一、乙醇诱导人体外培养K562细胞系凋亡的研究（论文文献综述）
崔钊[1]（2021）在《基于肿瘤铁死亡协同诱导机制的双氢青蒿素联合用药研究》文中提出肿瘤是危害人类健康的重大疾病。降低化疗药物的副作用,增强疗效,克服耐药性等研究,以及多靶点的药物联合治疗方式和新的抗肿瘤机制的应用仍是肿瘤治疗的重点问题。铁死亡（Ferroptosis）是一种新近发现的细胞调节性死亡方式,其核心病理机制是细胞内铁依赖的脂质过氧化通路和脂膜抗氧化系统失衡,致使过氧化脂质过度积聚,引起脂膜结构损伤和功能丧失,继而死亡。该死亡模式的发现引发生物界极大关注,并为肿瘤化疗药物研发及治疗等开创了新的领域。为了维持快速的物质代谢和能量代谢,癌细胞与正常的非癌细胞相比,铁需求增加。这种铁的依赖性可以使癌细胞更容易受到铁催化死亡即铁死亡的影响。人体不同组织内的铁元素含量以及在铁吸收、转运、储藏和释放以及排出等代谢过程中起着不同作用,其中肠道、肝脏、血细胞等组织细胞含量颇丰,铁代谢旺盛,且它们对应的肿瘤在危害人类健康的肿瘤谱中位居前列,这类肿瘤对铁死亡诱导剂是否更加敏感?基于铁死亡机制的联合用药是否更加有效?这些均是非常重要且亟待回答的问题。近年来大量研究结果证实,青蒿素类化合物（ARTs）具有确切的广谱抗肿瘤疗效。ARTs抗肿瘤作用具有以下特点:1)毒副作用相对较小;2)作用机制不同于传统化疗药物,联合当前常用化疗药物可取得良好增效作用;3)能逆转肿瘤细胞的多药耐药,提高肿瘤细胞放化疗敏感性;4)对一些目前尚缺少有效治疗药物之肿瘤（如胰腺癌等）有效。虽然青蒿素及其常用衍生物具有上述抗癌优势,但由于ARTs特殊的分子结构和化学性质致使该类药物存在着制剂困难的问题,另外,总体来看ARTs存在抗癌效价不高,选择性相对较低等缺憾,但这些特点无疑为联合用药、增效减毒提供了广阔的研究空间。因此,ARTs有望成为未来肿瘤临床组合治疗方案的常用药物之一。因此,本文以诱导肿瘤细胞铁死亡为基础,将双氢青蒿素其与目前一线抗肿瘤药物或一些前体化合物联合,筛选出具有协同增效的药物组合,同时进行协同机制的探讨,以期能够达到增效减毒的作用,并为临床应用提供基础数据。一、双氢青蒿素抗癌联用药物的体外筛选将双氢青蒿素（DHA）、全反式维甲酸（ATRA）、13-顺式-维甲酸（13-CRA）、维甲酰酚胺（Fen）、芳维甲酸（TTNPB）、索拉菲尼（Sora）、达拉非尼（Dab）、维莫非尼（Vem）、PLX-4720（PLX）、盐酸吉西他滨（Gem）分别与HepG2细胞孵育24 h,48 h,72h后,使用MTT法检测对肿瘤细胞的抑制率,计算药物对HepG2细胞的半数抑制浓度（IC50）,发现 DHA,ATRA,13CRA,Fen,Sora,PLX,TTNPB,Dab,Vem,Gem 在 48 h 的 IC50 分别为 19.46 μM,107.33 μM,104.58 μM,6.21 μM,6.21μM,55.54 μM,44.49 μM,121.43 μM,18.79 μM,0.82μM。根据各药物的 IC50值,以固定的浓度比例设置浓度梯度组合,将各药物分别与DHA联用,与细胞共孵育48 h后,使用MTT法检测对肿瘤细胞的抑制率,使用Calcusyn软件进行协同作用分析,计算联合指数（CI）;发现在HepG2细胞中,DHA分别与Sora,ATRA,Fen,PLX联用在24 h,48 h以及72 h时均显示出协同抑制HepG2细胞增殖的作用（CI<0.9）。二、不同肿瘤细胞系对铁死亡诱导剂敏感性的考察为了探讨了不同肿瘤细胞系对铁死亡诱导剂的敏感性,我们使用MTT法,检测了人髓性白血病K562细胞,人肝癌HepG2细胞,人结肠癌SW480细胞,人肺癌A549细胞,人神经胶质细胞瘤U251细胞对铁死亡诱导剂DHA与Sora的敏感性。发现K562细胞对DHA最为敏感,在24 h时DHA的IC50为2.76μM;其次为HepG2细胞和SW480细胞,在24 h时DHA的IC50分别为16.16 μM和24.29 μM;A549细胞与U251细胞对DHA的敏感性较低,24 h时DHA的IC50分别为 96.7 μM 和 154.2 μM。与 DHA 相似,Sora 24 h 时在 K562,HepG2,SW480,A548,U251 细胞中的 IC50 分别为 5.38 μM,12.55 μM,11.79 μM,20.61 μM,23.1 μM。我们在Sora 10μM和DHA 20μM诱导的一组人癌细胞死亡百分率的相关性分析中发现,Sora引起的细胞抑制与DHA引起的细胞抑制呈正相关（r=0.9850,p=0.0022）。结果表明,相对于其他部位的肿瘤细胞,铁死亡诱导剂对小肠、肝脏以及血液中的肿瘤细胞可能具有更明显的抑制效果。三、DHA联合Sora在体抗移植瘤实验将1.5×106个HepG2细胞接种到BALB/c裸鼠的右侧腋下;当肿瘤大小达到300 mm3时,将小鼠随机分为4组,每组7只;每天分别灌胃给药DHA 40mg/kg,腹腔注射给药 Sora 10 mg/kg,DHA40mg/kg+Sora 10 mg/kg 的组合剂量,对照组使用相同体积的溶剂。每周使用数字卡尺测量一次肿瘤结节的大小,并称重裸鼠重量。给药三周后,处死小鼠,剖取肿瘤称重,进行H&E染色。在实验结束时,与对照组相比,接受治疗的小鼠的体重没有明显变化。测量裸鼠瘤体积,联合用药组瘤体积为420.60±175.65 mm3相比Sora 10 μM单用组瘤体707.95±202.17 mm3显着降低（P<0.05）,相比DHA40 μM单用组瘤体积902.59±226.84 mm3显着降低（P<0.01）。联合用药组瘤重为0.57±0.19g相比Sora 10 μM单用组瘤重0.81±0.14g显着降低（P<0.05）,相比DHA40 μM单用组瘤重1.04±0.22g显着降低（P<0.01）。H&E染色结果表明,对照组,Sora单用组和DHA单用组分别出现约30%、57%和47%的细胞死亡区域;DHA与Sora联合治疗显示大面积的细胞形态模糊和细胞核染色消失,切片中显示约80%区域的细胞死亡。四、DHA单用及联合Sora对HepG2细胞L-ROS,MDA,LIP以及GSH的影响将药物与HepG2细胞共同孵育24 h,使用荧光探针Calcein AM和BODIPY 581/591 C11分别检测细胞内的不稳定铁池（LIP）和脂质活性氧（L-ROS）,使用脂质过氧化物丙二醛（MDA）检测试剂盒检测细胞内MDA水平,使用还原型/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）检测试剂盒检测细胞内GSH水平。与对照组相比,DHA20 μM与Sora 12 μM单用均能显着增加细胞内L-ROS水平（P<0.05）,MDA水平（P<0.05）以及LIP水平（P<0.01）,并能显着降低还原型GSH 水平（P<0.05）;DHA 1OμM联用Sora 12μM后,相比DHA 10μM单用,能显着增加细胞内L-ROS,MDA以及LIP水平（P<0.01）,显着降低GSH水平（P<0.01）。结果表明,DHA和Sora均可升高HepG2细胞内L-ROS,MDA以及LIP水平,降低还原型GSH水平,破坏HepG2细胞内的铁离子稳态以及氧化还原平衡,加速细胞内脂质过氧化的产生,因此DHA与Sora可通过诱导细胞铁死亡的相同作用机制起到协同作用。五、DHA单用及联合Sora对铁死亡相关蛋白的影响将药物与HepG2细胞共同孵育24h后裂解细胞,提取总蛋白后,使用BCA蛋白试剂盒定量。Western Blot法检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）,血红素加氧酶1（HO-1/HMOX1）,铁反应元件结合蛋白2（IREB2）,谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）,半胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白轻链亚基（SLC7A11/xCT）相对水平。我们发现,与对照组相比,DHA在10μM条件下能够显着降低细胞内xCT,GPX4,GCLC以及HO-1水平（P<0.01）;Sora在6μM条件下能够显着降低细胞内 xCT,GPX4,GCLC,IREB2以及HO-1水平（P<0.01）。与DHA 10μM单用组相比,DHA10μM与Sora 6μM联用后细胞内xCT,GPX4,GCLC,IREB2以及HO-1水平显着降低（P<0.01）。结果表明,DHA与Sora能够通过干扰铁依赖的脂质过氧化以及半胱氨酸-GPX4抗脂质过氧化两条通路的平衡,共同诱导HepG2细胞铁死亡。六、DHA单用及联合Sora对HepG2细胞有氧糖酵解及氧化磷酸化的影响将药物与HepG2细胞共同孵育8h后,使用Seahorse XF糖酵解速率测定试剂盒检测细胞的糖酵解速率的变化,使用Seahorse XF细胞线粒体压力测定试剂盒,检测细胞的氧化磷酸化能力。我们发现,与对照组相比,DHA在10μM,20 μM,30 μM剂量时均能显着降低细胞的糖酵解速率（P<0.05）,且具有剂量依赖性;与DHA 10 μM单用组相比,DHA 10 μM与Sora 12 μM联用后细胞的糖酵解速率显着降低（P<0.01）。与对照组相比,DHA在8 μM,12 μM,15μM剂量时均能显着降低细胞的最大呼吸能力以及备用呼吸能力（P<0.01）,降低氧化磷酸化ATP合成能力（P<0.01）,并增加质子泄漏（P<0.01）;与DHA10μM单用组相比,DHA 10μM与Sora5 μM联用后能显着降低细胞的线粒体最大呼吸能力（P<0.01）,备用呼吸能力（P<0.01）以及ATP合成能力（P<0.01）,并能够加速损伤线粒体引起质子泄漏（P<0.05）,使线粒体氧化磷酸化能力进一步降低。结果表明,DHA能够抑制HepG2细胞的有氧糖酵解及氧化磷酸化功能;DHA与Sora联用后起到了协同抑制细胞抑制能量代谢的作用。
李兰洲[2]（2021）在《基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究》文中提出胸腺肽类药物在恶性肿瘤的临床治疗常作为免疫调节剂与化疗药物联合使用。临床数据显示,胸腺肽类药物的使用提升了恶性肿瘤患者存活率和生活质量。胸腺肽注射制剂在使用中容易引起严重的过敏等副作用,而胸腺肽肠溶片虽然安全性更高,但也存在药品标准简单,质量控制项少等问题,且其相关研究较少,临床定位模糊,作用机制不明确。本研究以胸腺肽肠溶片原料药小牛胸腺肽（CTP）作为研究对象,对其物质基础进行测定,并通过免疫低下小鼠模型,B6/JGpt-Apcem1Cin（Min C）/Gpt基因型（APC）原发性结直肠癌小鼠模型,造血体外细胞模型和造血功能障碍小鼠模型,对CTP的免疫调节活性,基于免疫调节活性的抗结直肠癌活性和促造血活性及其作用机制进行研究。首先测定了CTP的分子量及分子量范围,17种氨基酸及5种核苷酸含量。结果显示CTP中分子量在100-800道尔顿（Da）之间有69.15%的组分,CTP的数均分子量为222 Da,重均分子量为998 Da。同时发现CTP中既含有大量的必须氨基酸,如:60.24 g/kg的赖氨酸和49.46 g/kg的亮氨酸,又含有大量的非必需氨基酸,如:86.82 g/kg的谷氨酸和55.67 g/kg的天冬氨酸。5种核苷酸中CMP以49763.19 mg/kg的含量占据绝对优势地位。其次,通过75 mg/kg环磷酰胺（CTX）建立免疫低下小鼠模型,通过测定小鼠自然杀伤（NK）细胞杀伤活性,淋巴细胞转化活性,免疫球蛋白（Ig）及细胞因子含量,对CTP免疫调节活性进行研究。结果显示CTP有效地缓解了免疫低下小鼠体重的降低,提高了小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞转化活性,提高了Ig A,Ig G,Ig M,白细胞介素（IL）-2,IL-6,肿瘤坏死因子α（TNF-α）,干扰素（IFN）-α和IFN-γ的含量,并降低了IL-10的含量。再次,在APC小鼠模型中,通过比较肿瘤形态变化及组织病理学,流式细胞术,肠道菌群测定,ELISA测定及western blot分析等技术,对CTP基于免疫调节的抗结直肠癌活性及作用机制进行研究。结果显示CTP作用有效地抑制了APC小鼠结直肠肿瘤的发展,限制了肿瘤组织中血管网络的建立,并有力地保持肠道细胞正常形态,说明在APC小鼠体内,CTP确实发挥了抑制结直肠癌的作用。CTP提高了APC小鼠外周血中NK细胞（CD3e-NK1.1+）和活化T淋巴细胞（CD3e+CD28+）的数量,提高了小鼠脾脏和肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞数量和辅助性T细胞（T helper cells,Th）1/Th2细胞比例。此外CTP作用显着提高了IL-2,IL-12,Toll样受体（TLR）4,TLR5含量,降低了IL-4,IL-10,转化生长因子β（TGF-β）含量,有效地提升了APC小鼠肠道菌群物种组成数量、种群丰度及均匀度,有效地降低了APC小鼠肿瘤及脾脏组织中细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA4）,程序性细胞死亡蛋白1（PD1）和程序性细胞死亡蛋白配体（PD-L）1含量,升高了小鼠脾脏中IL-2含量及Calcineurin A/活化T细胞核因子1（NFAT1）通路蛋白和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子κB抑制剂激酶（IKK）/核因子κB（NF-κB）p65通路蛋白的活化水平。最后选用K562细胞和CHRF细胞作为体外模型,通过XTT测定,流式细胞术凋亡测定,联苯胺染色,western blot分析等,在体外模型中初步确定CTP促造血活性。并通过100 mg/kg CTX建立造血功能障碍小鼠模型,模拟化疗引起的骨髓损伤相关的造血功能障碍。通过外周血细胞分析,组织病理学分析,骨髓细胞流式细胞术分析,蛋白质组学联合ELISA测定技术对造血相关细胞因子进行分析,western blot分析等,在体内水平对CTP促造血活性及作用机制进行研究。体外细胞实验显示,CTP作用在增强K562细胞和CHRF细胞增殖活性的同时,也促进了细胞分化,增加了K562和CHRF细胞中磷酸化（P）-细胞外调节蛋白激酶（ERK）1/2、P-核糖体蛋白S6激酶（RSK）1 p90、c-Myc和ETS转录因子ELK1（ELK1）等增殖分化相关蛋白的表达,证实CTP可通过调节增殖分化实现体外促造血作用。在造血功能障碍小鼠中,CTP促进了小鼠外周血中白细胞（WBC）,嗜酸性粒细胞（EO）,中性粒细胞（NE）等血细胞数量及血红蛋白含量的增多,并促进小鼠骨髓形态结构的重建及骨髓中B淋巴细胞,造血干细胞（HSCs）和造血祖细胞（HPCs）的增多,同时增加了小鼠体内IL-2,IL-4,粒细胞集落刺激因子（G-CSF）,巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）等细胞因子水平,限制了IL-17,CCL1,单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）,TNF-α,IFN-γ等细胞因子的释放,显着升高了ERK1/2,PI3K,AKT和信号转导与转录激活因子3（STAT3）的磷酸化水平及G-CSF,粒细胞集落刺激因子受体（G-CSFR）,M-CSF,NFAT1和IL-2的蛋白水平。以上结果表明:（1）CTP作为小分子多肽类物质,可以提高免疫低下小鼠体内免疫相关细胞因子水平,并提高了小鼠杀伤性免疫细胞的活性;（2）CTP通过调节肠道菌群,调控IL-2相关通路蛋白活化,降低免疫检查点作用,增加T淋巴细胞和NK细胞介导的免疫杀伤反应实现抗结直肠癌活性。（3）CTP能够通过调节G-CSF、M-CSF和IL-2水平及其相关通路蛋白变化,促进骨髓完整性重建和造血功能细胞增多,从而发挥促造血作用。本文研究内容将为CTP药物质量标准提升提供科学数据支持,并有助于确定CTP药物作用机制,明确其临床适用症,为基于CTP开发抗肿瘤或促造血药物提供科学的数据支持。
陈晓文[3]（2021）在《Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究》文中指出研究背景:慢性髓细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是临床常见的血液系统恶性肿瘤,主要特征为骨髓造血生成大量未成熟的白细胞,其发病率高达新发成人白血病的20%。BCR-ABL融合基因目前被认为是CML发病的重要原因和基本特征,该融合基因表达可生成具备组成性酪氨酸激酶活性的BCR-ABL嵌合蛋白。在CML的临床治疗中,特异性BCR-ABL抑制剂,如酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors,TKI）可将患者生存率显着提高,已被临床广泛应用。伊马替尼是（IM）一种通过阻断BCR-ABL蛋白的非活性构象的TKI,首次应用于CML的治疗,疗效显着,毒性较低。但仍有大量CML患者对伊马替尼不敏感或通过多种细胞机制产生耐药性。因此,在CML进展过程中筛选出有效的治疗靶点是非常迫切的,这将有助于提高CML在TKI药物治疗中的效果。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是由人Skp2基因编码的E3泛素连接酶。Skp2是一种C-Myc直接靶基因,在细胞周期进程的调控中起重要作用,多种恶性肿瘤中常发现有其表达上调。在血清缺乏的细胞中,Skp2过表达从而诱导细胞周期素A积累和p27磷酸化依赖性的降解从而促进细胞进入S期。Skp2还参与其他细胞周期调节蛋白的泛素化,包括细胞周期蛋白E和转录因子E2F1。目前国内外多项研究证实Skp2与许多实体肿瘤的化疗耐药性有关。如Skp2通过p27-CDKs-E2F1途径正向调节有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitotic arrest deficient 2,MAD2）的表达,通过抑制Skp2可以增强肺癌细胞对紫杉醇的敏感性。但Skp2在CML中的发生和抗肿瘤耐药中的作用尚待明确。研究目的:比较CML患者与正常对照组外周血白细胞中Skp2的蛋白水平与m RNA水平。探究Skp2的异常表达在K562细胞中的作用机制:在K562细胞中稳定敲减和过表达Skp2基因,检测细胞数量变化和细胞的增殖能力变化。在K562细胞中分别敲减和过表达c AMP应答元件结合蛋白（CREB）基因,检测Skp2的m RNA水平。检测抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴后K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。研究方法:1.收集24例新诊断的CML患者（研究组）和7例健康体检者（对照组）外周血,对外周血样本进行白细胞分离。分别通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）分析两组样本中Skp2的m RNA水平和蛋白水平。2.人CML细胞系K562在37℃,5%的CO2条件下用的RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）培养。构建基于PLK0.1的sh RNA-Skp2质粒,在K562细胞中稳定敲减Skp2,用Western Blot法检测稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞中Skp2蛋白水平,验证敲减Skp2基因的效果。通过细胞计数分析,比较K562细胞在Skp2稳定敲减和未敲减情况下的细胞增殖率,对稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-skp2-1或sh RNA-skp2-2的K562细胞用Ed U染色及Hoechst 33342染色法观察细胞核,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞的比值。在K562细胞中转染Flag-Skp2质粒,对过表达Skp2的K562细胞行Western Blot分析,采用细胞计数分析法测定过表达Skp2的K562细胞的细胞数变化,并用Ed U染色及Hoechst33342染色观察细胞形态,检测Ed U阳性细胞与Hoechst 33342阳性细胞之比。3.利用Jas PAR软件对编码Skp2基因的上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在保守的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析证实CREB基因和Skp2启动子中CREB结合区（BR）的基因片段之间存在特异性结合。构建一系列含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒。将K562细胞与含有野生型或突变型Skp2启动子区的PGL3荧光素酶报告质粒以及Flag或Flag-CREB质粒共转染K562细胞,转染后取细胞溶解物,使用荧光素酶测定其转录活性,用Western Blot法验证CREB的过表达效果,同时通过q RT-PCR测定Skp2的m RNA水平。K562细胞与含有sh RNA-CREB基因或sh RNA-ctrl基因共转染,转染后行Western Blot法证实基因敲减效果,荧光素酶分析转录活性。用q RT-PCR测定CREB基因敲减前后K562细胞中Skp2 m RNA水平变化。4.用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与sh RNA-ctrl组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用二甲基亚砜或磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂Ly294002（10μmol/L）预处理K562细胞4 h,伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,采用MTT比色法测定各组细胞活力,分别与对照组比较,通过三次实验得出相对细胞活力。用伊马替尼（1μmol/L）处理稳定表达sh RNA-ctrl、sh RNA-Akt、sh RNA-CREB或sh RNA-Skp2的K562细胞24 h,Western Blot分析caspase-3/7活性和PARP的裂解。K562细胞分别加用和不加Ly294002预处理再加用伊马替尼（1μmol/L）处理24 h,试剂盒检测caspase-3/7活性并用Western Blot分析PARP的裂解。研究结果:1.和健康对照组相比,Skp2在CML患者中异常表达。收集24例CML患者和7例健康体检者外周血白细胞,CML样本显示Skp2的m RNA水平及蛋白水平均较健康对照组显着上调。数据表明CML患者Skp2表达上调,Skp2蛋白水平与m RNA水平呈一致性改变。2.Skp2是K562细胞增殖的关键。在K562细胞中稳定敲减Skp2基因,与对照组细胞相比,敲减了Skp2的K562细胞的细胞数量显着减少。Ed U分析显示敲减Skp2的K562细胞增殖能力显着低于对照组细胞。3.Skp2过表达影响K562细胞的增殖。与敲减基因结果相反,通过过表达Skp2基因,K562细胞数量增加。与此相关,Skp2过表达导致K562细胞中Ed U阳性细胞百分比显着增加。4.Skp2通过CREB转录调控。利用Jas PAR软件对Skp2编码基因上游基因组序列进行分析,在Skp2启动子中发现一个潜在的CREB结合区（BR）。染色质免疫沉淀（Ch IP）分析显示,CREB能和Skp2基因中CREB结合区（BR）的基因片段特异性。构建一系列包含野生型CREB-BR（WT）PGL3荧光素酶报告质粒和缺失CREB-BR的突变型（MUT）PGL3荧光素酶报告质粒,将含有WT或MUT的Skp2启动子区以及Flag或Flag-CREB的质粒共转染K562细胞,野生型CREB-BR（WT）转录活性在过表达CREB后明显升高,但突变型质粒（MUT）和p GL3空载体转录活性未见明显升高。相反,野生型CREB-BR（WT）转录活性在稳定敲减CREB基因的K562细胞中降低,同样突变型构建体（MUT）和PGL3空载体均未显示转录活性的改变。5.CREB的稳定敲减导致K562细胞中Skp2 m RNA水平显着降低。鉴于CREB的转录活性是由其第133位丝氨酸磷酸化后被活化的,我们试图评估野生型的Flag-CREB和第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对Skp2表达的影响。野生型的Flag-CREB能够上调Skp2的m RNA水平,但第133位丝氨酸被突变的Flag-CREB-Ser-133A对于Skp2的m RNA水平无明显的调控作用。以上结果提示,在K562细胞中Skp2的表达在转录水平受到CREB的调控。6.抑制PI3K/Akt-CREB-Skp2轴增加K562细胞对伊马替尼的敏感性。用伊马替尼处理（1μmol/L）CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞并观察其存活率,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后表现出细胞活力的急剧下降。7.CREB或Skp2的敲减导致伊马替尼处理的K562细胞中caspase-3/7活性的显着增加。caspase-3/7的活化是对伊马替尼治疗敏感性的响应,CREB或Skp2稳定敲减的K562细胞在伊马替尼处理后与对照组细胞药物处理后相比,caspase-3/7的活化及PARP的裂解更明显。8.PI3K/Akt信号通路在关联CREB的激活及Skp2的表达中起到特定的作用。在K562细胞中稳定敲减Akt或使用LY294002来抑制PI3K/Akt通路,结果导致伊马替尼处理的K562细胞活力显着下降,Skp2蛋白水平降低,caspase-3/7活化及PARP裂解明显增强,说明K562细胞对伊马替尼更加敏感。结论:与健康对照者相比,初治CML患者外周血白细胞中Skp2高表达,并且Skp2高表达对CML细胞增殖至关重要。从机制上讲,在K562细胞中Skp2受PI3K/Akt-CREB信号通路的转录调控。此外,稳定敲减Skp2的表达或阻断PI3K/Akt-CREB通路可显着提高K562细胞对伊马替尼的敏感性。
杜妍[4]（2021）在《ATPR通过调控RARα/LDHB/ERK分子轴诱导急性髓系白血病细胞分化及机制研究》文中研究指明急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）的典型特征是髓系造血干/祖细胞的分化受阻。过去40年的治疗标准方案为“3+7”方案（蒽环类药物联合阿糖胞苷）,但是其副作用较大。不同于传统化学疗法,诱导分化疗法是通过药物选择性的诱导肿瘤细胞分化成正常细胞,而对正常的组织细胞没有明显的毒副作用。虽然作为一种经典的诱导分化药物,ATRA已经广泛应用于AML的临床治疗,但是ATRA仅对AML中10%的M3型的急性早幼粒细胞白血病（acute promyelocytic leukemia,APL）有效,并且治疗过程中复发的患者往往会产生ATRA耐药或维甲酸综合征。因此研究出低毒且高效的新型诱导分化剂具有重大意义。本课题组以ATRA为原型,合成的全新化合物代表4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯（4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate,ATPR）,已被证实在体内外对血液系统肿瘤均具有较强的诱导分化活性,但其在AML中的作用机制尚未阐明。异常的糖代谢是肿瘤细胞的主要特征之一。在有氧环境中,肿瘤细胞优先采用糖酵解途径而不是氧化磷酸化来提供能量,这种糖代谢的异常有助于多药耐药,并显着增加了肿瘤的复发率和死亡率,所以利用肿瘤细胞异常糖代谢的特征来锁定肿瘤细胞,可以更高效安全的靶向治疗肿瘤并改善患者预后。近年来的文献报道指出,在多种AML细胞系以及AML患者原代细胞中均存在较高的糖酵解水平,并且AML患者血清中糖酵解相关分子乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的水平也与化疗后出现的耐药与复发现象呈现正相关。这些结果提示,通过调控糖酵解途径靶向治疗AML,可能为未来探索AML治疗提供了新的思路。本课题组采用蛋白质组学对ATPR以及ATRA作用于NB4细胞分析后发现,与ATRA不同,ATPR可以选择特异性的下调糖酵解途径中的一种特殊催化酶,乳酸脱氢酶B（lactate dehydrogenase B,LDHB）,提示LDHB可能在ATPR诱导白血病细胞分化中发挥了潜在作用。本课题拟通过深入研究LDHB基因在ATPR诱导AML细胞分化中的作用及分子机制,为ATPR更好的应用于AML诱导分化治疗奠定理论基础。目的:通过体内外实验阐明LDHB在ATPR诱导AML细胞分化中的作用及分子机制。方法:1.维甲酸受体在ATPR诱导AML细胞分化中的作用采用CCK-8实验检测不同浓度ATPR（10-9-10-5 M,72 h）对不同AML细胞（NB4、HL-60、KG-1、U937和MOLM-13）生长活力的影响;采用Western blotting实验检测不同时间ATPR（10-6 M,24-72 h）对AML细胞系（NB4和MOLM-13）维甲酸受体（RARα,RARβ和RARγ）以及NB4特有的PML-RARα融合蛋白表达的影响;采用q RT-PCR检测不同时间ATPR（10-6 M,24-72 h）对AML细胞系（NB4和MOLM-13）维甲酸受体（RARα,RARβ和RARγ）以及下游靶基因（CRABP2和CYP26A1）的m RNA表达的影响;采用流式细胞术检测RARα抑制剂Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞周期和分化的影响。Western blotting实验检测Ro41-5253对ATPR作用下周期相关蛋白（Cyclin A2,CDK4和Cyclin D3）和分化相关蛋白（PU.1）的影响。2.LDHB在ATPR诱导AML细胞分化中的作用采用CCK-8实验检测不同浓度糖酵解抑制剂2-DG（1 m M-16 m M,72 h）对不同AML细胞系（HL-60,KG-1,NB4和MOLM-13）生长活力的影响;采用蛋白质组学检测ATPR和ATRA作用于NB4细胞蛋白质表达的差异;在TCGA数据库中分析LDHB基因在不同AML患者中的表达情况;采用Western blotting实验检测正常人外周血、AML初诊病人外周血/骨髓血以及不同的AML细胞系（HL-60,KG-1,NB4和MOLM-13）中LDHB基因蛋白的表达;采用Western blotting实验检测不同浓度和时间ATPR（10-7-10-5 M,24-72 h）作用下LDHB的蛋白表达;ATPR（10-6 M,72 h）处理前1 h加入RARα抑制剂Ro41-5253（10-5 M）,采用Western blotting实验检测Ro41-5253对ATPR作用下LDHB蛋白表达的影响。使用携带LDHB sh RNA的慢病毒构建LDHB稳定沉默的NB4和MOLM-13细胞模型,采用免疫荧光和Western blotting实验验证稳定沉默LDHB细胞模型的构建;采用CCK-8以及KI67染色实验检测沉默LDHB对NB4和MOLM-13细胞增殖的影响,采用瑞士吉姆萨染色、NBT染色以及流式细胞术（检测分化相关蛋白CD11b和CD14）实验检测沉默LDHB对NB4和MOLM-13细胞分化的影响,采用流式细胞术实验检测沉默LDHB对NB4和MOLM-13细胞周期的影响;使用慢病毒构建稳定沉默LDHB的NB4和MOLM-13细胞模型,筛选构建成功的细胞后,采用皮下注射稳定沉默LDHB的NB4和MOLM-13细胞构建NCG皮下移植瘤小鼠模型,观察沉默LDHB对NB4和MOLM-13细胞成瘤能力的影响。采用免疫组织化学染色观察沉默LDHB对增殖蛋白（KI67）和分化蛋白（CD11b）表达的影响。转染LDHB过表达质粒构建过表达LDHB的NB4和MOLM-13细胞模型,采用免疫荧光和Western blotting实验验证过表达LDHB细胞模型的构建;转染LDHB过表达质粒后,同时给予ATPR（10-6 M,72 h）处理,采用流式细胞术（分化相关蛋白CD11b）检测过表达LDHB对ATPR作用下细胞分化的影响,采用免疫荧光实验（增殖相关蛋白KI67染色）检测过表达LDHB对ATPR作用下细胞增殖的影响。3.Raf/MEK/ERK信号通路在ATPR诱导AML细胞分化中的作用采用Western blotting实验检测不同浓度ATPR（10-5-10-7 M,72 h）作用后NB4和MOLM-13细胞中Raf,p-MEK/MEK和p-ERK/ERK蛋白的表达;ATPR（10-6M,72 h）处理前1 h加入RARα抑制剂Ro41-5253（10-5 M）预处理,同样采用Western blotting实验检测Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞中Raf,p-MEK/MEK和p-ERK/ERK蛋白表达的影响;采用Western blotting实验检测沉默LDHB对NB4和MOLM-13细胞中Raf,p-MEK/MEK和p-ERK/ERK蛋白表达的影响;ATPR（10-6 M,72 h）处理时加入MEK抑制剂PD98059（10-5 M）预处理,同样采用Western blotting实验检测PD98059对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞周期相关蛋白（Cyclin A2,CDK4和Cyclin D3）和分化相关蛋白（PU.1）的影响。4.ATPR对NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型的影响体内通过NOD/SCID鼠腹腔注射NB4细胞,构建AML腹水移植瘤模型,分别进行腹腔注射ATPR（5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg）以及阿霉素（1 mg/kg）给药,记录小鼠一般情况和生存期,HE染色检测主要脏器（肝、脾、肾）的病理变化。结果:1.维甲酸受体在ATPR诱导AML细胞分化中的作用3/5AML细胞系（HL-60,KG-1,NB4,MOLM-13和U937）对ATPR均敏感,其中NB4和MOLM-13细胞系对ATPR最为敏感,且最佳作用浓度为10-6 M,最佳作用时间为72 h;与对照组相比,ATPR可以成时间依赖性的增加NB4和MOLM-13细胞中RARα和RARβ受体的m RNA和蛋白表达,降低NB4细胞特有的PMLRARα融合蛋白的表达,而对RARγ受体的m RNA和蛋白表达几乎没有影响。ATPR同样可以增加下游靶基因（CRABP2和CYP26A1）的m RNA表达;提前加入RARα受体抑制剂Ro41-5253可以阻断ATPR诱导NB4和MOLM-13细胞分化和G0/G1期周期阻滞作用。2.LDHB在ATPR诱导AML细胞分化中的作用与对照组相比,加入糖酵解抑制剂2-DG后可以成浓度依赖性的抑制AML细胞系（HL-60,KG-1,NB4和MOLM-13）的生长活力,其中NB4细胞对2-DG作用最为敏感;蛋白质组学结果显示,与ATRA相比,ATPR可以在NB4细胞中特异性的下调LDHB基因的蛋白表达;TCGA数据库显示LDHB基因在多种AML类型中均呈现高表达;与正常人外周血相比,LDHB在AML患者外周血/骨髓血以及不同的AML细胞系（HL-60、NB4、KG-1和MOLM-13）中表达增加;在NB4和MOLM-13细胞中,ATPR可以呈浓度和时间依赖性的抑制LDHB基因的表达;Ro41-5253可以逆转ATPR对LDHB基因的抑制作用。在体外实验中,沉默LDHB可以诱导NB4和MOLM-13细胞分化及增殖抑制;在体内实验中,沉默LDHB可以通过诱导细胞分化和增殖抑制进而阻碍NB4和MOLM-13细胞移植瘤生长;过表达LDHB可以逆转ATPR诱导NB4和MOLM-13细胞分化和增殖抑制作用。3.Raf/MEK/ERK信号通路在ATPR诱导AML细胞分化中的作用与对照组相比,ATPR可以呈浓度依赖性的激活NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白的表达;提前加入RARα受体抑制剂Ro41-5253可以阻断ATPR激活NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达的作用;与对照组相比,沉默LDHB可以激活NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白的表达;加入MEK抑制剂（PD98059）可以逆转ATPR诱导NB4和MOLM-13细胞分化和G0/G1期周期阻滞作用。4.ATPR对NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型的影响连续两天腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg,100 mg/kg,50 mg/kg均可抑制NOD/SCID小鼠免疫能力;NOD/SCID小鼠连续两天腹腔注射环磷酰胺150 mg/kg后,再进行腹腔注射NB4细胞可以在腹腔形成腹水以及实体瘤,并且浸润到肝,脾,肾等器官中,对正常组织结构进行破坏;ATPR（5 mg/kg,10 mg/kg和20 mg/kg）可以缓解NB4细胞对组织脏器的浸润与破坏,并且诱导腹水以及实体瘤细胞分化成熟;ATPR为10 mg/kg和20 mg/kg剂量可以明显延长小鼠生存期。结论:1.ATPR可能是通过RARα/LDHB/ERK分子轴发挥诱导AML细胞分化的作用。2.ATPR（10 mg/kg和20 mg/kg）可以促进NOD/SCID小鼠腹水移植瘤模型腹部实体瘤细胞分化成熟,抑制白血病细胞对NOD/SCID小鼠组织脏器的浸润,并明显延长NOD/SCID小鼠腹水移植瘤模型生存期。
李朝蓬[5]（2021）在《ETV6通过Raf/MEK/ERK通路调控K562细胞红系分化》文中提出背景:红系分化是指造血干细胞在经历多能造血干细胞、红系祖细胞、红系前体细胞、网织红细胞等多个生长分化阶段后,最终发育成为成熟红细胞的过程,是机体产生成熟红细胞的重要途径。而一旦红系细胞的发育停滞在某一阶段,不能最终分化成为成熟红细胞,便会导致多种疾病,白血病便是其中最为严重和常见的一类。慢性粒细胞白血病（CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆性疾病,约占所有成人白血病中的20%。分化与成熟障碍被认为是白血病细胞的共性,因此,诱导白血病细胞分化、突破分化成熟障碍已经成为医学基础研究以及临床转化的研究热点。K562细胞是从CML病人体内分离得到的细胞系,具有干细胞的特性,在行为上更接近于未分化早期多潜能的造血祖细胞,是诱导细胞分化的理想模型。ETV6又被称为TEL,位于人类12号染色体的短臂区域（12p13）,是E26transformation-specific（ETS）家族的成员之一。它编码一个含有452个氨基酸的蛋白质,并拥有两个独特的结构域:N-末端的HLH结构域和C-末端的ETS结构域。因其结构域可与其它分子结合形成不同的嵌合产物,例如ETV6-RUNX1、ETV6-PDGFRβ和ETV6-ABL等融合基因,而参与白血病的形成。此外,作为一种转录抑制因子,ETV6的主要作用是抑制多种靶基因的表达,其中许多基因在造血过程中受到其高度调控,提示我们ETV6与白血病细胞红系分化之间可能存在密切联系。本组前期发现与ETV6直接结合并相互调控的信号接头蛋白CRKL与K562细胞的红系分化紧密相关。结合ETV6在多种血液系统恶性肿瘤的发生发展中起到的重要作用,由此我们推测ETV6与K562细胞红系分化之间存在一定程度上的关联。目的:1、检测ETV6在CML患者样本中的表达水平,分析与CML的相关性;2、明确ETV6对K562细胞红系分化的影响;3、探讨ETV6调控K562细胞红系分化的分子机制。方法:1、q RT-PCR检测ETV6在13例CML初发患者,5例CML完全缓解患者样本和7例正常供者外周血单核细胞中的表达水平;2、hemin诱导K562细胞0、12、24、36、48 h后,通过联苯胺染色法检测K562红系分化阳性率,通过Western blot检测ETV6表达;3、联苯胺染色法检测ETV6表达变化对K562红系分化的影响;4、q RT-PCR检测ETV6表达变化对K562红系分化相关分子表达的影响;5、CCK-8法检测ETV6表达变化对K562细胞增殖的影响;6、流式细胞术检测ETV6表达变化对K562红系分化标志分子GPA和CD71表达的影响;7、Western blot检测ETV6表达变化对K562中Raf/MEK/ERK通路分子的影响;8、经PD98059抑制Raf/MEK/ERK通路,Western blot检测K562细胞中ERK以及p-ERK的表达,联苯胺染色法检测K562细胞红系分化阳性率,q RT-PCR检测K562中红系分化相关分子的表达。结果:1、与正常供者外周血单核细胞相比,ETV6总体表达水平在CML初发患者中升高137.3%（P=0.0378）;CML患者完全缓解后,与CML初发患者相比,ETV6表达水平降低54.5%（P=0.0459）,且与正常组相比,ETV6表达水平无差异;2、使用hemin诱导K562,红系分化随诱导时间增强,ETV6表达水平持续降低;3、敲降ETV6后K562细胞红系分化阳性率升高26.9%（P=0.0017）,红系分化相关分子α-globin、γ-globin、ε-globin、GPA和HBA表达水平分别升高44.8%（P=0.0166）、31.9%（P<0.0001）、38.5%（P=0.0135）、23.8%（P=0.0183）和112.3%（P=0.0142）。CCK-8法测得24 h时细胞增殖率降低6.6%（P=0.0012）,48 h时细胞增殖率降低20.6%（P=0.0001）,在72 h时细胞增殖率降低22.0%（P<0.0001）,细胞增殖能力降低;4、过表达ETV6后K562细胞红系分化阳性率降低25.7%（P=0.0016）,红系分化相关分子α-globin、γ-globin、ε-globin、GPA和HBA表达水平分别降低了49.5%（P<0.0001）、33.5%（P=0.0018）、30.9%（P=0.0051）、25.1%（P=0.0123）和25.6%（P=0.0086）。CCK-8法测得24 h时细胞增殖率升高13.0%（P=0.0003）,在48 h时增殖率升高24.2%（P<0.0001）,在72 h时增殖率升高15.9%（P=0.0004）;5、敲降ETV6后,p-Raf升高18.8%（P=0.0058）,p-MEK升高61.5%（P=0.0119）,p-ERK升高37.9%（P=0.0178）,而Ras、Raf、MEK、ERK原型分子表达无明显变化;过表达ETV6后,p-Raf降低43.0%（P=0.0149）,p-MEK降低36.6%（P=0.0066）,p-ERK降低45.6%（P=0.0382）,Ras、Raf、MEK、ERK原型分子表达无明显变化;6、ERK通路的阻断减弱了ETV6下调对K562细胞红系分化阳性率的促进作用;同时ERK通路的阻断减弱了ETV6下调对红系分化相关分子表达的促进作用。结论:1、ETV6在CML初发患者中高表达,而当CML初发患者完全缓解后,ETV6水平明显降低,表明ETV6升高与CML病程相关;2、ETV6敲降促进K562细胞红系分化;ETV6过表达抑制K562细胞红系分化;3、ETV6敲降激活Raf/MEK/ERK通路活性;ETV6过表达抑制Raf/MEK/ERK通路活性。
吕鑫鑫[6]（2021）在《miR-429靶向CRKL通过ERK通路调控K562细胞红系分化》文中认为红系分化是指造血干细胞经过多能造血干细胞、髓样祖细胞、红系祖细胞,形成成熟红细胞的过程,是机体产生成熟红细胞的重要途径。白血病的成因一般被认为是红系祖细胞的的发育和分化停滞。慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是一种多能造血干细胞恶性克隆增殖性疾病,具有凋亡阻滞、增殖失控、造血功能抑制及分化障碍等特征。因此对白血病细胞分化诱导和作用机制的深入研究以及诱导分化新靶点的发现可为白血病的治疗提供新的理论基础和依据。信号接头蛋白CRKL是CRK家族成员之一,可以通过其SH2、SH3结构域募集信号通路分子。CRKL的异常表达与恶性肿瘤的发生发展密切相关,可能是潜在影响肿瘤治疗和预后的靶标分子。本组前期结果表明CRKL差异表达影响K562的增殖、迁移、侵袭和红系分化、巨核分化能力;我们用CRKL稳定敲降的K562细胞通过基因芯片和蛋白组学筛选和鉴定了与红系分化相关分子的表达均升高,提示CRKL与K562细胞红系分化相关。miR-200家族中的miR-429是一种具有组织和细胞特异性的miRNA,在不同肿瘤中发现miR-429的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关。本组前期结果表明:在研究肝癌Hep G2细胞迁移、侵袭过程中发现miR-429与CRKL存在靶向调控关系,二者表达水平呈负相关,并且主要通过ERK通路起作用。但miR-429在白血病细胞红系分化中的作用及机制尚不清楚。所以本论文主要研究miR-429与CRKL靶向作用调控白血病细胞红系分化的分子机制,为白血病分子靶向治疗提供新的研究线索和思路。目的:1.在CML患者样本中检测miR-429与CRKL的表达。2.筛选CRKL表达相关的红系分化相关分子3.明确miR-429、CRKL对K562红系分化的影响;4.探讨miR-429靶向CRKL调控K562红系分化的分子机制。方法:1.qRT-PCR检测CML临床样本中miR-429与CRKL的表达及其相关性;2.基因芯片筛选CRKL稳定敲降后K562细胞中表达变化的红系分化相关分子;3.联苯胺染色法检测Hemin处理K562细胞的红系阳性率;4.qRT-PCR检测Hemin处理K562细胞24 h和48 h后红系分子表达;5.qRT-PCR和Western blot（WB）检测miR-429和CRKL在Hemin诱导24 h和48 h后K562细胞中的表达水平;6.用Lipofectamine TM 2000及Letran-R方法分别在K562细胞中瞬时转染PCDH-CRKL及PCDH质粒、miR-429 inhibitor及miR-NC inhibitor。WB和qRT-PCR分别检测CRKL和miR-429的表达水平;7.联苯胺染色法检测miR-429和CRKL水平变化对细胞红系分化的影响;8.qRT-PCR法检测miR-429和CRKL对K562红系分子表达的影响;9.CCK-8法检测miR-429和CRKL对K562增殖的影响;10.流式细胞术检测miR-429对K562细胞红系分子GPA和CD71表达的影响;11.WB法检测miR-429高、低表达和CRKL高表达对K562细胞中CRKL和p-CRKL表达的影响对ERK通路蛋白Raf、p-Raf、MEK、p-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2和Ras表达的影响;12.用PD98059抑制ERK通路,WB、联苯胺染色法和qRT-PCR分别检测miR-429和CRKL对K562细胞中ERK和p-ERK的表达,对K562红系分化的影响。结果:1.与正常外周血样本相比,CML初发患者骨髓样本单核细胞中miR-429表达降低1.1倍（P=0.0269）,CRKL表达升高4.45倍（P=0.0208）,二者负相关（R2=0.424,P=0.0301）。2.CRKL稳定敲降后,基因芯片数据结果表明与红细胞生成相关SPTA1、SPTB、TFRC、PKLR、EPB41L3、AHSP、RHD、RHCE水平在K562中分别升高1.50、1.64、1.76、1.82、1.90、2.20、1.94和2.06倍。3.50μM Hemin诱导K562细胞24和48 h之后,红系分化率分别上升36.5%（P=0.0036）和85.9%（P=0.0034）;红系分子γ-globin、ε-globin、GPA、α-globin的表达与0 h相比,在24 h分别升高3.2倍（P=0.0152）、1.0倍（P=0.0416）、2.4倍（P=0.0064）、1.9倍（P=0.0095）,在48 h分别升高3.5倍（P=0.0020）、0.86倍（P=0.0107）、2.1倍（P=0.0040）、1.5倍（P=0.0008）。4.qRT-PCR结果表明miR-429在40μM Hemin处理24 h和48 h的K562中表达水平则升高43.5%（P=0.0279）和123.0%（P=0.0011）;WB结果表明CRKL分别降低28.7%（P=0.0008）和37.7%（P=0.0072）。5.与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染K562细胞对40μM Hemin诱导的红系分化率降低51.4%（P<0.0001）;与PCDH转染相比,PCDH-CRKL转染K562细胞产生的红系分化率降低47.2%（P<0.0001）。6.与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染细胞中γ-globin、ε-globin、HBA分别降低61.3%（P=0.0005）、78.9%（P=0.0020）、44.6%（P=0.0226）;与PCDH转染细胞相比,PCDH-CRKL转染细胞中γ-globin、ε-globin、HBA分别降低55.3%（P=0.0034）、76.8%（P<0.0001）、92.1%（P<0.0001）。7.CCK-8法分析表明:与miR-NC inhibitor转染细胞相比,在24 h,48 h,72h时,miR-429 inhibitor转染细胞增殖能力分别升高10.3%（P=0.0020）,16.5%（P<0.0001）,61.1%（P<0.0001）;与PCDH转染细胞相比,PCDH-CRKL质粒转染细胞增殖能力分别升高18.2%（P=0.0010）,40.4%（P<0.0001）,25.7%（P<0.0001）。8.流式细胞术结果表明:与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染K562细胞中CD71和CD235a（GPA）双阳性细胞群占比增加42.5%。9.与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染K562细胞中CRKL表达降低39.3%（P=0.0006）,p-CRKL降低42.0%（P=0.0058）;p-Raf、p-MEK、p-ERK分别增加71.3%（P=0.0034）、47.5%（P=0.0306）、67.7%（P=0.0004）。与miR-NC inhibitor转染细胞相比,miR-429 inhibitor转染K562细胞中CRKL升高34.7%（P<0.0001）,p-CRKL升高83.0%（P=0.0041）;p-Raf、p-MEK、p-ERK表达分别降低33.0%（P=0.0071）、35.3%（P=0.0045）、46.3%（P=0.0025）。与PCDH转染细胞比,PCDH-CRKL转染K562中CRKL表达增加116.3%（P=0.0004）,p-CRKL增加81.0%（P=0.0047）;p-Raf、P-MEK、p-ERK表达分别降低35.7%（P=0.0147）、40.7%（P=0.0039）、41.0%（P=0.0005）。这三组细胞中Raf、MEK、ERK、Ras的表达均无差异。10.PD98059抑制ERK通路后,与miR-NC mimic转染细胞比,miR-429 mimic转染K562细胞红系分化率上升67.0%（P=0.0032）;与miR-429 mimic转染细胞相比,miR-429 mimic+PD98059转染细胞红系分化率降低34.5%（P=0.0088）。与si-NC转染细胞相比,si-CRKL转染细胞红系分化率升高72.0%（P=0.0002）;与si-CRKL转染细胞相比,si-CRKL+PD98059转染细胞红系分化率降低55.5%（P=0.0002）。相应地,ERK通路阻断后,与miR-NC mimic转染细胞相比,miR-429 mimic转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别升高74.8%（P=0.0022）、43.5%（P=0.0020）、42.5%（P=0.0011）;与miR-429 mimic转染细胞相比,miR-429 mimic+PD98059转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别降低56.2%（P=0.0015）、63.6%（P=0.0022）、23.1%（P=0.0286）。与si-NC转染细胞相比,si-CRKL转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别升高24.2%（P<0.0001）、28.7%（P=0.0338）、48.5%（P=0.0164）;与si-CRKL转染细胞相比,si-CRKL+PD98059转染细胞中γ-globin、ε-globin、GPA分别降低46.0%（P=0.0052）、30.9%（P=0.0172）、44.5%（P=0.0059）。结论:1.在CML临床样本中miR-429低表达,CRKL高表达,二者负相关。2.miR-429促进K562细胞红系分化。3.CRKL抑制K562细胞红系分化。4.miR-429靶向CRKL通过激活ERK信号通路调控K562细胞红系分化。
王丽静[7]（2021）在《慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究》文中进行了进一步梳理TGF-β信号通路是广泛调控生物体生命活动最重要的信号通路之一。TGF-β可以通过促进p15、p21、p57等抑癌基因的表达以及下调c-Myc等原癌基因的表达,从而抑制细胞增殖,以维持细胞正常的增殖稳态。因而,在多种癌症中TGF-β信号通路被作为破坏的靶标以实现癌细胞的过度增殖。比如在白血病中,虽然白血病类型有很多,但TGF-β信号通路被普遍认为是受到抑制的。而且,多种实体瘤中TGF-β信号通路中的重要成员经常发生缺失或失活突变,但在白血病中,类似的现象却比较少见。那么白血病细胞是如何逃逸TGF-β信号通路监控的呢?本课题在慢性髓细胞白血病（CML）中进行了深入的探讨。CML是一种髓系造血细胞恶性增殖疾病,酪氨酸激酶活性异常激活的BCR-ABL1融合蛋白对于CML的发生发展起着至关重要的作用,存在于高达95%的CML病人中。通过酪氨酸激酶库的筛选,我们发现ABL激酶可以磷酸化TGF-β信号通路中的关键蛋白Smad4,并且这种磷酸化现象进一步在人源CML细胞系K562中有检测到。通过质谱以及点突变等实验,我们找到了 ABL激酶磷酸化Smad4的主要位点,分别为Y195,Y301以及Y322。在TGF-β信号通路响应良好的细胞系中过量表达ABL激酶会明显削弱TGF-β所诱导的CDK抑制因子的表达以及影响TGF-β对于细胞增殖的阻滞作用。相反,在CML细胞系K562中加入ABL激酶的抑制剂Gleevec会显着增强细胞对于TGF-β信号的响应,并且我们发现TGF-β的使用也会增强K562对于Gleevec药物的敏感度。我们进一步发现,Smad4被ABL激酶磷酸化后,会降低其与转录共激活因子β300的结合从而导致了TGF-β信号通路的正常转录受到影响。最后,为了确认ABL激酶通过磷酸化Smad4而影响TGF-β的功能性位点,我们在K562 Smad4敲除的细胞系中分别回补了 Smad4 Y195/301/322F以及Y195/301/322E的突变体。结果发现回补Smad4 Y195/301/322F的K562对于TGF-β信号通路的响应增强,并且对于Gleevec的敏感性也明显提高,而回补Smad4 Y195/301/322E的K562对于上述两方面的现象恰恰是相反的。并且该现象在白血病小鼠模型中也得到进一步的验证。我们的研究首次证实Smad4是ABL激酶的靶蛋白并且进一步阐明了 CML以及其靶向药物Gleevec新的分子机制,这些研究结果一方面为研究CML与TGF-β信号通路之间的联系提供了理论依据,另一方面也为将来CML的治疗以及Gleevec药物的应用提供科学指导。
黄河[8]（2020）在《急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究》文中指出研究背景我国是世界上高原面积最大,常住人口最多的国家,有6000多万人居住在高原地区。随着高原地区社会经济和国防事业的日益发展,现在每年都有超过1000万人从平原进入高原从事旅游、商贸、建设和军事戍守。高原自然环境恶劣,低压低氧可导致急性高山病（又称急性高原反应）（acute mountain sickness,AMS）和高原红细胞增多症（high altitude polycythemia,HAPC）等疾病高发,严重损害身体健康。AMS是指从平原急进至高原（海拔高度2500 m以上）人群,出现由缺氧引起的以剧烈头痛、头晕、恶心等神经症状为典型表现的一种急性高原病。该病的发病率高,据国内外多项研究显示,AMS发病率高达30%-90%。同时,其危害性很大,轻者显着降低急进高原人的作业能力,影响日常工作,重者可以发展成为高致死率的高原脑水肿（high altitude cerebral edema,HACE）,危及生命安全。因此,AMS已经成为威胁急进高原军民身体健康的主要疾病。HAPC是一种以红细胞过度增生为主要特征的常见慢性高原病,在久居3000-4500 m高原人群中,其发病率为1.21%-24.0%。HAPC对人体具有很大危害性,过度增生的红细胞会引起微循环障碍,造成各器官缺氧损伤;损伤严重者,甚至会发生各脏器血栓栓塞,导致猝死。因此,HAPC高发已经成为严重威胁久居高原军民的重大公共卫生问题。目前对于AMS与HAPC治疗,尚无特异性高、副作用低的治疗药物可用,因此疾病的早期预防具有重要意义。然而,目前对于AMS与HAPC发病风险预测也缺乏特异性强、灵敏性高的生物标志物。究其原因,以往对AMS与HAPC的研究主要集中于生理反应差异、生化代谢改变及病理形态异常等方面,而对其分子生物学机制缺乏系统性探究。因此,从新角度深入研究AMS与HAPC的发病相关分子生物学机制,寻找可能防治靶点及高效的预测标志物,对于维护我国高原军民健康、促进高原地区社会经济和国防事业的发展具有重大的现实意义。近年来,有关microRNA对基因表达调控及其在疾病发病机制中的作用受到广泛关注。microRNA是一类广泛存在于真核细胞中,长度为18-24个核苷酸的内源性小分子非编码RNA。该分子在基因表达调控网络中处于节点位置,通过转录或转录后抑制的方式,调控机体超过30%的编码蛋白质基因。低氧可以引起多种microRNA的表达变化,且许多microRNA参与了缺氧代偿性生理调节与缺氧病理生理学过程。现已发现,microRNA表达异常与冠心病、脑卒中、肝肾缺血损伤、急性呼窘迫症等多种缺氧相关疾病的发生密切相关。这些研究为阐明疾病发病机制和寻找有效的防治靶点提供了全新的思路。然而,microRNA在AMS发病机制中起到什么作用?其是否能作为预测AMS发病风险的高效生物标志物?目前尚缺乏研究。同时,microRNA还参与红系细胞的增殖、分化和成熟,并在真性红细胞增多症、继发性红细胞增多症及骨髓增殖性肿瘤等多种血液疾病的发病中起到重要的作用。然而,microRNA是否参与HAPC这种高原特殊环境中的血液系统疾病的发生发展?目前,也缺乏系统的研究。因此,本文围绕“microRNA在AMS和HAPC中的表达特征及其在疾病发病机制中的作用”这一主题,从下述五部分进行研究。第一部分,采用microRNA表达谱芯片对急性高原低氧暴露后AMS患者和不发病者的血浆标本进行检测,以揭示AMS患者的microRNA表达谱特征。并进一步对AMS发病相关microRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析,以探究这些microRNA所调控的分子生物学过程及信号通路,为AMS发病机制研究提供新的思路。第二部分,以AMS患者体内显着上调的miR-181b-5p为研究分子,分别在小鼠高原脑水肿（high altitude cerebral edema,HACE）模型上对miR-181b-5p的变化进行检测（注:HACE是重症AMS发展而来,目前研究认为二者主要在病情的严重程度不同,而发病机制基本相同,再者由于AMS动物疾病模型的缺乏,故本研究选用HACE模型进行研究）;并进一步在细胞模型上对miR-181b-5p进行分子生物学实验,明确其在AMS炎症相关发病机制中所起的作用,为AMS治疗寻找新的靶点。第三部分,在AMS患者和不发病者平原时（急性低氧暴露前）血浆和唾液标本中进行 microRNA 实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测,为AMS发病风险预测寻找高效生物标志物。第四部分,对HAPC患者和同海拔健康对照的血浆标本进行外泌体RNA-seq检测,以揭示HAPC患者的血浆外泌体microRNA表达谱特征。并进一步对HAPC发病相关microRNA的靶基因进行GO和KEGG富集分析,以探究这些microRNA所调控的分子生物学过程及信号通路,为HAPC发病机制的研究提供新思路。第五部分,在HAPC患者及动物模型的红细胞内对miR-144-3p的变化进行检测;并进一步在红系细胞内针对miR-144-3p设计分子生物学实验,以明确miR-144-3p在HAPC红系细胞功能紊乱相关发病机制中的作用,为HAPC治疗寻找新的作用靶点。研究对象和实验方法一、AMS患者的microRNA表达谱检测（1）研究对象为急性暴露于高原环境中的AMS患者（AMS）和不发病者（Non-AMS）。AMS 诊断根据路易斯湖标准（Lake Louis score system,LLS）进行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标及血浆标本。（3）使用microRNA表达谱芯片对血浆标本进行检测,并对结果进行生物信息学分析。（4）运用qRT-PCR验证microRNA表达谱芯片筛选出的AMS发病相关microRNA。二、AMS发病相关分子miR-181b-5p的生物学功能研究（1）通过生物信息学分析,预测在AMS患者中上调的microRNA——miR-181b-5p的靶基因,了解其所涉及的信号通路。（2）选用8周龄的雄性C57BL/6小鼠,分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在常氧环境中饲养24 h;（Ⅱ）高原脑水肿组,通过低压氧舱（模拟海拔:6000 m）暴露24 h复合尾静脉注射脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（剂量:0.5 mg/kg）复制疾病模型。（3）检测对照组和高原脑水肿组小鼠外周血白细胞中miR-181b-5p、IL-1β、IL-6以及TNF-α表达水平。（4）选用小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞作为细胞实验对象。将RAW264.7细胞分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在21%O2条件下正常培养24 h;（Ⅱ）低氧和LPS复合刺激组,在1%O2和LPS（100 ng/mL）复合刺激条件下培养24小时,以构建细胞炎症模型。（5）使用 miR-181b-5p 模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）、阴性对照（negative control）转染RAW264.7细胞,检测细胞及上清中IL-1β、IL-6以及TNF-α的mRNA表达及蛋白含量变化。（6）采用双荧光素酶报告基因法鉴定“蛋白激酶C-δ（protein kinase C delta,PRKCD）”是否为miR-181b-5p的靶基因。三、平原血浆和唾液microRNA对AMS发病风险预测的研究（1）研究对象为AMS患者（AMS）和不发病者（Non-AMS）。AMS诊断根据LLS诊断标准进行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标。（3）采集AMS组和Non-AMS组的血浆及唾液标本。（4）使用qRT-PCR检测AMS组和Non-AMS组平原血浆和唾液中microRNA表达水平。（5）通过生物信息学分析microRNA生物学功能。（6）采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测AMS组和Non-AMS组急性高原暴露后血浆标本中IL-1β、IL-6以及TNF-α含量。四、HAPC患者microRNA表达谱检测（1）研究对象为HAPC患者和同海拔健康对照。HAPC诊断根据第六届国际高原医学和高原生理学学术会议推荐指南执行。（2）采集研究对象的人口学资料、生理学指标、血常规指标及血浆标本。（3）使用RNA-seq技术对血浆外泌体microRNA进行检测,并对结果进行生物信息学分析。（4）使用qRT-PCR验证筛选出的差异表达microRNA。五、HAPC发病相关分子miR-144-3p的生物学功能研究（1）通过生物信息学分析,预测HAPC患者中上调microRNA——miR-144-3p的靶基因,了解其所涉及的信号通路。（2）检测HAPC患者与健康对照红细胞中miR-144-3p表达水平及氧化物（ROS和MDA）和抗氧化物（SOD和GSH）含量。（3）动物实验研究:选6周龄的雄性SD大鼠,分成2组:（Ⅰ）对照组,在常氧条件下饲养28天;（Ⅱ）HAPC组,在低压氧舱（模拟海拔:5800 m）中持续暴露28天,复制HAPC大鼠模型。（4）检测对照组和HAPC组大鼠红细胞中miR-144-3p表达水平及ROS、MDA、SOD、GSH 含量。（5）选用人红系细胞系K562细胞为细胞实验对象。将K562细胞分成2组:（Ⅰ）正常对照组,在21%O2的培养箱中正常培养6h;（Ⅱ）氧化损伤组,使用含10 μM/mL过氧化氢的培养基,在21%O2的培养箱中培养6小时,构建细胞氧化损伤模型。（6）使用 miR-144-3p 模拟物（mimic）、抑制物（inhibitor）、阴性对照（negative control）转染K562细胞,检测细胞中ROS水平、MDA含量,及抗氧化物SOD1、GCLC、GCLM、CAT、GPX1 及 NQO1 mRNA 表达水平。（7）采用双荧光素酶报告基因法鉴定“核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）”是否为 miR-144-3p 的靶基因。主要结果一、AMS患者的microRNA表达谱特征（1）AMS患者和不发病者的microRNA表达谱存在显着差异microRNA芯片检测,共筛选到93个microRNA在AMS患者与不发病者之间显着差异表达,其中56个血浆microRNA在AMS患者中表达显着上调,37个显着下调（全部 p<0.05）。（2）AMS发病相关microRNA主要涉及低氧适应、能量代谢、血管生成及炎症反应相关信号通路调节AMS发病相关microRNA的功能,主要涉及低氧适应（HIF-1通路）、能量代谢（cAMP通路）、血管生成（VEGF通路）及炎症反应（MAPK、NF-κB、Toll样受体、NOD样受体及TNF等通路）等信号调节。（3）microRNA芯片检测结果可重复性强qRT-PCR 检测结果显示,与 Non-AMS 相较,miR-676-3p、miR-181b-5p、miR-193b-5p和miR-3591-3p在AMS患者血浆中的表达水平显着上调,与microRNA芯片结果趋势一致（全部p<0.01）。（4）miR-676-3p、miR-181b-5p 及 miR-3591-3p 可作 AMS 辅助诊断指标ROC 曲线分析显示,miR-676-3p、miR-181b-5p 及 miR-3591-3p 对 AMS 发病的诊断效能分别为 0.713（95%CI=0.588-0.838,p<0.01）、0.735（95%CI=0.614-0.855,p<0.001）和 0.805（95%CI=0.700-0.911,p<0.001）。二、miR-181b-5p是炎症反应的负调节分子（1）miR-181b-5p涉及炎症反应通路的调节miR-181b-5p的靶基因涉及的信号通路主要为炎症反应相关的信号通路,如:MAPK、NF-κB、NOD样受体、Toll样受体等通路。其中,NF-κB通路中重要基因“蛋白激酶C-δ（protein kinase C delta,PRKCD）”被预测为 miR-181b-5p 的靶基因。（2）miR-181b-5p在小鼠高原脑水肿模型中显着上调表达与对照组相较,小鼠高原脑水肿模型的白细胞中miR-181b-5p、IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平显着上调（全部p<0.05）。该结果提示miR-181b-5p与炎症反应之间的潜在关系。（3）miR-181b-5p可通过抑制PRKCD减轻巨噬细胞炎症反应外源性在RAW264.7细胞中过表达miR-181b-5p,可以显着下调细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达水平,并降低细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量（全部p<0.01）。而外源性在RAW264.7细胞中抑制miR-181b-5p表达后,结果与过表达相反（全部p<0.01）。经双荧光素酶报告基因实验鉴定,PRKCD是miR-181b-5p的靶基因（全部p<0.01）。三、平原血浆和唾液microRNA可作为AMS发病风险预测生物学标志物（1）平原血浆microRNA分子可作为AMS发病风险预测生物学标志物三个平原血浆microRNA 分子（miR-1183、miR-15b-5p及miR-23b-5p）构成的生物标志物组合对AMS发病风险的预测效能可以达到0.872（95%CI=0.836-0.903,p<0.001）。（2）调控抗炎症能力储备可能是血浆microRNA组合生物作用基础GO分析结果显示:miR-1183,miR-15b-5p和miR-23b-5p参与调控免疫系统过程、固有免疫反应、MAPK信号通路、MyD88-Toll样受体信号等经典炎症反应通路调节。相关性分析显示,miR-1183、miR-15b-5p和miR-23b-5p与血浆炎症因子（IL-1β,IL-6和TNF-α）含量显着相关（全部p<0.01）。（3）平原唾液miR-134-3p和miR-15b-5p可预测AMS发病风险平原时唾液miR-134-3p和miR-15b-5p组合对AMS发病风险的预测效能可达到0.811（95%CI=0.731-0.876,p<0.001）。（4）miR-134-3p和miR-15b-5p涉及调控炎症反应GO分析结果显示:miR-134-3p和miR-15b-5p可以共同调控MAPK及Toll样受体信号通路等经典炎症反应通路。四、HAPC患者microRNA表达谱特征（1）HAPC患者和健康对照间的microRNA表达谱存在显着差异RNA-seq检测筛选到44个血浆外泌体microRNA在HAPC患者和同海拔健康对照组间存在显着差异,其中3 3个microRNA在HAPC患者中表达显着上调,11个microRNA表达显着下调（全部p<0.05）。（2）HAPC发病相关microRNA主要的分子生物学功能上述HAPC发病相关microRNA分子涉及鞘脂类、细胞内吞、线粒体自噬、Ras、TNF、MAPK及Hedgehog等多个信号通路的调节。（3）RNA-seq检测结果可重复性强qRT-PCR检测结果显示,与同海拔健康对照相比较,miR-144-3p、miR-210-3p,miR-19b-3p及miR-21-3p在HAPC患者血浆外泌体中的表达水平显着上调（全部p<0.01）。该结果与RNA-seq检测结果趋势一致。五、miR-144-3p是抗氧化损伤通路的负向调节分子（1）miR-144-3p可能涉及抗氧化损伤通路的调节miR-144-3p的靶基因显着富集于HGF受体、NRF2-抗氧化损伤、Sonic Hedgehog及MAPK等信号通路。进一步分析发现“核因子E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）”是 miR-144-3p 的预测靶基因。（2）红细胞miR-144-3p表达上调与其抗氧化能力下降及氧化损伤加重密切相关与对照组相较,在HAPC患者及大鼠模型的红细胞中,miR-144-3p表达水平显着上调（全部p<0.05）。进一步相关性分析发现,红细胞中miR-144-3p与氧化指标ROS和MDA显着正相关（全部p<0.05）,与抗氧化指标SOD和GSH显着负相关（全部p<0.05）。（3）miR-144-3p可能通过抑制NRF2削弱红系细胞抗氧化能力外源性在K562细胞中过表达miR-144-3p,可以显着抑制抗氧化物SOD1、CAT、GCLC、GCLM、GPX1和NQO1mRNA表达水平,加重细胞氧化损伤（全部p<0.01）。而在K562细胞中外源性抑制miR-144-3p表达后,结果与过表达相反（全部p<0.01）。双荧光素酶报告基因实验证实,NRF2是miR-144-3p的靶基因（全部p<0.001）。结论（1）AMS患者和不发病者间的microRNA表达存在显着差异;差异microRNA主要涉及低氧适应、血管新生、能量代谢及炎症免疫等信号通路调节;急性低氧后miR-181b-5p表达不足,导致对NF-κB信号通路重要基因PRKCD抑制减弱,继而加剧外周炎症反应及神经炎症损伤,可能参与AMS发病。（2）平原血浆microRNA 分子（miR-1183、miR-15b-5p和miR-23b-5p）构成的生物标志物组合在可作为汉族青年男性人群AMS发病风险预测的新型生物学标志物;平原唾液miR-134-3p和miR-15b-5p组合可作为汉族青年男性人群AMS发病风险预测的无创生物标志物。（3）HAPC患者和同海拔健康人的microRNA表达存在显着差异;差异microRNA涉及鞘脂类、线粒体自噬、Ras、TNF、MAPK及Hedgehog等多条信号通路的调节;miR-144-3p通过抑制抗氧化损伤信号通路重要调节因子NRF2,继而削弱红系细胞抗氧化物能力,导致红系细胞的氧化损伤加重和功能紊乱,可能参与HAPC的发生发展。
王绅宇[9]（2020）在《分泌可溶性PD1的CAR T细胞增强抗肿瘤效果的研究》文中进行了进一步梳理目的:近年来,靶向CD19的CAR T细胞治疗B细胞肿瘤取得了显着疗效,但复杂的肿瘤微环境会导致肿瘤免疫逃逸。PD1/PDL1信号通路在此过程中起到重要作用,可溶性PD1（sPD1）可以与PDL1结合,减少PD1/PDL1信号对CAR T细胞的免疫抑制作用。本课题旨在探究分泌sPD1的CAR T细胞的抗肿瘤效果,为肿瘤的免疫治疗提供一种新思路。方法:1.制备用于转导T细胞和肿瘤细胞系的慢病毒。2.体外功能实验阶段,用流式细胞仪检测慢病毒载体的转导效率和转导后2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞对肿瘤细胞的杀伤情况,用ELISA检测sPD1的分泌以及IFN-γ,TNF-α和IL-2等细胞因子的表达情况。3.构建NALM6-PDL1小鼠模型,回输2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞,用活体成像技术检测小鼠体内肿瘤负荷,完成体内功能检测。4.利用流式细胞仪检测CAR T细胞活化表型相关分子CD25、CD107a,分化表型相关分子CD62L、CD45RA以及抗凋亡分子Bcl2等表达情况,从不同角度分析2nd-sPD1 CAR-T细胞抗肿瘤的机制。5.利用生物能量分析仪检测CAR T细胞糖酵解及氧化磷酸化水平,从代谢的角度分析2nd-sPD1 CAR T细胞功能。6.利用RNA测序检测2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞的差异性基因表达,用生物信息学手段从转录水平进行分析。结果:1.成功制备2nd-sPD1 CAR T细胞,构建表达CD19和/或PDL1的K562,NALM6,786o肿瘤细胞系。2.2nd CAR T和2nd-sPD1 CAR T细胞分别与表达CD19和/或PDL1的肿瘤细胞系共孵育,结果显示共表达CD19和PDL1的肿瘤细胞会引起2nd-sPD1 CAR T的细胞因子,如IFN-γ,TNF-α和IL-2等分泌水平升高,并且2nd-sPD1 CAR T细胞的抗肿瘤能力增强。3.活体成像结果显示,2nd-sPD1CAR T组的NALM6-PDL1小鼠体内肿瘤负荷程度较低,说明2nd-sPD1 CAR T细胞对于肿瘤的抑制效果更强。4.流式细胞检测结果显示,在与肿瘤细胞共孵育后,受到肿瘤特异性抗原CD19刺激,2nd-sPD1 CAR T细胞活化表型相关的CD25和CD107a水平升高;在单独培养第8天和第15天,2nd-sPD1 CAR T组的CD45RA+CD62L+幼稚T细胞和CD62L+中央记忆性T细胞群体总占比（82.7%,88.8%）大于2nd CAR T组（68.9%,69.4%）,抗凋亡分子Bcl2表达水平也高于2nd CAR T组。5.生物能量分析仪显示,与对照组相比,无论是否有肿瘤抗原刺激,2nd-sPD1 CAR T组细胞糖酵解都维持在较低水平,但与肿瘤细胞共孵育后,氧化磷酸化水平升高。6.RNA-seq结果显示,与对照组相比,2nd-sPD1 CAR T细胞与早期记忆T细胞、非耗竭型T细胞以及幼稚T细胞相关的基因表达水平更高,与糖酵解、细胞凋亡等相关基因表达水平较低。结论:1.2nd-sPD1 CAR T细胞只对共表达CD19和PDL1的肿瘤细胞产生阳性结果,推测是sPD1阻断了肿瘤细胞表面PDL1对CAR T细胞功能的抑制,从而增强对肿瘤细胞的杀伤作用。2.对接种NALM6-PDL1肿瘤细胞的小鼠模型肿瘤控制作用更好,说明了2nd-sPD1 CAR T细胞在体内复杂的情况下也增强对肿瘤细胞的控制。3.单独培养时,2nd-sPD1 CAR T组幼稚T细胞和中央记忆性T细胞比重较大,Bcl2分子表达水平较高,说明2nd-sPD1 CAR T细胞分泌的sPD1对维持细胞的“干”性和抵抗PDL1引起的凋亡有帮助。受到CD19刺激后,2nd-sPD1 CAR T细胞组的CD25和CD107a表达水平较2nd CAR T组更高,说明sPD1对CAR T细胞的预活化强度也有提高作用。4.细胞能量代谢分析中2nd-sPD1 CAR T细胞较低的糖酵解水平与受到肿瘤抗原刺激后较高的氧化磷酸化水平,验证了2nd-sPD1CAR T细胞具有更好的“干”性。5.在转录水平对2nd-sPD1 CAR T细胞的RNA测序结果与细胞功能检测结果相互印证。利用CAR T细胞分泌可溶性PD1为今后肿瘤的免疫治疗研究提供了一种新思路。
曹韪凡[10]（2020）在《靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究》文中研究表明近年来,嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）修饰的T细胞为代表的靶向免疫细胞治疗方案受到广泛关注。该技术通过在T细胞中转染并表达人工CAR,促使T细胞可以特异性靶向结合肿瘤表面抗原。同时,利用人工CAR胞内段结构域提供T细胞活化信号,使其成为具有精准靶向性、并持续维持杀伤活性的新一代细胞治疗技术,在多种肿瘤治疗领域特别是血液系统肿瘤的治疗中表现出良好的治疗效果。目前,大多数关于CAR的研究主要集中在T细胞,然而伴随而来的细胞因子风暴、脱靶效应等副作用已成为限制CAR-T细胞临床应用的重要因素。针对这些副作用或缺陷,促使我们将注意力转移到以自然杀伤（natural killer,NK）细胞与因子诱导杀伤细胞为代表的非特异性免疫细胞的人工CAR的改造研究中。NK细胞属于先天固有免疫系统中的重要组成部分,是机体天然免疫屏障中的主要承担者。NK细胞在肿瘤的免疫治疗中具有特殊优势。首先,NK细胞不受主要组织相容性复合体识别限制,并且无需抗原提呈细胞就可以激活自身免疫应答反应;其次,NK细胞在过继性细胞回输疗法中,体内存活周期短,不会诱发抗移植物宿主反应,相较于T细胞,NK细胞诱发因子风暴反应可控。然而人体肿瘤细胞可以通过多种免疫逃逸机制逃避NK细胞非特异杀伤作用,使得NK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用受到了制约。基于以上因素和前期我们在CAR-CIK细胞研究工作中的基础与策略,本次在NK细胞中引入CAR的修饰改造,引导NK细胞对血液肿瘤细胞靶向杀伤,同时利用CAR胞内段细胞活化信号结构域的表达来增强免疫细胞自身的活性。以B淋巴细胞白血病的特异性靶标CD19为靶点,针对不同来源的NK细胞生物学特点,开展了人工CAR胞内段和跨膜区的改造工作。在胞内段优化过程中,将具有NK细胞活化功能的含有IL-15分子、4-1BB细胞共刺激信号分子、CD3 ζ链胞内区分子、CD8引导链和Kozak序列等胞内段活化结构域相关分子序列进行串联整合,融入到CAR结构中,制备特性化针对NK细胞的人工CAR重组质粒,然后通过病毒载体,在体外进行转导,成功构建出带有靶向识别杀伤功能的人工CAR修饰的NK细胞。同时,优化了 NK细胞体外培养与活化体系,为后续大剂量的细胞制备,开展体外、体内试验以及未来临床试验和应用奠定了基础。在此基础上,为了进一步检验人工CAR修饰细胞的靶向杀伤能力,采用乳酸脱氢酶法、杀伤因子检测和流式细胞检测等多种方法,对构建的CAR-CIK、CAR-NK-92、CAR-NK细胞杀伤效果进行了验证与分析评估。利用药效学,研究分析了我们构建的人工CAR修饰细胞在小鼠急性B淋巴细胞白血病模型中的靶向杀伤作用以及安全性。结果表明,构建的人工CAR修饰细胞具有明显的靶向杀伤能力和可靠的生物安全性。此外,利用单细胞转录组测序技术和基因表达水平以及生物信息学分析,研究脐血NK细胞分别在人工CAR载体转导前后以及增殖过程中基因的表达谱变化。结果显示,以CX3CR1为代表的功能成熟的NK细胞基因高表达,而且具有独特的转录特性,探讨了 NK细胞的发育生物学的分子机制,并针对CD19-CAR-NK细胞技术的临床应用研究进行了再设计与评估。本项研究的创新点在于尝试突破人工CAR细胞方法改造非特异性细胞的技术瓶颈,构建出一套创新优化的CAR-NK制备体系,为拓展人工CAR细胞治疗方案提供技术支撑;改造了 CAR胞内段细胞活化信号分子,以及验证了 CD19-CAR-NK细胞的成药性、有效性以及安全性;这将有利于CAR相关技术在免疫治疗过程中发挥更重要的作用,并为进一步的临床应用研究提供新方法和新思路。主要结果:1.构建了基于CAR-T技术的靶向CD19的CAR-CIK细胞、CAR-NK-92细胞制备体系。2.构建了基于脐血来源的NK细胞靶向CD19的新型CAR-NK细胞技术体系。3.体外实验验证了 CD19-CAR-NK具有显着的靶向细胞杀伤功能,并呈现剂量依赖性特点,特异性杀伤效果明显。4.探索了 CAR-NK细胞最佳NK细胞转导方法,可使用慢病毒载体或逆转录病毒载体对NK细胞进行转导。通过优化的培养体系培养的NK细胞可以获得更好的转导效率。5.利用单细胞测序技术,探讨了脐血NK细胞分别在CAR转导前后以及增殖过程中基因表达谱变化,以CX3CR1为代表的功能成熟NK细胞基因高表达转录特性。6.B淋巴细胞白血病小鼠模型研究结果表明,CD19-CAR-NK细胞在回输后第7天抑瘤率为61%,远高于对照组抑瘤率12%。未产生相关毒性以及致瘤致畸等不良情况,验证了 CD19-CAR-NK细胞具有良好的生物安全性及有效性。
二、乙醇诱导人体外培养K562细胞系凋亡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、乙醇诱导人体外培养K562细胞系凋亡的研究（论文提纲范文）
（1）基于肿瘤铁死亡协同诱导机制的双氢青蒿素联合用药研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词(Abbreviation) |
| 文献综述 铁死亡在抗肿瘤应用中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第一章 DHA抗癌联用药物的筛选 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞冻存 |
| 2.5 细胞生长曲线的测定 |
| 2.6 细胞计数 |
| 2.7 MTT法测定药物对细胞的增殖抑制作用 |
| 2.8 药物协同作用分析 |
| 2.9 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 药物对HepG2细胞增殖抑制的影响 |
| 3.2 DHA与不同药物的联合用药指数分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 铁死亡诱导剂敏感细胞株的初步探究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞复苏，冻存，细胞计数，MTT抑制率实验均与第一章相同 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 MTT法测定DHA以及Sora对不同细胞的增殖抑制作用 |
| 2.5 Sora和DHA诱导癌细胞死亡百分率的相关性分析 |
| 2.6 DFO对DHA及Sora诱导HepG2细胞死亡的抑制作用 |
| 2.7 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA以及Sora对不同细胞的抑制率比较 |
| 3.2 Sora和DHA诱导癌细胞死亡百分率的相关性分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 DHA联合Sora的协同作用机制的探讨 |
| 第一节 DHA联合Sora在体抗移植瘤实验 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 裸鼠移植瘤抑制实验 |
| 2.2 H&E染色 |
| 2.3 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 裸鼠移植瘤抑制实验结果 |
| 3.2 H&E染色 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二节 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞内LIP,L-ROS,MDA以及GSH的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞动态铁池(LIP)检测 |
| 2.2 细胞脂质活性氧(L-ROS)检测 |
| 2.3 细胞脂质过氧化终产物(MDA)检测 |
| 2.4 细胞GSH/GSSH检测 |
| 2.5 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞LIP的影响 |
| 3.2 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞L-ROS的影响 |
| 3.3 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞MDA的影响 |
| 3.4 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞GSH的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三节 DHA与Sora单用及联用对HepG2细胞内抗氧化相关蛋白的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Western Blot实验 |
| 2.2 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA与Sora单用及联用对抗氧化相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 DHA单用及与Sora联用对HepG2细胞能量代谢的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器及试剂 |
| 1.2 药物及溶液配置 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 HepG2细胞糖酵解速率测试 |
| 2.2 HepG2细胞线粒体压力测试 |
| 2.3 统计学分析方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 DHA单用对HepG2细胞糖酵解速率的影响 |
| 3.2 DHA与Sora联用对HepG2细胞糖酵解速率的影响 |
| 3.3 DHA单用对HepG2细胞线粒体氧化磷酸化的影响 |
| 3.4 DHA与Sora联用对HepG2细胞线粒体氧化磷酸化的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胸腺肽的研究进展 |
| 1.1.1 胸腺肽概述 |
| 1.1.2 胸腺肽作用研究 |
| 1.2 免疫系统的研究进展 |
| 1.2.1 免疫系统的组成 |
| 1.2.2 免疫系统的功能 |
| 1.2.3 免疫系统影响因素 |
| 1.2.4 免疫系统与肿瘤发生发展的关系 |
| 1.2.5 造血与免疫系统 |
| 1.3 免疫治疗在结直肠癌治疗中的研究进展 |
| 1.3.1 肿瘤免疫治疗 |
| 1.3.2 免疫治疗在结直肠癌治疗中的应用 |
| 1.4 化疗引起的造血功能障碍研究进展 |
| 1.5 立题背景及意义 |
| 第2章 小牛胸腺肽成分分析研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 CTP分子量测定 |
| 2.3.2 CTP中氨基酸含量的测定 |
| 2.3.3 CTP中核苷酸含量的测定 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 分子量测定结果 |
| 2.4.2 氨基酸含量测定结果 |
| 2.4.3 核苷酸含量测定结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 试剂盒和抗体信息 |
| 3.2.4 实验细胞及动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫低下小鼠模型的构建及分组给药 |
| 3.3.2 小鼠样品采集及脏器指数检测 |
| 3.3.3 NK细胞杀伤活性及淋巴细胞转化活性 |
| 3.3.4 小鼠肝脏、脾脏、肾脏病理学检测 |
| 3.3.5 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.6 APC小鼠分组给药 |
| 3.3.7 小鼠样品采集及脏器指数、肠道指数检测 |
| 3.3.8 小鼠外周血有核细胞制备、染色及流式测定 |
| 3.3.9 小鼠肠道菌群检测及分析 |
| 3.3.10 小鼠结直肠及脏器组织病理学检查 |
| 3.3.11 小鼠脾脏和肿瘤组织中相关蛋白免疫组化检测 |
| 3.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 3.3.13 Western blot分析 |
| 3.3.14 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CTP对免疫低下小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.2 CTP对免疫低下小鼠NK细胞杀伤活性的影响 |
| 3.4.3 CTP对免疫低下小鼠淋巴细胞转化活性的影响 |
| 3.4.4 CTP对免疫低下小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.5 CTP对免疫低下小鼠免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.6 CTP对 APC小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 3.4.7 CTP对 APC小鼠结直肠肿瘤和肠道指数的影响 |
| 3.4.8 CTP对 APC小鼠肿瘤组织病理学的影响 |
| 3.4.9 CTP对 APC小鼠脏器组织病理学的影响 |
| 3.4.10 CTP对 APC小鼠外周血中免疫细胞的影响 |
| 3.4.11 CTP对 APC小鼠脾脏和结直肠肿瘤中免疫相关蛋白的影响 |
| 3.4.12 CTP对 APC小鼠血清和结肠中免疫相关细胞因子的影响 |
| 3.4.13 CTP对 APC小鼠肠道菌群物种组成的影响 |
| 3.4.14 小鼠肠道菌群Alpha多样性分析 |
| 3.4.15 小鼠肠道菌群Beta多样性分析 |
| 3.4.16 小鼠肠道菌群差异性分析 |
| 3.4.17 CTP对 APC小鼠肿瘤组织和脾脏中相关蛋白表达的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小牛胸腺肽促造血功能活性的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 试剂盒及抗体信息 |
| 4.2.4 实验细胞及动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 K562 细胞和CHRF细胞的铺板及CTP给药 |
| 4.3.2 细胞活性检测 |
| 4.3.3 细胞凋亡检测 |
| 4.3.4 K562 细胞联苯胺染色 |
| 4.3.5 Western blot分析 |
| 4.3.6 造血功能障碍小鼠模型的构建及CTP给药 |
| 4.3.7 样品采集及脏器指数检测 |
| 4.3.8 外周血细胞计数 |
| 4.3.9 小鼠骨髓有核细胞制备,染色及流式细胞术测定 |
| 4.3.10 小鼠骨髓及脏器组织病理学检测 |
| 4.3.11 蛋白质组学分析筛选细胞因子 |
| 4.3.12 小鼠生化指标测定 |
| 4.3.13 Western blot分析 |
| 4.3.14 小鼠骨髓有核细胞制备及给药 |
| 4.3.15 Western blot分析 |
| 4.3.16 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞活性的影响 |
| 4.4.2 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞凋亡的影响 |
| 4.4.3 CTP对K562 细胞分化能力的影响 |
| 4.4.4 CTP对 K562 细胞和CHRF细胞增殖分化相关蛋白的影响 |
| 4.4.5 CTP对造血功能障碍小鼠体重和脏器指数的影响 |
| 4.4.6 CTP对造血功能障碍小鼠外周血细胞的影响 |
| 4.4.7 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓细胞的影响 |
| 4.4.8 CTP对造血功能障碍小鼠骨髓和脏器组织病理学的影响 |
| 4.4.9 CTP对造血功能障碍小鼠细胞因子的影响 |
| 4.4.10 CTP对造血功能障碍小鼠脾脏中相关通路蛋白的影响 |
| 4.4.11 CTP对小鼠原代骨髓细胞中相关通路蛋白的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 结论和展望 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简介及在攻读博士学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（3）Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 Skp-2 在恶性肿瘤发生机制中的作用 |
| 参考文献 |
（4）ATPR通过调控RARα/LDHB/ERK分子轴诱导急性髓系白血病细胞分化及机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验细胞 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 临床样本收集 |
| 2.4 药品与试剂 |
| 2.5 仪器与设备 |
| 2.6 分析软件 |
| 2.7 主要溶液配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 LDHB基因慢病毒转染 |
| 3.3 LDHB基因过表达质粒转染 |
| 3.4 Western blotting |
| 3.5 荧光定量Real-time PCR (qRT-PCR) |
| 3.6 CCK-8检测细胞生存率 |
| 3.7 蛋白质组学 |
| 3.8 细胞周期检测 |
| 3.9 KI67染色 |
| 3.10 硝基四氮唑蓝(NBT)还原试验 |
| 3.11 瑞氏-吉姆萨染色 |
| 3.12 粒细胞表面分化抗原CD11b和CD14阳性细胞检测 |
| 3.13 NCG小鼠皮下白血病移植瘤模型建立 |
| 3.14 NOD/SCID小鼠白血病腹水移植瘤模型建立 |
| 3.15 组织病理学 |
| 3.16 统计学分析 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 ATPR对AML细胞系生长活力的影响 |
| 4.2 ATPR对NB4和MOLM-13细胞生长活力的影响 |
| 4.3 ATPR对NB4和MOLM-13细胞中维甲酸受体的影响 |
| 4.4 RARα受体拮抗剂(Ro41-5253)对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞分化的影响 |
| 4.5 Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞周期的影响 |
| 4.6 Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞分化相关蛋白(PU.1)及周期相关蛋白(Cyclin A2,CDK4和Cyclin D3)的影响 |
| 4.7 糖酵解抑制剂(2-DG)对AML细胞系生长活力的影响 |
| 4.8 ATPR对NB4细胞作用的蛋白质组学结果 |
| 4.9 通过TCGA数据库分析LDHB基因在AML中的表达情况 |
| 4.10 LDHB基因在正常人和急性髓系白血病病人外周血及骨髓血中的表达变化 |
| 4.11 LDHB基因在不同急性髓细胞血病细胞系(HL-60、NB4、KG-1和MOLM-13)中的表达变化 |
| 4.12 ATPR在NB4和MOLM-13细胞中对LDHB基因表达的影响 |
| 4.13 Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞中LDHB基因表达的影响 |
| 4.14 慢病毒沉默LDHB基因对NB4和MOLM-13细胞增殖的影响 |
| 4.15 慢病毒沉默LDHB基因对NB4和MOLM-13细胞分化的影响 |
| 4.16 慢病毒沉默LDHB基因对NB4和MOLM-13细胞移植瘤小鼠实体肿瘤生长的影响 |
| 4.17 慢病毒沉默LDHB基因对NB4和MOLM-13细胞移植瘤小鼠实体瘤增殖蛋白(KI67)和分化蛋白(CD11b)的影响 |
| 4.18 过表达LDHB基因对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞增殖的影响 |
| 4.19 过表达LDHB基因对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞分化的影响 |
| 4.20 ATPR对NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路的影响 |
| 4.21 Ro41-5253对ATPR作用下NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路的影响 |
| 4.22 慢病毒沉默LDHB基因对NB4和MOLM-13细胞中Raf/MEK/ERK信号通路的影响 |
| 4.23 Western blotting检测加入MEK抑制剂PD98059对ATPR诱导的NB4和MOLM-13细胞分化相关蛋白(PU.1)和细胞周期相关蛋白(Cyclin A2、Cyclin D3和CDK4)的影响 |
| 4.24 体内建立NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型 |
| 4.25 ATPR对NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型体重的影响 |
| 4.26 ATPR对NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型生存期的影响 |
| 4.27 ATPR对NOD/SCID小鼠NB4细胞腹水移植瘤模型主要组织病理学的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 个人简介 |
| 致谢 |
| 综述 糖酵解途径在急性髓系白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
（5）ETV6通过Raf/MEK/ERK通路调控K562细胞红系分化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 ETV6在CML患者中的表达及与红系分化相关性分析 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 CML临床样本及细胞系 |
| 1.2 主要试剂及仪器 |
| 1.3 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 从CML患者骨髓液中提取单个核细胞 |
| 2.2 单个核细胞总RNA的提取 |
| 2.3 反转录反应(RT-PCR) |
| 2.4 实时荧光定量PCR反应(q RT-PCR) |
| 2.5 hemin诱导K562 红系分化 |
| 2.6 联苯胺染色法检测细胞红系分化阳性率 |
| 2.7 Western blot检测ETV6 表达水平 |
| 2.8 数据处理与统计学分析 |
| 结果 |
| 1.ETV6在CML初发患者样本中表达升高,CR后表达降低 |
| 2.K562 红系分化阳性率随hemin诱导时间延长而逐渐升高 |
| 3.hemin诱导K562 细胞后ETV6 表达降低且与红系分化阳性率负相关 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 ETV6 敲降对hemin诱导的K562 红系分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株及培养条件 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 siRNA |
| 2.实验方法 |
| 2.1 K562 细胞瞬时转染si-ETV6 敲降ETV6 |
| 2.2 瞬时转染si-ETV6 同时使用hemin诱导K562 细胞 |
| 2.3 联苯胺染色法检测K562 红系分化阳性率 |
| 2.4 q RT-PCR检测K562 红系分化相关分子表达水平 |
| 2.5 流式细胞术检测K562 表面红系分子的表达 |
| 2.6 CCK-8 法检测K562 细胞增殖能力 |
| 2.7 数据处理与统计学分析 |
| 结果 |
| 1.siRNA敲降K562 细胞中ETV6 的表达 |
| 2.ETV6 敲降增加K562 红系分化阳性率 |
| 3.ETV6 敲降使K562 中红系分化相关分子表达升高 |
| 4.ETV6 敲降使K562 表面红系分子CD235a与 CD71 表达升高 |
| 5.ETV6 敲降抑制K562 细胞增殖 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 ETV6 过表达对hemin诱导的K562 红系分化的影响 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株及培养条件 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 PCDH-ETV6 重组表达载体 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 K562 中瞬时转染PCDH-ETV6 过表达ETV6 |
| 2.2 瞬时转染PCDH-ETV6 同时使用hemin诱导K562 细胞 |
| 2.3 联苯胺染色法检测K562 红系分化阳性率 |
| 2.4 qRT-PCR检测K562 红系分化相关分子表达水平 |
| 2.5 流式细胞术检测K562 表面红系分子的表达 |
| 2.6 CCK-8 法检测K562 细胞增殖能力 |
| 2.7 数据处理与统计学分析 |
| 结果 |
| 1.PCDH-ETV6 重组质粒使K562 细胞中ETV6 表达升高 |
| 2.ETV6 过表达后K562 红系分化阳性率降低 |
| 3.ETV6 过表达使K562 中红系分化相关分子表达降低 |
| 4.ETV6 过表达抑制K562 表面红系分子CD235a与 CD71 表达 |
| 5.ETV6 过表达促进K562 细胞增殖 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 ETV6 通过Raf/MEK/ERK通路调控K562 红系分化 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株及培养条件 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 Western blot检测ETV6 敲降对ERK通路分子的影响 |
| 2.2 Western blot检测ETV6 过表达对ERK通路分子的影响 |
| 2.3 PD98059 处理对ETV6 敲降K562中ERK通路分子的影响 |
| 2.4 联苯胺染色法检测PD98059 处理的K562 红系分化率 |
| 2.5 qRT-PCR分析PD98059 处理的K562 中红系分化相关分子表达变化 |
| 2.6 数据处理与统计学分析 |
| 结果 |
| 1.ETV6 敲降激活K562 细胞中Raf/MEK/ERK通路活性 |
| 2.ETV6 过表达抑制K562 细胞中Raf/MEK/ERK通路活性 |
| 3.PD98059 抑制Raf/MEK/ERK通路活性 |
| 4.经PD98059 处理后K562 红系分化阳性率降低 |
| 5.经PD98059 处理后K562 中红系分化相关分子表达降低 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 ETV6 在血液系统恶性肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）miR-429靶向CRKL通过ERK通路调控K562细胞红系分化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 miR-429和CRKL在CML患者样本中表达及CRKL相关红系分化分子筛选 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 临床血液样本 |
| 1.2 细胞系 |
| 1.3 主要仪器及试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 临床样本单核细胞总RNA的提取 |
| 2.2 实时荧光定量反应(qRT-PCR) |
| 2.3 CRKL相关红系分化基因筛选 |
| 2.4 数据处理及统计学分析 |
| 结果 |
| 1.miR-429在CML样本中低表达 |
| 2.CRKL在CML样本中高表达 |
| 3.CML样本中miR-429与CRKL表达负相关 |
| 4.CRKL低表达K562中差异表达红系分化基因 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-429和CRKL对K562红系分化的影响 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 PCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-CRKL重组表达载体 |
| 1.3 主要仪器和试剂 |
| 1.4 试剂配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 Hemin诱导K562细胞红系分化及检测 |
| 2.2 瞬时转染miR-NC/429inhibitor和PCDH/PCDH-CRKL质粒 |
| 2.3 qRT-PCR法检测miR-429及红系分子的表达 |
| 2.4 WB法检测CRKL的表达 |
| 2.5 miR-429和CRKL对Hemin诱导K562增殖的影响 |
| 2.6 流式细胞术检测miR-429高表达对Hemin诱导K562红系分子表达影响 |
| 2.7 数据处理及统计学分析 |
| 结果 |
| 1.Hemin诱导K562细胞红系分化 |
| 2.Hemin诱导K562红系分化后miR-429和CRKL的水平变化 |
| 3.miR-429低表达抑制Hemin诱导K562红系分化 |
| 4.CRKL高表达抑制Hemin诱导K562红系分化 |
| 5.miR-429和CRKL水平变化对K562增殖的影响 |
| 6.miR-429高表达促进K562红系分子CD235a与CD71表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 miR-429靶向CRKL通过ERK通路调控K562红系分化 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞系 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 miR-429表达对ERK通路蛋白分子表达影响 |
| 2.2 CRKL高表达对ERK通路蛋白分子表达影响 |
| 2.3 PD98059对miR-429高表达和CRKL低表K562细胞中ERK和p-ERK表达的影响 |
| 2.4 PD98059处理K562细胞后红系阳性率检测 |
| 2.5 qRT-PCR法检测PD98059处理K562后红系分子表达 |
| 结果 |
| 1.miR-429表达对CRKL及ERK通路分子表达影响 |
| 2.CRKL高表达对CRKL及ERK通路分子表达的影响 |
| 3.ERK通路抑制对miR-429调控K562红系分化影响 |
| 4.ERK通路抑制对CRKL调控K562细胞红系分化的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 microRNAs与红系分化 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 TGF-β信号通路概述 |
| 1.2 TGF-β信号通路在白血病中的研究现状介绍 |
| 1.3 ABL1蛋白激酶研究进展 |
| 1.4 总结 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验方法与步骤 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ABL1激酶抑制TGF-β信号通路 |
| 3.2 ABL1激酶抑制剂Gleevec回复CML细胞中TGF-β信号通路活性 |
| 3.3 ABL1激酶磷酸化Smad4及其位点解析 |
| 3.4 Smad4磷酸化介导了ABL1激酶对TGF-β信号通路的抑制 |
| 3.5 ABL1激酶抑制TGF-β信号通路的分子机制研究 |
| 3.6 ABL1激酶磷酸化Smad4促进CML白血病细胞生长 |
| 3.7 ABL1激酶磷酸化Smad4抑制TGF-β信号通路的工作模型 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 急性高山病患者microRNA表达谱特征及miR-181b-5p在其发病中的作用研究 |
| 2.1 研究对象与材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 研究不足与未来展望 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 平原血浆和唾液microRNA对急性高山病发病风险的预测作用研究 |
| 3.1 研究对象与实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 研究不足和未来展望 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 高原红细胞增多症患者的microRNA表达谱特征及miR-144-3p在其发病中的作用研究 |
| 4.1 研究对象与材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 研究不足和未来展望 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 microRNA对缺氧神经损害的保护作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）分泌可溶性PD1的CAR T细胞增强抗肿瘤效果的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 慢病毒载体构建与CAR T细胞制备 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 2nd-sPD1 CAR慢病毒载体的构建 |
| 1.3.2 2nd-sPD1 CAR对 T细胞的转导效率 |
| 1.3.3 2nd-sPD1 CAR T细胞sPD1 的表达 |
| 1.3.4 不同肿瘤细胞系的构建 |
| 1.4 讨论 |
| 第二章 2nd-sPD1 CAR T细胞体外功能实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 2nd-sPD1 CAR T细胞对肿瘤细胞系的杀伤实验 |
| 2.3.2 2nd-sPD1 CAR-T的细胞因子表达 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 2nd-sPD1 CAR T细胞体内功能实验 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 动物模型中2nd-sPD1 CAR-T抗肿瘤功能验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 2nd-sPD1 CAR T细胞抗肿瘤效果增强的探究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 2nd-sPD1 CAR T细胞活化表型检测 |
| 4.3.2 2nd-sPD1 CAR T细胞分化表型检测 |
| 4.3.3 2nd-sPD1 CAR T细胞凋亡及耗竭相关表型检测 |
| 4.3.4 2nd-sPD1 CAR T细胞代谢情况检测 |
| 4.3.5 CAR T细胞的转录水平分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（10）靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CAR-T的抗肿瘤研究和构建策略 |
| 1.2 人工CAR的结构 |
| 1.2.1 胞外抗原结合区 |
| 1.2.2 胞内细胞信号传导区与跨膜链接区 |
| 1.2.3 CAR-T的抗肿瘤机制及进展 |
| 1.3 CAR-T技术研究和临床应用的瓶颈 |
| 1.3.1 细胞因子风暴 |
| 1.3.2 脱靶效应 |
| 1.3.3 实体瘤应用瓶颈 |
| 1.3.4 转染载体的缺陷 |
| 1.3.5 移植物抗宿主反应与免疫细胞活性维持 |
| 1.3.6 免疫抑制作用 |
| 1.3.7 CAR-T细胞来源的限制 |
| 1.4 NK细胞为代表的非特异性免疫细胞研究 |
| 1.4.1 NK细胞的生物学特性研究 |
| 1.4.2 NK细胞对肿瘤的杀伤机理 |
| 1.5 NK细胞在治疗中的研究进展 |
| 1.5.1 针对血液肿瘤的NK细胞过继性免疫治疗研究 |
| 1.5.2 针对实体瘤的NK细胞相关免疫研究 |
| 1.6 人工CAR修饰的NK细胞构建与研究进展 |
| 1.6.1 CAR-NK分子靶点 |
| 1.6.2 CAR改造NK细胞的临床应用 |
| 1.7 CAR-NK相关的细胞因子介导的内源性NK细胞活化 |
| 1.8 非特异性免疫细胞的选择 |
| 1.8.1 CIK细胞的生物学特性和抗瘤特点研究 |
| 1.8.2 NK细胞来源与筛选 |
| 1.9 特异性分子靶点的研究与选择 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 CIK细胞人工CAR改造研究 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株与质粒 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 |
| 2.1.3 主要实验试剂及耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血单个核细胞的分离和培养 |
| 2.2.2 CAR-T细胞与CAR-CIK细胞的体外制备和体外扩增培养 |
| 2.2.3 CAR表达载体的构建及转化 |
| 2.2.4 病毒转导与检测 |
| 2.2.5 CAR-T细胞体外扩增 |
| 2.2.6 CAR-CIK细胞体外扩增 |
| 2.2.7 细胞计数及细胞形态增殖情况观察 |
| 2.2.8 CAR-CIK和CAR-T细胞免疫表型的检测 |
| 2.2.9 CAR-CIK和CAR-T细胞体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 CAR-T细胞和CAR-CIK细胞体外制备和扩大培养 |
| 2.3.2 设计并构建Psb1576-CD19-CAR重组载体 |
| 2.3.3 扩增CD19片段重组质粒构建和慢病毒的制备 |
| 2.3.4 CD19抗原过表达靶细胞稳定株构建 |
| 2.3.5 CD19-CAR在T细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.6 CD19-CAR在CIK细胞中的转导效率和免疫表型 |
| 2.3.7 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 2.3.8 CIK和CAR-T细胞体外靶向细胞杀伤能力分析比较 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 NK细胞系的人工CAR改造研究 |
| 3.1 实验细胞株与材料试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 目的片段的PCR扩增和胶回收 |
| 3.2.3 表达GFP、IL-15和4-1BB基因的重组载体的构建及转化 |
| 3.2.4 病毒转导 |
| 3.2.5 流式细胞技术检测CAR阳性细胞比例以及表型分析 |
| 3.2.6 乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测CAR-NK-92细胞杀伤活性 |
| 3.2.7 细胞因子释放能力检测 |
| 3.2.8 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 CAR-NK-92重组质粒的设计 |
| 3.3.2 CAR-NK-92重组质粒的载体构建 |
| 3.3.3 CAR-NK-92重组质粒的筛选验证与载体包装和滴度测定 |
| 3.3.4 CAR-NK-92细胞的构建与免疫表型检测 |
| 3.3.5 不同浓度条件培养基对NK细胞扩增倍数的影响 |
| 3.3.6 不同浓度的条件培养基对NK细胞扩增以及活化表型的影响 |
| 3.3.7 CD19-CAR-NK-92细胞体外靶向识别杀伤能力检测 |
| 3.3.8 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 脐血来源的NK细胞人工CAR改造研究 |
| 4.1 实验用细胞材料及试剂配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 脐血单个核细胞分离方法 |
| 4.2.2 脐血NK细胞分离方法 |
| 4.2.3 脐血NK细胞体外扩增培养 |
| 4.2.4 CAR表达载体的改造 |
| 4.2.5 针对NK细胞改良的CD19-CAR载体转导 |
| 4.2.6 CAR-NK细胞体外优化培养 |
| 4.2.7 脐血CAR-NK细胞免疫表型及重要功能性分子表达检测 |
| 4.2.8 脐血CAR-NK细胞对靶细胞的细胞毒作用检测 |
| 4.2.9 细胞因子释放能力检测 |
| 4.2.10 体内动物实验 |
| 4.2.11 过氧化物酶染色法 |
| 4.2.12 细胞总RNA提取与qRT-PCR检测基因表达水平 |
| 4.2.13 免疫印迹实验 |
| 4.2.14 细胞单基因测序与生信分析 |
| 4.2.15 临床研究试验前期方案设计 |
| 4.2.16 统计学数据处理分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CAR-NK重组质粒的构建 |
| 4.3.2 脐血来源的NK细胞筛选与扩增培养 |
| 4.3.3 重组CD19-CAR载体的转导及转导效率检测 |
| 4.3.4 CD19-CAR-NK细胞分子表达 |
| 4.3.5 NK细胞对靶细胞杀伤作用的测定 |
| 4.3.6 杀伤后细胞因子释放能力检测 |
| 4.3.7 CD19-CAR-NK细胞的动物体内药效检测 |
| 4.3.8 CD19-CAR-NK细胞的动物体内安全性检测 |
| 4.3.9 CD19-CAR-NK细胞的动物模型中药代动力学 |
| 4.3.10 CD19-CAR-NK细胞的高通量测序分析 |
| 4.3.11 CD19-CAR-NK细胞的基因功能分类分析 |
| 4.3.12 CD19-CAR-NK细胞的细胞生物学调控 |
| 4.3.13 临床试验样本病理学分析 |
| 4.3.14 CD19-CAR-NK细胞临床预实验研究 |
| 4.3.15 CD19-CAR-NK细胞临床研究前患者样本分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 非特异性免疫细胞人工CAR的构建及细胞生物学研究 |
| 5.2 体外非特异性细胞扩增活化体系的优化 |
| 5.3 非特异性免疫细胞的选择与理论依据 |
| 5.3.1 CIK细胞方案 |
| 5.3.2 NK-92细胞方案 |
| 5.3.3 脐血NK细胞方案 |
| 5.4 CAR-NK的体内药效和基因表达谱分析 |
| 5.5 超越CAR-T的新型CAR-NK的优势与发展 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
| 博士学位论文修改情况确认表 |
四、乙醇诱导人体外培养K562细胞系凋亡的研究（论文参考文献）
- [1]基于肿瘤铁死亡协同诱导机制的双氢青蒿素联合用药研究[D]. 崔钊. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]基于免疫调节的小牛胸腺肽抗结直肠癌活性及促造血功能的研究[D]. 李兰洲. 吉林大学, 2021(01)
- [3]Skp2对慢性髓细胞白血病细胞增殖及其对伊马替尼敏感调控机制的研究[D]. 陈晓文. 安徽医科大学, 2021(01)
- [4]ATPR通过调控RARα/LDHB/ERK分子轴诱导急性髓系白血病细胞分化及机制研究[D]. 杜妍. 安徽医科大学, 2021
- [5]ETV6通过Raf/MEK/ERK通路调控K562细胞红系分化[D]. 李朝蓬. 大连医科大学, 2021(01)
- [6]miR-429靶向CRKL通过ERK通路调控K562细胞红系分化[D]. 吕鑫鑫. 大连医科大学, 2021(01)
- [7]慢性髓细胞白血病中ABL1激酶通过磷酸化抑癌因子Smad4以抑制TGF-β信号通路的研究[D]. 王丽静. 浙江大学, 2021(01)
- [8]急性高山病和高原红细胞增多症的microRNA表达特征及其病理生理学意义研究[D]. 黄河. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
- [9]分泌可溶性PD1的CAR T细胞增强抗肿瘤效果的研究[D]. 王绅宇. 军事科学院, 2020(02)
- [10]靶向CD19抗原的新型嵌合抗原受体NK细胞的优化构建和功能研究[D]. 曹韪凡. 东北林业大学, 2020