一、FGF和VEGF在血管生成中的作用（论文文献综述）
令狐熙涛[1]（2021）在《菊苣酸作用BM-EPCs抑制血管生成的体外实验研究》文中研究表明目的:探索菊苣酸在低氧环境中对人BM-EPCs表达HIF-1α和分泌VEGF的影响及血管生成的作用和机制,为菊苣酸抑制肿瘤新生血管形成提供前期体外实验依据。方法:（1）通过密度梯度离心法分离人BM-EPCs并传代扩增。（2）用不同浓度Co Cl2溶液进行低氧诱导,通过CCK-8法检测BM-EPCs的细胞活力,然后通过酶联免疫吸附实验及Western blot检测VEGF的分泌和HIF-1α的表达,观察在低氧环境中BM-EPCs的细胞活力及血管内皮生长因子分泌情况。（3）在不同浓度菊苣酸溶液作用下,通过CCK-8法检测菊苣酸溶液对BM-EPCs活力的影响,然后通过ELISA实验检测菊苣酸溶液对BM-EPCs分泌VEGF的影响,最后分别采用血管生成实验和黏附实验检测菊苣酸溶液对BM-EPCs血管生成能力与黏附能力的影响。（4）在低氧条件下用菊苣酸溶液处理BM-EPCs,然后通过Western blot分析菊苣酸溶液对血管生成相关信号通路分子HIF-1α、AHR及AKT/e NOS等表达的影响。结果:（1）ELISA结果提示低氧可促进BM-EPCs分泌VEGF,且分泌量随Co Cl2溶液浓度增加而增加,Co Cl2溶液浓度在100、150、200μM时差异较对照组具有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果显示在Co Cl2溶液作用下HIF-1α表达较对照组明显增高,在150μM时HIF-1α表达量最高。（2）CCK-8结果显示BM-EPCs的细胞活力随菊苣酸溶液浓度增加而逐渐下降。2.5、5μM的菊苣酸溶液对细胞活力影响较小,较对照组无统计学意义（P>0.05）;10、20与40μM的菊苣酸溶液可显着抑制细胞的活力,较对照组有统计学意义（P<0.05）,以40μM菊苣酸溶液抑制作用最显着（P<0.01）。（3）血管生成实验显示在低氧环境中,BM-EPCs的血管生成能力明显增强,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;加入5、10μM菊苣酸溶液后,BM-EPCs的血管生成能力被抑制,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。细胞黏附实验显示在低氧环境中,BM-EPCs的黏附能力明显增强,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;5、10μM菊苣酸溶液能抑制低氧条件下BM-EPCs的黏附能力,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）ELISA结果提示低氧可促进BM-EPCs分泌VEGF。5、10μM菊苣酸溶液可抑制低氧环境中BM-EPCs分泌VEGF,与对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）Western blot结果表明菊苣酸溶液可抑制HIF-1α的表达,较对照组和低氧组明显下调;同时激活AHR的表达,较对照组和低氧组明显上调。Western blot结果还显示AKT/e NOS总表达量较对照组和低氧组未见明显变化,但AKT/e NOS磷酸化的相对表达量较对照组和低氧组明显下调,且下调作用随菊苣酸溶液浓度增加而增强。结论:（1）菊苣酸溶液能抑制低氧环境中BM-EPCs表达HIF-1α和分泌VEGF。（2）菊苣酸溶液能抑制低氧环境中BM-EPCs的细胞活力、黏附能力和血管生成能力。（3）菊苣酸溶液可抑制低氧环境中BM-EPCs的AKT/e NOS磷酸化表达水平。
呼啸[2]（2021）在《VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究》文中认为羊绒制成的纺织品轻薄柔软,保温效果极佳,加之羊绒产量较少,所以具有极高的经济价值。内蒙古绒山羊阿尔巴斯型主要分布于内蒙古西北部地区,该品种繁殖率高,体型较大,所产羊绒纤维纤细,能够满足高端纺织品对原材料的各项要求。但因羊绒具有细而短的特点,纤维间的抱合力和摩擦力均小,易产生起球现象,增加羊绒纤维的长度能够有效解决这一问题。血管内皮细胞生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）能够通过诱导血管形成而促进绒毛生长,成纤维细胞生长因子5（Fibroblast Growth Factor 5,FGF5）可以通过调节毛囊生长周期而影响羊绒纤维长度,二者对毛发生长分别具有正向和负向调控的作用,本研究以VEGF在FGF5位点定点整合绒山羊为动物模型,研究基因编辑对绒山羊表型的影响,并通过多种高通量测序技术结合分子生物学手段来探究VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的作用机制,发掘下游功能基因和核心作用分子,同时为高产优质绒山羊新品种的培育提供理论依据。一、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测1、基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定首先通过PCR和Southern Blot在DNA水平对VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的基因整合情况进行鉴定,结果出现序列和长度正确的特异性条带,证明VEGF在FGF5位点实现整合;通过real-time PCR检测基因表达量,该基因编辑绒山羊皮肤组织中VEGF和FGF5分别是对照组的1.63倍和0.41倍,结果与Western Blot一致,表明VEGF在高表达的同时降低了FGF5的表达量;此外,从脱靶分析和健康状况方面对基因编辑绒山羊的安全性进行检测,结果表明该基因编辑绒山羊没有发生脱靶且健康状况良好。2、基因编辑绒山羊产绒性能检测从宏观和微观两方面对基因编辑绒山羊的产绒性能进行检测。宏观方面,该绒山羊表现出了多部位羊绒成簇聚集生长的表型,与对照相比产绒量提高31.5%,绒纤维长度增加35%,且并没有影响绒纤维的细度和强度;微观方面,我们通过石蜡切片及HE染色发现该绒山羊皮肤组织中次级毛囊的数量与对照相比增加19%,次级毛囊平均直径增加48.3%。表明该绒山羊具有良好的产绒性能,可以作为动物模型用于研究VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的作用机制,并可作为高产优质绒山羊培育的育种材料。二、VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析1、转录组学研究以基因编辑绒山羊为实验组,以未经基因编辑的体细胞核移植绒山羊和经自然交配产生的野生型绒山羊共同作为对照组,通过转录组测序研究皮肤组织在m RNA水平的差异。按照|log2FC|≥0.848、p-adjust<0.05为标准,共筛选到差异基因1,246个,其中上调基因843个,下调基因403个。对差异基因参与的生物学功能进行分析,发现其主要富集到生长因子结合、PI3K-AKT信号通路和细胞外基质（Extracellular Matrix,ECM）受体互作中,且PI3K-AKT信号通路与VEGF信号通路有交汇,共同作用于花生四烯酸代谢。2、TMT（Tandem Mass Tags）蛋白质组学研究通过TMT标记,对绒山羊皮肤组织中的蛋白质进行研究,以上调差异倍数1.2、下调差异倍数0.83、p-adjust<0.05为标准,共筛选得到差异蛋白178个,其中上调蛋白108个,下调蛋白70个。在GO富集中,差异蛋白主要富集到花生四烯酸代谢过程、内质网腔和铁离子结合;在KEGG富集中,差异蛋白主要富集在其他多糖降解、类固醇生物合成、花生四烯酸代谢。且差异蛋白在花生四烯酸代谢中的富集呈现出高表达蛋白多而分散、低表达蛋白少而集中的特点。3、LC-MS非靶向代谢组学研究通过非靶向代谢组学分析绒山羊皮肤组织中代谢物的种类和含量,共筛选到122个已被命名的差异代谢物,其中阳离子73个,阴离子49个。在KEGG富集中,差异代谢物主要富集到亚油酸代谢、花生四烯酸代谢和甲状腺素合成中,且代谢物在花生四烯酸代谢中富集的位置与蛋白质组一致。此前研究表明,VEGF表达量的升高和FGF5的降低均能提高p-AKT的表达,证明PI3K-AKT信号通路被激活。结合本研究中高通量测序结果,表明VEGF的高表达与FGF5的敲除共同激活PI3K-AKT信号通路,进而影响花生四烯酸的代谢进程,最终对绒山羊的绒毛生长产生影响。三、VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长的研究以GFFs为实验材料,通过添加PI3K-AKT信号通路激活剂740 Y-P和抑制剂NU7441,分析二者对GFFs细胞增殖、凋亡和周期方面的影响,并通过real-time PCR和Western Blot对PI3K-AKT信号通路中的核心蛋白AKT及其磷酸化形式p-AKT和花生四烯酸代谢通路中的PLA2G4D、PTGS2、CYP2B和EPHX2的表达量进行检测,探究VEGF和FGF5对花生四烯酸代谢通路的影响。结果显示在PI3K-AKT信号通路激活剂740 Y-P处理后的GFFs中,上述基因的表达趋势与VEGF在FGF5位点定点整合基因编辑绒山羊皮肤组织中的趋势一致。表明VEGF和FGF5通过影响PI3K-AKT信号通路的活化状态,进而作用于花生四烯酸代谢,阻碍了花生四烯酸向EETs（Epoxyeicosa trienoic acid）和DHETs（Dihydroxyeicosa trienoic acid）的转化,进而促进绒山羊的绒毛生长。本研究初步阐明了VEGF和FGF5调节绒山羊毛发生长的机制,为培育高产优质绒山羊提供了育种材料,更为下游功能基因和核心作用分子的发掘提供了理论基础。
宫文静[3]（2021）在《ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究》文中提出研究背景在所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均位居首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是肺癌最主要的类型,占全部肺癌的80-85%。NSCLC起病隐匿,多数患者就诊时已处于疾病中晚期。近年来随着手术、化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗等多种治疗手段的发展,NSCLC的预后有了很大改善,但其整体5年生存率仍仅有20%,而复发和转移是NSCLC治疗失败的最主要因素。众所周知,肿瘤的生长和转移依赖新生血管的形成来提供能量及转移路径,因此抗血管生成治疗成为NSCLC整体治疗重要组成部分。目前临床中抗肿瘤血管生成的治疗策略主要包括:针对VEGF/VEGFR通路的大分子单克隆抗体、多靶点小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）类药物和血管内皮抑制素等。但由于肿瘤微环境中促血管生成旁路信号的激活、抗体结合力降低等原因,导致现有的抗血管生成药物的临床获益普遍较为短暂;此外,多靶点抗血管生成药物因其作用机制复杂,毒性反应较重,也在某种程度上限制了其临床应用。因此,探索NSCLC血管生成的分子机制,寻找新的有效治疗靶点,开发更具特异性的高效低毒的抗血管生成药物,是克服肿瘤血行转移、提高临床获益的重要研究方向,对提高NSCLC的治疗水平、改善患者预后具有重要意义。免疫球蛋白样转录子（immunoglobulin-like transcripts,ILTs）,也被称为白细胞免疫球蛋白样受体（leukocyte immunoglobulin-like receptors,LIR or LILR）,或单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体（monocyte/macrophage immunoglobulin-like receptors,MIR）。根据胞内基序的作用不同分别将ILTs（LILRs）分为激活性受体LILRA（白细胞免疫球蛋白样受体亚型A,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily A）和抑制性受体 LILRB（白细胞免疫球蛋白样受体亚型 B,leucocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B）。激活性受体LILRA包括LILRA1-LILRA6这6种受体;而抑制性受体LILRB包括LILRB1-5这5种受体。ILT4又被称为LILRB2、LIR2,单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体10（monocyte/macrophage immunoglobulin-like 10,MIR-10）或 CD85d,是经典的免疫抑制性受体。作为I型跨膜蛋白,ILT4与不同的配体结合,通过胞内3个酪氨酸激酶抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs,ITIMs）传递抑制信号至胞内。ILT4起初发现主要表达于髓系细胞包括树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和血小板。最近研究显示它也表达于活化的CD4+T细胞中。ILT4通过抑制树突状细胞的成熟和抗原提呈、诱导巨噬细胞和髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）M2 样极化、抑制中性粒细胞的吞噬功能、促进CD4+Th2分化等方式,诱导免疫抑制的微环境。除免疫细胞外,近年来研究发现ILT4在乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、原发性肝癌和非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤细胞也高表达,通过多种机制促进肿瘤细胞的增殖和侵袭,诱导M2样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）募集及T细胞老化和免疫浸润。课题组前期通过基因芯片发现ILT4可以上调血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGF-A）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9,MMP9）这两种促血管生成因子的表达。VEGF-A是血管内皮细胞强有力的促细胞分裂剂,是调控血管生成的经典因子;MMP9也被证实能够促进血管基底膜的分解,诱导内皮细胞迁移,促进新生血管形成。因此我们推测ILT4可能与调控肿瘤新生血管密切相关。由于目前国内外针对ILT4在肿瘤新生血管形成方面的研究尚属空白,考虑到目前NSCLC抗血管生成治疗的局限性,以及我们课题组前期基因芯片的发现,本研究拟从组织水平、细胞水平以及大数据分析进行一系列研究检测ILT4对NSCLC血管生成的作用,并通过体外和体内干预性研究对可能的分子机制进行进一步的探索。该研究结果可能会为ILT4在NSCLC抗血管生成方面的研究带来新的突破。研究目的1.通过免疫组化、qPCR和Western blot检测NSCLC组织和细胞株中ILT4的表达,结合生存随访和GEO（Gene Expression Omnibus）数据库的生存信息,明确ILT4在NSCLC中的表达及预后意义;2.通过检测NSCLC组织中微血管密度（microvascular density,MVD）以及体外研究通过上调和沉默ILT4表达检测ILT4对血管内皮细胞迁移和小管生成的影响,结合数据库分析,明确ILT4对血管生成的作用;3.通过转染过表达、敲低ILT4,检测ILT4调控的促血管生成因子的变化、信号通路蛋白的变化及应用相应的促血管生成因子中和抗体、信号通路抑制剂进行干预,探究ILT4调控血管生成的分子机制;4.利用ILT4过表达/敲除肺癌细胞系建立裸鼠体内移植瘤模型,进一步体内验证ILT4对血管生成的影响及可能的分子机制。研究方法1.通过qPCR和Western blot方法检测NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞中ILT4表达,明确ILT4在NSCLC细胞和正常支气管上皮细胞表达的差异,并筛选出内源性低表达ILT4的细胞系H1650、A549和内源性高表达ILT4的细胞系H1299、H1975。2.通过免疫组织化学方法检测ILT4在NSCLC组织和癌旁组织表达的差异,分析ILT4的表达与NSCLC临床病理指标的相关性;随访病人的生存状况,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,分析ILT4对NSCLC患者总生存的影响;同时结合Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统,分析ILT4表达对肺癌患者预后的影响。3.应用免疫组化的方法检测NSCLC组织中ILT4表达与肿瘤微血管密度相关蛋白的表达情况,同时结合 GEPIA（gene expression profiling interactive analysis）数据库,统计分析ILT4与微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理参数的相关性。4.采用转染技术,将携带ILT4过表达载体的慢病毒转染内源性ILT4低表达的H1650、A549细胞株,上调H1650、A549细胞中的ILT4的表达,空载体作为对照;将携带ILT4短发夹RNA（short hairpin RNA,shRNA）慢病毒转染内源性ILT4过表达的H1975、H1299细胞株,以下调ILT4的表达,空载体作为对照。收集该细胞培养基作为条件培养基,用于培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelia cells,HUVECs）。应用 qPCR 和 Western blot实验方法验证转染效果。采用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验检测ILT4过表达及敲除对血管内皮细胞迁移能力和小管形成能力的影响。5.通过基因芯片技术发现ILT4上调后可引起促血管生成因子VEGF-A和MMP9表达的上调。细胞水平上,通过转染技术上调和下调NSCLC细胞ILT4的表达,利用qPCR和Western blot技术验证ILT4对VEGF-A和MMP9表达的调节作用;组织水平上,通过将NSCLC组织连续切片应用免疫组化验证ILT4与VEGF-A、MMP9在组织中表达的相关性。6.采用转染技术,将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4,采用VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,应用Transwell细胞迁移实验和HUVECs小管形成实验观察条件培养基对血管内皮细胞迁移能力和成管能力的影响。7.结合基因微阵列筛选出ILT4调控的信号通路,采用转染技术过表达和沉默NSCLC细胞ILT4的表达,利用Western blot技术检测ILT4对促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路中关键蛋白及其磷酸化水平的影响,包括pERK、ERK、pp38、p38、pJNK和JNK。8.将内源性低表达ILT4的细胞系H1650和A549过表达ILT4后,加入ERK抑制剂、p38抑制剂进行干预,分别阻断ERK信号通路,p38信号通路,应用Western blot方法检测通路抑制后VEGF-A和MMP9的表达情况,采用Transwell细胞迁移实验和小管形成实验观察ERK信号通路在ILT4调控血管生成方面的作用。9.通过慢病毒感染建立稳定ILT4过表达的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4和对照组细胞株A549 LV-NC;建立稳定干扰ILT4的NSCLC细胞株H1299 LV-shILT4和对照组细胞株H1299 LV-shNC,选择BALB/c Nude裸鼠皮下注射上述细胞,体内实验观察ILT4对NSCLC细胞体内成瘤能力的影响;利用免疫组化的方法检测移植瘤组织中微血管密度,同时检测促血管生成因子VEGF-A、MMP9和信号通路ERK和pERK蛋白表达,进一步验证ILT4对血管生成能力的影响。研究结果1.ILT4在NSCLC细胞系和NSCLC肿瘤组织中高表达qPCR和Western blot检测显示ILT4在NSCLC细胞中的表达高于正常支气管上皮细胞。内源性低表达ILT4的细胞系为H1650和A549,内源性高表达ILT4的细胞系为H1299和H1975。免疫组化显示ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达高于肿瘤周围正常组织,ILT4在肿瘤组织的阳性表达率为:57.7%（52/90）,在周围正常组织中的阳性率为4.4%（4/90）。2.ILT4表达与NSCLC患者临床病理指标及患者预后的相关性ILT4在NSCLC肿瘤组织中的表达与较晚的TNM分期（III期-IV期,p=0.0104）,淋巴结转移（p=0.001）成正相关。随访90例NSCLC患者生存,Kaplan-Meier生存分析显示ILT4高表达患者的OS低于ILT4低表达患者OS（p=0.0419）。利用Kaplan-Meier Plotter在线生存分析系统分析ILT4对肺癌患者预后的影响,采用包含ILT4基因特定序列的探针进行测探,探针207697xat信息显示ILT4高表达组患者总生存OS（p=0.056）及中位至疾病进展时间FP均低于ILT4低表达组（p=0.022）。3.ILT4表达水平与NSCLC瘤内微血管密度的相关性,ILT4/CD34共表达与临床病理指标的相关性目前尚没有ILT4在NSCLC血管生成方面的研究,我们探索性的分析了ILT4表达水平与NSCLC肿瘤组织中的微血管密度的相关性。采用临床常用的CD34阳性的细胞表达情况代表微血管密度。GEPIA数据库分析提示,ILT4与CD34表达呈正相关;组织标本免疫组化结果提示ILT4高表达组的微血管密度显着高于ILT4低表达组的微血管密度（p=0.0058）。同时ILT4+/CD34+共表达患者,较ILT4-/CD34-组患者,有更高的淋巴结转移率（p=0.0466）,共表达组腺癌的患者比例明显增高（p=0.0 12）。4.ILT4促进HUVECs细胞迁移能力和HUVECs小管形成能力Transwell细胞迁移实验证实过表达ILT4的H1650和A549的条件培养基促进HUVECs细胞迁移,并提高其成管能力;ILT4下调的H1975和H1299的条件培养基抑制HUVECs的细胞迁移,减弱其成管能力。5.ILT4可以上调NSCLC中促血管生成因子VEGF-A和MMP9的表达基因芯片检测提示肿瘤细胞ILT4过表达可引起VEGF-A和MMP9基因表达上调。在细胞水平上,通过qPCR和Western blot结果提示过表达ILT4后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均明显升高;下调ILT4表达后的NSCLC细胞系VEGF-A和MMP9的RNA水平和蛋白水平均显着下降;组织水平上,在病理连续切片中通过免疫组化提示ILT4高表达组织中VEGF-A、MMP9的蛋白表达水平偏高。6.ILT4通过调控NSCLC细胞的VEGF-A、MMP9表达参与血管内皮细胞迁移和HUVECs小管形成内源性低表达ILT4的H1650和A549细胞系过表达ILT4后,加入VEGF-A中和抗体或MMP9中和抗体进行干预,收集条件培养基,培养HUVECs,结果示阻断VEGF-A、MMP9表达后,HUVECs细胞迁移能力明显降低;HUVECs的小管形成能力明显下降。7.ILT4可以激活NSCLC细胞ERK、p38信号通路基因微阵列分析提示上调ILT4后可引起MAPK信号通路中多种基因的表达。MAPK信号通路主要包括ERK通路,JNK通路和p38信号通路。Western blot实验提示H1650和A549细胞过表达ILT4后,肿瘤细胞的pERK、pp38水平升高,H1975和H1299细胞下调ILT4表达后,pERK,pp38蛋白表达水平均明显降低。8.ILT4通过激活ERK信号通路促进VEGF-A、MMP9表达将内源性低表达ILT4的H1650、A549细胞过表达ILT4后,加入ERK抑制剂U0126和p38通路抑制剂SB 203580（20μM）进行干预,培养48小时,收集条件培养基,Western blot提示加入ERK抑制剂U0126后ILT4过表达上调的VEGF-A、MMP9表达被显着逆转,加入p38通路抑制剂对VEGF-A、MMP9表达无影响。9.ILT4通过ERK信号通路调控血管内皮迁移和HUVECs的小管形成Transwell迁移实验和HUVECs小管形成实验证实抑制ERK信号通路后,ILT4上调的血管内皮细胞迁移能力和成管能力均显着逆转。结果提示:ILT4通过ERK信号通路诱导VEGF-A、MMP9表达并调控血管内皮细胞迁移和HUVECs的小管形成。10.ILT4促进NSCLC细胞体内成瘤及血管生成通过裸鼠皮下注射稳定过表达ILT4的NSCLC细胞株A549 LV-ILT4,和注射稳定干扰ILT4表达的细胞株H1299 LV-shILT4,建立裸鼠移植瘤模型,结果提示ILT4过表达组,NSCLC肿瘤生长速度显着快于对照组,ILT4过表达组的肿瘤体积和重量明显大于对照组;干扰ILT4表达组,肿瘤生长速度显着慢于对照组,ILT4干扰组的肿瘤体积和重量明显小于对照组。通过建立裸鼠移植瘤模型,造模4周后,分离肿瘤组织行免疫组化,结果提示ILT4过表达组,肿瘤微血管密度显着高于对照组,VEGF-A和MMP9表达高于对照组,pERK明显高于对照组,ERK表达无明显改变;干扰ILT4表达后,肿瘤微血管密度显着低于对照组,VEGF-A和MMP9表达低于对照组,pERK明显低于对照组,ERK表达无明显改变。体内实验进一步支持ILT4具有促进NSCLC血管生成的潜力。结论1.ILT4在NSCLC组织中及多个NSCLC细胞株中高表达,与更晚的病理分期、淋巴结转移及临床不良预后明显相关,可作为预后预测因子。体内体外实验证实ILT4可促进NSCLC血管生成。2.体外实验证实了 ILT4通过激活ERK信号通路上调VEGF-A、MMP9的表达并促进NSCLC血管内皮细胞迁移和小管形成,体内实验进一步验证了 ILT4对NSCLC血管生成的作用及潜在机制。
李建德[4]（2021）在《小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究》文中研究指明眼角膜暴露于外部环境,极有可能受到各种损伤。角膜化学损伤占眼科急诊的11.5%至22.1%,其中,碱烧伤通常比其他类型的损伤更严重,这是由于碱试剂亲脂性的特征使其能迅速穿透组织,造成更为严重的创伤。即使采取及时的临床治疗,大多也会由于伤口愈合过程中形成角膜瘢痕和新生血管而造成永久性失明。因此,角膜的碱烧伤修复不仅是基础科学研究的热点,也是一个急需解决的重要医学问题。然而,大量的研究多集中在药物对角膜碱烧伤的影响上,对损伤引起的系统性应答机制研究较少,不利于靶点药物的筛选。角膜碱烧伤引发的应答是一个复杂的级联反应,涉及细胞因子介导下的角膜上皮细胞、基质细胞和免疫细胞之间的相互作用,其中最为重要的是损伤引起的角膜血管新生、纤维化和严重的炎症反应。近年来,雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）被发现具有抗角膜损伤引起的纤维化和血管生成作用,但其介导哺乳动物雷帕霉素靶点（Mammalian target of Rapa,m TOR）调节角膜血管新生的机制研究甚少。本研究通过建立小鼠角膜碱烧伤模型,采用Hematoxylin&Eosin（H&E）染色、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）、亚硫酸氢钠测序PCR（Bisulfite sequencing PCR,BSP）、电泳迁移率实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）、蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）、流式细胞术（Flow cytometry,FCM）和酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）技术,从形态、组织和分子水平,确定小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控机制、转录因子调控机制、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控机制、以及角膜碱烧伤引起的机体免疫应答与药物干预下的修复机制,得到以下结论:Ⅰ.碱烧伤引起的小鼠角膜浑浊化及Rapa干预下血管生成的DNA甲基化调控、转录因子调控、及MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路调控:1.碱烧伤引发血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）介导的血管新生,并诱导静止的角质细胞分化为成纤维细胞,成纤维细胞表达α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin,α-SMA）转化为肌成纤维细胞导致角膜纤维化。Rapa通过降低VEGF和α-SMA介导的血管生成和角膜纤维化,减轻角膜碱烧伤引起的损伤。2.碱烧伤诱导的角膜细胞增殖主要来自于基质细胞,而Rapa诱导的损伤角膜细胞增殖主要来自于上皮细胞。此结果显示出Rapa作为治疗角膜碱烧伤备选药物的可行性:能有效促进损伤角膜上皮细胞的增殖以达到修复创伤面的目的,并可能抑制因损伤引起的基质细胞增殖,保证了角膜基质的均一性和良好的光线折射性。3.小鼠角膜碱烧伤可诱导DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferases 3b,Dnmt3b）表达升高并介导m TOR基因启动子发生从头DNA甲基化修饰,而Rapa通过抑制Dnmt3b的表达降低碱烧伤诱导的甲基化。这种调控机制在如碱烧伤类的损伤中主要借助于基因启动子区一些关键的Cp Gs位点实现其对转录水平的影响。4.转录因子ETS变体5（The transcription factor ETS-variant 5,ETV5）结合在Rapa诱导的m TOR基因去甲基化位点并负调控基因表达,在角膜碱烧伤后的Rapa修复中发挥重要作用。5.小鼠角膜碱烧伤模型中,损伤诱导PI3K/AKT/m TOR信号通路活化和低氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α）高调,引起VEGF高表达。因此得到一条角膜碱烧伤引起的血管生成调控轴:PI3K/AKT/m TOR/HIF-1/VEGF。6.MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信号通路通过m TOR分子调控VEGF的表达,因此,对以上通路的联合抑制,有利于血管生成疾病的治疗。Ⅱ.小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下的免疫应答:1.角膜碱烧伤引起包括巨噬细胞和中性粒细胞在内的白细胞浸润,它们通过角膜缘迁移进入基质,释放白介素1α（Interleukin-1α,IL-1α）和肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）,启动Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）和NOD样受体家族3（Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3）炎症信号通路,招募基质金属蛋白酶-2（Matrix metalloproteinases-2,MMP-2）,发展了损伤角膜的急性炎症反应和与之相关的血管生成。Rapa通过抑制白细胞的浸润和炎症因子的表达降低了碱烧伤引起的角膜炎症反应和炎症相关的血管生成。2.Rapa促进角膜中碱烧伤诱导的CD4+T细胞向CD4+CD25high Treg细胞转化。
谌程程[5]（2021）在《c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响》文中认为研究背景和意义:足部溃疡创面经久不愈是糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者容易罹患的严重并发症之一,这种以周围神经损害及缺血为特征的足部溃烂,临床上称之为糖尿病足。研究显示糖尿病人群中并发糖尿病足的患者比例从15%到20%不等,这其中大约20%的患者需要接受截肢治疗[1],而截肢对患者来说是心理和生理的双重打击。糖尿病溃疡创面延迟愈合涉及多种复杂机制,目前关于糖尿病足部溃疡的病理研究主要集中在微生物侵袭、再上皮化障碍、持续的炎症反应和免疫功能受损等一些致病因素上[2,3]。而血运障碍是伴随所有糖尿病溃疡形成的另一个潜在致病因素,血运障碍会严重影响创面的正常愈合,多项研究强调了充分的血运和血管生成在组织修复中的重要性,并认为局部血管生成障碍和血供减少是糖尿病慢性创面愈合延迟的重要病理改变之一[4-6]。因此,加强创面血管生成反应的治疗策略可能可以有效地促进糖尿病慢性创面的愈合。血管生成是一个由内皮细胞（endothelial cells,ECs）、与其相关的血管周围支持细胞（血管平滑肌细胞和周细胞）以及免疫细胞协调参与的动态过程。血管生成失调已被认为是多种疾病的共同病理改变,包括癌症、外周动脉疾病、糖尿病性血管病变、类风湿性关节炎和炎症性肠病等[7-10]。血管生成受到生长因子、细胞内信号和细胞外成分的微妙和动态平衡关系的调节。多种类型的细胞（包括内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、血小板、免疫细胞和干/祖细胞）可通过分泌相关生长因子参与这一过程,其中发挥主要作用的是碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b FGF）[11]、转化生长因子α[12]、转化生长因子β[13]、肿瘤坏死因子α[14]、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）[15-17]和磷脂酶C-γ（phospholipase C gamma,PLCγ1）[18-20]等。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）具有分化、旁分泌及免疫调控等功能,被认为在血管生成的过程中起到重要作用[21]。此外,Shin等人的研究发现在糖尿病动物模型中内源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）的功能受损、以及迁移到受损创面的细胞数量明显降低是导致创面难以愈合重要因素之一[22]。目前已发现MSCs通过促进血管生成加速创面愈合的几种机制,包括分泌促血管生成因子、向内皮细胞和（或）周细胞分化促进血管生成、募集内源性干/祖细胞、调控细胞外基质产生和重塑以及免疫抑制作用等[23]。近年来,外源性MSCs在多种疾病动物模型中的治疗效果,特别是在创伤和缺血性疾病的治疗上受到了广泛的关注[24-26]。多项动物实验研究表明,外源性MSCs的注射治疗可以通过促进创面基底血管生成来加速糖尿病等慢性创面的愈合[27,28]。但是,从组织中获取的原代MSCs,其细胞生物学功能在经过体外培养和增殖后大幅降低,导致治疗效果低于预期[29]。因此,亟待寻找一种方法来增强长期扩增培养BM-MSCs的修复功能,并通过动物实验进一步检测其对糖尿病创面的促愈合作用和安全性。c-Cbl（c-Casitas b-lineage lymphoma）是细胞中的一种原癌基因,属于Cbl家族的成员之一,其编码的蛋白被认为是一种E3泛素连接酶且包含特征性的环指（RING Finger,RNF）结构域,能够调控细胞膜表面受体介导的多种信号[30,31]。实验证实在肿瘤及视网膜血管新生的病理过程中,抑制c-Cbl可以增强VEGF诱导的内皮细胞增殖和血管生成,从而促进这一进程[19]。另外,研究还发现在糖尿病小鼠模型中,敲除c-Cbl基因可以改善高脂饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗[32]。这些结果提示,c-Cbl能够通过调控信号分子转导影响细胞的功能改变进而参与血管生成的过程,并且c-Cbl基因在糖尿病动物模型中也起到重要作用。然而,c-Cbl在BM-MSCs及其长期扩增培养后的功能变化中是否起到作用,起到何种作用,目前尚不清楚。因此,在本文中我们通过向SD大鼠腹腔内注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）并以血糖值建模标准筛选Ⅰ型糖尿病大鼠,用于制作创面模型。通过体外实验研究c-Cbl在长期扩增培养的BM-MSCs功能改变中的作用,并在动物模型上观察经过调控的BM-MSCs对促进糖尿病创面愈合的作用。研究结果对MSCs在糖尿病等慢性创面治疗的应用上具有重要意义,并为改善MSCs在体外扩增培养后的功能降低提供理论依据。此外,探索c-Cbl对MSCs促血管生成功能的调控作用,可以更好的阐明MSCs的功能变化与血管生成的关系,具有一定参考价值。实验研究方法:1.体外扩增培养大鼠BM-MSCs,检测c-Cbl与蛋白激酶B（Akt）的活化水平及相互作用关系将购买的Sprague-Dawley（SD）大鼠BM-MSCs在体外进行扩增培养,通过蛋白免疫印迹（western blot,WB）法分别检测传第3代（passage 3,P3）、传第6代（passage6,P6）及传第10代（passage 10,P10）细胞中Y731c-Cbl/c-Cbl和S473-Akt/Akt的蛋白表达水平;并且在P10细胞中使用锁核酸修饰的反义寡核苷酸间隔物（locked nucleic acid modified antisense oligonucleotide gapmers,LNA Gapmers）抑制c-Cbl表达,再次检测S473-Akt/Akt的蛋白表达变化。2.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs旁分泌血管生成因子及迁移能力的影响通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）分别定量P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 BM-MSCs在体外培养过程中分泌血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）及b FGF的水平,同时采用小管形成试验分别检测内皮细胞在各组细胞条件培养液中形成血管样结构的程度变化。另外,采用Transwell试验检测各组细胞的迁移功能。3.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs增殖及衰老的影响采用β-半乳糖苷酶染色试剂盒分别对P3、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs进行染色,以检测衰老细胞的比率。采用CCK-8（cell counting kit-8）试验检测各组细胞分别在24、48、72及96小时的细胞增殖速率。4.构建糖尿病大鼠创面模型首先我们以65mg/kg剂量对SD大鼠进行腹腔注射STZ,诱导构建Ⅰ型糖尿病大鼠模型。然后,以1.8cm的直径在大鼠背部制作对称的两处圆形皮肤全层创面。术后1天在创面周围注射BM-MSCs进行治疗干预。5.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射下调c-Cbl表达的P10 BM-MSCs（转染c-Cbl LNA Gapmers）、阴性对照P10 BM-MSCs（转染Scramble LNA Gapmers）及等量磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）,采用免疫组化的方法检测术后7天和14天创面组织中血小板-内皮细胞粘附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1/CD31）和VEGFA的表达,以判断创面血管生成情况。6.观察c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响分别予糖尿病大鼠创面组织周围注射PBS、P10及抑制c-Cbl表达后的P10 MSCs,在创面制造后0、3、7、14天拍照并计算创面愈合率。另外,收集术后14天创面组织制作石蜡切片进行苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色和马松（Masson）染色,并统计病理评分。实验结果:1.体外长期扩增培养的BM-MSCs中,c-Cbl的磷酸化水平明显增加而Akt的磷酸化水平受到抑制,c-Cbl LNA Gapmer转染能够下调c-Cbl的蛋白表达水平,并且c-Cbl下调后,Akt的磷酸化水平得到提高,表明c-Cbl在一定程度上介导了体外长期扩增培养诱导的BM-MSCs的磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/Akt信号抑制。2.体外长期扩增培养的BM-MSCs,其旁分泌血管生成因子和迁移能力受到抑制,而下调c-Cbl的表达可改善其旁分泌和迁移能力。3.体外长期扩增培养的BM-MSCs增殖能力降低并呈现较高的衰老率,而下调c-Cbl的表达可增强其增殖能力并在一定程度上降低衰老率,但并没有过度激活MSCs的增殖活性。4.成功构建了STZ诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠,并在此基础上制作了糖尿病大鼠创面模型,模型构建的成功率高、稳定性强。5.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对促进糖尿病创面血管生成的治疗效果,与对照组相比,局部注射c-Cbl下调的BM-MSCs可以显着促进创面组织中VEGFA的早期表达,并最终促进糖尿病创面的血管生成。6.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的速率。另外,通过HE及Masson染色统计分析的组织病理评分显示,经c-Cbl下调的BM-MSCs治疗后,创面评分明显高于对照组。结论:1.下调c-Cbl的表达可以改善BM-MSCs长期扩增培养后的Akt磷酸化抑制及促血管生成相关功能降低,表明c-Cbl的表达水平与BM-MSCs的Akt信号和功能变化具有一定的相关性。2.下调c-Cbl的表达提高了体外长期扩增培养的BM-MSCs对糖尿病大鼠创面的促血管生成及促愈合的治疗效果。
张俊峰[6]（2021）在《双靶向VEGF和PFKFB3诱导胶质母细胞瘤血管正常化及MRI评价》文中研究指明背景和目的新兴诊疗方法在肿瘤学领域取得了令人瞩目的突破性进展,但胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）患者的预后仍然不容乐观,其中位生存时间约为14.5～16.6个月。采用抗血管生成药物如单克隆人源化血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）抗体贝伐单抗（Bevacizumab,BEV）促进肿瘤血管正常化（Tumor vascular normalization,TVN）是被给予厚望的抗肿瘤治疗策略。抗血管生成治疗（Anti-angiogenic therapy,AAT）诱导的TVN效应能够重塑肿瘤微环境（Tumor microenvironment,TME）,为联合其他抗肿瘤治疗提高治疗增效提供了一个机会时间窗。然而,血管正常化效应短暂,需要探索新的治疗策略增强延长AAT诱导的TVN效应,以期能够改善现有TVN诱导策略,持续提高对抗肿瘤治疗的协同增效作用。无创监测肿瘤治疗响应从而准确识别TVN效应有利于在正常化时间窗内正确指导抗肿瘤治疗实施和对治疗增效作用的评价。动态对比增强磁共振成像（Dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging,DCE-MRI）定量参数Ktrans能够定量评价血管功能特征,已被北美放射学会定量影像生物标志物联盟推荐作为评价AAT疗效的终点指标。体素内不相干运动磁共振成像（Intravoxel incoherent motion-MRI,IVIM-MRI）由于可同时定量评价组织微循环和组织间水分子弥散特征,且不依赖外源性钆对比剂（Gd-based contrast agent,GBCA）成像近年来受到了越来越多的关注。作为不同定量MRI技术,联合DCE-MRI与IVIM-MRI各自的成像优势有助于提供更丰富的血管功能信息。探究DCE-MRI和IVIM-MRI对肿瘤治疗响应监测和TVN评价的应用价值具有重要临床意义,有助于促进TVN策略的临床转化和应用。在本研究中,我们建立原位人源GBM移植瘤（Patient-derived xenograft,PDX）小鼠模型,探究靶向抑制VEGF和糖酵解激活因子PFKFB3的联合疗法是否能够协同增强TVN效应,并以DCE-MRI和IVIM-MRI监测肿瘤治疗响应的动态变化,分析MRI定量参数与TVN指标的相关性。材料与方法1、本研究首先采用GEO数据集GSE39221分析BEV治疗前后U87-MG GBM组织PFKFB3表达水平,随后建立224例原位GBM PDX小鼠模型,将其中172例PDX模型随机分为BEV单一治疗组、3PO（PFKFB3抑制剂）单一治疗组、BEV+3PO联合治疗组和安慰剂（生理盐水）对照组。采用7.0T临床前磁共振成像仪、免疫印迹和组织学染色对PDX模型进行肿瘤大小、PFKFB3表达水平、细胞增殖与凋亡和生存期评价,分析不同治疗干预方案对GBM的抗肿瘤作用。在治疗前基线、治疗后2天、5天、8天、14天、25天对PDX模型进行组织病理学和1H-磁共振波谱（1H-magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS）分析,评价肿瘤血管形态学特征、肿瘤缺氧程度、乳酸脱氢酶-A（Lactate dehydrogenase-A,LDHA）表达水平和肿瘤代谢物浓度。采用盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride,DOX）作为化疗药物对52例PDX模型进行不同治疗干预（DOX、DOX+3PO、DOX+BEV、DOX+BEV+3PO）,评价DOX在瘤内的富集程度和抗肿瘤作用。采用血管生成相关因子蛋白芯片、免疫印迹和生物信息学分析评价治疗相关的分子表达特征。2、采用7.0T临床前磁共振成像仪在治疗前基线、治疗后2天、5天、8天、14天、25天对已建立的172例PDX模型进行DCE-MRI和IVIM-MRI扫描,采用肿瘤区域分割和直方图方法分析肿瘤治疗响应的动态变化,并以影像-组织学指标相关性分析探讨MRI定量参数评价TVN的价值。结果1、GEO数据集分析结果显示U87-MG GBM组织PFKFB3水平在BEV单一治疗后显着增高。此结果在GBM PDX模型中得到一致验证。蛋白免疫印迹结果进一步显示PFKFB3靶向抑制剂3PO能够有效抑制BEV单一治疗诱导的PFKFB3表达增高,并显着增强BEV的抗肿瘤作用。BEV+3PO联合治疗较BEV单一治疗显着延长了荷瘤鼠生存期（68.5天vs.81天,P（27）0.05）,延缓了肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖。组织学染色分析表明BEV与3PO的协同抗肿瘤作用得益于持续的TVN增效作用。TVN指标周细胞覆盖指数（Pericyte coverage index,PCI）和基膜标志物collagen IV表达在双靶向联合治疗后2天显着增加,此增高现象持续至治疗后第25天,显着长于BEV单一治疗诱导的TVN效应（治疗后2～14天,P（27）0.05）。双靶向治疗诱导的TVN协同增效作用持续提高了对缺氧、酸性TME的重塑作用,肿瘤缺氧标志物哌莫硝唑和LDHA表达水平显着降低（P（27）0.05）。1H-MRS进一步发现肿瘤代谢物胆碱峰、脂质峰和乳酸峰明显降低（P（27）0.05）。此外,BEV+3PO治疗诱导的TVN协同增效作用显着改善了DOX的药物递送效率和疗效（P（27）0.05）,BEV+3PO治疗组中肿瘤区域DOX的富集程度较BEV单一治疗组更加明显,肿瘤生长抑制作用和荷瘤鼠生存期显着延长（P（27）0.05）。分子机制上,双靶向治疗下调了多种促血管生成因子的表达水平。其中,作为调控TVN过程的关键因子,肿瘤细胞和内皮细胞中的Tie-1表达水平在BEV+3PO处理后显着降低。2、DCE-和IVIM-MRI定量参数显示BEV+3PO诱导的肿瘤治疗响应异质性显着降低,肿瘤区域分割和直方图分析结果表明肿瘤中心区和外周区MRI参数变化均较BEV单一治疗组更加显着（P（27）0.05）。MRI定量参数与TVN指标相关性结果表明,DCE-MRI参数Ktrans、IVIM-MRI参数f和D*与肿瘤微血管密度和TVN指标相关关系均显着（P（27）0.0001）,Ktrans与微血管密度相关程度最高（r（28）0.7202,P（27）0.0001）。D*与PCI、collagen IV表达和肿瘤缺氧相关系数r分别为0.6365,0.6628,-0.5446,高于Ktrans（r分别为-0.5214,-0.5781,0.4656）。D*与Ktrans相关程度较弱（r（28）-0.4499,P（27）0.0001）。结论1、原位GBM PDX模型中,双靶向VEGF和PFKFB3治疗策略能够协同增强对GBM的抗肿瘤作用和TVN效应,进而持续改善缺氧、酸性TME,可为提高化疗增效提供一个持续的机会时间窗。此策略有利于克服目前TVN效应短暂的局限性,或可作为一个有希望的TVN诱导策略。2、IVIM-MRI参数D*具有很大潜力作为非外源性GBCA依赖的影像标志物有效补充DCE-MRI参数Ktrans评价肿瘤治疗响应TVN效应,有助于促进TVN治疗策略的临床转化及应用,对TVN时间窗内实施治疗决策提供了有价值参考指标。
张珊珊[7]（2021）在《视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究》文中进行了进一步梳理血管生成是通过已有的血管发芽而形成新血管的过程,胚胎发育完成后生理性与病理性血管均通过此过程产生。生理性的血管生成对损伤修复、组织的生长和再生都十分关键,而生理性血管的异常生成和病理性血管的形成往往与许多疾病的发生有关。视网膜血管作为视网膜中氧气和营养供应的通道,其异常发育会诱发许多眼病,如家族性渗出性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变等。目前对于这些疾病仍缺少有效的诊疗方法,寻找影响血管生成的基因,明确生理性血管发育与病理性血管生成的机制,对于这些疾病的诊疗具有重要意义。本论文研究了三个基因在视网膜血管生成中的作用,并对其调控机制进行了研究,为血管性眼病的治疗提供了参考。论文的主要内容如下:1.首次就TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其机制进行了研究。研究发现,人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常。另外,在小鼠血管内皮细胞中特异性敲除Tmem30a导致视网膜表层血管发育迟缓、密度降低,血管末端膨大,顶端内皮细胞的数量减少,丝状伪足数目降低;在小鼠全身敲除Tmem30a还会导致血管壁的完整性遭到破坏。而在小鼠视网膜血管发育完成后敲除Tmem30a不会影响血管网络的维持。在转录水平进行分析发现在敲减TMEM30A的人视网膜血管内皮细胞与全身敲除Tmem30a小鼠的肺组织中与细胞周期有关的基因表达量减少;同时蛋白质免疫印迹分析发现其中涉及VEGF信号传导的相关蛋白质的磷酸化水平也明显降低。以上结果表明,Tmem30a在血管生成和维持血管屏障的完整性中发挥了作用,其通过调节VEGF的信号传导来控制血管生成。2.研究了TWIST1基因在视网膜病理性血管生成中的作用。研究发现在血管内皮细胞条件性过表达Twist1的小鼠中出现了视网膜表层血管发育迟缓、前端异常增生和局部渗漏的表型。免疫荧光染色发现该小鼠血管内皮细胞增殖速度显着加快,小鼠视网膜中胶质纤维酸性蛋白表达增多,血管内皮生长因子分泌异常。而血管内皮细胞核染色显示血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠血管内皮细胞核多为椭圆形,且不指向无血管区。该结果说明Twist1过表达导致星形胶质细胞的异常激活,其分泌的血管内皮生长因子随之升高,进一步导致了血管的异常增生,同时Twist1过表达后引起的血管内皮细胞极性的丧失会导致血管发育迟缓。而在小鼠视网膜血管发育完成后过表达Twist1不会影响血管网络的维持。另外,全身过表达Twist1后,小鼠眼球变小,视网膜表层血管发育迟缓、密度下降、局部渗漏,与在血管内皮细胞过表达Twist1的表型不同,说明Twist1在其他细胞中同样发挥作用。体外荧光素酶实验发现过表达TWIST1导致Norrin/β-catenin信号通路活性增强。以上结果表明TWIST1可能通过异常激活Norrin/β-catenin信号通路导致视网膜病理性新生血管的生成。3.鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1,并对其致病机制进行了研究,首次将DLG1与FEVR相关联,进一步明确了DLG1影响血管生成的作用机制。研究表明DLG1的错义突变S598G使DLG1无法正常激活β-catenin信号的传导,血管形成实验表明敲减DLG1影响了人视网膜血管内皮细胞的管腔形成,蛋白免疫印迹实验证明了DLG1缺失后VEGFR2蛋白磷酸化水平降低。综上,本研究阐明了TMEM30A在视网膜血管生成中的作用及其分子机制,证实了TWIST1在病理性血管生成中的作用,鉴定出了一个新的家族性渗出性玻璃体视网膜病变的候选基因DLG1。为血管性眼病及其他病理性血管生成疾病的治疗提供了新的药物治疗靶点。
张大力[8]（2021）在《成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）调节的淋巴管内皮细胞在异位骨化中的作用及其机制研究》文中研究表明研究目的异位骨化（heterotopic ossification,HO）是指在软组织中形成骨组织,主要包括遗传性HO和获得性HO两大类。遗传性HO包括进行性骨化性肌炎（FOP）和进行性骨发育异常（POH）,这是两种非常严重的全身性的异位骨化疾病,主要由于基因突变引起,人群发病率低。而获得性HO一般发生于严重创伤、烧伤、冲击伤或重大手术之后,中枢神经系统损伤也会诱发HO。HO的临床症状包括慢性疼痛、关节挛缩、活动受限等,目前治疗方法包括放疗、非甾体抗炎药（NSAIDs）和手术治疗,但治疗效果有限且容易复发。目前认为HO的形成是三个关键因素的共同作用的结果:参与HO形成的前体细胞、启动异位成骨的分子信号、损伤诱导的炎症微环境。FGFR3是调节成骨的重要分子,同时也参与淋巴管生成的调控,而淋巴管参与损伤后炎症细胞和炎症因子的引流,因此FGFR3有可能参与调控HO的形成。本课题旨在研究FGFR3对于HO调节的作用及具体细胞和分子机制,为HO的防治提供新的策略。研究方法1.建立多种转基因小鼠品系建立FGFR3flox/flox;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;Prx1-Cre ERT2小鼠、Col2a1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、Prx1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、FGFR3flox/flox;Col2a1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、FGFR3flox/flox;Prx1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、Col2a1-Cre ERT2;Rosa26m Tm G小鼠、FGFR3flox/flox;Prox1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/+;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/+;Prox1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/flox;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/flox;Prox1-Cre ERT2小鼠品系。2.小鼠他莫昔芬（Tamoxifen,TM）注射和获得性HO模型建立雄性小鼠按照100 mg/kg剂量腹腔注射他莫昔芬。每天注射1次,连续注射5天。之后通过跟腱切断手术诱导小鼠跟腱获得性HO形成。3.小鼠X光拍照和HO标本micro-CT扫描小鼠跟腱切断术后每2周进行X光检测（术后2、4、6、8周）,记录小鼠跟腱HO发生情况。小鼠术后4周、8周取材的HO标本用4%多聚甲醛固定之后按照标准流程X光拍照。X光图像是通过美国Faxitron公司MX-20 Cabinet X光拍照系统采集获得。小鼠跟腱切断术后4周、8周HO标本4%多聚甲醛固定24小时后,使用瑞士Scanco viva CT 40μCT系统进行扫描,设置机器扫描参数为70kv,113 m A。选择扫描区域为小鼠膝关节至足底。待机器扫描及图像整合完毕后,在操作软件上对图像进行重建。在重建HO的3D形态时选择对标本整体重建（包含胫骨腓骨）,在定量统计HO体积时只选择对异位骨进行重建（不包含胫骨腓骨）。三维重建和分析的阈值统一设置为170。4.HO切片病理染色、免疫组化及免疫荧光染色HO标本脱钙、脱水后进行冰冻切片,切片厚度为10μm。跟腱切断术后4周、8周HO冰冻切片分别进行苏木素伊红、藏红固绿病理染色。每个跟腱HO标本大约能够收集30-50张冰冻切片,每个标本取6-10张切片进行病理染色,使用奥林帕斯图像采集系统拍照,每张切片采集5-8个随机视野使用骨计量分析系统（Osteometrics）进行组织形态学计量。选取3-5张典型切片进行免疫组化染色,检测HO区域软骨、成骨标志分子表达水平,使用Image J软件对阳性细胞进行统计。每批实验每个标本选取3-5张典型切片进行免疫荧光染色标记HO区域软骨、成骨细胞,另外检测LEC标志分子从而标记淋巴管内皮细胞,检测F4/80、i NOS标记促炎巨噬细胞,检测FGFR3、BMPR1a、p Smad1/5评估相关分子表达水平。5.跟腱组织RNA提取、定量PCR检测提取小鼠损伤跟腱组织RNA,通过荧光定量PCR检测跟腱HO软骨、成骨标志分子水平评估HO进展情况,检测淋巴管内皮细胞标志分子评估LEC生成情况。6.小鼠损伤跟腱组织总蛋白提取、蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）提取小鼠损伤跟腱组织总蛋白,通过蛋白质免疫印迹实验检测跟腱HO软骨、成骨标志分子水平评估HO进展情况。7.损伤跟腱原代细胞分离培养、免疫荧光染色分离小鼠损伤跟腱后充分剪碎在I型胶原酶中消化至组织匀浆,离心获取原代细胞置于内皮细胞培养基（ECM）中培养传代。将原代细胞接种于12孔板爬片至30%-40%细胞密度时进行免疫荧光染色,检测LEC相关标志分子鉴定淋巴管内皮细胞。8.小鼠吲哚菁绿（ICG）近红外（NIR）淋巴管成像参照相关文献配制0.1 mg/ml浓度的ICG（Sigma公司）生理盐水溶液,使用胰岛素注射器将10μl ICG溶液皮内注射到距离跟骨远端约2 mm的小鼠足垫内。使用Fusion FX Edge系统（Vilber Lourmat公司）采集小鼠下肢的ICG NIR成像（820 nm红外滤光片）。记录小鼠足垫内ICG信号强度作为初始信号强度,24小时后再次对小鼠下肢ICG信号进行拍照（拍摄参数与前一天保持一致）,记录小鼠足垫内ICG信号强度作为24小时信号强度。使用Evolution-Capt v18.02软件对ICG NIR拍摄图像进行分析。ICG清除率为注射后24小时足垫ICG信号强度相对于足垫ICG初始信号强度降低的百分比。9.异位骨化患者HO标本获取患者HO标本来自大坪医院创伤外科既往发生过肘关节骨折的男性患者,经内固定治疗后诊断出现异位骨化而再次进行手术治疗。根据相关文献中的方法将患者HO标本按照其肘关节骨折内固定之后到获取HO标本的时间进行分期,成骨期HO为骨折内固定术后3-6个月获取的HO标本,成熟期HO为内固定术后12-18个月获取的HO标本。10.小鼠淋巴管内皮细胞系（mLEC）培养及FGFR3敲降mLEC细胞系生长至60%左右密度时通过小干扰RNA（si RNA,瑞博公司）对FGFR3进行敲降,依照Lipofectamine RNAi MAX转染试剂（Invitrogen公司）说明书中标准流程进行操作,转染36小时后提取mLEC蛋白。通过蛋白质免疫印迹实验检测FGFR3敲降水平及BMPR1a、p Smad1/5、Smad1/5表达的改变。11.人重组FGF9和VEGF-c跟腱局部缓释FGF9局部缓释实验中雄性小鼠行跟腱切断手术后将FGF9（0、0.01、0.1、1μg）与Matrigel混合溶液5μl滴于损伤跟腱处,观察FGF9对小鼠术后跟腱HO的影响。在VEGF-c实验中将人重组VEGF-c（Peprotech公司）（0或0.1μg）Matrigel混合溶液5μl滴加于雄性小鼠损伤跟腱局部,观察VEGF-c对小鼠术后跟腱HO的影响。研究结果1.FGFR3Col2小鼠跟腱切断术后获得性HO较对照组显着加重;10周龄FGFR3Col2小鼠及FGFR3f/f小鼠连续5天注射他莫昔芬,之后行跟腱切断手术。术后每2周通过X光检测跟腱HO发生情况,FGFR3f/f小鼠术后2、4、6、8周跟腱HO发生率为4.3%（1/23）、13.0%（3/23）、47.8%（11/23）、78.3%（18/23）,FGFR3Col2小鼠损伤跟腱HO发生率分别为18.2%（4/22）、22.7%（5/22）、68.2%（15/22）、95.5%（21/22）。跟腱切断术后4周micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠HO较对照组加重,病理染色显示FGFR3Col2小鼠较对照组损伤跟腱内异位软骨显着增加,免疫组化、q PCR、WB检测发现FGFR3Col2小鼠跟腱内软骨、成骨相关标志物如Sox9、ACAN、Osx、Runx2较FGFR3f/f小鼠均显着增加。术后8周micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱内异位骨较对照小鼠明显加重,病理染色显示FGFR3Col2小鼠较对照组跟腱内异位骨显着增加,免疫组化、q PCR、WB检测发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱软骨、成骨相关标志物如Sox9、ACAN、Runx2、OC较对照小鼠均显着增加。2.Col2+细胞没有直接参与HO形成,而是参与损伤跟腱新生淋巴管生成;Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠跟腱切断术8周后免疫荧光检测发现损伤跟腱中tomato+细胞未与Sox9或Runx2共染,提示Col2+谱系细胞未直接参与HO形成。H&E染色发现损伤跟腱中有新生血管生成,CD31免疫荧光染色发现Col2+谱系细胞与新生血管明显分开。进一步研究发现Col2tomato小鼠跟腱中tomato+细胞明显共染LEC标志分子LYVE1,同时疏松结缔组织和正常跟腱腱鞘膜中Col2+谱系细胞共染LYVE1。Col2m Tm G小鼠术后8周通过免疫荧光检测发现LEC标志分子LYVE1、Prox1、PDPN均与Col2+谱系细胞明显共染。Col2tomato小鼠他莫昔芬注射1天之后发现Col2+谱系细胞存在于正常跟腱腱鞘膜中,损伤8周后跟腱和腱鞘膜中Col2+谱系细胞明显共染LYVE1。Col2tomato小鼠他莫昔芬注射8周后,tomato+细胞分布于骨髓腔中,且参与小鼠足底部分肌肉形成,术后8周损伤跟腱中tomato+细胞共染间充质干细胞标志分子α-SMA。Tomato小鼠、Col2tomato小鼠、m Tm G小鼠、Col2m Tm G小鼠未注射他莫昔芬术后8周损伤跟腱中已有新生LYVE1+LEC,但未发现reporter阳性细胞存在。Col2m Tm G小鼠注射他莫昔芬跟腱切断手术8周损伤跟腱分离原代细胞免疫荧光检测发现GFP+细胞明显共染LEC标志分子LYVE1、Prox1、VEGFR3,而m Tm G小鼠、Col2m Tm G小鼠未注射他莫昔芬损伤跟腱原代细胞未检测到GFP+细胞。Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠术后8周损伤跟腱中tomato+细胞与LYVE1共染,不与F4/80共染。Prx1tomato和FGFR3f/f-Prx1tomato小鼠术后8周跟腱HO中tomato+细胞与Sox9共染,不与LYVE1共染。Prx1tomato和FGFR3f/f-Prx1tomato小鼠损伤跟腱中LYVE1+LEC数量无显着差异。3.FGFR3Prox1小鼠跟腱切断术后获得性HO较对照组显着加重;FGFR3Prox1小鼠跟腱切断术后4周和8周X光、CT检测发现跟腱HO较对照组小鼠均显着加重。病理染色可见术后4周FGFR3Prox1小鼠跟腱中异位软骨较对照组显着增加,免疫组化检测可见FGFR3Prox1小鼠跟腱HO中Sox9、Osx水平较FGFR3f/f小鼠显着提高。病理染色可见术后8周FGFR3Prox1小鼠跟腱HO较对照小鼠显着加重,FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱HO的Runx2、OC水平较对照小鼠显着增加。4.LEC中FGFR3缺失抑制损伤跟腱淋巴管生成、加重局部炎症水平;Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠术后4周、8周损伤跟腱共染LYVE1,发现敲除FGFR3后Col2+细胞形成的LEC数量显着减少,q PCR检测LEC相关标志分子发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱淋巴管生成较对照组明显减少。免疫荧光检测发现FGFR3Prox1小鼠术后8周跟腱LYVE1+LEC数量较对照小鼠显着减少。ICG NIR检测淋巴管引流功能发现FGFR3Col2小鼠和FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱淋巴引流水平显着降低。共染F4/80和i NOS发现敲除FGFR3小鼠术后4周、8周损伤跟腱促炎巨噬细胞水平较对照小鼠显着增多。病人HO标本病理染色发现成熟期HO（创伤后12-18个月）中已经形成成熟骨小梁和骨髓腔,而成骨期HO（创伤后3-6个月）主要为软骨和少量骨组织。免疫荧光染色发现成熟期HO较成骨期HO中LYVE1+LEC表达的FGFR3水平显着降低,且LEC数量也显着减少,同时F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显着增多。免疫荧光检测发现野生型小鼠术后12周损伤跟腱LYVE1+LEC数量较术后8周显着减少,同时促炎巨噬细胞数量显着增多。5.LEC中FGFR3缺失能够上调BMPR1a-p Smad1/5信号通路;免疫荧光检测显示FGFR3f/f-Col2tomato小鼠较Col2tomato小鼠术后8周损伤跟腱LYVE1+LEC中FGFR3表达水平显着降低,而BMPR1a、p Smad1/5表达水平显着增高。WB检测发现小鼠LEC细胞系中敲降FGFR3后BMPR1a、p Smad1/5表达水平明显增高,而Smad1/5表达无明显变化。同时FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱LYVE1+LEC中FGFR3表达水平较FGFR3f/f小鼠明显降低,而BMPR1a、p Smad1/5表达水平明显增高。6.FGFR3缺失小鼠敲除BMPR1a后能够促进损伤跟腱淋巴管生成抑制HO形成;X光检测发现FGFR3Col2;BMPR1af/+、FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠术后2、4、6、8周跟腱HO发生率较FGFR3Col2小鼠明显降低,通过micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠敲除BMPR1a后跟腱切断术4周、8周HO体积明显减少,H&E和SOFG染色提示术后4周FGFR3Col2;BMPR1af/+小鼠和FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠跟腱中异位软骨较FGFR3Col2小鼠明显减少,损伤跟腱中Sox9、Osx表达水平明显降低。病理染色和组织形态学计量显示术后8周FGFR3Col2;BMPR1af/+、FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠跟腱HO较FGFR3Col2小鼠明显减少,免疫组化检测跟腱HO中OC表达显着减少。FGFR3Prox1;BMPR1af/+小鼠、FGFR3Prox1;BMPR1af/f小鼠跟腱切断术后8周与FGFR3Prox1小鼠相比,micro-CT检测发现HO体积显着减少,病理染色及组织形态学计量同样显示跟腱HO体积显着减少,而跟腱HO中OC表达明显降低。免疫荧光检测提示FGFR3、BMPR1a双敲小鼠损伤跟腱中LYVE1+LEC数量与FGFR3敲除小鼠相比显着增多,而跟腱局部F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显着减少。7.FGF9抑制获得性HO形成依赖于LEC的FGFR3;野生小鼠跟腱切断术后给予0.01、0.1、1 ug剂量FGF9局部缓释治疗,8周后micro-CT和SOFG病理染色检测发现跟腱HO体积均明显减少,且HO中Sox9、OC表达水平均显着减少。LYVE1免疫荧光结果提示FGF9治疗后损伤跟腱新生LEC数量增多,且跟腱淋巴管引流功能增强,跟腱局部促炎巨噬细胞数量显着减少。而FGFR3Prox1小鼠给予FGF9治疗后HO体积及损伤跟腱LEC数量均无明显变化。8.VEGF-c促进损伤跟腱淋巴管生成抑制HO形成;野生小鼠跟腱切断术后给予VEGF-c局部缓释治疗后micro-CT检测发现跟腱HO体积显着减少,SOFG染色发现跟腱中HO形成明显抑制,免疫荧光检测发现VEGF-c治疗显着增加损伤跟腱中LYVE1+LEC数量,同时局部F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显着减少。研究结论1.Col2+细胞作为LEC前体细胞参与损伤跟腱中淋巴管生成;2.FGFR3在LEC中敲除通过抑制损伤跟腱新生淋巴管形成,加重损伤局部炎症水平,进而促进获得性HO形成;3.LEC中敲除FGFR3通过上调BMPR1a-p Smad1/5信号通路抑制跟腱损伤后新生淋巴管生成;4.靶向激活LEC中FGFR3能够抑制获得性HO的形成。
刘大海[9]（2020）在《双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制》文中研究说明研究背景血管瘤是常见的良性病变,由中胚层血管组织过度增生引起。血管瘤会给患者带来沉重的身心负担,尤其是对于皮肤病变患者。药物治疗和外科手术是血管瘤治疗的主要方法。但是,仍然有25%的血管瘤患者接受切除手术后仍存在症状。据报道,约75%–80%的血管瘤患者是女性。女性优势的详细原因尚不清楚。据报道,健康儿童的雌二醇水平低于血管瘤患者。增殖的血管瘤组织中的血清雌二醇水平高于渐开线阶段的水平。实验室研究表明,雌激素可促进血管瘤细胞的体外增殖,这可能取决于某些生长因子并被他莫昔芬抑制。此外,雌激素和VEGF对血管瘤细胞的增殖具有协同作用。所有这些数据表明,雌激素信号对血管瘤进展具有积极作用。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）是6个配体家族。VEGFA是与内皮增殖,迁移和存活相关的主要生长因子。成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGFs）由22个分子组成,与结构相关。根据新的命名法,FGF被连续编号,碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）被称为FGF-2。FGF和VEGF诱导的形态差异毛细血管论证了这些生长因子在血管生成中的不同作用。众所周知,VEGF是血管通透性的强力诱导剂,可引起水肿并导致高浓度血管瘤的形成。但是,尚未报告这些有害作用与此相关,反而FGF诱导的新形成的血管通常情况下功能表征成熟,且毛细血管壁细胞增加了。双酚S可以通过Snail的诱导在血管瘤细胞中诱导上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）。目的:（1）探究双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子诱发血管瘤细胞恶性变的机制。（2）探究BPS通过增加HA细胞中碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor,bFGF）的表达增加HA细胞增殖和迁移的机制。（3）探究BPS通过激活和增加HIF-1α增加bFGF表达的分子机制。（4）探究BPS通过上调HIF-1α和下调miR-195来增加bFGF的表达来触发HA细胞的恶性发展的机制。方法:（1）原代HA衍生内皮细胞（HDEC）和CRL‐2586细胞在含10%FBS的DMEM培养基中培养保存,使用含有相同浓度（小于0.5%）的DMSO（对细胞无毒作用）的培养基作为对照。细胞增殖测定,细胞群落形成试验,细胞周期分析,实时RT-PCR分析,蛋白质印迹分析,酶联免疫吸附试验,启动子活性分析。（2）研究中使用血管瘤来源的内皮细胞（Hemangio-derived endothelial cells,HDEC）,将细胞保存在含有10%的内皮基础培养基（EBM-2）中。将HDEC接种于RPMI1640中,其中补充了10%热灭活的胎牛血清,链霉素和青霉素（100U/mL）,于37℃,5%CO2的湿润气氛下培养。根据实验要求将细胞分为以下几组:对照组（正常培养的细胞系作为实验对照）,BPS处理组（使用浓度80μM的BPS处理细胞）,miR-424的过表达组（将100 pmol miR-424模拟物添加到HDEC进行转染）,抑制剂组（使用BAY 11-7082对BPS诱导的HDEC进行处理）。逆转录定量PCR（RT-qPCR）实时分析bFGF、VEGF、FGFR1、p65 mRNA表达。用MTT测定法分析HDEC增殖活力。流式细胞仪分析细胞凋亡。Transwell分析检测细胞迁移。蛋白质印迹分析检测miR-424对bFGF/FGFR1通路蛋白表达的影响。（3）内皮细胞系来源于血管瘤组织,在补充有10 ng/ml表皮生长因子和15%胎牛血清加上100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养基（Invitrogen,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国）中培养细胞系,环境温度37°C下,含有5%CO2的潮湿环境。根据实验将培养细胞分为以下分组:对照组（正常培养的细胞系作为实验对照）,BPS处理组（用100μMBPS处理细胞,并孵育24小时）,HIF-1α抑制组（BPS处理前使用一定浓度的HIF-1α抑制剂NS398同细胞一起孵育）,siRNA敲低HIF-1α组（使用X-tremeGene siRNA转染试剂在不含抗生素的人内皮无血清培养基中进行转染,每个样品使用1μg siRNA）,除实验处理不同外各组细胞的培养条件都相同。蛋白印迹分析细胞中HIF-1α及bFGF蛋白表达;MTT测定细胞增殖;TUNEL分析细胞的凋亡情况;逆转录定量PCR（RT-qPCR）实时分析STAT3和Bcl-2的mRNA表达。（4）作为双酚A（Bisphenol A,BPA）的替代品,双酚S（Bisphenol S,BPS）已应用于我们日常生活中的消费产品。具有与BPA类似的化学结构,BPS还被证明是一种外源性内分泌干扰化学物质。HA来源的内皮细胞（HA-derived endothelial cells,HDEC）细胞系购自北京安必奇生物科技有限公司。HDEC细胞系在Dulbecco改良的Eagle培养基中添加10%热灭活的胎牛血清,100 U/每毫升青霉素和100μg/mL链霉素将其置于37°C含5%CO2的潮湿气氛中。将Lv-HIF-1α过表达载体和miR-195模拟物或抑制剂转染到HAs细胞中,并进行进一步的功能实验。通过蛋白质免疫印迹检测BPS诱导后miR-195、bFGF和VEGF蛋白含量。通过MTT测定法评价细胞增殖活性。通过流式细胞仪分析细胞凋亡指数。使用miRWalk 2.0进行生物信息分析,筛选miR-195的靶基因。将带有HIF-1α野生型（WT）3’-UTR或突变的3’-UTR的pmirGLO报告载体与miR-195模拟物或抑制剂共转染入HDEC细胞。转染后48小时,用双重荧光素酶报告系统检查荧光素酶活性。通过qRT-PCR检测miR-195、HIF-1α和bFGF的表达。结果:（1）细胞群落形成分析表明,10nm BPS也能显着地触发HDEC和CRL-2586细胞的定植。细胞周期分析表明,BPS组G0/G1期细胞数量减少。BPS可通过诱导细胞周期转换而触发HA细胞的增殖。在BPS HA细胞增加bFGF的表达。bFGF参与了BPS诱导的HA细胞增殖。bFGF可以提高bFGF的转录和mRNA的稳定性。NF-κB参与BPS诱导的HA细胞bFGF表达。miR-155-5p参与BPS增加的bFGF mRNA稳定性。（2）BPS处理组较对照组bFGF、VEGF、FGFR1的mRNA表达升高（P<0.05）。说明BPS促进血管瘤细胞bFGF、VEGF、FGFR1的转录表达。第24小时和第36小时BPS处理组较对照组细胞增值率升高（P<0.05）,第72小时BPS处理组较对照组细胞增值率升高（P<0.01）。BPS处理组较对照组细胞凋亡率降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组细胞活力升高（P<0.05）。BPS处理组较对照组细胞迁移数量增加（P<0.05）,BPS处理组较对照组细胞侵袭数量增加（P<0.05）,说明BPS可促进细胞的迁移侵袭。抑制剂组较BPS处理组p65mRNA表达升高（P<0.05）,BPS处理组较对照组p65mRNA表达无差异（P>0.05）,抑制剂组较BPS处理组和对照组bFGFmRNA表达降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组bFGFmRNA表达升高（P<0.05）。miR-424的过表达组较BPS处理组和对照组bFGF/FGFR1、ERK1/2蛋白表达降低（P<0.05）,BPS处理组较对照组bFGF/FGFR1、ERK1/2蛋白表达升高（P<0.05）。说明miR-424的过量表达阻断了bFGF/FGFR1途径,且miR-424过表达显着抑制ERK1/2磷酸化。（3）BPS（0μM）较BPS（50μM）HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）,BPS（50μM）较BPS（200μM）HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）,结果表明,BPS以剂量依赖的方式促进了HIF-1α、bFGF的蛋白表达。第72小时较第48小时、24小时HIF-1α及bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,第48小时较第24小时HIF-1α及bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,表明,HIF-1α和bFGF表达在24 h时增加,并持续增加直至72 h。通过MTT测定细胞增殖力情况,第24小时、48小时BPS处理组较对照组细胞增殖增加（P<0.05）,第72小时对照组较BPS处理组细胞增殖降低（P<0.01）。BPS处理组较对照组HIF-1α、bFGF蛋白表达升高（P<0.05）,HIF-1α抑制组较BPS处理组HIF-1α、bFGF蛋白表达降低（P<0.05）。结果表明,BPS对细胞的影响通过是通过HIF-1α的激活来增加bFGF的蛋白表达。对照组较BPS处理组STAT3、Bcl-2 mRNA表达降低（P<0.05）,siRNA敲低HIF-1α组较BPS处理组STAT3、Bcl-2 mRNA表达降低（P<0.05）。siRNA敲低HIF-1α降低STAT3和Bcl-2的mRNA表达,这些结果表明HIF-1α在BPS介导的血管瘤细胞对STAT3信号的促进中起着重要作用。（4）HA组较对照组miR-195蛋白含量降低、bFGF和VEGF蛋白含量升高,BPS诱导组较HA组miR-195蛋白含量进一步降低、bFGF和VEGF蛋白含量进一步升高（P<0.05）。miR-195模拟物转染组（2.53±0.37,8.53±0.85）较空白对照组（3.46±0.52,2.17±0.24）细胞增殖活性降低,细胞凋亡率增加（P<0.05）。miR-195抑制剂转染组（3.89±0.22,2.11±0.23）较空白质粒转染组（2.37±0.26,5.64±0.16）细胞增殖活性增加,细胞凋亡率降低（P<0.05）。miR-195模拟物降低了HIF-1αWT 3’-UTR的萤光素酶活性,而miR-195抑制剂增强了该效果,但它们均对HIF-1α突变3’-UTR的萤光素酶活性没有影响。miR-195模拟物增加了miR-195的表达,降低了HIF-1α和bFGF的表达,而miR-195抑制剂则降低了miR-195的表达,增加了HIF-1α和bFGF的表达。结论:（1）BPS可以通过诱导细胞增殖和细胞周期转换而引发HA细胞的恶性变,该过程是通过BPS激活p65造成miR-155-5p下调,使得bFGF的表达增加而实现的。（2）BPS可以诱导细胞增殖触发HA细胞肿瘤的发生,该过程通过激活ERK1/2和了bFGF/FGFR1信号通路,上调bFGF的表达,促进HA细胞的增殖迁移完成的。（3）BPS通过激活和增加缺氧诱导因子（HIF）-1α来促进bFGF在血管瘤细胞中的表达,诱导血管瘤细胞的增殖发展。（4）miR-195通过靶向HIF-1α,调控bFGF和VEGF的表达,促进BPS诱导的HA细胞的增殖并抑制其凋亡,抑制皮肤HA的发展。并且miR-195上调和HIF-1α下调为HAs提供了潜在的治疗靶标。由于产前时期对BPS暴露敏感,我们建议孕妇和婴儿应特别注意避免暴露于BPS（例如,减少使用塑料制品,PCP,罐头食品以及与热敏纸的皮肤接触）。
杨会珍[10]（2020）在《LINC00667通过稳定VEGFA促进肺腺癌血管生成机制研究》文中研究指明背景与目的:肺癌是全球男女发病率最高的恶性肿瘤,寻求精准的诊断生物标志物和治疗靶点的识别甚为必要。这些公认的生物标志物包括长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNAs）。LncRNA 序列大于 200bp,常被认为是一类单一的转录本,不具有蛋白质编码能力,但它们可以在DNA-RNA-蛋白质水平上调控分子过程。通过参与表观遗传、转录和转录后机制,在抑癌基因和癌基因表达的调控中起着重要作用。VEGF-A-VEGFR轴在生理和病理血管生成和血管通透性中都是关键的。VEGF-A-VEGFR 轴（VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR-2）中仅一个基因的剪接中断就会导致整个信号轴的改变,从而导致癌症中VEGFR-2信号的增加和血管生成异常。本研究我们首先利用基因芯片技术筛选出差异LncRNAs,经RT-PCR技术验证LINC00667在肺腺癌组织标本中高表达,且沉默LINC00667抑制肺腺癌细胞株增殖、迁移,促进凋亡,提示LINC00667为促癌基因,通过生物信息软件分析,提示LINC00667可能与VEGF-VEGFR通路相关,进一步验证LINC00667如何通过与VEGFA的相互作用调控病理性血管生成。本研究结果将为肺癌抗血管生成机制的基础研究及治疗提供新思路。方法:第一部分LINC00667在肺腺癌组织的表达及临床意义方法1.利用基因芯片技术检测3对肺腺癌及癌旁正常肺组织新鲜冰冻标本中lncRNA的表达,筛选出表达明显差异的LncRNA;2.在40例新鲜冰冻腺癌组织及癌旁正常肺组织中利用Real-time PCR方法检测包含LINC00667在内的4个差异LncRNA表达水平;3.检测肺腺癌细胞系及正常肺上皮细胞系中LINC00667表达;4.将LINC00667表达水平与研究对象临床指标相关性进行分析,卡方检验方法研究分析LINC00667表达是否与肺腺癌疾病发展及预后相关。结果1.基因芯片检测初步在肺腺癌及其配对癌旁组织中筛选出有差异表达的LncRNA共800条,生物信息分析筛选后发现其中有显着差异的20条,10条（50%）在肺腺癌组织标本中明显上调,10条（50%）明显下调,LINCOO667在肺腺癌组织标本中表达水平明显增高。2.在肺腺癌与癌旁正常肺组织中利用RT-PCR方法检测LINC00667结果显示,相对于邻近的正常肺组织,LINC00667在85%（34/40）的肺腺癌样本中明显高表达（P<0.05）,差异有统计学意义。3.相对于人 IMR90 细胞系,LINC00667 在肺腺癌 H1975,H23,H1299 和 SPC-A1细胞系中表达明显增加（P<0.05）,其中在SPC-A1和H1299细胞中的表达丰度均为高,在其余两株细胞中的表达丰度为中。4.LINC00667NSCLC患者的表达水平与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期、脉管系统浸润情况相关（P<0.05）,与患者性别、年龄、吸烟史、病变位置无关。第二部分沉默LINC00667抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成方法1.构建沉默LINC00667表达的重组慢病毒载体,对数生长期SPC-A1和H1299细胞分别转染慢病毒表达载体及对照组空质粒载体,RT-PCR检测转染后细胞内LINC00667表达情况。2.利用 Cell counting kit-8（CCK-8）及 EdU analysis 技术,检测沉默 LINC00667对SPC-A1和H1299细胞增殖能力的影响。3.利用Transwell实验检测沉默LINC00667对SPC-A1和H1299细胞迁移能力的影响。4.Tube formation assay血管生成实验检测沉默LINC00667后血管生成情况。结果1.结果显示转染慢病毒表达载体的SPC-A1和H1299细胞系的LINC00667表达量较空质粒对照组明显减少,证实转染率较高,成功获取沉默LINC00667的SPC-A1和H1299细胞株。2.CCK8及EdU analysis实验结果显示在转染慢病毒载体shLINC00667后,细胞增殖能力受到抑制。3.Transwell实验结果显示在转染慢病毒载体shLINC00667后,SPC-A1和H1299穿过基底膜基质的细胞数量明显减少,迁移能力受到抑制。4.沉默LINC00667可以抑制血管生成。第三部分LINC00667通过VEGFA通路促进肺腺癌血管生成方法1.微阵列数据分析（Microarray analysis）与 LINC00667 及 VEGFA 相关的 RNA结合蛋白。2.Real time-qPCR方法检测肺腺癌标本中VEGFA及EIF4A3的表达。3.利用上调VEGFA慢病毒载体（pcDNA3.1/VEGFA）转染SPC-A1和H1299细胞,Tube formation assay血管生成实验检测血管生成情况,采用CCK8、Transwell实验检测上调VEGFA对SPC-A1和H1299细胞增殖、迁移的影响。4.Western-blot 技术检测沉默 LINC00667 对 SPC-A1 和 H1299 细胞中 VEGFA、EIF4A3表达的影响。5.检测沉默EIF4A3对SPC-A1和H1299细胞血管生成、增殖和迁移的影响。结果1.生物信息分析结果显示LINC00667与RNA结合蛋白EIF4A3可以结合。2.肺腺癌组织较癌旁组织中VEGFA、EIF4A3表达升高,沉默LINC00667后,VEGFA表达量明显下降,说明LINC00667与VEGFA有相关性。另外,VEGFA启动子的荧光素酶活性不受影响,LINC00667通过转录后水平影响VEGFA生物活性。3.过表达SPC-A1细胞中VEGFA能促进增殖,迁移,促进血管生成。4.Sh-LINC00667慢病毒载体转染SPC-A1和H1299细胞,VEGFA蛋白表达水平明显下降（P>0.05）,EIF4A3表达水平无影响。沉默肺腺癌细胞SPC-A1和H1299中LINC00667能抑制VEGFA的表达,可使与VEGFA结合的EIF4A3蛋白减少。5.加入EIF4A3抑制剂后,SPC-A1和H1299细胞增殖、迁移及血管生成能力减弱。结论:1.LINC00667和VEGFA在肺腺癌中表达水平较高,LINC00667与肿瘤大小、淋巴结转移情况、TNM分期以及脉管系统浸润情况有相关性。2.LINC00667可促进肺腺癌的增殖、迁移及血管生成。3.LINC00667可能通过与EIF4A3结合调控肺腺癌VEGFA的稳定性,促进血管生成,有望成为肺腺癌新的治疗靶标。
二、FGF和VEGF在血管生成中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FGF和VEGF在血管生成中的作用（论文提纲范文）
（1）菊苣酸作用BM-EPCs抑制血管生成的体外实验研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 肿瘤新生血管形成机制与治疗的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 VEGF和 FGF5 调节毛发生长的研究进展 |
| 1.1 VEGF的分子特征与功能 |
| 1.1.1 VEGF的分子特征 |
| 1.1.2 VEGF的分子功能 |
| 1.1.3 VEGF促进毛发生长的研究进展 |
| 1.2 FGF5 的分子特征与功能 |
| 1.2.1 FGFs的分子特征 |
| 1.2.2 FGF5 的生物学功能 |
| 1.2.3 FGF5 促进毛发生长的调控机制 |
| 1.3 结语 |
| 第二部分 研究论文 |
| 第一章 VEGF在 FGF5 位点定点整合基因编辑绒山羊的鉴定及检测 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.2.1 试剂耗材 |
| 1.2.2 仪器设备 |
| 1.2.3 溶液配制 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定 |
| 1.3.2 基因编辑绒山羊产绒性能检测 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 基因编辑绒山羊基因整合情况鉴定 |
| 1.4.2 基因编辑绒山羊产绒性能检测 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 VEGF在 FGF5 位点定点整合基因编辑绒山羊的多组学分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 试剂耗材 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 转录组学研究 |
| 2.3.2 TMT蛋白质组学研究 |
| 2.3.3 LC-MS非靶向代谢组学研究 |
| 2.3.4 VEGF和 FGF5与PI3K-AKT信号通路 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 转录组学研究 |
| 2.4.2 TMT蛋白质组学研究 |
| 2.4.3 LC-MS非靶向代谢组学研究 |
| 2.4.4 VEGF和 FGF5与PI3K-AKT信号通路 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 VEGF和 FGF5 调节绒山羊绒毛生长的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 试剂耗材 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 细胞增殖检测 |
| 3.3.3 细胞凋亡检测 |
| 3.3.4 细胞周期检测 |
| 3.3.5 Real-Time PCR检测 |
| 3.3.6 Western Blot检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 细胞增殖检测 |
| 3.4.2 细胞凋亡检测 |
| 3.4.3 细胞周期检测 |
| 3.4.4 Real-Time PCR检测 |
| 3.4.5 Western Blot检测 |
| 3.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及专利 |
（3）ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 ILT4对非小细胞肺癌血管生成的作用和预后分析 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ILT4调控非小细胞肺癌血管内皮细胞迁移和血管生成的机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 第三部分体内验证ILT4通过诱导血管生成促进肿瘤进展 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述:ILT4和VEGF-A的研究现状与进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 外文论文Ⅰ |
| 外文论文Ⅱ |
（4）小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 哺乳动物眼球及角膜结构 |
| 1.1.1 眼球的结构 |
| 1.1.2 角膜的结构 |
| 1.2 角膜碱烧伤引起的主要不良病变 |
| 1.3 小鼠角膜碱烧伤引起的血管新生和纤维化病变研究 |
| 1.3.1 哺乳动物角膜碱烧伤引起的血管新生 |
| 1.3.2 哺乳动物角膜碱烧伤引起的角质细胞向成纤维细胞和肌成纤维细胞的转化 |
| 1.4 角膜碱烧伤的甲基化调控研究 |
| 1.4.1 表观调控及甲基化调控简介 |
| 1.4.2 角膜疾病中的甲基化调控研究及研究意义 |
| 1.5 角膜碱烧伤引起的炎症反应和免疫应答 |
| 1.6 Rapamycin(Rapa)对角膜碱烧伤治疗的研究 |
| 1.6.1 Rapa及mTOR简介 |
| 1.6.2 Rapa在碱烧伤治疗中的应用和研究意义 |
| 1.7 PI3K/AKT/mTOR、MAPK信号通路和HIF-1 对角膜碱烧伤影响的研究 |
| 1.7.1 PI3K/AKT/m TOR信号通路对血管生成的调控 |
| 1.7.2 HIF-1/VEGF通路对血管生成的调控 |
| 1.7.3 MAPK信号通路对血管生成的调控 |
| 1.8 选题依据、意义及研究内容 |
| 1.9 本研究的创新 |
| 第二章mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控、转录因子调控及信号通路PI3K/AKT和 MAPK/ERK调控 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要药物和试剂 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 实验动物及模型建立 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 碱烧伤引起的角膜新生血管形态学数据采集 |
| 2.3.2 石蜡切片和Hematoxylin and Eosin(H&E)染色 |
| 2.3.3 冰冻切片及CD31、HIF-1α和VEGF免疫荧光染色 |
| 2.3.4 石蜡切片和Brd U免疫荧光染色 |
| 2.3.5 RNA提取及实时定量聚合酶链式反应(Quantitativereal-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 2.3.6 DNA亚硫酸氢钠测序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP) |
| 2.3.7 电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA) |
| 2.3.8 蛋白提取及Western blot |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 时间梯度的筛选和建立 |
| 2.4.2 碱烧伤引起的角膜血管新生和Rapa处理对其形态的影响 |
| 2.4.3 碱烧伤及Rapa处理对角膜上皮层和基质层结构的影响 |
| 2.4.4 碱烧伤及Rapa处理对角膜细胞增殖的影响(Brd U+细胞染色) |
| 2.4.5 碱烧伤及Rapa处理对角膜血管生成的影响(CD31 染色) |
| 2.4.6 碱烧伤及Rapa处理对角膜VEGF和 α-SMA表达的影响 |
| 2.4.7mTOR因子介导的小鼠角膜碱烧伤及Rapa干预下血管生成的甲基化调控(DNA水平调控) |
| 2.4.8 转录因子ETV对去甲基化位点的负调控(转录水平调控) |
| 2.4.9 Rapa通过抑制碱烧伤诱导的PI3K/AKT/mTOR、HIF-1和MAPK信号通路活化,降低了VEGF的表达(蛋白水平调控) |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 碱烧伤诱导VEGF和 α-SMA表达与Rapa对角膜血管生成和纤维化的抑制作用 |
| 2.5.2 碱烧伤引起的角膜组织损伤和Rapa对其的修复 |
| 2.5.3 角膜碱烧伤及Rapa对其修复的分子机制 |
| 2.6 本章主要结论 |
| 第三章 小鼠角膜碱烧伤及Rapa治疗过程中的免疫应答 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 主要药物和试剂 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 实验动物及模型建立 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠血清的采集 |
| 3.3.2 石蜡切片和H&E染色 |
| 3.3.3 CD45、F4/80和MPO冰冻切片的免疫荧光染色 |
| 3.3.4 RNA提取及qRT-PCR |
| 3.3.5 血清中TGF-β和 Foxp3的ELISA测定 |
| 3.3.6 流式细胞术对脾脏淋巴细胞的测定 |
| 3.3.7 角膜中TNF-α、MMP-2、p-mTOR和VEGF蛋白的检测 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CD45+、F4/80+、MPO+细胞通过角膜缘浸润进入基质 |
| 3.4.2 Rapa抑制碱烧伤诱导的炎症因子高表达 |
| 3.4.3 脾脏T细胞对小鼠角膜碱烧伤及Rapa处理的响应 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 碱烧伤引起的炎症细胞浸润和Rapa对其过程的抑制 |
| 3.5.2 Rapa在多重细胞因子调控的炎症和血管生成中发挥作用 |
| 3.5.3 MMP-2对碱烧伤引起的血管重构发挥炎症因子作用 |
| 3.5.4 Rapa通过诱导CD4+CD25highTreg细胞生成调控角膜的损伤修复 |
| 3.6 本章主要结论 |
| Rapa在角膜碱烧伤诱导的损伤应答中的主要作用 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 长期扩增培养的BM-MSCs中c-Cbl与Akt蛋白的活化水平及相互作用关系 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促血管生成相关功能的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面血管生成的影响 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs促进糖尿病创面愈合的影响 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 脂筏在血管生成调控中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）双靶向VEGF和PFKFB3诱导胶质母细胞瘤血管正常化及MRI评价（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 材料与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 第三章 靶向抑制VEGF和 PFKFB3 协同增效胶质母细胞瘤血管正常化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 胶质母细胞瘤治疗响应动态变化及肿瘤血管正常化MRI评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 肿瘤血管正常化及影像学评价研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究意义 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 视网膜血管的发育 |
| 1.2.2 视网膜血管生成异常眼病的治疗进展 |
| 1.2.3 小鼠模型在视网膜血管发育研究中的应用 |
| 1.2.4 家族性渗出性玻璃体视网膜病变的研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的结构安排 |
| 第二章 TMEM30A在视网膜血管生成中的功能研究 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验所需溶液的配制 |
| 2.2.3 人视网膜细胞的培养 |
| 2.2.4 人视网膜血管内皮细胞的感染 |
| 2.2.5 Trizol法提取细胞总RNA |
| 2.2.6 RNA的逆转录及实时定量PCR |
| 2.2.7 血管形成实验 |
| 2.2.8 细胞蛋白的提取 |
| 2.2.9 蛋白免疫印记实验 |
| 2.2.10 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 2.2.11 实验小鼠基因型鉴定 |
| 2.2.12 视网膜铺片的制备 |
| 2.2.13 视网膜铺片的免疫荧光染色 |
| 2.2.14 冰冻切片的制备 |
| 2.2.15 免疫组化染色 |
| 2.2.16 视网膜铺片增殖染色 |
| 2.2.17 小鼠组织蛋白提取 |
| 2.2.18 细胞凋亡检测 |
| 2.2.19 转录组测序分析 |
| 2.2.20 实时荧光定量PCR |
| 2.2.21 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 磷脂内翻酶及TMEM30A在血管内皮细胞中广泛表达 |
| 2.3.2 人视网膜血管内皮细胞敲减TMEM30A后成管异常 |
| 2.3.3 血管内皮细胞敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.4 全身敲除Tmem30a导致小鼠视网膜血管发育异常 |
| 2.3.5 TMEM30A影响血管内皮细胞增殖与VEGF的信号传导 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 TWIST1在视网膜病理性血管生成中的功能研究 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验小鼠模型的构建与诱导 |
| 3.2.3 实验小鼠基因型鉴定 |
| 3.2.4 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 3.2.5 人视网膜血管内皮细胞中TWIST1的过表达 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 TWIST1 在正常血管内皮细胞中表达量较低 |
| 3.3.2 血管内皮细胞过表达Twist1的小鼠视网膜表层血管发育异常 |
| 3.3.3 血管内皮细胞过表达Twist1促进血管内皮细胞增殖 |
| 3.3.4 血管内皮细胞过表达Twist1影响血管内皮细胞极性 |
| 3.3.5 血管内皮细胞过表达Twist1影响VEGF分泌 |
| 3.3.6 过表达TWIST1后Norrin/β-catenin信号通路活性上调 |
| 3.3.7 全身过表达Twist1的小鼠的视网膜血管发育异常 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 家族性渗出性玻璃体视网膜病变家系致病相关突变筛查 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 样本收集及伦理审查 |
| 4.2.3 外周血收集及DNA提取 |
| 4.2.4 全外显子测序 |
| 4.2.5 全外显子测序结果的生物信息学分析 |
| 4.2.6 致病基因筛选原则 |
| 4.2.7 Sanger测序验证筛选到的致病基因 |
| 4.2.8 点突变质粒的构建 |
| 4.2.9 HEK293STF中的Norrin/β-catenin信号通路活性测定 |
| 4.2.10 人视网膜血管内皮细胞中DLG1的敲减 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 家族性渗出性玻璃体视网膜病变患者临床表型评估 |
| 4.3.2 家族性渗出性玻璃体视网膜病变致病基因筛选 |
| 4.3.3 S598G突变影响了DLG1功能的正常发挥 |
| 4.3.4 DLG1在人视网膜血管内皮细胞及小鼠各组织中广泛表达 |
| 4.3.5 敲减DLG1影响了血管内皮细胞的正常成管 |
| 4.3.6 敲减DLG1影响了VEGFR2的磷酸化 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）调节的淋巴管内皮细胞在异位骨化中的作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 FGFR3在Col2~+细胞来源的淋巴管内皮细胞敲除加重获得性异位骨化形成 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 FGFR3 在淋巴管内皮细胞缺失抑制局部淋巴管生成加重局部炎症促进异位骨化形成 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 FGFR3 缺失通过上调BMPR1a-p Smad1/5 抑制淋巴管生成加重异位骨化 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 FGF/FGFR信号与血管/淋巴管生成研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间所发表论文 |
| 致谢 |
（9）双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 主要试剂及仪器 |
| 绪论和引言 |
| 绪论 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 血管瘤 |
| 2 血管瘤的生物学 |
| 3 双酚S |
| 4 双酚S在血管瘤细胞中诱导EMT |
| 5 双酚S通过bFGF的上调触发血管瘤细胞的增殖及其细胞周期的转变 |
| 6 血管瘤治疗 |
| 7 血管生成信号通路间的联系 |
| 8 总结和展望 |
| 第1章 双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子诱发血管瘤细胞恶性变 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 细胞培养与处理 |
| 1.1.2 细胞增殖测定 |
| 1.1.3 细胞集落形成试验 |
| 1.1.4 细胞周期分析 |
| 1.1.5 实时RT-PCR分析 |
| 1.1.6 蛋白质印迹分析 |
| 1.1.7 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 1.1.8 启动子活性分析 |
| 1.1.9 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BPS诱导HA细胞的增殖和细胞周期转变 |
| 1.2.2 BPS增加HA细胞bFGF的表达 |
| 1.2.3 bFGF参与BPS诱导的HA细胞增殖 |
| 1.2.4 BPS可以增加bFGF的转录和m RNA稳定性 |
| 1.2.5 NF-κB参与BPS诱导的HA细胞bFGF表达 |
| 1.2.6 miR-155-5p参与BPS增强bFGF mRNA稳定性 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 BPS通过增加HA细胞中碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达增加HA细胞增殖和迁移的机制 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 细胞及细胞处理 |
| 2.1.2 细胞转染及抑制剂 |
| 2.1.3 实验分组 |
| 2.1.4 逆转录定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.1.5 蛋白质免疫印迹 |
| 2.1.6 细胞增殖测定 |
| 2.1.7 细胞凋亡分析 |
| 2.1.8 细胞迁移试验 |
| 2.1.9 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 BPS诱导bFGF、VEGF、FGFR1 表达 |
| 2.2.2 BPS诱导细胞增殖 |
| 2.2.3 细胞凋亡及活力检测 |
| 2.2.4 BPS促进血管瘤细胞的迁移侵袭 |
| 2.2.5 NF-κB参与BPS诱导的细胞中bFGF的表达 |
| 2.2.6 蛋白印迹分析bFGF/ FGFR1 含量 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 BPS通过激活和增加缺氧诱导因子(HIF)-1α增加b FGF表达的分子机制 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 细胞处理及siRNA |
| 3.1.3 实验分组 |
| 3.1.4 蛋白质免疫印迹 |
| 3.1.5 MTT检测细胞增殖 |
| 3.1.6 TUNEL分析 |
| 3.1.7 逆转录定量PCR(RT-qPCR) |
| 3.1.8 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 BPS以剂量浓度方式促进血管瘤细胞中HIF-1α及 bFGF蛋白表达 |
| 3.2.2 BPS以时间依赖性方式促进血管瘤细胞中HIF-1α及 bFGF蛋白表达 |
| 3.2.3 BPS促进血管瘤细胞增殖 |
| 3.2.4 TUNEL染色分析 |
| 3.2.5 BPS通过激活HIF-1α增加bFGF的表达 |
| 3.2.6 BPS促进血管瘤细胞中STAT3和Bcl-2 的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 BPS通过上调HIF-1α和下调miR-195 来增加bFGF的表达来触发HA细胞的恶性发展的机制 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 BPS下调miR-195 和上调bFGF水平 |
| 4.2.2 miR-195 模拟物抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 |
| 4.2.3 miR-195 抑制剂促进增殖并阻止细胞凋亡 |
| 4.2.4 HIF-1α被确定为miR-195 的直接靶标 |
| 4.2.5 miR-195 调控HIF-1α和 b FGF水平 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第7章 结论 |
| 创新点及不足 |
| 参考文献 |
| 作者简介及博士期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（10）LINC00667通过稳定VEGFA促进肺腺癌血管生成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文索引 |
| 引言 |
| 第一部分 LINC00667在肺腺癌组织的表达及临床意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 标本 |
| 2.2 试剂 |
| 2.3 仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 LncRNA基因芯片分析 |
| 3.2 Real-time PCR方法检测肺腺癌组织及细胞系中差异LncRNA表达 |
| 3.3 分析LINC00667与肺腺癌患者临床数据的相关性 |
| 3.1 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 LncRNA基因芯片分析结果 |
| 4.2 LINC0667在肺腺癌组织及细胞中表达水平较高且与临床参数相关 |
| 4.3 LINC00667的表达与临床特征的关系 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 沉默LINC00667抑制肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株:同第一部分 |
| 2.2 载体及慢病毒辅助包装载体 |
| 2.3 试剂 |
| 2.4 设备 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 慢病毒载体的构建 |
| 3.2 慢病毒感染SPC-A1和H1299细胞 |
| 3.3 RT-qPCR检测沉默LINC00667对SPC-A1和H1299细胞株中LNC00667表达的影响 |
| 3.4 CCK8法检测LINC00667对SPC-A1和H1299细胞增殖能力的影响 |
| 3.5 TRASWELL检测沉默沉默LINC00667对SPC-A1和H1299细胞迁移能力的影响 |
| 3.6 Tube formation assay血管成管实验检测沉默LINC00667后血管生成影响 |
| 3.7 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 构建沉默LINC00667慢病毒载体 |
| 4.2 沉默LINC00667对SPC-A1和H1299细胞中LINC00667表达的影响 |
| 4.3 CCK8法检测shLINC00667对SPC-A1和H1299细胞增殖能力的影响 |
| 4.4 TRASWELL实验检测shLINC00667对SPC-A1和H1299细胞迁移能力的影响 |
| 4.5 Tube formation assay技术检测shLINC00667对SPC-A1和H1299细胞血管生成的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LINC00667通过EIF4A3调控VEGFA通路促进肺腺癌血管生成 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 细胞株、细菌、慢病毒载体(同第一、二部分) |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 主要仪器 |
| 2.4 计算机信息学相关网站和计算机分析软件 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 生物信息软件微阵列分析(Microarray analysis)与LINC00667相关的RNA结合蛋白 |
| 3.2 Real time-qPCR方法检测肺腺癌标本中VEGFA及EIF4A3的表达 |
| 3.3 上调VEGFA慢病毒载体转染SPC-A1和H1299细胞 |
| 3.4 Westem-blot方法检测沉默LINC006676对SPC-A1和H1299细胞中VEGFA、EIF4A 表达的影响 |
| 3.5 Westem-blot方法检测沉默EIF4A3对SPC-A1和H1299细胞中VEGFA表达的影响 |
| 3.6 双荧光素酶报告检测(Dual-luciferase reporter assay) |
| 3.7 RNA免疫沉淀(RIP)分析 |
| 3.8 RNA pull-down assay |
| 3.9 Fluorescence in situ hybridization (FISH) |
| 3.10 统计学分析 |
| 4 结果 |
| 4.1 微阵列分析结果 |
| 4.2 沉默LINC00667对VEGFA表达影响 |
| 4.3 过表达VEGFA细胞功能验证结果 |
| 4.4 EIF4A3表达水平的检测结果 |
| 4.5 抑制EIF4A3活性后细胞功能验证结果 |
| 4.6 VEGFA为LINC00667影响NSCLC的靶点 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 脉管生成机制及其在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在校期间发表论文 |
| 致谢 |
四、FGF和VEGF在血管生成中的作用（论文参考文献）
- [1]菊苣酸作用BM-EPCs抑制血管生成的体外实验研究[D]. 令狐熙涛. 遵义医科大学, 2021(01)
- [2]VEGF和FGF5调节绒山羊绒毛生长机制的研究[D]. 呼啸. 内蒙古大学, 2021(10)
- [3]ILT4调控非小细胞肺癌血管生成的作用和机制研究[D]. 宫文静. 山东大学, 2021(11)
- [4]小鼠角膜碱烧伤及雷帕霉素对其修复的机制研究[D]. 李建德. 兰州大学, 2021(09)
- [5]c-Cbl对长期扩增培养的BM-MSCs用于促进血管生成及糖尿病创面愈合的影响[D]. 谌程程. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [6]双靶向VEGF和PFKFB3诱导胶质母细胞瘤血管正常化及MRI评价[D]. 张俊峰. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [7]视网膜血管生成异常眼病的相关基因研究[D]. 张珊珊. 电子科技大学, 2021(01)
- [8]成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）调节的淋巴管内皮细胞在异位骨化中的作用及其机制研究[D]. 张大力. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021
- [9]双酚S通过调节碱性成纤维细胞生长因子影响恶性血管瘤细胞生物学特性的机制[D]. 刘大海. 吉林大学, 2020(08)
- [10]LINC00667通过稳定VEGFA促进肺腺癌血管生成机制研究[D]. 杨会珍. 郑州大学, 2020(02)