细胞明显促进了胃癌细胞的粘附、迁移、侵袭能力。结论:胃癌细胞可通过分泌一系列生物活性物质促进腹膜间皮细胞发生衰老,其衰老表现有,衰老相关β半乳糖苷酶产生增多,缝隙连接蛋白减少,衰老相关DNA的活化损伤反应增加,以及与衰老相关基因表达增加。同时衰老的腹膜间皮细胞可促进胃癌细胞粘附、迁移、侵袭。
孙安琦[9]（2020）在《TNF-α通过MZF-1/Cx43轴上调胃癌细胞干性与腹膜转移机制的研究》文中进行了进一步梳理目的:胃癌是全球第四大常见癌症,是癌症相关死亡的第二大主要原因。大多数胃癌患者被诊断时已处于晚期,因为早期胃癌通常无症状,而且,即使在根治性切除后胃癌也经常发生转移性复发。胃癌手术后治疗失败的最常见原因就是腹膜扩散,主要是由于原发灶胃癌中游离癌细胞的播种引起的,有肉眼可见的腹膜转移癌的胃癌患者预后非常差。炎症与癌症之间的联系已经被大家所熟知,目前已有研究发现,脱落致腹腔中的肿瘤细胞会优先定植在乳斑,而乳斑主要由未成熟的巨噬细胞组成。我们这项研究意图联系炎症与癌症之间的关系,证明巨噬细胞在与肿瘤细胞相互作用的情况下,能够形成富含TNF-α的炎症微环境,TNF-α进而通过MZF-1/Cx43的通路导致胃癌干细胞比例升高,从而促进胃癌细胞的腹膜转移。旨在为胃癌细胞发生腹膜转移的机制提供新的见解,进一步为临床开发抗胃癌腹膜转移的药物提供理论基础。方法:运用Transwell侵袭、迁移实验和划痕实验检测Cx43在胃癌细胞株HGC-27中的细胞功能。通过免疫组织化学染色法分析Cx43表达与腹膜转移发生之间的相关性。过表达Cx43后,通过WB实验检测Cx43与干性相关指标Sox2、Nanog和Oct4之间的联系。把巨噬细胞与胃癌细胞进行共培养,模拟腹腔内乳斑与游离肿瘤细胞的相互影响,之后通过WB实验检测胃癌细胞中Cx43与干性相关指标的表达。敲低Cx43后再次共培养,验证Cx43在其间的作用。通过Elisa实验检测了共培养培养基中的TNF-α水平。通过qRT-PCR实验检测巨噬细胞中TNF-α的mRNA水平。加入TNF-α刺激细胞后,通过WB实验检测Cx43与干性相关指标的变化。加入TNF-α刺激细胞后,检验肿瘤干细胞的成球能力。敲低Cx43后再次加入TNF-α刺激,验证Cx43在其间的作用。敲低MZF-1后进行WB实验和qRTPCR实验检测Cx43的表达。在TNF-α刺激下通过WB实验检测MZF-1蛋白表达。敲低MZF-1后再次共培养或加入TNF-α刺激,验证MZF-1在TNF-α及共培养调节Cx43及肿瘤细胞干性中的作用。结果:1、Transwell迁移、侵袭试验和划痕实验的结果显示,Cx43上调可促进癌细胞的侵袭与迁移。免疫组化结果显示,Cx43蛋白的表达与胃癌腹膜转移的发生密切相关。2、WB结果显示,Cx43过表达后,干性相关指标Sox2、Nanog和Oct4的蛋白表达均上调。3、WB结果显示,与巨噬细胞共培养的HGC-27及MKN-45有更高的Cx43及干性指标蛋白表达水平,并且敲低Cx43后,与巨噬细胞共培养原本引起的肿瘤细胞干性升高会受到抑制。4、Elisa实验结果显示,与单独培养的肿瘤细胞HGC-27、MKN-45以及单独培养的巨噬细胞的培养基相比,共培养培养基中的TNF-α水平升高。qRT-PCR结果显示共培养的巨噬细胞中TNF-α的mRNA水平表达升高。5、WB结果显示,在TNF-α刺激作用下,胃癌细胞中Cx43、Sox2、Oct4、Nanog的蛋白表达量逐步升高。肿瘤干细胞成球实验结果显示,在TNF-α刺激作用下,肿瘤球形成的大小和数量都显着增加。6、敲低MZF-1后,WB和qRTPCR结果显示Cx43表达下调。WB结果显示,在TNF-α刺激作用下MZF-1蛋白表达上调,MZF-1敲低后,下调了共培养或加TNF-α刺激时Cx43及胃癌细胞的干性指标蛋白的表达。结论:1、Cx43基因在胃癌细胞里可能起促癌基因的作用并与肿瘤干性相关,在患者体内表现为与腹膜转移的发生相关。2、当游离的胃癌细胞暴露于巨噬细胞时,巨噬细胞可分泌TNF-α,而TNF-α可通过上调Cx43的表达增强肿瘤细胞的干性。3、TNF-α可通过MZF-1调控Cx43的表达。
孙立平[10]（2019）在《口腔鳞癌肿瘤相关成纤维细胞外泌体中miR-188-5p调控PTEN促进细胞迁移和侵袭》文中认为目的口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）是口腔颌面-头颈部最常见的恶性肿瘤之一,OSCC恶性程度高,5年生存率低[1]。易发生转移是OSCC不良预后的主要原因之一,因此,OSCC转移的预防和治疗是临床和基础研究亟待解决的问题之一。既往关于OSCC转移机制的研究多关注OSCC细胞本身的迁移和侵袭能力,而研究证明不止是肿瘤细胞的遗传学改变,肿瘤细胞与局部微环境相互作用与肿瘤的发生发展及转移亦密切相关。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）是肿瘤微环境中最主要的间质细胞之一,与肿瘤发生发展与转移密切相关。PTEN是重要的抑癌基因,参与肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭。本研究的目的是探讨CAFs调控OSCC细胞中PTEN表达的机制及其在OSCC细胞迁移和侵袭中的作用。实验方法1.探讨CAFs是否调控OSCC细胞迁移和侵袭应用组织块法从OSCC组织和癌旁正常组织中分离培养成纤维细胞,应用α-SMA标记CAFs;将CAFs与癌旁正常组织中成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）分别与口腔鳞状细胞癌细胞系CAL-27细胞共培养,应用transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证CAFs是否调控CAL-27细胞迁移和侵袭。2.探讨CAFs如何调控CAL-27细胞迁移和侵袭分离CAFs和NFs细胞条件培养基中外泌体,分别应用两种外泌体培养CAL-27细胞,transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力;分别提取两种外泌体中RNA,反转录后应用实时定量PCR（qRT-PCR）检测miR-382-5p表达,比较两种外泌体中miR-382-5p表达量;敲除CAFs中miR-382-5p,将敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs与CAL-27细胞共培养,应用transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证CAFs是否通过miR-382-5p调控CAL-27细胞迁移和侵袭;将荧光标记的miR-382-5p转染至CAFs,并将其与CAL-27细胞共培养,加入外泌体分泌抑制剂,检测miR-382-5p是否通过外泌体途径被转运至CAL-27细胞。3.探讨miR-382-5p调控CAL-27细胞迁移和侵袭的机制在 CAL-27 细胞中转染 miR-382-5p inhibitors,检测 CAL-27 细胞中 PTEN表达;在敲除 PTEN 的 CAL-27 细胞中转染 miR-382-5p inhibitors,应用 transwell实验检测CAL-27细胞迁移和侵袭能力,以验证miR-382-5p是否通过调控PTEN影响CAL-27细胞迁移和侵袭;构建PTEN 3’-UTR活性报告基因,将报告基因转染至CAL-27细胞中,检测转染miR-382-5p后PTEN 3’-UTR报告基因活性;突变报告基因上miR-382-5p识别位点,检测突变后是否能够阻断miR-382-5p对报告基因活性的调控作用。结果1.应用组织块法从OSCC组织和癌旁正常组织中分离培养成纤维细胞,免疫细胞化学染色显示,OSCC组织中成纤维细胞为α-SMA染色阳性,而癌旁正常组织中成纤维细胞为α-SMA染色阴性,Western blot结果亦显示OSCC组织中成纤维细胞α-SMA表达量明显高于癌旁正常组织中α-SMA表达量,提示OSCC组织中成纤维细胞为CAFs。将NFs与CAFs分别与CAL-27细胞共培养,transwell实验显示,与NFs相比,CAFs能够明显促进CAL-27细胞迁移和侵袭。2.分离CAFs和NFs培养基中外泌体,分别用于培养CAL-27细胞,transwell实验显示CAFs来源的外泌体较NFs来源的外泌体培养的CAL-27细胞表现出更强的迁移和侵袭能力。提取CAFs和NFs来源的外泌体中RNA,qRT-PCR实验发现CAFs外泌体中miR-382-5p表达量明显高于NFs。将敲除和未敲除miR-382-5p的CAFs与CAL-27细胞共培养,transwell实验结果显示,敲除miR-382-5p后,共培养的CAL-27细胞迁移和侵袭能力明显减弱。将荧光标记的miR-382-5p转染至CAFs,并将其与CAL-27细胞共培养,发现miR-382-5p能够进入CAL-27细胞中,加入外泌体释放抑制剂能够明显阻断miR-382-5p 由 CAFs 进入 CAL-27 细胞。3.在 CAL-27 细胞中转染miR-382-5p inhibitors,检测 PTEN 表达,qRT-PCR和 Western blot 实验显示,miR-382-5p inhibitors 能够明显上调 PTEN mRNA 和蛋白表达。敲除PTEN能够明显逆转miR-382-5p inhibitors导致的细胞迁移和侵袭能力的减弱。构建PTEN3’-UTR报告基因,并突变报告基因上miR-382-5p识别位点,miR-382-5p能够明显下调PTEN 3’-UTR报告基因活性,而突变报告基因上miR-382-5p识别位点能够阻断miR-382-5p对PTEN 3’-UTR报告基因活性的调控作用。结论在本研究中,我们发现口腔鳞状细胞癌CAFs外泌体可以将miR-382-5p转移到口腔鳞状细胞癌细胞中,miR-382-5p抑制口腔鳞状细胞癌细胞中PTEN表达,从而影响口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭。本研究揭示了肿瘤微环境中CAFs调控口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的新机制,为靶向CAFs研发抗口腔鳞状细胞癌的药物提供了理论依据。
二、Alteration of cadherin isoform expression and inhibition of gap junctions in stomach carcinoma cells（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Alteration of cadherin isoform expression and inhibition of gap junctions in stomach carcinoma cells（论文提纲范文）
（1）靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一部分 靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1 章 引言 |
| 第2章 靶向Claudin18.2 ADC LZ1904 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1节 稳定表达人Claudin18.2 细胞株构建及验证 |
| 第2节 LZ1904 的体外抗肿瘤作用及机制 |
| 第3章 靶向Nectin-4 ADC LMA282 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1节 稳定表达人Nectin-4 细胞株构建及验证 |
| 第2节 LMA282 的体外抗肿瘤作用及机制 |
| 第3节 LMA282 体内抗肿瘤活性评价 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 第二部分 PARP抑制剂TSL-1502 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 TSL-1502 抗肿瘤作用及机制研究 |
| 第3章 总结与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 图表目录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）薯蓣提取物-薯蓣皂苷抑制胃癌侵袭转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞增殖及迁移能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 抗体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 药品制备 |
| 2.3 MTT实验 |
| 2.4 划痕实验 |
| 2.5 Transwell实验 |
| 2.6 Western-Blot实验 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷抑制胃癌细胞的增殖 |
| 3.2 薯蓣皂苷抑制胃癌细胞的迁移 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞上皮间质转化的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 缝隙连接蛋白43在胃癌中的表达与临床病理特征及预后相关性 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 病例及标本 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 1.5 抗体 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 免疫组化 |
| 2.2 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Cx43在胃癌中低表达 |
| 3.2 Cx43的表达与临床病理特征的相关性 |
| 3.3 Cx43是影响预后的独立因素 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 薯蓣皂苷对胃癌细胞缝隙连接蛋白43表达的影响和抑制胃癌侵袭转移可能的机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷上调胃癌细胞Cx43的表达 |
| 3.2 薯蓣皂苷调控PI3K/Akt信号通路 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 文献综述 上皮间质转化及缝隙连接研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 Cx43与脓毒症肠损伤的相关性及其对脓毒症肠损伤影响的研究 |
| 引言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 Cx43在脓毒症肠损伤中的具体作用机制研究 |
| 引言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验设计 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 术语与缩略语表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 农药残留及免疫检测技术发展现状 |
| 1.2 农药小分子特异性单克隆抗体研究进展 |
| 1.3 杂交瘤细胞技术 |
| 1.4 杂交瘤细胞识别特异性基础——B淋巴细胞 |
| 1.5 CRISPR/Cas基因编辑在杂交瘤细胞生物学研究中的应用 |
| 1.5.1 基因编辑技术概况 |
| 1.5.2 CRISPR/Cas系统结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas系统机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9基因编辑原理 |
| 1.5.5 CRISPR/Cas9基因编辑文库 |
| 1.5.6 CRISPR/Cas9系统及文库在抗体基因编辑上的应用 |
| 1.6 研究内容及预期目标 |
| 1.6.1 主要研究内容 |
| 1.6.2 预期目标 |
| 1.6.3 研究技术路线 |
| 第2章 杂交瘤细胞株及抗百菌清单抗表型的多样性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料与设备 |
| 2.2.1.1 试剂材料 |
| 2.2.1.2 试剂盒 |
| 2.2.1.3 仪器设备 |
| 2.2.1.4 培养液及缓冲液配方 |
| 2.2.1.5 试验动物 |
| 2.2.2 农药特异性杂交瘤细胞筛选及单克隆抗体制备 |
| 2.2.2.1 动物免疫 |
| 2.2.2.2 小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)及饲养细胞的准备 |
| 2.2.2.3 细胞融合 |
| 2.2.2.4 阳性杂交瘤单克隆细胞株筛选 |
| 2.2.3 腹水单抗制备与表征 |
| 2.2.3.1 小鼠腹水单抗制备 |
| 2.2.3.2 腹水单抗灵敏度测定 |
| 2.2.3.3 腹水单抗轻重链类型测定 |
| 2.2.4 不同农药特异性杂交瘤细胞株不同处理后阴性率统计 |
| 2.2.5 杂交瘤细胞株抗体分泌FACS分析 |
| 2.2.6 阴阳性单克隆杂交瘤细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.2.7 BJQ单克隆杂交瘤细胞株抗体产生情况表征 |
| 2.2.7.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.2.7.2 BJQ杂交瘤细胞不同生长阶段Ig G分泌表征 |
| 2.2.7.3 杂交瘤细胞胞内总蛋白提取及浓度测定 |
| 2.2.7.4 胞内蛋白抗体亲和特异性检测 |
| 2.2.7.5 胞内蛋白Ig G定量 |
| 2.2.7.6 胞内蛋白抗体轻重链类型鉴定 |
| 2.2.7.7 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 阳性单克隆杂交瘤细胞株筛选及腹水单抗表征 |
| 2.3.2 单克隆杂交瘤细胞株阴性率测定 |
| 2.3.3 抗体分泌情况FACS分析 |
| 2.3.4 各农药阴阳性细胞株抗体轻重链类型检测 |
| 2.3.5 BJQ单克隆细胞周期及抗体表达表征 |
| 2.3.5.1 BJQ杂交瘤细胞增殖速率表征 |
| 2.3.5.2 BJQ阳性细胞株E2生长阶段与Ig G分泌 |
| 2.3.5.3 胞内蛋白的抗体特异性鉴定 |
| 2.3.5.4 胞内蛋白IgG定量 |
| 2.3.5.5 胞内蛋白抗体轻重链类型表征 |
| 2.3.5.6 胞内蛋白抗体WB表征 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料与设备 |
| 3.2.1.1 试剂材料 |
| 3.2.1.2 仪器设备 |
| 3.2.1.3 主要缓冲液 |
| 3.2.1.4 实验材料 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞测序 |
| 3.2.2.1 杂交瘤细胞总RNA提取 |
| 3.2.2.2 5’RACE反转录及PCR扩增抗体轻重链可变区序列 |
| 3.2.2.3 抗体基因克隆及Sanger测序 |
| 3.2.3 HEK293(F)重组全抗体瞬时表达 |
| 3.2.3.1 质粒提取 |
| 3.2.3.2 瞬时表达质粒构建及验证 |
| 3.2.3.3 重组全抗体瞬时表达及纯化 |
| 3.2.3.4 瞬时表达重组抗体表征 |
| 3.2.4 HEK293重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.1 构建慢病毒表达载体 |
| 3.2.4.2 慢病毒包装及滴度测定 |
| 3.2.4.3 重组全抗体稳定表达 |
| 3.2.4.4 稳定表达重组抗体表征 |
| 3.2.5 杂交瘤细胞株免疫组库测序及分析 |
| 3.2.6 杂交瘤细胞转录组测序及生物信息分析 |
| 3.2.6.1 转录组测序 |
| 3.2.6.2 转录组数据生物信息分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 杂交瘤细胞测序 |
| 3.3.1.1 总RNA的提取 |
| 3.3.1.2 特异性PCR产物分析 |
| 3.3.2 百菌清重组抗体瞬时表达 |
| 3.3.2.1 瞬时表达载体构建及验证 |
| 3.3.2.2 重组抗体瞬时表达及纯化表征 |
| 3.3.3 百菌清重组抗体稳定表达 |
| 3.3.3.1 不同表达质粒和表达体系稳定表达重组抗体效果表征 |
| 3.3.3.2 腹水抗体以及瞬时/稳定表达的重组抗体亲和性表征 |
| 3.3.4 BJQ杂交瘤细胞株免疫组库测序 |
| 3.3.5 BJQ阴阳性细胞转录组学测序及分析 |
| 3.3.5.1 RNA样品检测结果 |
| 3.3.5.2 测序数据过滤及测序质量分析 |
| 3.3.5.3 参考基因组比对 |
| 3.3.5.4 样品组间相关性 |
| 3.3.5.5 杂交瘤细胞株抗体基因表达分析 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 抗百菌清单抗表达差异的杂交瘤细胞株转录组分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料与设备 |
| 4.2.1.1 试剂材料 |
| 4.2.1.2 仪器设备 |
| 4.2.1.3 实验材料 |
| 4.2.2 转录组差异表达基因筛选及GO/KEGG富集 |
| 4.2.3 qPCR验证转录组差异表达基因 |
| 4.2.3.1 RNA提取 |
| 4.2.3.2 cDNA合成 |
| 4.2.3.3 qPCR反应 |
| 4.2.4 RNA干扰 |
| 4.2.4.1 基因siRNA片段设计 |
| 4.2.4.2 siRNA转染条件优化 |
| 4.2.4.3 RNA基因干扰 |
| 4.2.4.4 qPCR验证RNAi效果 |
| 4.2.4.5 流式分析RNAi杂交瘤细胞抗体分泌情况 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 差异表达基因分析 |
| 4.3.2 差异基因GO富集分析 |
| 4.3.3 差异基因KEGG富集分析 |
| 4.3.4 显着差异表达基因分析 |
| 4.3.5 qPCR验证转录组数据 |
| 4.3.6 RNAi验证基因功能 |
| 4.3.6.1 siRNA转染效率优化 |
| 4.3.6.2 RNA干扰功能基因表达及抗体分泌 |
| 4.3.7 杂交瘤细胞抗体表达途径及转阴可能因素 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 第5章 CRISPR/Cas9文库筛选杂交瘤细胞抗体表达的功能基因 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试剂与材料 |
| 5.2.2 仪器与设备 |
| 5.2.3 文库质粒扩增 |
| 5.2.4 慢病毒包装 |
| 5.2.4.1 去内毒素质粒中提 |
| 5.2.4.2 慢病毒包装 |
| 5.2.4.3 慢病毒滴度测定 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞慢病毒文库感染 |
| 5.2.5.1 细胞准备 |
| 5.2.5.2 嘌呤霉素筛选浓度优化 |
| 5.2.5.3 慢病毒感染效率测定 |
| 5.2.6 GeCKO慢病毒文库感染E2细胞株 |
| 5.2.7 农药压力筛选 |
| 5.2.7.1 筛选原理 |
| 5.2.7.2 百菌清农药对杂交瘤细胞致死效应及抗体“中和作用” |
| 5.2.7.3 百菌清农药筛选浓度优化 |
| 5.2.7.4 百菌清农药筛选GeCKOv2E2细胞文库 |
| 5.2.8 流式细胞分选 |
| 5.2.8.1 分选原理 |
| 5.2.8.2 流式细胞分选 |
| 5.2.9 NGS扩增子测序 |
| 5.2.9.1 基因组DNA提取 |
| 5.2.9.2 特异性PCR |
| 5.2.9.3 NGS扩增子测序及数据分析 |
| 5.2.10 sh RNA功能基因验证 |
| 5.2.10.1 shRNA慢病毒质粒构建及慢病毒包装 |
| 5.2.10.2 shRNA慢病毒感染 |
| 5.2.10.3 qPCR验证基因功能 |
| 5.2.10.4 FACS检测杂交瘤细胞抗体表达情况 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 GeCKOv2 library质粒扩增 |
| 5.3.2 GeCKO library慢病毒包装与检测 |
| 5.3.3 杂交瘤细胞慢病毒文库构建 |
| 5.3.3.1 puro筛选浓度优化 |
| 5.3.3.2 慢病毒感染效率测定 |
| 5.3.3.3 GeCKOv2 E2 library慢病毒敲除文库构建 |
| 5.3.4 百菌清农药压力筛选 |
| 5.3.4.1 百菌清农药对杂交瘤细胞的毒性作用 |
| 5.3.4.2 特异性单抗对百菌清农药的“中和作用” |
| 5.3.4.3 百菌清农药筛选时间及浓度优化 |
| 5.3.4.4 百菌清农药筛选GeCKO v2 E2细胞文库 |
| 5.3.5 流式细胞分选 |
| 5.3.6 农药压力筛选NGS扩增子测序分析 |
| 5.3.6.1 核酸样品质控 |
| 5.3.6.2 测序数据质控 |
| 5.3.6.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.6.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.6.5 样品间相似性分析 |
| 5.3.6.6 显着富集基因分析 |
| 5.3.6.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.6.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.6.9 药筛富集的功能基因、通路与转录组比对分析 |
| 5.3.7 流式细胞分选测序结果分析 |
| 5.3.7.1 核酸样品质控 |
| 5.3.7.2 测序数据质控 |
| 5.3.7.3 gRNA比对与统计结果 |
| 5.3.7.4 阳性基因筛选与注释 |
| 5.3.7.5 样本间相似性分析 |
| 5.3.7.6 显着差异基因分析 |
| 5.3.7.7 GO功能富集分析 |
| 5.3.7.8 KEGG富集分析 |
| 5.3.7.9 CRISPR library流式筛选及药物筛选功能基因通路与RNA-seq比对分析 |
| 5.3.8 shRNA干扰验证功能基因 |
| 5.3.8.1 shRNA慢病毒感染效率优化 |
| 5.3.8.2 qPCR验证干扰基因及抗体基因表达情况 |
| 5.3.8.3 FACS检测抗体表达情况 |
| 5.4 讨论与小结 |
| 第6章 百菌清抗原免疫小鼠脾脏细胞转录组学分析 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 实验材料 |
| 6.2.2 转录组测序与生物信息分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 脾脏转录组RNA样品检测结果 |
| 6.3.2 脾脏转录组测序数据过滤及测序质量分析 |
| 6.3.3 脾脏转录组数据参考基因组比对 |
| 6.3.4 基因表达分析及显着性DEG筛选 |
| 6.3.5 差异基因GO富集分析 |
| 6.3.6 差异基因KEGG富集分析 |
| 6.3.7 显着差异基因分析 |
| 6.4 讨论与小结 |
| 第7章 抗百菌清杂交瘤细胞抗体表达的调控途径及分子机制探究 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 BJQ特异性杂交瘤细胞株及其单抗的多样性分析 |
| 7.2.1 杂交瘤细胞株及其单抗表型的多样性分析 |
| 7.2.1.1 阴阳性单克隆杂交瘤细胞的定义 |
| 7.2.1.2 不同处理方式测定杂交瘤细胞株阴性率 |
| 7.2.1.3 杂交瘤细胞增殖及抗体分泌情况 |
| 7.2.1.4 流式分析杂交瘤细胞抗体分泌情况及抗体亚型检测 |
| 7.2.1.5 BJQ杂交瘤细胞株抗体产生情况分析 |
| 7.2.2 杂交瘤细胞株抗体基因及转录水平比较分析 |
| 7.2.2.1 BJQ特异性杂交瘤细胞抗体序列测定及验证 |
| 7.2.2.2 BJQ阴阳性细胞及SP2/0 细胞免疫组库测序 |
| 7.2.2.3 BJQ五株阴阳性细胞及SP2/0 细胞抗体基因表达情况 |
| 7.3 BJQ特异性抗体表达差异的杂交瘤细胞株转录组学分析 |
| 7.3.1 DEG筛选及RNA-seq可靠性验证 |
| 7.3.2 GO功能及KEGG通路富集分析 |
| 7.3.3 差异表达基因分析 |
| 7.3.4 RNAi相关功能基因分析 |
| 7.4 CRISPR文库筛选杂交瘤细胞抗体表达相关基因及通路分析 |
| 7.4.1 GeCKO文库质粒扩增及慢病毒包装 |
| 7.4.2 慢病毒文库感染杂交瘤细胞 |
| 7.4.3 农药压力筛选与流式细胞分选 |
| 7.4.4 NGS扩增子测序数据分析 |
| 7.4.5 差异基因与功能通路富集分析 |
| 7.4.6 shRNA验证Pet2基因和Ccnd2基因功能 |
| 7.5 BJQ杂交瘤细胞转录组与CRISPR library筛选综合分析 |
| 7.5.1 转录组与CRISPR library筛选方法比较 |
| 7.5.2 两种筛选方式共同富集的基因功能及信号通路 |
| 7.5.3 两种筛选方式共同富集的差异基因分析 |
| 7.5.4 杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.6 骨髓瘤细胞SP2/0 与杂交瘤细胞功能基因表达差异分析 |
| 7.7 百菌清农药抗原免疫小鼠脾细胞各阶段转录组分析 |
| 7.7.1 研究对象的选择 |
| 7.7.2 转录组基因表达分析及差异基因筛选 |
| 7.7.3 脾脏转录组显着差异基因GO/KEGG富集分析 |
| 7.7.4 小鼠机体产生抗BJQ特异性抗体的过程 |
| 7.7.5 杂交瘤细胞与机体B细胞抗体合成途径异同 |
| 7.8 抗百菌清特异性单抗合成及分泌途径及调控机制 |
| 7.8.1 杂交瘤细胞的融合与体外培养 |
| 7.8.2 杂交瘤细胞抗体基因编码与表达 |
| 7.8.2.1 DNA编码水平 |
| 7.8.2.2 表观遗传学编码水平 |
| 7.8.2.3 杂交瘤细胞抗体基因表达调控 |
| 7.8.3 杂交瘤细胞周期进程调控 |
| 7.8.4 信号通路与转录因子调控杂交瘤细胞抗体表达 |
| 7.8.5 杂交瘤细胞抗体基因转录后调控 |
| 7.8.6 杂交瘤细胞抗体装配与修饰 |
| 7.8.7 杂交瘤细胞抗体运输及分泌 |
| 7.8.8 杂交瘤细胞调控抗体合成及分泌的相关机制 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 全文总结 |
| 8.2 全文创新点 |
| 8.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 |
（5）大蒜素对胃癌细胞EMT的作用及对NF-κB活化的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 3.统计学方法 |
| 结果 |
| 1.大蒜素对胃癌HGC-27 细胞体外作用的研究 |
| 2.大蒜素对胃癌HGC-27 细胞发生EMT后体外作用的研究 |
| 讨论 |
| 1.大蒜素对胃癌细胞的作用 |
| 2.大蒜素对胃癌细胞EMT现象的作用及其机制的初步探讨 |
| 3.不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师评阅表 |
（6）Beclin1调控斑马鱼肠道炎症的功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 斑马鱼肠道发育与免疫系统概述 |
| 1.1.1 斑马鱼肠道早期发育 |
| 1.1.2 肠道微生物对斑马鱼的影响 |
| 1.1.3 斑马鱼肠道的天然性免疫系统 |
| 1.1.4 斑马鱼肠道的获得性免疫系统 |
| 1.2 斑马鱼肠炎的研究进展 |
| 1.2.1 通过药物诱导形成肠炎的研究进展 |
| 1.2.2 通过遗传改造形成肠炎的研究进展 |
| 1.3 Beclin1 蛋白的结构域简介 |
| 1.4 Beclin1 蛋白的功能概述 |
| 1.4.1 Beclin1 在自噬中的功能 |
| 1.4.1.1 自噬简介 |
| 1.4.1.2 自噬发生的分子机制 |
| 1.4.1.2.1 自噬起始阶段 |
| 1.4.1.2.2 自噬体前体膜延伸和封闭阶段 |
| 1.4.1.2.3 自噬体与溶酶体融合及降解阶段 |
| 1.4.1.3 自噬通路中Beclin1 相关的复合体 |
| 1.4.2 Beclin1 非自噬依赖的功能 |
| 1.4.2.1 Beclin1 参与内体循环 |
| 1.4.2.2 Beclin1 在肿瘤细胞中的研究 |
| 1.4.2.2.1 Beclin1 调控生长因子信号通路 |
| 1.4.2.2.2 Beclin1 调控细胞周期 |
| 1.4.2.2.3 Beclin1 参与DNA损伤修复 |
| 1.4.2.2.4 Beclin1 参与细胞凋亡 |
| 1.5 自噬在维持肠道稳态中的作用 |
| 1.5.1 自噬维持肠上皮屏障功能 |
| 1.5.2 自噬维持肠上皮细胞的正常功能 |
| 1.5.3 自噬调控免疫细胞的发育和分化 |
| 1.6 人类炎症性肠病 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 斑马鱼品系 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 其他实验试剂的配置 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 斑马鱼胚胎的无菌培养 |
| 2.2.2 斑马鱼肠道Total RNA提取 |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 石蜡切片 |
| 2.2.5 H&E染色 |
| 2.2.6 冰冻切片 |
| 2.2.7 切片免疫荧光 |
| 2.2.8 肠道组织免疫荧光 |
| 2.2.9 斑马鱼基因型鉴定 |
| 2.2.10 Taq酶的制备 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 beclin1 突变体肠道结构异常 |
| 3.2 beclin1 突变体肠道屏障功能损坏 |
| 3.3 beclin1 突变体肠道发生炎症反应 |
| 3.4 beclin1 突变体中的炎症反应依赖肠道菌群 |
| 3.5 beclin1 突变体中肠道屏障功能的缺陷可能不依赖自噬 |
| 第4章 总结与讨论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 结果分析与讨论 |
| 4.2.1 beclin1 突变体与CD的相似性比较 |
| 4.2.2 Beclin1 在维持肠上皮稳态中的功能分析 |
| 4.2.3 beclin1 突变体表型出现的时间及比例问题分析 |
| 4.2.4 无菌培养下葡聚糖在突变体中出现一种新的分布模式分析 |
| 4.2.5 beclin1 突变体中的表型主要表现在前肠 |
| 4.3 有待完善的实验 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）启膈方调控Gas6/Axl信号传导通路抑制食管癌细胞迁移和侵袭的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 人食管鳞状细胞癌组织Gas6和Axl的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 启膈方通过调控Gas6/Axl抑制食管癌细胞的移动能力 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 启膈方调节Gas6/Axl抑制EMT影响食管癌细胞迁移和侵袭的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 肿瘤侵袭和转移的研究及与 Gas6/Axl 的关系 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）腹膜间皮细胞衰老在胃癌腹膜转移中作用的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :胃癌上清诱导腹膜间皮细胞衰老 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要细胞和试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要耗材 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 原代提取及培养 |
| 2.2.3 条件培养基制备 |
| 2.2.4 条件培养基对腹膜间皮细胞直接诱导 |
| 2.2.5 衰老相关β半乳糖苷酶检测 |
| 2.2.6 细胞全蛋白提取及蛋白定量 |
| 2.2.7 蛋白质免疫印迹 |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 细胞总RNA提取 |
| 2.2.10 RNA逆转录(Taka Ra047A) |
| 2.2.11 荧光实时定量PCR(Real time PCR)(Taka Ra820A) |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 腹膜间皮细胞原代提取 |
| 3.2 胃癌上清诱导腹膜间皮细胞后其衰老相关β半乳糖苷酶产生增多 |
| 3.3 胃癌上清诱导腹膜间皮细胞CX43表达降低 |
| 3.4 胃癌上清诱导腹膜间皮细胞γ-H2A.X表达增加 |
| 3.5 胃癌上清诱导腹膜间皮细胞P16~(ink4a)表达增加 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 衰老的腹膜间皮细胞促进胃癌细胞粘附、迁徙、侵袭能力增加 |
| 1 前言 |
| 2 材料方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器和耗材 |
| 2.2 主要实验方法 |
| 2.2.1 年轻腹膜间皮细胞和衰老腹膜间皮细胞鉴别 |
| 2.2.2 胃癌细胞-腹膜间皮细胞粘附实验 |
| 2.2.3 胃癌细胞-间皮细胞迁移实验 |
| 2.2.4 胃癌细胞-间皮细胞侵袭实验 |
| 2.3 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 年轻腹膜间皮细胞与衰老腹膜间皮细胞对比 |
| 3.2 腹膜间皮细胞衰老促进胃癌细胞粘附 |
| 3.3 腹膜间皮细胞衰老促进胃癌细胞迁徙 |
| 3.4 腹膜间皮细胞衰老促进胃癌细胞侵袭 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）TNF-α通过MZF-1/Cx43轴上调胃癌细胞干性与腹膜转移机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 重要仪器 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 瞬时转染实验 |
| 2.3.3 慢病毒转染实验 |
| 2.3.4 Transwell细胞迁移、侵袭实验 |
| 2.3.5 划痕实验 |
| 2.3.6 免疫组织化学染色实验 |
| 2.3.7 Western Blot实验 |
| 2.3.8 qRT-PCR实验 |
| 2.3.9 肿瘤干细胞成球实验 |
| 2.3.10 Elisa实验 |
| 2.3.11 统计方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 Cx43促进胃癌细胞的侵袭与迁移,并与腹膜转移相关 |
| 3.2 胃癌细胞中Cx43过表达可引起胃癌细胞干性升高 |
| 3.3 与巨噬细胞共培养可通过上调Cx43引起胃癌细胞干性升高 |
| 3.4 巨噬细胞可提供富含TNF-α的微环境 |
| 3.5 TNF-α可以通过上调Cx43 蛋白表达引起胃癌细胞干性升高 |
| 3.6 胃癌细胞中MZF-1可调节Cx43的表达 |
| 3.7 TNF-α通过MZF-1 调节Cx43 的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）口腔鳞癌肿瘤相关成纤维细胞外泌体中miR-188-5p调控PTEN促进细胞迁移和侵袭（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 CAFs促进OSCC细胞迁移和侵袭 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 第二部分 外泌体将miR-382-5p转运至OSCC细胞促进细胞迁移和侵袭 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 第三部分 miR-382-5p通过抑制PTEN促进OSCC细胞迁移和侵袭 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 附图与附表 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 承担科研项目 |
| 致谢 |
| 英文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、Alteration of cadherin isoform expression and inhibition of gap junctions in stomach carcinoma cells（论文参考文献）
- [1]靶向细胞间粘附分子抗体药物偶联物抗肿瘤作用及机制研究[D]. 朱西. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
- [2]薯蓣提取物-薯蓣皂苷抑制胃癌侵袭转移的作用及机制研究[D]. 顾慧杰. 扬州大学, 2021
- [3]抑制Cx43通过减轻氧化应激对脓毒症肠损伤的保护作用研究[D]. 邹兆伟. 南方医科大学, 2021
- [4]杂交瘤细胞中百菌清特异性抗体基因的表达及调控机制[D]. 柳颖. 浙江大学, 2020(01)
- [5]大蒜素对胃癌细胞EMT的作用及对NF-κB活化的影响[D]. 徐丹. 石河子大学, 2020(08)
- [6]Beclin1调控斑马鱼肠道炎症的功能研究[D]. 张哲. 西南大学, 2020(01)
- [7]启膈方调控Gas6/Axl信号传导通路抑制食管癌细胞迁移和侵袭的研究[D]. 孔令玉. 河北医科大学, 2020(01)
- [8]腹膜间皮细胞衰老在胃癌腹膜转移中作用的实验研究[D]. 吴佩. 中国医科大学, 2020(01)
- [9]TNF-α通过MZF-1/Cx43轴上调胃癌细胞干性与腹膜转移机制的研究[D]. 孙安琦. 中国医科大学, 2020(01)
- [10]口腔鳞癌肿瘤相关成纤维细胞外泌体中miR-188-5p调控PTEN促进细胞迁移和侵袭[D]. 孙立平. 山东大学, 2019(02)