表皮干细胞分离和基因特异性表达

一、表皮干细胞分离及基因特异性表达（论文文献综述）

王欣^[1]（2020）在《S14G-humanin（HNG）对表皮细胞氧化应激、自由基代谢和DNA损伤的保护机制的研究》文中研究表明研究背景:近年,由于自然环境遭到破坏,臭氧层也遭到了不同程度的破坏,有些地方已经出现了臭氧层空洞,破坏的臭氧层过滤作用减弱,因而到达地球表面的紫外线（UV）增多。紫外线可促进机体对维生素D的吸收,但是过度的UV辐射会影响人类健康,一是紫外线辐射会导致皮肤发生光老化,进而使皮质层的胶原纤维产生大量减少,皮肤弹力会有明显的下降,更严重的会发生皮肤结缔组织严重损伤,进而引起皮肤的松弛、下垂和皱纹加深等不良后果;二是短时暴露在高剂量的紫外线环境中,会使皮肤干细胞发生凋亡坏死的现象,这将损害表皮天然屏障的防护功能,进而会引起临床特征性改变包括纹理加深,斑点状色素沉着,皱纹增多,干燥粗糙,皮肤松弛,毛细血管扩张,弹性降低以及良、恶性肿瘤等。皮肤是人体最大的器官,有防止紫外线辐射、调节体温、防止水分丢失、维持外貌以及抵御微生物入侵等作用。皮肤是由非同源性的细胞组成有很强的自我愈合能力。在紫外线的两种不同波段中,UVA会使细胞自由基生成、会使脂质过氧化的能力达到最强,进而会影响真皮组织中胶原以及弹力纤维,从而会产生皮肤的光老化;UVB主要通过引起表皮层和真皮浅层的病变,进而产生日晒的红斑、免疫的抑制及严重者皮肤癌。UVA和UVB相互联合能够在表皮和真皮中导致一系列的病变,并且UVA具有增强UVB红斑作用的能力。UVA可以依靠氧化作用产生过氧化物,后者会引起继发性DNA损伤,从而使UVB的致癌作用得到增强。正常皮肤的自我修复和更新是由不同类型的干细胞共同作用的结果,这是维持皮肤正常的组织结构以及稳定细胞内环境的要求。皮肤分为真皮和表皮,表皮由里及外是由基底层、棘细胞层、颗粒层、透明层和角质层组成,而基底层中含有大量的干细胞,是一细胞集群落,在体内会增殖发育成表皮细胞,表皮干细胞有一个较为缓慢的分裂增殖周期,可引起自细胞的短暂扩增,经过几次分裂后,完成终末分化。体外的研究证明S14G-Humanin在低浓度下即可显着抑制干细胞损害,对干细胞、原代皮层细胞死亡都有显着性的抑制作用。S14G-Humanin既可以通过抗细胞死亡途径来发挥其干细胞保护作用,还可以通过与特定受体结合而起到细胞保护作用,其中包括促细胞凋亡Bcl-2家族蛋白Bim、Bid和Bax。皮肤长期暴露于UV照射可引起细胞DNA的损伤和突变,一旦受到损伤,机体会启动修复程序,细胞内的一些基因被抑制,一些基因被激活。若是不能修复损伤的DNA则会启动细胞凋亡程序。细胞凋亡与凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡加速基因Bax密切相关。Bcl-2蛋白能够抑制细胞凋亡,与Bax结合形成异源二聚体后,通过抑制细胞色素C的释放,进而抑制下游的caspase-3的激活,从而实现抑制细胞凋亡的目的。另外Bax蛋白还有促进细胞凋亡的作用,可直接在线粒体膜上建立跨膜通道,促进细胞色素C的释放,通过调控细胞色素C达到促进细胞凋亡的目的。Bcl-2和Bax的比例决定了细胞是否凋亡,两者间形成对细胞凋亡的正向调控。JAK2/STAT3信号通路是近年来研究最为广泛的信号转导通路之一。STAT3信号通路的作用是通过将细胞膜检测到的信号直接传递给细胞核,进而使靶基因转录被激活。研究发现,细胞因子（CNTF,IL2,IL6等）和生长因子（PDGF,EGF,CSF等）都是通过这种信号转导途径来诱导细胞的分化,增殖或凋亡的发生,并在细胞中发挥特异性和多功能的生物学功能,进而起到调节免疫功能,肿瘤发生和造血的作用。PI3K是磷酸化磷脂酰肌醇磷脂酰激酶家族的一员,在肌醇环D3的位置上。PI3K家族主要结构涉及细胞外信号转导,进而反应产物是第二信使,其目标是丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt位于PI3K的下游,并受到细胞外刺激的激活,Akt经细胞质转移到细胞膜,同时在细胞质Akt的两个残基（苏氨酸308和丝氨酸473）磷酸化,进而引起Akt的完全激活。Akt通路的作用是可以抑制细胞凋亡并促进细胞生长。PI3K/Akt和JAK2/STAT3是非常重要的信号通路。它们参与许多病理生理过程,例如细胞活化,凋亡,炎症反应和趋化性的产生。这两个信号通路参与了各种针对细胞凋亡的干预机制,但是是否参与了表皮细胞氧化应激,自由基代谢和DNA损伤尚待研究。1.S14G-humanin（HNG）对紫外线-B诱导的表皮干细胞损伤的保护作用目的:探究S14G-humanin（HNG）对紫外线-B诱导的表皮干细胞损伤的保护作用。方法:分离了小鼠表皮干细胞,并在紫外线（UV）-B处理下研究了HNG对表皮干细胞的细胞保护作用。实验细胞随机分为4组:空白对照组、紫外线组、100μM HNG预处理组和200μM HNG预处理组,每组包括60个培养皿。干预措施:将ESC用100μM和200μM HNG处理12小时,用50m J/cm2的紫外线刺激12小时。MTT细胞存活和LDH细胞毒性实验。使用MTT测定法测试细胞活力;实时PCR分析Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1的转录水平;蛋白质分离和蛋白质印迹分析Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1的表达;活性氧（ROS）的测量;TMRM染色;还原型谷胱甘肽（GSH）的测定。结果:HNG抑制UV-B诱导的ROS产生并增加抗氧化剂谷胱甘肽的表达。HNG预处理的细胞在暴露于UV-B后有细胞因子产生,包括TNF-α,IL-1β和IL-6。HNG预处理对UV-B介导的细胞毒性有保护作用并促进ESC存活。此外,HNG治疗减弱了UV-B诱导的线粒体膜电位（MMP）的减少,并保持其干细胞能力。机制上,HNG处理改善了UV-B诱导的Wnt/β-连环蛋白的减少,包括Wtn3a、Myc和细胞周期蛋白D1。结论:HNG在表皮干细胞中起着促生存和抗氧化应激的作用,并有可能用于ESC介导的治疗。2.S14G-humanin（HNG）缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤的分子机制目的:探索S14G-humanin（HNG）缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤的分子机制。方法:实验细胞分为两组:S14G-humanin质粒转染组、空白对照组,每组包括60个培养皿。干预措施:S14G-humanin质粒转染组和空白对照组的细胞用30J/m2的紫外线刺激12小时。对小鼠皮肤干细胞进行转染,利用RT-PCR对S14G-humanin靶基因表达进行分析,对转染后的细胞的凋亡状态利用流式细胞仪进行分析,通过Western blot对凋亡蛋白及细胞通路蛋白表达量进行测定。结果:功能性S14G-humanin V143A选择性增强了参与细胞生长阻滞和DNA损伤修复的S14G-humanin V143A靶点的表达,而非凋亡;紫外照射后S14G-humanin组的细胞凋亡或细胞周期分布未受到紫外线的显着性影响（P>0.05）;Western blot实验结果表明,S14G-humanin V143A组p-c-Jun的表达水平明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）,S14G-humanin V143A的表达抑制了紫外线刺激的JNK活性,抑制了JNK信号的传递。结论:S14G-humanin（HNG）通过抑制JNK信号通路缓解紫外线诱导的小鼠皮肤干细胞自由基代谢和DNA损伤。3.S14G-humanin（HNG）缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞损伤机制的研究目的:研究S14G-humanin（HNG）缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞损伤的机制。方法:从小鼠背部皮肤中分离出表皮干细胞ESC进行细胞培养,并随机分为3组:对照组（正常细胞培养板中培养16个小时的细胞）;诱导组（密封室中剥夺葡萄糖和血清,在37℃下产生缺氧条件下培养,随后在正常培养基中构建氧葡萄糖剥夺/再氧合模型）和HNG+诱导组:在诱导组基础上加入1μg/l的HNG继续培养5个小时;HNG+诱导组+抑制剂组（分别添加FLLL32、LY294002和MK-2206等特异性抑制剂来研究PI3K/AKT通路与Jak2/Stat3的激活情况）;通过TMRM染色测量线粒体跨膜电位的水平;使用DCFH-DA测定活性氧;通过q RT-RCR和蛋白质免疫印迹检测细胞凋亡和相关因子蛋白的表达;用CCK8检测细胞活力,使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。结果:在氧葡萄糖剥夺/复氧的条件下,HNG提高了ESC活力,降低凋亡率,并降低了细胞内ROS水平,促进GSH生成,阻止线粒体跨膜电位降低;HNG提高了Jak2、Stat3、p-Jak2和P-Stat3蛋白的表达水平,降低了促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）m RNA的表达和凋亡蛋白Bax、caspase的表达。机制上,Jak2/Stat3通路被抑制后,凋亡蛋白Bax、caspase的表达水平升高和凋亡率升高;PI3K/AKT通路被抑制后,Jak2和Stat3蛋白表达明显降低。结论:S14G-humanin（HNG）通过PI3K/AKT通路激活Jak2/Stat3的表达从而缓解氧葡萄糖剥夺复氧对表皮干细胞的损伤。4.S14G-humanin通过增强抗氧化防御系统和激活pparα保护表皮细胞免受氧化应激损伤的机制目的:研究S14G-humanin通过增强抗氧化防御系统和激活pparα保护表皮细胞免受氧化应激损伤的作用机制。方法:通过传代、冻存、复苏等进行细胞培养,使用H2O2建立表皮细胞氧化应激损伤模型,将实验分为空白对照组,H2O2损伤模型组,S14G-humanin作用组进行实验。在研究过程中检测细胞增殖活性、观察细胞的形态学特征,使用试剂盒测定细胞中SOD、CAT、GSH、GPx、GST等的活性;提取细胞RNA进行反转录后使用PCR扩增仪进行扩增,琼脂糖电泳,进行凝胶成像检测PPAR-αm RNA的表达,并提取细胞蛋白,利用Western blot检测PPAR-α蛋白表达,统计各项试验结果,进行相关性分析。结果:在H2O2作用下,S14G-humanin作用组细胞形态改善,增殖活性提高,抗氧化酶（SOD、CAT、GSH、GPx和GST）活性增强;人ESC内ppar-αm RNA的水平和蛋白表达量升高。结论:H2O2可刺激人表皮干细胞,抑制其生长,S14G-humanin对人表皮干细胞的氧化应激损伤有一定的改善作用。S14G-humanin可使细胞的SOD活性、CAT活性、GSH活性等抗氧化活性系统酶类活性增强,它们是生物体内抗氧化防御系统的主要成分,其活性升高有利于防止机体免受应激伤害。同时S14G-humanin可提高ppar-αm RNA水平、促进PPAR-α蛋白的表达,从而保护表皮细胞免受氧化应激的损伤

杨玉花^[2]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中研究表明背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。

苏义群^[3]（2020）在《头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成》文中研究指明研究背景毛发具有十分重要的生理学和社会学的价值,而脱发一直是医学界的一大难题。为此全球各大医药公司每年投入大量的人力物力以寻求治疗脱发的有效疗法。尽管如此,可供选择的治疗手段依然十分有限,而毛囊相关的研究主要受限于缺乏安全高效的药物筛选系统。类器官作为一种由干细胞为原料,经体外培养自我组装成的三维结构,具有与实际器官相似的特征及功能,为研究器官发育、组织再生及疾病发病机理提供了新的可能。近年来,已成功培育多种上皮类器官,例如乳腺,唾液腺以及结肠和肝管,但是在体外培育毛囊类器官仍是一大难题,本研究通过体外悬浮共培养头皮真皮祖细胞及表皮干细胞形成具有毛囊早期发育特征的真皮-表皮细胞聚集体,探究了 WNT信号通路在毛囊类器官形成过程中的作用,并通过体内实验证实其促生发能力,为实现高效培育毛囊类器官提供了新的途径。实验目的1.通过构建真皮祖细胞和表皮干细胞的三维聚集体探索体外培育毛囊类器官的实验方法。2.对成功构建的毛囊类器官进行组织学及遗传学评估。3.探究WNT信号通路在毛囊类器官形成早期发挥的作用。4.探究培育的毛囊类器官在移植后是否可以有效促进毛发生成。实验方法1.依照本课题组创立的“一步消化法”,从新生儿包皮组织中分离原代表皮细胞,并通过克隆形成实验及流式细胞术检测干细胞标志物α6-integrin的表达对表皮干细胞进行鉴定。通过免疫荧光检测相应的特异性标志物对成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞多向分化能力进行鉴定。2.将分离的头皮真皮祖细胞和表皮干细胞重悬于配制好的DMEM/F12（3:1）完全培养基中,然后将其接种到低粘附力Costar（?）6-孔板中进行悬浮共培养以形成细胞聚集体。通过倒置显微镜观察细胞聚集体的形态及生长状态。3.将培养成功的真皮-表皮聚集体制成冰冻标本,通过HE染色探究聚集体的构成结构并通过免疫荧光染色检测聚集体中毛囊发育相关基因的表达,对共培养过程中形成的不同真皮-表皮细胞聚集体进行分类及鉴定。4.利用qRT-PCR检测真皮-表皮细胞聚集体中毛囊发育相关基因的表达。5.在悬浮共培养基中加入WNT3a重组蛋白和WNT抑制剂IWP2,观察聚集体的形成并通过qRT-PCR探究WNT通路相关信号分子在毛囊类器官形成过程中的表达。6.通过裸鼠移植检测真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集构成的毛囊类器官在移植后对毛发再生的作用。实验结果1.从新生儿包皮组织中成功分离出表皮干细胞,传代培养后子代细胞可以形成符合干细胞评价标准的全克隆,并表达表皮干细胞标志物α6-integrin。免疫荧光结果显示,成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞在分化诱导后表达成骨、成脂、成肌、成神经的相关标志蛋白,具有多向分化潜力。2.体外悬浮共培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞自组装为两种类型的聚集体,免疫荧光结果显示其中Ⅰ型聚集体表达毛囊发育早期标志基因,符合毛囊类器官的鉴定标准。3.RT-PCR结果显示,真皮-表皮聚集体中毛囊早期发育相关信号分子差异性表达,其中WNT信号通路在聚集体形成早期被显着激活。4.WNT通路激活剂WNT3a重组蛋白及WNT通路抑制剂IWP-2,可分别促进和抑制毛囊类器官的形成,表明WNT通路的激活是体外成功培养毛囊类器官形成的必要条件。5.胎儿头皮组织来源真皮祖细胞与表皮干细胞经悬浮共培养聚集后在体内移植中的毛发再生效率明显高于未经预聚集培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞混合液。6.在与表皮干细胞悬浮共培养的过程中,胎儿头皮来源的真皮祖细胞形成Ⅰ型聚集体（毛囊类器官）的效率明显高于成人头皮来源的真皮祖细胞,表明Ⅰ型聚集体的形成能够反映细胞在移植后毛发再生的能力。结论在本实验中,我们建立了可以在体外高效形成大量毛囊类器官（Ⅰ型聚集体）的实验系统,该系统为检测毛发干细胞的生发潜能,评估诱导多能干细胞及促毛囊再生药物的大规模筛选提供了新的平台。此外,我们还证实了WNT信号通路的早期激活是符合毛囊类器官特征的Ⅰ型聚集体形成的必要条件。本研究还清楚地表明,使用胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞培育的毛囊类器官在移植后具有良好的毛发再生能力,而使用成年头皮组织来源的真皮祖细胞在体外有效地再生毛囊类器官仍然是一个巨大的挑战。出于伦理学考虑,在科研及临床应用中不宜广泛使用胎儿组织来源的细胞。因此,未来将致力于从诱导性多能干细胞（iPSC）转化为毛囊干细胞,并探索将成年细胞重编程为胎儿样细胞,以取代本实验中的胎儿来源的细胞。

王淞^[4]（2019）在《P311在创面血管新生中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景皮肤创面是临床最常见病症之一,烧伤、创伤、手术及多种内科疾病等均可导致皮肤创面的发生。创面修复,尤其是难愈性创面的修复在临床上仍面临着许多挑战,仅在美国,每年应用于难愈性创面治疗的直接医疗费用就超过了250亿美元。近年来虽对皮肤创面修复进行了较多的研究,但其机理并未完全清楚。创面血管新生是创面修复的关键环节之一,创面血管新生主要包括血管基底膜降解、血管内皮细胞迁移与出芽生长、管腔形成、局部需要性调整与稳定成熟等步骤。整个过程涉及多种细胞与细胞因子,其中微血管内皮细胞是参与此过程的主要功能细胞,它们在多种细胞因子及信号通路的精确调控下,通过迁移、增殖、芽生等而形成新生血管。VEGF（现在表示为VEGFA）是创面愈合过程中最主要的促血管生成因子。VEGF及其介导的各级联信号通路参与血管新生各个过程。VEGFR2是VEGF最主要的结合受体,能够转导VEGF的所有已知作用,是在血管生成中发挥重要作用的VEGFR。VEGF与VEGFR2结合,在小鼠中使得VEGFR2 Tyr1173磷酸化（人类中Tyr1175磷酸化）,该位点的磷酸化对ERK1/2激活至关重要,研究发现将其突变为苯丙氨酸（Tyr1173F）后,在胚胎发育时期内皮祖细胞分化受到抑制,进而导致胚胎早期死亡,这与敲除VEGFR2基因后的表现一致。P311是一种在种属间高度保守的细胞内多功能蛋白。虽然目前P311并不属于任何已知的蛋白质家族,但是现有研究发现P311蛋白在组织纤维化、神经系统疾病、肿瘤浸润、血压维持、组织再生等多方面发挥重要作用。我们课题组近期研究发现,P311在创面愈合中发挥重要作用。P311通过增强表皮干细胞Rho A和Rac1的活性提高表皮干细胞迁移能力,从而促进创面再上皮化。此外,P311可以通过TGFβ1/Smad信号通路,促进表皮干细胞向肌成纤维纤维样细胞转分化,从而促进烧伤创面的修复。鉴于创面血管新生是创面修复的关键环节之一,本课题在通过生物信息学预测发现P311可能参与血管形成的基础上,研究了P311对真皮微血管内皮细胞生物学功能的影响及其在创面血管新生的作用,并进一步从对VEGFR2/Erk1/2信号通路活化和VEGF表达调控的角度探讨了P311调控创面血管新生的分子机制。第一部分构建P311蛋白质相互作用网络初步探索其生物学功能方法:1.生物信息学预测P311功能将前期通过酵母双杂交实验鉴定出的能够与P311相互作用的蛋白,与P311一起构成原始P311蛋白质相互作用网络,进一步将此网络与已知的人类蛋白质相互作用网络分别合并,形成新的蛋白相互作用数据集。通过OCG算法处理该数据集,得到重构的P311蛋白质相互作用网络。通过DAVID分析各组重构P311蛋白质相互作用网络中的蛋白参与的生物过程,以预测P311可能的功能。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,通过HE染色观察创面浸润炎症细胞;实时定量PCR检测创面CD14和CD16 mRNA水平;流式细胞仪检测创面中F4/80阳性炎症细胞的百分比。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响使用P311重组腺病毒载体转染小鼠成纤维细胞,使之高表达P311。通过CCK8检测P311对成纤维细胞增殖能力的影响;通过流式细胞仪检测P311对细胞周期的影响。4.P311对烧伤后凝血功能的影响使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建浅Ⅱ°烧伤模型,使用血栓弹性描记图监测烧伤后血液的凝血特征。结果:1.生物信息学预测P311功能P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。2.P311在创面愈合过程中炎症反应中的作用HE染色发现,P311基因敲除小鼠创面炎症细胞和F4/80阳性细胞的数目明显低于P311野生型小鼠。P311基因敲除小鼠创面内CD14和CD16 mRNA水平明显低于P311野生型小鼠。3.P311对小鼠成纤维细胞的增殖的影响P311促进小鼠成纤维细胞的增殖。高表达P311的成纤维细胞中处于S期细胞比例明显较对照组比例高（25.16±4.92%vs 36.68±3.56%,p<0.05）。4.P311对烧伤后凝血功能的影响比较P311 WT烧伤小鼠与P311 KO烧伤小鼠血液血栓弹性描记图,除血凝块形成时间（R 8.850±1.541vs 7.733±1.210min,p=0.57）外,角度、MA和G等参数均有显着差异（p<0.05）。综上所述,我们通过构建P311蛋白质相互作用网络的生物信息学方法,预测了P311可能拥有14种新功能,其中P311在血管形成、炎症反应、细胞增殖和凝血中发挥作用最可信。并通过生物学实验初步证实P311参与炎症反应、细胞增殖和凝血过程。P311在血管形成中的作用在第二三部分进行系统研究。第二部分P311在创面血管新生中的作用方法:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强免疫组化和免疫荧光染色观察人创面和小鼠创面P311的表达情况;采用Percoll分离+CD31磁珠分离法分离培养小鼠真皮微血管内皮细胞,荧光和流式检测了分离细胞血管内皮细胞标志物的表达。免疫荧光染色和实时定量PCR检测分离培养的微血管内皮细胞在稳定状态和炎症刺激状态（IL-1β刺激）下P311的表达情况。2.P311对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测了P311敲除后对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;利用体内皮下基质胶栓实验检测P311敲除后对真皮微血管内皮细胞体内血管形成的影响。3.P311在小鼠创面血管新生的作用使用P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠分别构建全层皮损模型,大体和HE染色观察P311野生型小鼠和P311基因敲除小鼠的创面愈合、再上皮化和新生肉芽及微血管形成的规律;免疫组化染色观察小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;Western Blot检测小鼠创面、正常皮肤中CD31、VEGF和TGFβ1的表达情况;ELISA检测小鼠创面、正常皮肤中VEGF和TGFβ1的表达情况。结果:1.真皮微血管内皮细胞表达P311,在炎症刺激条件下其表达增强1.1创面微血管内皮细胞表达P311免疫组化观察到在人皮肤创面血管样结构中出现一些P311阳性细胞,进一步通过免疫荧光在小鼠创面中观察到在肉芽组织中vWF阳性细胞也表达P311,即血管内皮细胞表达P311。1.2成功分离培养真皮微血管内皮细胞分离培养的细胞融合后呈特征性“鹅卵石”形态,并且高表达vWF、CD31和CD34。1.3真皮微血管内皮细胞表达P311免疫荧光结果显示小鼠真皮微血管内皮细胞表达P311,但表达量不高,10ng/ml IL1β刺激后表达明显增强。定量PCR结果显示,10ng/ml IL1β刺激后小鼠真皮微血管内皮细胞中P311转录水平明显提高（p<0.01）。2.P311敲除对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响2.1 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311敲除后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显减少（p<0.01）,管状结构总长度明显变短（p<0.01）。2.2 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体外迁移能力细胞体外划痕迁移实验结果显示,P311敲除后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显减少（p<0.01）。2.3 P311敲除减弱真皮微血管内皮细胞体内血管形成能力体内皮下基质胶栓实验结果显示,P311敲除后基质胶栓中内皮细胞数量明显减少p<0.01)。3.P311在小鼠创面血管新生的作用3.1 P311敲除小鼠创面愈合、再上皮化减慢大体观察发现伤后第3天、第5天和第7天P311WT小鼠创面面积百分比均明显小于P311KO小鼠创面面积百分比。P311 WT小鼠创面平均6.2天愈合而P311 KO小鼠的创面平均7.8天愈合（p<0.05）。HE染色发现,伤后第3天和第5天,P311KO小鼠创面新生上皮长度显着短于P311WT小鼠创面新生上皮长度（p<0.05）。3.2 P311敲除小鼠创面新生肉芽及微血管减少HE染色发现,P311KO小鼠创面新生肉芽组织厚度较P311WT小鼠创面新生肉芽组织厚度薄,且P311KO小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量较P311WT小鼠创面新生肉芽组织中可见的微血管数量少（p<0.05）。免疫组化染色发现,P311 KO创面小鼠创面新血管数量（CD31阳性细胞）显着低于P311 WT创面小鼠;Western Blot分析结果显示P311WT小鼠创面组织中CD31蛋白水平明显较P311KO小鼠创面CD31蛋白水平高（P<0.01）。3.3 P311敲除小鼠创面VEGF和TGFβ1的表达减少免疫组化染色发现P311 KO创面小鼠创面VEGF和TGFβ1表达均明显低于P311WT创面小鼠;Western Blot结果显示P311WT小鼠创面组织中VEGF和TGFβ1蛋白水平均明显较P311KO小鼠创面VEGF和TGFβ1蛋白水平高（P<0.01）;ELISA结果显示P311 KO创面组织匀浆上清液中VEGF和TGFβ1的浓度明显低于P311 WT创面。综上所述,我们首次报道了P311通过影响真皮微血管内皮细胞的生物学功能来影响创面愈合中的血管新生。第三部分P311促进创面血管新生的机制研究方法:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响利用细胞体外划痕迁移模型检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞迁移功能的影响;利用体外基质胶血管管腔形成实验检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞体外血管形成的影响;nCounter基因表达谱分析系统和实时定量PCR检测P311高表达对真皮微血管内皮细胞血管生成基因表达的影响。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成利用Western blot检测P311高表达对VEGFR2和ERK1/2蛋白表达和磷酸化水平的影响;使用siRNA-VEGFR2和ERK1/2抑制剂SCH772984,利用Western blot和体外基质胶血管形成实验,检测P311通过激活VEGFR2进而激活Erk1/2,从而促进血管形成。3.P311对VEGF表达的调控使用P311重组腺病毒载体转染真皮微血管内皮细胞,使之高表达P311,通过Western Blot和实时定量PCR检测VEGF在微血管内皮细胞内的表达情况,通过ELISA检测VEGF在微血管内皮细胞培养上清中的水平。4.P311调控VEGF表达的分子机制构建VEGF启动子双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF启动子活性的影响;通过亚硫酸氢盐测序法检测P311对VEGF启动子CpG岛甲基化的影响;通过放线菌素D处理符合实时定量PCR检测P311对VEGF mRNA稳定性的影响;构建VEGF非翻译区（Untranslated region,UTR）双荧光素酶报告载体,通过荧光素酶报告实验检测P311对VEGF UTR活性的影响。结果:1.P311高表达对真皮微血管内皮细胞细胞生物学功能的影响1.1 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外血管管腔形成能力体外基质胶血管管腔形成实验结果显示,P311高表达后真皮微血管内皮细胞形成的管状结构中的节点数明显增多（p<0.01）,管状结构总长度明显变长（p<0.01）。1.2 P311高表达提高真皮微血管内皮细胞体外迁移能力体外细胞划痕迁移实验结果显示,P311高表达后,各观察时间点真皮微血管内皮细胞覆盖区域均明显增多（p<0.01）。1.3 P311高表达上调真皮微血管内皮细胞促血管生成基因的表达实时定量PCR结果显示,真皮微血管内皮细胞高表达P311后,CCL2表达上调3.66倍（p<0.05）,CXCL8表达上调4.58（p<0.05）,FGFR3表达上调2.36（p<0.05）,IL6表达上调2.55（p<0.05）,PTGS1表达上调29.58（p<0.05）,VEGF表达上调2.94（p<0.05）。2.P311通过VEGFR2/ERK1/2信号通路促进血管形成2.1 P311高表达促进VEGFR2和ERK1/2磷酸化P311高表达后,真皮微血管内皮细胞VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平分别提高到对照组水平的3.62倍和2.17倍。2.2 siRNA-VEGFR2抑制VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平,阻断P311对血管形成的促进作用使用siRNA-VEGFR2后,微血管内皮细胞VEGFR2的磷酸化水平和总蛋白表达明显降低（p<0.05）,Erk1/2的磷酸化水平明显降低（p<0.05）,P311对血管形成的促进作用明显受到抑制（p<0.05）。2.3 SCH772984抑制Erk1/2的磷酸化,阻断P311对血管形成的促进作用使用SCH772984后,微血管内皮细胞Erk1/2的磷酸化水平明显降低（p<0.05）,P311对血管形成的促进作用明显受到抑制（p<0.05）。3.P311对VEGF表达的调控实时定量PCR结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF mRNA水平显着升高（p<0.05）;Western Blot结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞内VEGF蛋白质水平显着升高（p<0.01）;ELISA结果显示,P311高表达后,微血管内皮细胞培养上清中VEGF含量显着升高（p<0.01）。4.P311调控VEGF表达的分子机制4.1 P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,促进VEGF的转录双荧光素酶报告实验结果显示,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合。亚硫酸氢盐测序结果显示P311对VEGF启动子CpG岛甲基化无影响。4.2 P311通过与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译实时定量PCR结果显示,P311高表达对VEGF mRNA的稳定性没有影响;双荧光素酶报告实验结果显示,P311与VEGF mRNA 3’-UTR和5’-UTR结合并提高其活性,进而诱导VEGF蛋白的翻译综上所述,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,从而提高启动子活性,进而促进VEGF的转录,同时P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2通路,促进血管新生。结论本研究首次证明P311是一种新的促进创面血管新生的关键分子,P311可能通过与VEGF启动子-2000到-1550区域结合,提高启动子活性,促进VEGF的转录;P311通过与VEGF mRNA 5’-UTR和3’-UTR结合并提高其活性,促进VEGF的翻译,从而促进VEGF的表达和分泌,进而激活VEGFR2/Erk1/2信号通路促进血管形成。

何维雅^[5]（2019）在《α6和β1整合蛋白的差异表达揭示皮肤表皮细胞的行为及在单细胞水平上的异质性》文中研究说明皮肤表皮是由毛囊间上皮（interfollicular epidermis,IFE）和毛囊（hair follicles,HFs）组成的复层上皮组织。整合蛋白是一种跨膜蛋白受体,在皮肤表皮中介导细胞与基质间的粘附作用,其表达在空间上反映了表皮的异质性。目前,对整合蛋白的差异表达量能否反映表皮细胞的行为和异质性仍未有充分的了解。首先,本研究验证了α6和β1整合蛋白的差异表达与表皮细胞分化、迁移以及干细胞激活的行为趋势的关系。当使用高浓度钙离子的培养条件来诱导表皮细胞分化时,α6和β1整合蛋白的表达随着细胞分化而下调了,证明其表达下调反映表皮细胞的分化。与正常表皮相比,α6整合蛋白的表达量在损伤修复的过程中,且特定地在损伤区域的迁移细胞中显着增加了,说明其表达上调反映表皮细胞的迁移。另外,RNA测序结果显示,α6整合蛋白在定向祖细胞和早期分化IFE细胞中表达上调,而β1整合蛋白则在早期分化IFE细胞中表达下调,说明α6和β1整合蛋白的差异表达能反映出表皮干细胞的激活和分化。然后,在表皮异质性的研究中,根据α6和β1整合蛋白的差异表达来分选的9组表皮细胞在RNA测序后,成功地被鉴别为9种主要的表皮细胞类型,并通过基因集富集分析验证了IFE细胞群间的谱系关系。为进一步探索表皮的异质性,本研究将α6和β1整合蛋白的差异表达与GFP荧光示踪的方法结合,从tetOKrt14-H2BGFP小鼠的再生表皮中分选了576个单细胞。通过RNA测序,鉴定出了13种表皮细胞类型,并区分出表皮的基底层和漏斗部中的静息态和中间态干细胞群,证明了α6和β1整合蛋白的差异表达能够反映出表皮的异质性。本研究揭示了整合蛋白的表达量与表皮细胞行为和异质性的关系,并鉴定出了多种表皮细胞类型及其分子特征。本研究设计了一种基于整合蛋白差异表达的细胞分选方法和一种适用于预分选测序的单细胞转录组文库构建方法。实现了高通量、高分辨的对表皮细胞进行分类,此分选方法亦能应用于对皮肤表皮中的特定细胞类群进行分离富集。

万大鹏^[6]（2019）在《木犀草苷对人表皮干细胞增殖的影响及作用机制研究》文中认为表皮干细胞（epidermal stem cells,EpSCs）在表皮再生、皮肤稳态维持和创面修复过程中发挥重要作用。表皮干细胞具有自我更新能力和增殖潜能,是制备组织工程皮肤理想的种子细胞。寻找能促进表皮细胞增殖的化合物将有利于为皮肤组织的体外制备提供更多的种子细胞。文献报道木犀草苷（Luteolin-7-glucoside,L7G）能通过抗炎、抗氧化、抑制透明质酸酶和胶原酶活性促进皮肤伤口愈合。目的探讨L7G是否能促进人表皮干细胞增殖并阐明其作用机制。方法1.利用中性蛋白酶和胰蛋白酶依次消化人皮肤组织制备表皮细胞悬液,通过Ⅳ型胶原快速贴壁法分离表皮干细胞。通过免疫荧光染色及流式细胞仪检测表皮干细胞标志分子（CK19、β1整合素、α6整合素、CD71）以鉴定表皮干细胞。2.分别通过MTT、BrdU掺入实验和Ki67免疫荧光染色检测L7G对表皮干细胞增殖的影响。用碘化丙啶标记DNA后经流式细胞仪检测L7G对表皮干细胞细胞周期分布的影响。通过体外划痕愈合模型观察L7G对表皮干细胞迁移的影响。3.通过RT-PCR和Western blot检测干细胞增殖相关基因的表达。4.通过HE染色、免疫组化和免疫荧光染色表皮干细胞标志分子分别观察L7G对体外培养皮肤组织表皮层厚度以及表皮干细胞数量的影响。结果1.分离培养的人皮肤表皮干细胞在光镜下呈鹅卵石样。免疫荧光检测显示这些细胞中CK19及β1整合素阳性的细胞占90%以上;流式细胞仪检测结果表明α6整合素高表达/CD71低表达的细胞占92.87%,说明分离培养的细胞为表皮干细胞并且纯度较高,并满足实验要求。2.通过MTT实验发现0.1-1 μM的L7G能够浓度依赖性地促进表皮干细胞增殖。BrdU掺入实验和Ki67免疫荧光染色结果证实L7G能促进表皮干细胞增殖。细胞周期分析发现L7G孵育表皮干细胞细胞能降低G1期细胞百分比、升高S期细胞百分比。1 μM的L7G能显着促进表皮干细胞迁移及划痕愈合。3.机制研究发现L7G能显着诱导β-catenin,c-Myc以及细胞周期蛋白D1、A2、E1的表达;L7G通过β-catenin和c-Myc介导促进表皮干细胞增殖。4.用L7G体外孵育人皮肤组织能显着增加表皮层的厚度,并增加表皮基底层的α6整合素阳性和β1整合素阳性细胞的数量。此外,p63以及细胞增殖抗原在表皮层细胞的表达都显着增强。这些结果说明L7G对离体培养的表皮干细胞及皮肤组织中的表皮干细胞都有促增殖作用。结论L7G通过上调β-catenin,c-Myc和细胞周期蛋白D1,A2和E1的表达促进体外培养的皮肤表皮干细胞增殖。L7G能促进培养的人皮肤组织表皮干细胞增殖,增加表皮层厚度。

周仁鹏^[7]（2019）在《Mettl14和Mettl3对表皮干细胞的影响及机制研究》文中指出目的:表皮干细胞自我更新和分化的平衡由多种基因调控。在基因表达调控中,RNA代谢发挥重要作用。RNA代谢,包括mRNA可变剪切、mRNA稳定性以及翻译效率,受Mettl14和Mettl3介导的m6A（6-甲基腺嘌呤）RNA修饰调节。作为甲基转移酶复合物关键成分,Mettl14和Mettl3是否以及如何调控表皮干细胞生物学行为尚未报道。因此本课题主要研究Mettl14和Mettl3对表皮干细胞自我更新和分化的影响及机制,以及研究Mettl3在表皮癌增殖、分化中的作用。方法:1.应用条件性基因敲除小鼠特异敲除表皮的Mettl14,应用免疫组化、裸鼠皮肤移植等方法检测小鼠表型。2.分离Mettl14突变组小鼠原代角质形成细胞,进行m6A水平检测、RNA-seq分析差异表达基因。3.应用条件性基因敲除小鼠特异敲除表皮的Mettl3,应用免疫组化等方法检测突变组小鼠表型。4.构建慢病毒敲低表皮鳞状细胞癌细胞中的Mettl3,应用免疫组化的方法检测癌细胞的表型,采用裸鼠荷瘤实验研究敲低Mettl3在体内对皮肤鳞状细胞癌的影响。结果:1.小鼠表皮特异性敲除Mettl14后,出生后第7天表皮显着增厚,表皮基底层细胞增殖增加,突变组小鼠在出生后7-9天死亡;裸鼠皮肤移植术后14天突变组表皮表型和出生后7天小鼠表型一致,术后17天表皮细胞增殖降低,术后34天突变组移植表皮丢失。2.分离的Mettl14突变组小鼠原代角质形成细胞中,m6A水平降低,RNA-seq和qPCR验证有S100a8和S100a9基因的差异表达。3.小鼠表皮特异性敲除Mettl3后,出生后第9天表皮显着增厚,表皮基底层细胞增殖增加,且影响Mettl14的表达。4.构建Mettl3慢病毒载体敲低鳞状细胞癌Mettl3,影响Mettl14表达,降低m6A水平,促进癌细胞分化,抑制癌细胞干性,同时影响自我更新和分化相关基因的表达。在裸鼠荷瘤实验中,敲低Mettl3抑制鳞状细胞癌的体内生长。结论:1.Mettl14和Mettl3参与m6A修饰,特异性敲除Mettl14能导致表皮干细胞的一过性过度增殖,最终导致表皮干细胞池的耗竭。2.敲低鳞状细胞癌的Mettl3能抑制癌细胞的生长3.我们研究初步阐明Mettl14和Mettl3对表皮干细胞以及皮肤鳞状细胞癌的自我更新和分化的影响和机制,为表皮稳态相关疾病（创伤、表皮癌）的研究和治疗提供新的理论基础。

詹日兴^[8]（2016）在《烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究》文中指出烧伤是以皮肤损伤为始发因素的创伤,损伤主要是皮肤和黏膜,严重者可伤及皮下及黏膜下组织,如骨及关节、肌肉等,甚至内脏器官等。及时封闭、修复创面是防治创面感染、减轻组织器官功能损伤、防治瘢痕增生、提高重度烧伤患者救治成功率及生活质量的基础。烧伤的根本问题就是创面修复,如何尽早封闭和修复创面是烧伤治疗中的根本。表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）是皮肤组织之中特异性干细胞,是皮肤创面愈合最重要的物质基础之一,也是皮肤及其皮肤附属器管生长发育、修复以及改建的源泉。应用表皮干细胞无限增殖能力及多向分化的潜能等,促使创面修复由功能修复到解剖修复成为了可能。因此表皮干细胞对表皮组织及其附属器官的重建具有重大价值。浅度以及深Ⅱ度烧伤创面的修复主要依赖于残存和健在的表皮干细胞脱粘附、增殖、分化以及迁移并最终修复创面,是创面愈合的主要过程,尤其是毛囊外鞘隆突部的毛囊干细胞起着重要的作用;同时表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学行为受到体内多种因素的影响。表皮干细胞离开其特定的干细胞巢穴迁移,才具有增殖、分化能力,因而表皮干细胞离巢迁移是启动烧伤创面愈合的关键步骤。但目前关于诱使表皮干细胞脱粘附、离巢迁移、增殖、分化的因素及其机制并不清楚。一氧化氮（Nitric Oxide,NO）是众多的小分子生物活性介质中的一种,参与了多种生理、病理等过程。NO在创面的炎症反应、肉芽生长及创面修复中均起着重要的作用,具有参与炎症反应、扩张血管、收缩创面、抗感染以及促进创面胶原合成、成纤维细胞增殖、增强创面抗张强度、血管生成等。烧伤后早期创面即有大量NO产生,在时间上与烧伤后表皮干细胞离巢迁移修复创面现象相重叠。NO对创面愈合有多种作用机制与途径,但NO促进创伤愈合的具体作用机制尚未完全清楚,还有待进一步的深入研究。烧伤后创面产生大量NO产生,初期主要由角质细胞产生,随后主要由活化的巨噬细胞产生。创面局部产生的NO在烧伤后第三天左右达到高峰,并且几乎伴随整个创面愈合的过程。文献报道,在气道上皮细胞的体外划痕实验中NO显着促进细胞的迁移;NO可通过GC-c GMP途径使细胞骨架重排,从而促进气道上皮细胞的迁移与创面修复;NO可通过影响Rho GTP酶调节细胞骨架及细胞的粘附与迁移。因此我们推测,一氧化氮的促进创面修复作用中是通过影响角质细胞及表皮干细胞的脱粘附、增殖、分化、迁移等生物学作用实现的。no在烧伤后表皮干细胞脱粘附、离巢、迁移、分化等生物学变化中的作用及其机制未见文献报道。我们前期研究中,以硝普钠（snp）为no供体,以角质细胞株hacat细胞为研究对象,发现适宜浓度的no具有促进hacat细胞迁移作用,其作用的可能机制是:1、no通过调节细胞内cgmp的浓度升高,促进rhogtpase活化作用增强,以及蛋白表达水平增高,进而影响细胞骨架结构f-actin蛋白聚合,最终促进细胞迁移;2、no通过下调β1整合素的表达,减少细胞对细胞外基质的粘附力,进而减少细胞迁移阻力。同时我们以原代培养人表皮干细胞为研究对象,选择以snap（s-nitroso-n-acetyl-dl-penicillamine）为no供体,深入研究no对体外原代培养人esc脱粘附离巢、增殖分化及迁移功能的影响;并在体实验中通过brdu滞留标记表皮干细胞,浅二度烫伤模型研究外源性no对成年小鼠表皮干细胞离巢、迁移的作用。本课题在前期实验的基础上,我们进而探讨了烧伤患者创面中no浓度及创面中inos的表达,深入研究no促进表皮干细胞迁移的物质基础和可能机制,明确no促进烧伤等创面愈合的机理,为进一步完善一氧化氮在促进创面愈合中的基础理论和可能的临床应用打下基础。本课题重点探讨了no通过cgmppkgrhogtpase途径调节表皮干细胞骨架的重排,进而促进escs迁移;以及在体no通过增强表皮干细胞迁移而促进创面再上皮化,最终修复创面。我们将本研究获得的主要结果和结论归纳如下:一、烧伤后创面no的产生:为进一步了解烧伤患者创面中no浓度及烧伤不同时间点no浓度的变化,共收集临床20例烧伤患者标本,其中水泡液46份,血清27份;深二度烧伤创面组织14份,同体正常皮肤组织14份。均符合入选标准:年龄18-55,性别不限,烧伤面积≤40%tbsa。收集水泡液、血清及组织块-80度保存。该项研究内容均告知患者,并征得患者和患者家属的同意,研究对象签署知情同意书表示愿意参加该项试验。1、水泡液及血清中no浓度检测:采用griessreagent法检测发现,小面积（烧伤面积≤40%tbsa）患者血浆中no的浓度相对恒定在6.44±0.71μm;而烧伤患者水泡液中no随伤后不同时间而有较大变化,伤后10小时内的水泡液no浓度为7.73±0.62μm,伤后10至20小时水泡液no浓度为9.45±0.65μm,伤后20至30小时水泡液no浓度为7.23±1.53μm,伤后30小时以上时水泡液no浓度为6.84±1.08μm,发现在伤后10至20小时时水泡液no浓度最高。2、烧伤创面中no浓度的测定:组织块碾磨后用同体积去离子水混合离心取上清。检测no浓度方法:采用与griessreagent同体积混合,酶标仪测量od450值,通过标准亚硝酸盐浓度标准曲线得出no浓度。结果发现:正常组织中no浓度为0.32±0.13μm,浅二度创面组织中no浓度为4.70±0.70μm。表明烧伤后创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出约15倍。3、深二度烧伤创面组织中inos的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经石蜡包埋、切片后行免疫荧光组织化学发现,正常组织中inos表达不明显,而创面组织中在表皮的基底层及真皮组织中inos明显,其中表皮基底层inos的表达与表皮干细胞表面标志物角质蛋白ck19存在共定位。表明,烧伤后表皮干细胞中高表达inos。4、深二度烧伤创面组织及正常组织中inos蛋白的表达:烧伤患者正常组织及浅二度组织经组织蛋白性蛋白印迹检测发现,创面组织中no浓度较正常组织中no浓度高出14.8倍,表明烧伤后表皮组织高表达inos。二、原代人表皮干细胞的分离、培养及鉴定:主要是进行表皮干细胞的分离培养及细胞免疫化学、克隆实验和流式等鉴定手段,我们发现:Ⅳ型胶原10min快速黏附法可以快捷、方便的实现表皮干细胞分离富集,能较好的维持表皮干细胞的干性。1、原代人表皮干细胞的分离培养:采用Ⅳ型胶原快速粘附法结合无血清角质细胞培养基分离培养的细胞符合表皮干细胞的形态及"铺路石"样克隆生长;采用tripleselect细胞消化液消化细胞能快速消化细胞且能较好保持细胞的活性。2、细胞免疫荧光染色检测细胞中integrinβ1和ck19的表达:所培养的第二代细胞中表皮干细胞标志物keratin19和integrinβ1均呈强阳性表达。3、流式细胞仪检测分离培养细胞α6-integrin及cd71的表达:采用流式细胞分析技术发现第二代培养细胞中α6bricd71dim原代培养表皮细胞率为94.3±4.36%。4、细胞克隆形成能力检测:所培养第二代细胞具有较强的克隆形成能力,克隆形成率为33.1±4.8%。三、no对表皮干细胞迁移的影响及机制研究:（一）no对培养表皮干细胞迁移的影响:我们首先进行了no供体snap不同作用时间产生no浓度和snap对表皮干细胞的毒性检测;通过划痕实验和活性工作站完成no对表皮干细胞迁移和运动速度的检测,以及通过细胞骨架实验和pulldown技术检测no促进表皮干细胞迁移可能的物质基础。1、no供体snap产生no浓度的检测:我们通过传统no检测方法griess法测定snap加入细胞培养基后产生no情况,实验发现100μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.173、0.655、1.713、3.553、5.124、6.2818455、6.557、6.878、7.324μm;500μmsnap时在0、2、6、12、18、24、30、36、48小时时生成no的浓度分别为0.209、1.206、2.938、6.349、8.576、11.284、12.448、13.601、14.532μm。表明0-500μmsnap在细胞培养基中生成no浓度与snap浓度成正相关、与持续时间呈正相关。2、snap对表皮干细胞安全有效作用浓度测定:采用cck-8检测相对活细胞数量,结果snap浓度在0-500μm内通过cck-8测量的escs细胞数无显着差异（p>0.05）,而snap浓度在1000-4000μm时活细胞数量较对照组显着减少,snap1000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为52.12±5.96%;snap2000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为6.79±1.16%;snap4000μm时活细胞数较对照组比较细胞存活率为5.62±1.63%。表明no供体snap的有效安全作用浓度为0-500μm。3、划痕实验检测no对escs迁移功能的影响:结果发现,随着snap浓度的升高（0100μmol/l）,划痕后不同时间点细胞迁移率较对照组均增加;其中划痕后12、24h,10、100μmol/lsnap组的迁移率较对照组有显着差异（p值均小于0.01）;而300、500μmol/lsnap组的迁移率较对照组减少,其中在划痕后18、24小时时有显着差异（p值均小于0.05）。其中划痕12小时时与对照组迁移率（48.8±2.7%）相比,100μmol/lsnap组迁移率达到了82.1±15.8%（p<0.01）,而500μmol/lsnap抑制的细胞迁移率为8.2±7.2%。实验表明低浓度的no供体snap（0-100μmol/l）时对细胞具有促进迁移的作用。4、活细胞工作站检测no对escs运动速度的影响:为进一步检测no对表皮干细胞运动功能的影响,我们通过活性工作站从细胞运动速度方面测定no对表皮干细胞运动速度的影响。研究发现,snap浓度在0100μmol/l时细胞运动速度逐步提高,100μmol/lsnap组的细胞运动速度为1.07±0.18μm/min,与其他组比较细胞运动速度最快。表明,低浓度的no供体snap（0-100μmol/l）时对细胞具有促进细胞运动的作用,而当snap高浓度时对细胞运动的抑制作用显着。5、激光共聚焦检测no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合作用:细胞骨架是细胞迁移与运动的基础,其中细胞骨架蛋白中最重要的是f-actin蛋白,f-actin蛋白的重组与细胞迁移具有直接关系。我们通过鬼笔环肽染色、激光共聚焦研究发现,结果发现:100μmno供体snap组huescs应力纤维f-actin纤毛明显增多,胞内应力性纤维束增粗,而阴性对照组纤毛稀少,胞内应力性纤维束纤细;经细胞骨架f-actin荧光染色强弱分析得出实验组较对照组应力性纤维增加了31.7%,具有显着性差异p=0.001。实验表明,no促进huescs应力纤维f-actin的聚合。6、pull-down技术检测no活化rhogtpase的作用:rhogtp酶是真核细胞中重要的信号转导分子,通过肌动蛋白和肌球蛋白对细胞骨架进行调控进而调控细胞运动,对肌动蛋白细胞骨架的调节起着主要作用。为此,我们通过pulldown技术检测发现,rhoa活化作用中snap组是对照组的4.14±0.33倍;rac1活化作用中snap组是对照组的1.78±0.07倍;cdc42活化作用中snap组是对照组的1.22±0.17倍。实验表明,100μmno供体snap组对rhoa、rac1具有显着的活化作用,而对cdc42的活化作用不明显。（二）no对培养表皮干细胞迁移的机制研究:cgmp-pkg是no最重要的下游信号转导途径,为此我们通过细胞划痕实验、细胞运动速度实验、细胞骨架实验、pull-down实验,分别分组给予cgmp抑制剂odq、pkg抑制剂rp-8pcpt-cgmps、rhoa抑制剂rhosin、cdc42抑制剂zcl278、rac1抑制剂z62954982及snap处理,此外还采用rhoa、rac1、cdc42的特异性小干扰rna验证“no通过cgmp-pkg调节活化rhogtpase,进而影响细胞骨架蛋白f-actin的聚合,最终促进escs迁移”的假说。1、划痕实验检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no促进escs迁移中的作用:结果发现,对照组的细胞迁移率为74.25±5.59%;snap组的细胞迁移率为94.06±5.59%;odq+snap组的细胞迁移率为75.17±7.02%;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞迁移率为70.91±10.09%;rhosin+snap组的细胞迁移率为71.39±9.74%;z62954982+snap组的细胞迁移率为76.28±7.26%;zcl278+snap组的细胞迁移率为86.58±4.89%;snap和cgmp、pkg的激动剂显着促进escs细胞的迁移,迁移率与对照组相比分别增加了9.78%和11.12%。结果表明,snap对escs细胞的迁移作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用最显着,而cdc42抑制剂的阻断作用不明显。2、活细胞工作站实验检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no促进escs运动速度的作用:结果发现,对照组的细胞运动速度为0.72±0.08μm/min;snap组的细胞运动速度为0.93±0.14μm/min;odq+snap组的细胞运动速度为0.78±0.06μm/min;rp-8pcpt-cgmps+snap组的细胞运动速度为0.74±0.07μm/min;rhosin+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min;z62954982+snap组的细胞运动速度为0.72±0.06μm/min;zcl278+snap组的细胞运动速度为0.73±0.07μm/min。表明:no供体snap促进escs细胞的运动,其作用可被cgmp、pkg、rhoa、rac1抑制剂阻断,其中rhoa抑制剂的抑制作用显着,而cdc42抑制剂阻断snap对escs运动速度的影响弱。3、激光共聚焦检测cgmppkgrhogtpase信号通路在no对escs细胞骨架蛋白f-actin聚合中的作用:我们采用imagej分析了皮层肌动蛋白（corticalactin）和丝状伪足（filopodia）观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合情况。经统计分析发现皮层肌动蛋白对照组为103.33±3.41%,snap组为190.26±2.92%,odq+snap组为87.41±3.20%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为104.33±1.75%,rhosin+snap组为80.12±2.21%;z62954982+snap组为120.83±3.61%,zcl278+snap组为141.68±4.75%。细胞的丝状伪足百分率对照组为25.00±3.86%,snap组为41.82±7.60%,odq+snap组为19.66±3.87%,rp-8pcpt-cgmps+snap组为25.27±7.57%,rhosin+snap组为24.00±6.29%,z62954982+snap组为31.87±3.49%,zcl278+snap组为31.14±11.69%。结果表明:得出no供体snap对esc细胞骨架蛋白f-actin具有聚合作用;cgmppkg以及rhogtpase的rhoa,rac1抑制剂均可阻断snap对escf-actin的聚合作用,而cdc42抑制剂的阻断作用不显着。4、pull-down技术检测cgmppkg在no活化rhogtpase中的作用:采用pull-down技术检测no供体snap处理表皮干细胞24小时对rhoa,cdc42和racl的活化。结果发现,对rhoa活化作用以对照组设为1,snap组为4.46±0.14;odq+snap组为0.89±0.11;rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.52±0.12;对racl活化作用snap组为2.08±0.08,odq+snap组为0.72±0.12,rp-8pcpt-cgmps+snap组为1.22±0.17;对cdc42活化作用snap组为1.16±0.24,odq+snap组为1.21±0.13;rp-8pcpt-cgmps+snap组为0.89±0.13。表明no通过cgmp、pkg调节rhoa,rac1的活化作用。5、pull-down技术检测不同时间snap对活化rhoa的作用:采用pulldown技术检测snap在处理后6、12、18、24小时对rhoa,cdc42和racl的活化作用。结果发现,灰度值比较中对照组活化蛋白比总蛋白设为1（0小时）,6、12、18、24小时snap组对rhoa活化作用分别为3.38±0.56、4.09±0.46、3.60±0.39、4.17±0.43倍;而snap组对racl活化作用分别为2.55±0.48、2.69±0.75、2.56±0.47、2.69±0.44。表明在给予snap处理后escs中活化的rhogtpase持续高表达。6、sirna转染体外培养人表皮干细胞及sirna干扰效率检测:50nm的sirna采用脂质体2000转染表皮干细胞,以与rhogtpase无同源性的葡萄糖氧化酶glo的sirna作为阴性对照,为避免脱靶效应每一个mrna均采用两个不同的sirna。采用wb检测sirna的干扰效率均大于75%。同时我们采用rhoa、rac1和cdc42的特异性sirna干扰实验进一步验证了no通过rhogtpase的rhoa和rac1在no促进表皮干细胞迁移中的作用。7、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs迁移中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行划痕实验,结果发现,snap组的细胞迁移率为92.89±3.99%;siglo+snap组的细胞迁移率为90.68±4.22%;rhoasirna+snap组的细胞迁移率为53.25±5.78%、51.42±5.23%;rac1sirna+snap组的细胞迁移率为55.23±9.92%、61.06±8.43%;cdc42sirna+snap组的细胞迁移率为81.62±10.75%、80.29±13.04%。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断snap对esc的迁移作用。表明,no通过rhogtpase的rhoa和rac1影响表皮干细胞的迁移作用。8、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进escs运动中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后进行活性工作检测细胞的运动速度实验,结果发现,siglo+snap组的细胞运动速度为0.96±0.07μm/min;rhoasirna+snap组的细胞运动速度为0.74±0.06μm/min、0.76±0.07μm/min;rac1sirna+snap组的细胞运动速度为0.83±0.05μm/min、0.83±0.03μm/min;cdc42sirna+snap组的细胞运动速度为0.90±0.10μm/min、0.93±0.09μm/min。表明rhoasirna、rac1sirna可阻断no对esc运动速度的促进作用。9、sirna干扰后检测rhogtpase在no促进骨架蛋白f-actin聚合中的作用:采用rhogtpase的特异性sirna干扰目的基因的表达后给予no供体snap处理24小时。通过imagej分析了皮层肌动蛋白（corticalactin）和丝状伪足（filopodia）的表达观察细胞骨架蛋白f-actin的聚合与重排作用。研究表明,rhogtpase的rhoa、rac1的mrna干扰小rna可阻断snap对escs的f-actin的聚合作用。四、no对皮肤创面愈合及在体表皮干细胞迁移的影响:为进一步探讨no在创面愈合、上皮化以及进一步验证no对esc的在体迁移情况,我们在brdu在体标记表皮干细胞基础上采用全层皮肤缺损模型研究no在创面愈合、上皮化以及对esc迁移。应用brdu在体标记表皮干细胞后孔器器打孔,伤口大小为直径4.5mm,分组分别给予腹腔注射生理盐水组,甘氨酸（gly）,一氧化氮合成底物（l-精氨酸）及一氧化氮合酶抑制剂（l-nmma）。分别于伤后0、1、3、5、7、9天观察创面愈合情况,于第9天取材做he染色观察创面上皮化情况,于第12天观察esc迁移情况。1、no在创面愈合中的作用:我们采用全层皮肤缺损模型模型检测no对创面的愈合作用。结果发现,致创后第1、3、5、7、9天创面愈合率分析生理盐水组分别为20.08±3.03%,47.97±4.99%,70.00±3.49%,80.54±2.17%,70.95±3.56%;L-精氨酸组致分别为29.30±3.55%,47.97±4.99%,89.61±2.69%,94.74±2.43%,98.75±0.81%;L-NMMA组为18.91±3.06%,44.47±4.99%,64.58±4.52%,72.45±2.52%,76.72±3.84%。结果表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面愈合;NO合成酶抑制剂L-NMMA创面愈合速度较对照组明显减慢。2、NO在创面上皮化中的作用:同上我们在致创后第9天创面组织取材,切片行H&E-染色并经统计分析结果。发现,生理盐水组未上皮化创面大小为1.44±0.32mm,未上皮化创面大小甘氨酸组为1.37±0.52mm、L-精氨酸组0.38±0.41mm、L-NMMA为2.54±0.61mm。实验表明,创面缺损模型中NO合成底物L-精氨酸促进创面上皮化,具有显着性差异;NO合成酶抑制剂L-NMMA与对照组比较明显抑制创面上皮化。3、BrdU标记ESC后全层皮肤缺损模型中NO对ESC迁移作用研究:Brd U在体标记表皮干细胞基础上,在全层皮肤缺损模型中给与NO处理,研究NO对ESC迁移情况。研究发现,在同一高倍视野再生表皮中BrdU阳性细胞对照组为12.27±2.67个,甘氨酸组为14.88±5.14个,L-精氨酸组为24.04±8.34个,L-NMMA组为6.67±2.42个。表明,L-精氨酸组创面上皮化中的BrdU阳性细胞较其他组显着增多,同时NO合成酶抑制剂L-NMMA组中BrdU阳性细胞较其他组少。总结:1、烧伤后表皮干细胞可能通过高表达i NOS,而促进烧伤创面NO的大量产生;2、Ⅳ型胶原快速黏附结合K-SFM角质细胞专用无血清培养基培养是一种简单、快捷、有效分离、纯化人表皮干细胞的方法;3、NO供体SNAP对体外培养人表皮干细胞的最佳作用浓度为100μM。4、NO通过cGMP/PKG调节Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影响细胞骨架蛋白F-actin的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。5、在体实验中,NO可能通过促进表皮干细胞迁移,而促进创面再上皮化,最终促进皮肤创面愈合。综上所述,烧伤后创面表皮干细胞可能通过高表达i NOS,产生大量NO,产生的NO通过c GMP/PKG调节Rho GTPase中Rho A和Rac1的活化,继而增加细胞骨架F-actin蛋白的聚合,进而促使表皮干细胞迁移,最终促进创面愈合。

姚志慧^[9]（2016）在《P311在皮肤创面再上皮化和肾纤维化中的作用及机制研究》文中认为第一部分:P311在皮肤创面再上皮化中的作用及机制研究背景:创面修复是一个动态持续的过程,需要机体多种类型细胞、细胞外基质及一系列细胞因子和生长因子的共同参与。难愈创面目前已成为一个重要的临床难题,其原因除了传统的烧伤、创伤及外科手术外,一些慢性疾病如静脉曲张、糖尿病等也可引起创面难以愈合。难愈创面常常可导致终生残疾,给病人、家庭和社会造成巨大的经济社会负担。据统计,目前患有慢性难愈创面的病人数量正在全球范围内逐渐增加。鉴于此,深入研究创面愈合的相关机制,发展新的创面治疗方法,提高创面愈合质量已成为该领域研究的热点、重点和难点问题之一。哺乳动物皮肤创面愈合一般分为四个阶段:凝血期、炎症期、新生组织形成和组织重塑。新生组织形成起始于新生表皮迁移覆盖受损真皮。表皮干细胞主要分布于毛囊隆突部位,表皮细胞基底层和皮脂腺组织中,在保持皮肤表皮更新、促进创面愈合过程中起着至关重要的作用。当创面形成后,表皮干细胞活化增殖产生更多短暂扩充细胞,进一步增殖、分化迁移至创面发挥修复作用。表皮干细胞目前已成为临床上治疗慢性难愈创面的候选细胞。P311基因定位于人5号染色体和小鼠18号染色体,首次在小鼠胚胎大脑发现,并且在成年小鼠小脑、海马和嗅球中保持较高水平表达。P311蛋白是一个分子量为8-k Da的胞内蛋白,包含68个氨基酸,目前不属于任何已知的蛋白家族。P311蛋白N末端包含PEST结构域（富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸）,在人、小鼠和鸡中高度保守。PEST结构域在目的蛋白通过泛素/蛋白酶体通路降解及蛋白与蛋白之间相互作用和活化过程中发挥重要作用。目前研究发现P311在神经和肺泡再生、血压稳态维持、神经胶质细胞瘤侵袭和肌成纤维细胞活化等方面发挥重要作用。我们前期研究发现,P311在早期增生性瘢痕肌成纤维细胞和创面肉芽组织活化的成纤维细胞中表达增高,可以通过促进TGF-β1表达在增生性瘢痕的形成过程中发挥一定作用。但目前P311在皮肤创面再上皮化过程是否发挥一定作用尚不清楚。在此基础上,我们对P311在皮肤创面再上皮化过程中的作用进行了研究,主要涉及以下三个方面:1)P311在皮肤创面新生表皮和正常皮肤表皮中的表达和分布;2)P311在表皮干细胞迁移中的作用;3)P311促进表皮干细胞迁移的分子机制。结果:1、P311在人和小鼠皮肤创面新生表皮中表达增高。我们收集了5例人皮肤创面组织标本和同体正常皮肤对照,同时构建了小鼠全层皮肤缺损模型,检测样本中P311基因表达。免疫组织化学技术检测发现P311主要表达于人和小鼠皮肤创面新生表皮细胞胞浆中,而正常皮肤表皮细胞中无P311表达。2、P311可以促进表皮干细胞迁移。利用Ⅳ型胶原快速黏附法分离了健康青年男性包皮中表皮干细胞,应用细胞免疫荧光和流式细胞技术检测了分离细胞中表皮干细胞分子标记物表达。细胞免疫荧光发现分离细胞中角蛋白K19和β1整合素高表达,并且二者于培养细胞中共定位表达。流式细胞技术检测发现培养细胞高表达α6整合素,而阴性标志物CD71表达阴性。我们进一步利用细胞体外创伤模型检测了P311腺病毒载体转染表皮干细胞后对细胞迁移功能的影响。结果发现P311增强表达后可以促进表皮干细胞迁移。我们分离了P311-/-和P311+/+新生小鼠皮肤表皮干细胞并应用流式细胞技术进行分子鉴定,结果发现培养细胞高表达α6整合素,而阴性标志物CD71表达阴性。进一步利用细胞体外创伤模型检测了P311敲除后对表皮干细胞迁移功能的影响,结果发现P311敲除后可以表皮干细胞迁移明显下降。我们构建了小鼠全层皮肤缺损模型检测P311敲除后对皮肤创面再上皮化的影响。结果发现小鼠全层皮肤缺损模型可以显着抑制小鼠皮肤创面收缩,P311+/+小鼠皮肤创面再上皮化速度明显快于P311-/-小鼠,P311敲除后小鼠皮肤创面再上皮化能力减弱。3、Rho GTPases在P311促进表皮干细胞迁移中的作用研究。为了探索P311促进表皮干细胞迁移的作用机制,我们应用Pulldown技术检测了Rho GTPases Rho A、Rac1和Cdc42活性。结果发现:P311增强表达后Rho A、Rac1和Cdc42活性明显增高,同时P311敲除后Rho A、Rac1和Cdc42活性下降。我们应用细胞体外创伤模型检测了Rho A、Rac1和Cdc42特异性抑制剂对P311促进表皮干细胞的影响。结果发现Rho A和Rac1抑制剂可以显着抑制P311对表皮干细胞迁移能力的增强作用,而Cdc42抑制剂无明显影响。综上所述,我们的研究首次发现P311可能通过增强Rho A和Rac1活性促进表皮干细胞迁移和创面再上皮化。本研究拓展了P311在创面愈合中的认识,可能为今后创面愈合的研究和治疗提供新的线索。第二部分:P311在肾纤维化中的作用及机制研究背景:肾纤维化是肾脏组织在多种损伤因素的刺激下自我修复过程失调的结果,临床上,有很大部分比例的肾纤维化病人最终将发展为肾功能衰竭,需要终生进行血液透析或肾脏移植治疗维持生命。大量流行病学研究表明,肾功能衰竭病人的患病率在世界范围内正逐渐增加。肾纤维化疾病现在已发展成为全球范围内的公共健康问题,给患者个人、家庭及社会造成了巨大的社会经济负担。目前,临床上针对肾纤维化疾病尚无十分有效的治疗方法。鉴于此,深入研究肾纤维化形成的病理机制,寻找肾纤维化形成的相关特异性基因是目前该领域研究的热点、重点和难点问题之一。肾脏纤维化是多种慢性肾脏疾病中不可逆的、进行性动态发展的病理过程,以肾脏小球及小管间质中大量的细胞外基质的合成和积聚为主要特征,该过程需要肾脏多种类型细胞的参与。基质产生细胞的活化被认为是肾纤维化病理过程中的关键,而基质产生细胞的来源主要包括成纤维细胞,肾小管上皮细胞、血管平滑肌细胞和巨噬细胞。肾小管上皮细胞是肾纤维化晚期阶段不可逆发展过程中最主要的效应细胞,在多种促纤维化因子（尤其是TGF-β1）的作用下,肾小管上皮细胞经历上皮细胞间质转型（epithelial-mesenchymal transition,EMT）过程,细胞表型发生改变,转分化成为肌成纤维细胞。TGF-β1是肾小管上皮细胞EMT过程中关键的调控分子,可以介导多种慢性肾脏疾病的病理发展过程,可以诱导肾小管上皮细胞表达波形蛋白（vimentin,一种成纤维细胞标志）和α肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA,一种肌成纤维细胞细胞标志）。P311最初在小鼠胚胎大脑中发现,在成年小鼠小脑、海马和嗅球中保持较高水平表达。P311基因定位于人5号染色体、小鼠18号染色体,编码分子量约8-k Da胞内蛋白。P311蛋白包含68个氨基酸,尚不属于任何已知蛋白质家族。目前研究发现P311主要在神经和肺泡发育、神经胶质瘤细胞侵袭及迁移、血压稳态维持、肌成纤维细胞分化和运动中发挥重要作用。本课题组研究发现,P311基因在早期增生性瘢痕中高表达,可以通过调节TGF-β1和α-SMA表达促进成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,在增生性瘢痕形成中发挥一定的促进作用。在此基础上,我们对P311在肾纤维化中的作用进行了研究,主要涉及以下三个方面:1)P311在肾纤维化组织和正常肾脏组织中的表达和分布;2)P311敲除后对肾纤维化的影响;3)P311促进肾脏纤维化的分子机制。结果：1、P311在人和小鼠肾纤维化组织表达增高。我们收集了22例人肾纤维化组织标本和2例人正常肾脏组织标本,同时构建了小鼠单侧输尿管结扎模型成功地诱导了小鼠肾脏组织纤维化,检测样本中P311基因表达。HE染色显示肾纤维化组织可见典型的肾小管扩张、萎缩塌陷和大量炎症细胞浸润,Masson染色可见肾脏间质大量胶原纤维沉积和积聚。免疫组织化学技术检测发现P311主要表达于人和小鼠肾纤维化组织部分肾小管上皮细胞胞浆中,而正常肾脏组织中无P311表达。2、P311可能通过诱导肾小管上皮细胞EMT促进肾脏组织纤维化。我们应用masson染色、Real-Time PCR和western bloting技术检测了P311+/+和P311-/-小鼠肾纤维化组织中胶原含量和波形蛋白的表达。Masson染色结果显示P311-/-小鼠肾纤维化组织中胶原含量明显低于P311+/+小鼠。Real-Time PCR结果显示P311-/-小鼠肾纤维化组织中Ⅰ胶原m RNA水平明显低于P311+/+小鼠。Western Bloting技术检测结果显示P311敲除后,小鼠肾纤维化组织中波形蛋白含量明显下降。α-SMA是组织纤维化过程中肌成纤维细胞活化的典型标志物,因此我们利用免疫组织化学、Real-Time PCR和western bloting检测了P311+/+和P311-/-小鼠肾纤维化组织中α-SMA表达。免疫组织化学结果显示α-SMA蛋白主要表达于肾纤维化组织部分肾小管上皮细胞胞浆中,并且于P311阳性的细胞共定位表达。Real-Time PCR和Western Bloting结果显示α-SMA m RNA和蛋白在P311-/-小鼠肾纤维化组织中表达明显低于P311+/+小鼠。3、P311敲除后抑制了肾纤维化组织中TGF-β/Smad信号通路。TGF-β1是肾纤维化过程中肾小管上皮细胞EMT最关键的细胞因子,可以被损伤肾小管上皮细胞和浸润的巨噬细胞大量分泌,因此我们利用免疫组织化学、Real-Time PCR和western bloting检测了P311+/+和P311-/-小鼠肾纤维化组织中TGF-β1表达和巨噬细胞数量。免疫组织化学结果显示TGF-β1蛋白主要表达于肾纤维化组织部分肾小管上皮细胞胞浆中,并且于P311和α-SMA阳性的细胞共定位表达。Real-Time PCR结果显示TGF-β1 m RNA表达水平在P311+/+和P311-/-小鼠肾纤维化组织中无显着性差异,western bloting结果显示TGF-β1蛋白在P311-/-小鼠肾纤维化组织中表达明显低于P311+/+小鼠。TGF-β/Smad信号在肾纤维化病理发展过程中其中是否重要的作用,因此我们进一步利用Real-Time PCR和western bloting技术检测TGF-β1相关受体和Smad蛋白的表达。Real-Time PCR结果显示与P311+/+小鼠相比,TGF-β1Ⅰ型受体和TGF-β1Ⅱ型结果:受体m RNA表达水平在P311-/-小鼠肾纤维化组织明显下降。并且p-Smad2,Smad2,p-Smad3,Smad3,Smad4和Smad7蛋白P311-/-小鼠肾纤维化组织中表达明显低于P311+/+小鼠。综上所述,我们的研究发现P311可能通过增强TGF-β/Smad信号通路促进肾小管上皮细胞EMT和肾脏纤维化。本研究拓展了P311在纤维化疾病中的认识,可能为今后肾纤维病理过程的研究和治疗提供新的线索。

王瑶^[10]（2013）在《毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究》文中研究指明干细胞（stem cells）维持着生命体组织器官的发生发展以及损伤的修复与再生,随着近年来再生医学的迅猛发展,干细胞治疗在临床中的应用日益广泛,疗效显着,已成为很多难治性疾病的终极治疗手段,干细胞的研究已经成为全国乃至全世界的研究热点。在下文中我们将以毛囊干细胞这一成体干细胞为研究主体,对其生物学特性及其在再生医学中的应用进行研究实验,以期证明毛囊干细胞为再生医学干细胞治疗的理想干细胞源。实验目的：1.体外分离培养并扩增毛囊干细胞（hair follicle stem cells,HFSCs）,建立一种快速高效的细胞培养体系,为后续试验奠定基础；2.通过体外诱导实验,将HFSCs定向诱导为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞,验证HFSCs的多分化潜能；3.证实HFSCs经过特殊共培养体系诱导后,可以分化为汗腺样细胞（sweat gland cells,SGCs）,并可参与汗腺（sweat gland,SG）的修复与再生；4.以HFSCs为种子细胞构建结构和功能更趋于完整的组织工程全层皮肤。实验方法：1.分别用“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种方法体外分离HFSCs,并将毛囊组织或细胞植入铺有IV型胶原,以丝裂霉素C处理过的成纤维细胞为饲养层的transwell双层细胞培养板中,观察对比两组中细胞的形态、生长特性、及体外扩增能力的异同,并通过CD200、CD29、CK15等HFSCs特异性标记物的免疫细胞化学染色、免疫细胞荧光染色及流式细胞技术,分析、鉴定分离培养的HFSCs;2.分别建立两种不同的体外细胞诱导体系,将HFSCs分别诱导分化为皮脂腺细胞、表皮细胞,并通过皮脂腺细胞及表皮细胞特异性标记物的免疫细胞化学、免疫细胞荧光染色及脂质的油红O染色,对诱导后细胞进行表型分析与鉴定；3.体外分离培养人手掌或脚掌来源的SGCs及真皮间充质干细胞（dermal mesenchymal stem cells,d-MSCs）,利用transwell细胞培养板建立了一种特殊的HFSCs共培养体系,主要由热休克的SGCs及一种仿真皮结构的间质组织构成,我们又称之为间质饲养层（mesenchymal feeder layer, M-FL）主要包括d-MSCs、 Matrigel基质胶以及一定比例的优质胎牛血清（FBS）,同时设立两个对照组,对照组1中不包含热休克SGCs,对照组2中不包含M-FL；细胞经过诱导后,应用免疫细胞化学,免疫细胞荧光染色及流式细胞技术对诱导后细胞进行SGCs表型鉴定,对比实验组、对照组1、对照组2中细胞的表型变化情况,同时,通过台盼蓝拒染实验观察各组细胞的生长活性,Edu（5’-ethynyl-2’-deoxyuridine）标记技术对比分析各组中细胞的增殖能力；4.体外建立裸鼠脚掌烫伤模型,将HFSCs诱导来源的汗腺样细胞（induced-sweat gland cells, i-SGCs）移植到裸鼠脚掌的烫伤部观察,并以等量Nacl注射作为对照组,4周后,愈合创面全层皮肤取材,汗腺特异性标记物癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）、细胞角蛋白14（cytokeratin14, CK14）的免疫组化及免疫荧光染色分析判断,观察接受细胞移植的创面皮肤中是否有新生的汗腺结构存在；5.蛋白印迹法（western bolt）、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）及实时荧光定量PCR （real-time fluorescent quantitative PCR）检测分析HFSCs诱导前、后的外胚层发育不良（ectodermal dysplasia,EDA）基因及其受体（ectodermal dysplasia receptor,EDAR）的基因及蛋白表达的变化,以进一步探索HFSCs分化为SGCs的分子机制；6.分别以HFSCs （A组）,表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）（B组）为种子细胞体外建立组织工程学全层皮肤,通过伊红-苏木素（hematoxylin-eosin staining, HE）染色分析两组标本形态结构的异同,观察A组标本中是否有毛囊样结构形成；两组标本分别进行integrin β1（CD29）、细胞角蛋白19（cytokeratin19, CK19）免疫组织化学染色,观察阳性细胞分布多少及分布区域。实验结果：1.“酶消化-毛囊剥离-直接种植法”及“酶消化-毛囊剥离-酶消化”两种细胞分离方法对比结果显示：应用前一种方法培养的第一代细胞生长至80-90%融合的时间为13～14天,而后一种方法为8～9天,但是传代后,从第二代细胞开始,两组细胞的生长速度及增殖能力无明显差异,无统计学意义（p>0.05）2.经过特异性微环境的诱导,HFSCs分别被诱导分化为上皮膜抗原（EMA）及油红染色阳性的皮脂腺细胞,以及细胞角蛋白10（cytokeratin10, CK10）阳性的角质形成细胞；3.在HFSCs汗腺化诱导实验中,实验组中,有一部分HFSCs最终被定向诱导分化成为具有汗腺表型的细胞,对比之下,对照组1中没有细胞分化为SGCs.对照组2中只有极少部分细胞发生了向SGCs的转化；我们利用细胞的特异性标记物,通过免疫荧光染色及流式细胞技术鉴定诱导后细胞,发现在这些细胞中HFSCs特异性标记物CD200、CD29及CK15的表达变弱了,而汗腺细胞特异性标记物CEA和CK14的表达却增强了,这说明HFSCs在设计的共培养微环境中可以实现向SGCs的分化；4. western blot结果显示分化而来的SGCs高表达EDA和EDAR,RT-PCR及实时荧光定量PCR分析显示EDA基因及EDAR基因在诱导后SGCs中呈高表达状态；而CD29、CD200等HFSCs特异性抗原基因在汗腺化诱导后表达降低；5.在随后的细胞移植实验中,接受了细胞注射的裸鼠烫伤脚掌的愈合创面,我们发现了类似SG的新生结构,进而行SGCs特异性标记物的免疫组织化学染色及免疫荧光染色,结果显示这些类似汗腺的结构对CEA、CK14呈阳性表达,而在Nacl注射组的创面标本中,没有发现这种类汗腺结构的存在。6.在以HFSCs为种子细胞的A组及以ESCs为种子细胞的B组标本中,HE染色结果显示,两组标本均由表皮和真皮组成,二者之间以基底层相连接,基底层细胞排列较为整齐,细胞偏大,有CK19+和CD29+细胞散在分布；两组间标本对比显示：A组标本中,表皮层相对于B组较厚,分层较多,而且部分标本在基底层下方有毛囊样结构形成,表皮与真皮结合较紧密；B组标本对比A组来说,表皮层较薄,分层较少,表皮真皮易分离,基底层附近CK19+和CD29+阳性细胞较A组标本少,基底层下浅真皮层中无毛囊样结构形成实验结论：1. HFSCs可以在体外适宜的微环境中被分离、培养、扩增；其中“酶消化-毛囊剥离-酶消化”法较“酶消化-毛囊剥离-直接种植”法缩短了原代细胞的培养时间,在实验中更具优势；2. HFSCs具有多分化潜能,可以在体外被诱导分化为皮脂腺细胞及表皮角质形成细胞；3. HFSCs可以在适宜的微环境中,被诱导分化为SGCs; HFSCs作为一种成体干细胞,有用于治疗汗腺缺失的潜能；我们建立的共培养诱导体系可以有效的将HFSCs定向诱导分化为SGCs,其分子机制与EDA/EDAR基因的激活有关；诱导分化而来的汗腺细胞是有功能的,可以参与皮肤创面中汗腺的再生；4.以HFSCs为种子细胞有望构建出富含皮肤附属器的,形态、结构、功能更趋于完善的组织工程全层皮肤。

二、表皮干细胞分离及基因特异性表达（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、表皮干细胞分离及基因特异性表达（论文提纲范文）

（1）S14G-humanin（HNG）对表皮细胞氧化应激、自由基代谢和DNA损伤的保护机制的研究（论文提纲范文）

（2）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）

（3）头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成（论文提纲范文）

（4）P311在创面血管新生中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（5）α6和β1整合蛋白的差异表达揭示皮肤表皮细胞的行为及在单细胞水平上的异质性（论文提纲范文）

（6）木犀草苷对人表皮干细胞增殖的影响及作用机制研究（论文提纲范文）

（7）Mettl14和Mettl3对表皮干细胞的影响及机制研究（论文提纲范文）

（8）烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究（论文提纲范文）

（9）P311在皮肤创面再上皮化和肾纤维化中的作用及机制研究（论文提纲范文）

（10）毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究（论文提纲范文）

四、表皮干细胞分离及基因特异性表达（论文参考文献）

• [1]S14G-humanin（HNG）对表皮细胞氧化应激、自由基代谢和DNA损伤的保护机制的研究[D]. 王欣. 吉林大学, 2020(08)
• [2]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
• [3]头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成[D]. 苏义群. 山东大学, 2020(02)
• [4]P311在创面血管新生中的作用及机制研究[D]. 王淞. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
• [5]α6和β1整合蛋白的差异表达揭示皮肤表皮细胞的行为及在单细胞水平上的异质性[D]. 何维雅. 华南理工大学, 2019(02)
• [6]木犀草苷对人表皮干细胞增殖的影响及作用机制研究[D]. 万大鹏. 扬州大学, 2019(02)
• [7]Mettl14和Mettl3对表皮干细胞的影响及机制研究[D]. 周仁鹏. 上海交通大学, 2019(07)
• [8]烧伤后一氧化氮促进表皮干细胞迁移的作用及机制研究[D]. 詹日兴. 第三军医大学, 2016(02)
• [9]P311在皮肤创面再上皮化和肾纤维化中的作用及机制研究[D]. 姚志慧. 第三军医大学, 2016(02)
• [10]毛囊干细胞的多分化潜能及其向汗腺细胞分化的实验研究[D]. 王瑶. 南开大学, 2013(06)

标签：干细胞论文;  诱导多能干细胞论文;  细胞增殖论文;  血管内皮细胞论文;  烧伤面积论文;