一、应用噬菌体随机9肽库淘筛汉滩病毒核衣壳蛋白B细胞表位（论文文献综述）
冯凌譞[1]（2020）在《噬菌体展示技术筛选人IFN-γ抗原表位》文中认为干扰素（IFNs）是一种由免疫细胞分泌的细胞因子,目前已知的干扰素有3类,IFN-γ是II型干扰素家族中唯一的成员,因其突出的免疫调节能力,又被称作免疫干扰素。虽然IFN-γ在先天和获得性免疫应答、肿瘤监测以及对抗病毒和细菌感染中发挥着重要作用,但IFN-γ的过度表达也会导致很多疾病的发生。应用抗IFN-γ抗体中和体内过多的IFN-γ,被认为是一种有效的治疗手段。然而,鼠源抗体或是人鼠嵌合抗体用于人体后,会引起机体不同程度的免疫应答,不仅影响药效,而且会产生过敏反应。因此,免疫原性较低的全人源抗体药越来越受到研究人员和医疗工作者的重视。利用转基因小鼠制备全人源抗体是一种成熟且可靠的方法,但由于其漫长的研发周期和巨额的资金投入,限制了该方法的广泛使用。于是许多研究人员将目光放在了噬菌体展示技术上,该技术是一种从大量变异体中选出目的多肽或蛋白的体外筛选技术。可利用人免疫球蛋白序列构建全人源抗体库,再以多肽或蛋白为标靶,筛选出全人源抗体。本研究以实验室自有质粒pET28a-IFN-γ为模板扩增出人IFN-γ基因全长片段,经DNA酶随机酶切得到50bp200bp的基因片段,将基因片段连接至pComb-EcoRV载体,电转入TG1感受态细胞中,构建噬菌体基因片段肽库,文库库容量为5.1×106cfu/mL,随机挑选单克隆基因测序,计算文库正确率为10%。再以实验室已经获得的鼠源抗IFN-γ单克隆抗体为靶标,对噬菌体肽库进行了5轮生物淘选,利用多克隆phage ELISA检测富集效果以判定淘选效果,随后以单克隆phage ELISA结果为参考,挑选高显色值单克隆进行基因测序,最后得到4株测序结果与IFN-γ同源的单克隆,提示该4段序列为对应鼠源抗IFN-γ单克隆抗体的潜在抗原表位。综上所述,本研究为后续利用噬菌体抗体库筛选全人源抗IFN-γ单克隆抗体的研究奠定了基础。
李卓[2]（2017）在《人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定》文中研究表明肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）是一种以发热、出血、急性肾功能损害为特征的急性传染病,通常由汉坦病毒（Hantaviruses,HTV）感染引起,在世界范围内广泛分布,中国是世界上发病人数最多的国家,而陕西省为我国HFRS的高发地区之一。长期以来,我国通过对重点疫区人群进行疫苗接种预防HFRS的发生,因此需要对HFRS疫苗的免疫效果进行定期评价。抗汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）抗体特别是中和抗体（neutralizing antibody,NAb）可直接与HTNV结合,参与机体对病毒的免疫清除。鼠源性抗体因为异源性反应很难应用于人体,目前很少有人源性抗体用于HFRS的紧急预防和治疗,因此,制备具有潜在中和活性的人源性抗体十分必要。本研究在评价了HFRS抗体检测试剂盒和疫苗接种者免疫接种效果的基础上,建立了疫苗接种者的B淋巴母细胞系（Blymphoblastoid cell lines,BLCLs）。将NAb阳性的疫苗接种者和HFRS患者的BLCLs抗体基因重组到噬菌体载体上,建立噬菌体Fab抗体库,筛选HTNV特异性抗体和中和活性抗体,经表达、纯化和鉴定获得了具有潜在中和活性的人源性抗HTNV Fab抗体,为HFRS的紧急预防、治疗以及疾病的诊断提供新的途径。为此,我们进行了以下实验:第一部分:HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化首先,基于HTNV抗体检测的需要,评价了国产与进口HFRS IgG抗体ELISA试剂盒的性能,结果表明国产试剂盒敏感性高,进口试剂盒特异性强。然后,采集疫苗接种者的血液标本,应用EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）转化技术建立了70株疫苗接种者BLCLs,检测了疫苗接种者的血清标本和BLCLs培养上清中HTNV特异性抗体,评价了咸阳地区HFRS疫苗接种的免疫效果。疫苗接种人群血清中HTNV核蛋白（nucleocapsid protein,NP）特异的IgM、IgG抗体以及HTNV NAb的水平和阳性率明显升高,三者具有较好的相关性;最强烈的抗体分泌反应发生在接种疫苗后3个月,与血清检测结果一致,表明针对HFRS的疫苗免疫接种计划在中国西北地区人群中可以有效地诱导体液免疫应答。最后,明确了NAb阳性的BLCLs（占44%）并对BLCLs进行了克隆化,NAb阳性的35株BLCLs（HFRS疫苗接种者与科室保存的患者BLCLs）为构建具有潜在中和活性的噬菌体抗体库提供基因资源;BLCLs的成功克隆化有望为单克隆抗体制备开辟新的途径。第二部分:抗HTNV噬菌体Fab抗体库的构建和筛选提取NAb阳性BLCLs的mRNA并合成cDNA,应用噬菌体展示技术建立了库容量为1.3×109的抗HTNV噬菌体Fab抗体库,Fab的阳性插入率为95%,抗体序列正确率为68%。以HTNV全抗原为靶分子,用固相筛选法经过4轮“吸附-洗脱-扩增”,对洗脱的噬菌体滴度进行测定,结果显示回收率明显增加。筛选前随机克隆测序正确率为68%,第4轮筛选后随机克隆测序正确率为81%;筛选前多样性为95%,第4轮筛选后多样性为31%。经Phage-ELISA检测,最终从第3、4轮筛选的50个克隆中选出了15个序列正确的特异性强的HTNV噬菌体Fab抗体。通过此部分实验,我们成功构建了抗HTNV噬菌体Fab抗体库并对其进行了筛选。第三部分:人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达和中和活性检测将第二部分筛选获得的特异性HTNV Fab噬菌体转染Ecoli.HB2151,诱导表达制备可溶性HTNV Fab抗体,并应用亲和层析法进行纯化。表达及纯化产物经还原电泳检测分析,发现在约25kDa处出现明显目的条带,与Fab的预期大小相符。间接ELISA表明这些可溶性HTNV Fab抗体均能与HTNV特异性结合。病毒中和实验结果显示3个Fab抗体具有中和活性。测序分析了15个Fab抗体轻链和重链可变区氨基酸序列,结果表明这些Fab抗体分属于6个抗体家族,大多数轻链和重链属于V3和V4家族,以IGKV3-20*01、IGHV4-59*01家族为主。同源性分析显示,3个具有中和活性的Fab抗体基因序列来自人胚系基因,未发现与其完全相同的抗体基因序列。第四部分:HTNV感染巨噬样人急性单核细胞白血病细胞系（differentiated THP-1,dTHP-1）诱导内质网应激（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）反应HTV感染机体后可诱导强烈的免疫应答,但其致病机制尚未明确,我们从ER stress的角度,初步观测了HTNV感染对dTHP-1内质网应激的影响。检测结果显示HTNV感染dTHP-1细胞后,其内质网应激标志性分子葡萄糖调节蛋白（78kDa glucose-regulated protein,GRP78）的mRNA和蛋白水平、X盒结合蛋白1（X box-binding protein 1,XBP-1）的mRNA水平均明显升高,表明HTNV感染可以诱导dTHP-1启动ER Stress。而在病毒感染后2h,C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein,CHOP）的mRNA水平在病毒感染组与未感染组无明显差异;凋亡检测结果显示,HTNV感染dTHP-1 12h后细胞未发生明显凋亡;这些结果提示HTNV诱导的ER Stress在病毒感染早期（12h内）并未直接导致dTHP-1凋亡。
刘丹丹[3]（2015）在《猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌体免疫纳米抗体库构建及抗Cap纳米抗体的筛选》文中指出猪圆环病毒II型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起PCV2相关疾病（PCV2-associated diseases,PCVAD）的主要病原。PCVAD目前呈世界范围内广泛流行,给全世界养猪业造成了重大经济损失。PCV2为单股环状负链DNA病毒,也是目前已知最小动物病毒,Cap蛋白为PCV2唯一结构蛋白,同时也是临床上PCVAD预防和诊断的主要靶标。PCV2的快速检测是预防PCVAD的重要手段之一。为建立快速有效的PCV2血清学检测方法,本研究以商品化PCV2亚单位疫苗为免疫原免疫双峰驼,构建骆驼重链可变区抗体（Single-domain variable heavy chain antibody,VHH or nanobodies）噬菌体免疫库。以原核表达的PCV2 Cap病毒样颗粒（viral like particles,VLPs）为抗原,生物淘洗筛选针对PCV2 Cap的VHHs,为PCV2抗原检测提供高质量抗体。本研究内容分为3部分:1.筛选用抗原制备构建表达Cap蛋白的重组表达质粒pET32a-SUMO-Cap。转入E.coli BL21（DE3）,诱导表达并纯化重组Cap蛋白,经SUMO蛋白酶Ulp酶切裂解和Ni2+亲和树脂纯化后获得无任何多余氨基酸的Cap蛋白。进一步经透射电镜观察发现,无多余氨基酸的PCV2Cap蛋白能在体外自组装形成病毒样颗粒（VLPs）。2.构建文库用噬菌粒的改造以商品化噬菌粒pCANTAB5E为载体骨架,通过Linker引入,将pCANTAB5E载体上用于VHH文库插入的Sfi I、Not I双酶切位点变成两个识别序列不同的Sfi I酶切位点。在两个Sfi I酶切位点之间进一步引入CAT/Ccdb正负筛选标签。获得构建VHH文库用噬菌粒pCANTAB5E-Ccdb-cm。克隆效率检测结果发现,改造后的pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒与商品化噬菌粒pCANTAB5E相比,显着提高了VHH的克隆效率。3.利用PCV2商品化亚单位疫苗免疫双峰驼,免疫5次后,分离外周血淋巴细胞,提取总RNA反转录后,两步法扩增获得VHH库。将扩增的VHH库与pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒经Sfi I酶切后,连接转化大肠杆菌TG1感受态细胞,成功构建了可用于Cap蛋白VHH淘筛的VHH噬菌体初级库（库容6×106,插入率100%,多样性丰富）。以Cap VLPs为淘筛抗原,通过4轮淘筛和phage-ELISA检测,获得了4株反应性较好的VHHs。本研究构建了PCV2噬菌体免疫纳米抗体库,并筛选到了4株具有抗Cap活性的VHHs,为以VHH抗体为基础的PCV2抗原检测试剂盒研发和PCV2致病机理研究奠定了基础。
杨栋强,白雪帆[4]（2012）在《噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用》文中指出噬菌体展示技术是近年发展起来的新技术,在研究蛋白质与蛋白质之间、抗原抗体之间的相互作用、新药开发、疾病诊断、疫苗研制以及病毒研究等方面具有广泛应用。文中就噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用现状作一综述。
杨栋强[5]（2012）在《汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定》文中进行了进一步梳理肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）和汉坦病毒肺综合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）均是由汉坦病毒属病毒（hantaviruses）引起的自然疫源性疾病，目前全世界每年仍有5～10万HFRS和HPS病例发生，病死率因感染的病毒型别而异，自0.1%～40%不等[1-3]。我国是当今世界上受HFRS危害最为严重的国家之一，自建国后至2010年年末，已累计发现上报出血热病例近160万，占到同期世界上总发病例数的83%以上[4]。由于HFRS多散在发生，且早期主要在农村和城镇周边中小医院救治，难以组织开展较大样本、随机、双盲和对照的临床研究，对各种治疗药物和治疗方案的评价仍缺乏高质量的循证医学的证据，远远落后于乙型和丙型病毒性肝炎等高发传染病。目前临床上抗汉坦病毒感染的治疗药物仍限于利巴韦林和干扰素α等少数品种。且时至今日，美国FDA仍未批准包括利巴韦林等在内的任何针对HFRS和HPS的特效治疗药物[5]。因此，深入探讨汉坦病毒致病的分子机理，进而寻找有效的治疗靶点和抗病毒药物仍是HFRS防治的重要任务。抗微生物肽是近些年发现的新型活性生物分子。短肽或寡肽类分子具有分子量小、抗原性弱、活性强、穿透力强、易于制备且比较容易与靶分子结合等优点，是当前治疗肿瘤和感染等疾病的有效靶向药剂。功能性多肽的筛选工作量十分浩大，需要高通量的筛选技术，而噬菌体展示技术恰好可满足该项工作的需要[6-8]。已知病毒感染靶细胞的第一步是病毒进入（entry）细胞质内，通常需要病毒吸附蛋白或表位与靶细胞的特定受体结合[9]。近年研究表明β3整合素是汉坦病毒感染靶细胞的关键受体，并且可能参与了血管屏障功能的维持，封闭或阻断β3整合素已成为抗汉坦病毒治疗研究的重要策略之一[10-11]。本研究在既往对β3整合素和汉坦病毒感染的基础上，应用噬菌体展示技术，以β3整合素为靶分子，对噬菌体七肽展示库进行8轮亲和筛选，获得结合β3整合素的噬菌体蓝色克隆，挑取其中结合力比较强的克隆，测得插入其中的外源性DNA序列，并推导出各自对应的多肽序列，然后应用生物信息学软件分析多肽序列的特性，同时行同源性分析，从而找出特异性结合且与比对序列有相似生物学特性、较高同源性的多肽序列。继之请生物公司合成这些多肽序列，用病毒感染阻断实验对这些多肽的抗汉坦病毒的活性进行初步测试，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。本课题研究内容和结果如下：1.细菌生长的测定用标有不同时间的锥形瓶和摇菌管分别培育大肠埃希菌E.coliER2738，以用于噬菌体的扩增，培养相应的时间后用分光光度计测定600nm波长的OD值，最终找出最佳摇菌时间。结果发现扩增噬菌体时，最佳摇菌时间为2.5h；测滴度时，最佳摇菌时间为5.5h。2.噬菌体肽库的淘筛应用亲和富集法对噬菌体7肽库进行8轮筛选，β3整合素用量逐轮减少，并逐轮缩短结合时间，逐轮延长洗涤时间和不断增加洗涤液中Tween-20的浓度，以筛选得到高亲和力、特异性强的噬菌体克隆。结果显示每轮淘洗噬菌体数量都有较高的富集，淘筛过程中通过用不同梯度浓度的β3整合素靶分子来改变选择强度，在经过8轮淘筛后，我们筛选出与β3整合素具有较高亲和力和较高活性的短肽。3.融合基因的测序和序列分析比对随机挑取80个克隆，经过DNA测序，得到5条重复率较高结构不同的寡肽序列，分别为TGVKGPG、LPLTPLP、KLTSSPT、SPVGPLP和DHRNHLV。将上述多肽序列与汉滩型病毒囊膜糖蛋白氨基酸序列比对，发现5条短肽与汉滩病毒的囊膜糖蛋白具有较高的同源性。运用生物信息学手段分析这些短肽，发现他们具有与同源序列相似的等电点和典型的疏水性。结论：通过对噬菌体展示肽库的淘筛，获得若干与β3整合素结合并具有潜在抗汉滩病毒的多肽，为进一步设计和获取高活性的抗汉坦病毒短肽奠定了基础。
杨巍[6]（2011）在《猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定》文中提出猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起的一种猪的急性、高度接触性肠道传染病。自1978年报道以来在欧洲以及亚洲许多国家相继爆发,给养猪业带来巨大损失,因此对于PED的诊断以及疫苗的研究就显得尤为重要。PEDV纤突糖蛋白（S）是位于病毒粒子表面的结构蛋白,它既含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,又拥有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位,具有良好的免疫原性。利用生物学软件对PEDV S基因进行了抗原位点分析,在不破坏线性抗原位点的前提下将S基因进行分割获得S基因的片段命名为S1。本试验在高效表达PEDV S1蛋白后,利用噬菌体展示技术筛选并鉴定了能与PEDV S1蛋白相互作用的多肽分子,为进行PED的快速诊断以及开发有效的新型疫苗奠定了基础。本试验成功构建了编码PEDV S1蛋白的pET30a-S1原核重组表达质粒,并在E.Coli Rosetta中进行原核表达。将制备并纯化的重组蛋白进行复性和活性检测,结果表明这种融合蛋白具有一定的生物学活性。以重组蛋白为免疫原免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体。免疫荧光实验以及病毒抑制实验证明此多克隆抗体具有良好的生物学活性。利用噬菌体随机十二肽库,以PEDV S1重组蛋白为靶分子,对其进行了四轮生物淘选。对第四轮洗脱物随机淘选出的10个噬菌体单克隆的核苷酸序列进行测定,并进行多肽序列的推导,结果表明,经过对靶分子的四轮筛选后,最终筛选出三个具有高度同源性的多肽,序列分别是MPAVMSSAQVPR,NLSNRLNLSPGI,YVIHQPYAMALR。ELISA方法对合成多肽的检测结果表明这三条多肽均能与重组的PEDV S1蛋白结合。病毒体外抑制实验表明所筛选出来的其中两条多肽M和N具有良好的生物活性。体内实验通过免疫昆明鼠检测了多肽的抗病毒活性,结果表明多肽M、N在小鼠体内起到了一定的中和病毒的作用。本实验为建立新的PED诊断方法以及新型多肽疫苗的开发提供了一定的理论基础和实验依据。
闫果林[7]（2011）在《汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定》文中指出肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS）是由汉坦病毒（hantavirus，HTV）引起的以鼠类为主要传染源的一种自然疫源性疾病，又称流行性出血热（epidemic hemorrhagic fever，EHF），简称出血热。全球每年新发病例有90%左右在中国；死亡率在2%10%左右。该病在我国绝大多数省区流行，病情危急，危害很大。汉滩病毒（hantaan virus， HTNV）和汉城病毒（Seoul virus， SEOV）是我国HFRS的两种主要病原体。汉坦病毒感染可引起机体明显的适应性免疫应答。体液免疫应答强烈而持久；细胞免疫可能在免疫保护和免疫病理损伤两方面都有作用。汉坦病毒核蛋白是诱导体液免疫应答主要的免疫原，可在发病数天内引起抗体应答。因此，重组核蛋白常被用来检测患者血清中病毒特异性抗体的类型和水平，为HFRS的诊断提供依据。糖蛋白免疫原性较弱，糖蛋白特异性抗体出现稍晚，多在病程中后期。但是，一般认为汉坦病毒糖蛋白是诱导中和抗体产生的主要来源；而据报道，中和抗体出现的早晚与患者的病情及预后密切相关。人感染汉坦病毒后，血清病毒特异性IgG水平随时间延长不断升高，一般于恢复早期达到平台期；持续时间长，有时在病愈后数十年仍可检测到。抗体的产生离不开抗原特异性B细胞的活化、增殖、分化；抗原特异性B细胞接触并结合抗原是体液免疫应答的始动环节；而这离不开B细胞受体（B cell receptor, BCR）对抗原的有效识别。抗原与BCR相互识别、发生作用的结构叫做抗原决定簇（antigenic determinants），又称表位（epitope）。表位是抗原与抗体发生作用的主要部位，是抗体识别抗原的结构基础。研究汉坦病毒结构蛋白特异性抗体识别的B细胞表位对于深入认识病毒致病和抗体产生机制，中和抗体的免疫保护作用，以及研发新的诊断材料、亚单位疫苗等具有重要意义。目前，有关汉滩病毒结构蛋白B细胞表位的报道较少，尚缺乏系统的研究。本论文首次采用合成的重叠多肽对HFRS患者血清抗体识别的HTNV核蛋白（nucleocapsid protein，NP）线性B细胞表位进行了系统分析。把覆盖HTNV NP氨基酸全序列的70条重叠15肽包被于ELISA板，用间接ELISA法筛选了35例HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位，并用竞争ELISA证实了患者血清抗体与抗原肽结合的特异性。发现HFRS患者血清抗体识别的线性B细胞表位主要在NP氨基端（aa1-117），其次为NP羧基端（aa361-429），在NP氨基酸序列的中部仅有数个线性B细胞表位。发现一些患者血清抗原肽特异性IgG水平在急性期可有不同的变化。同时，我们合成了覆盖HTNV GP氨基酸全序列的281条重叠15肽，利用间接ELISA和点杂交两种PepScan法对3D8、3G1、8G3这3株鼠源性中和抗体识别的B细胞表位进行表位作图。首先，将合成的281条重叠多肽分成28组，每10条肽为一组，混合后包被于ELISA板或者NC膜上，用上述3株单克隆抗体做粗筛；然后将与单克隆抗体呈阳性反应的混合肽中各组成肽分别包被ELISA板或NC膜继续用单克隆抗体反应，做细筛，从而确定各单克隆抗体识别的抗原肽。然后用竞争ELISA证实抗原肽与中和抗体结合的特异性。我们发现单克隆抗体3D8和8G3识别HTNV GP抗原肽881-KGFLCPEFPGSFRKK-895，而单克隆抗体3G1可能识别由数个线性肽组成的构象表位。由于原合成肽相邻肽间相差4个氨基酸残基，因此又追加合成了与881-KGFLCPEFPGSFRKK-895分别相差3个、2个、1个氨基酸残基的15肽。将这些肽包被于ELISA板或NC膜上与单克隆抗体3D8反应，进行单克隆抗体3D8识别线性B细胞表位的精细定位。我们发现单克隆抗体3D8与882-GFLCPEFPGSFRKKC-896反应最强烈。接着，用丙氨酸扫描突变法分析882-GFLCPEFPGSFRKKC-896这条抗原肽发挥主要作用的氨基酸残基，发现aa885C、aa896C是该抗原肽表位最关键的氨基酸残基，aa882G、aa883F、aa884L、aa893R、aa894K、aa895K对单克隆抗体3D8识别这个抗原肽表位也有重要影响。本论文首次系统分析了肾综合征出血热患者血清抗体识别的HTNV核蛋白线性B细胞表位，对具有中和作用的单克隆抗体3D8的B细胞表位作图确定了汉滩病毒糖蛋白上一个新的中和表位。这一结果不仅为深入探讨HTNV感染引起的体液免疫应答规律以及研制新型疫苗提供了理论依据，同时为搞清单克隆抗体3D8作为HFRS治疗性抗体的抗病毒感染机制提供了重要的实验依据。
冯烨,涂长春[8]（2009）在《噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用》文中认为感染性疾病是病原体与宿主相互作用的结果。了解病原体与宿主相互作用的分子基础,对于感染性疾病的预防和控制尤为重要。噬菌体展示技术不仅广泛应用于抗原表位作图和抗体工程技术,而且还可用于研究蛋白质与配体的相互作用,以揭示感染过程中蛋白与配体的相互作用机制。本文仅就噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用作一综述。
杨东靖[9]（2009）在《天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究》文中认为汉坦病毒（Hantavirus，HV）归属布尼亚病毒科（Bunyaviridae），是有包膜分节段的负链RNA病毒，病毒基因组由长（L）、中（M）、短（S）三个单股负链RNA片段组成，分别编码RNA聚合酶（RNA polymerase），G1、G2糖蛋白（Glycoprotein，GP）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein，NP）。人感染汉坦病毒后导致肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征（HPS）两种严重的病毒性疾病。我国流行的是HFRS，每年报告病例占全球90％以上，报告发病人数2～5万人。该病在我国分布范围广、疫区类型复杂，已成为危害人民健康和生命安全的重点防治传染病之一。天津地区的HFRS发病率从1999年开始明显上升，是全国发病增长速度最快的地区之一，2002年HFRS的报告发病率达到4．05／10万，为天津市HFRS发病的历史最高水平。为了解天津地区HFRS病原体——汉坦病毒的流行型别、核苷酸序列特征及其进化关系，本研究对天津地区人群感染和鼠间传播的汉坦病毒进行分子流行病学分析；并且鉴于汉坦病毒G2包膜糖蛋白的重要研究地位，本研究在对汉坦病毒L99株G2蛋白进行了全面生物信息学分析的基础上，构建了G2多表位抗原基因mea，并对其进行了表达和蛋白纯化，并建立MEA-ELISA方法用于病人检测。第一部分天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析【目的】针对近年来天津地区肾综合征出血热（HFRS）的疫情形势，对宿主动物传播和HFRS病人感染的HV进行了系统的分子流行病学研究，同时对HFRS患者的早期实验室检测和宿主动物标本的检测进行了方法学研究。【方法】（1）收集16份临床诊断HFRS患者血清，分别用间接免疫荧光方法（IFA）和捕获ELISA方法检测特异性IgG和IgM，用RT-Nested PCR方法检测汉坦病毒核酸并分型，用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。（2）采集天津地区的243份鼠肺标本，用rNP抗体-IFA法检测HV抗原，选取阳性鼠肺标本进行病毒RNA提取和RT-Nested PCR分型。用核苷酸序列测定和生物信息学分析进行同源性比对和种系进化分析。同时，将人群感染的HV与鼠间传播的HV进行序列同源性分析。（3）将HTN型HV感染的鼠肺接种Vero-E6细胞，进行病毒分离，通过RT-PCR和T-A克隆获得其S和M全基因片段，进行核苷酸序列分析、同源性分析和种系发生分析。【结果】（1）16例HFRS患者中，用捕获ELISA法检测特异性IgM的阳性率为52．65％（9／16例），用IFA法检测特异性IgG的阳性率为52．65％（9／16例），有11例RT-Nested PCR结果呈阳性，阳性率为68．75％，并且均为SEO型，并且相互间序列同源性为93．7％～100％。（2）rNP抗体-IFA法检测243份鼠肺标本，10份为阳性，阳性率为4．12％，10份阳性标本经RT-Nested PCR分型，有9株为SEO型，1株HTN型。并且9株SEO型HV的同源性为95．4％～100％。（3）天津地区人群感染与鼠间传播的汉坦病毒M片段的序列（1343～1629 nt）同源性分析发现，源自鼠肺组织的BC0207株与源自HFRS患者的1yf、ssg和hcy株的序列同源性为100％。（4）病毒分离获得HTN型汉坦病毒TJJ16株，其S片段与HTN型Q32毒株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为96．1％和97．9％，其M片段与Q32株的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为99．4％和99．6％；【结论】天津地区人群感染和鼠间传播的HV分子流行病学研究表明均以SEO型为优势流行型，并具有明显区域聚集性特征。首次在社鼠体内分离到1株HTN型毒株TJJ16，与贵州的黑线姬鼠分离株Q32属同一亚型。第二部分汉坦病毒GP多表位抗原基因的构建与表达【目的】构建L99株G2蛋白的多表位抗原基因mea，并进行大肠杆菌表达和纯化，建立MEA-ELISA方法用于HFRS患者特异性抗体的检测。【方法】（1）通过生物信息软件对汉坦病毒L99株M基因及其编码的G2包膜糖蛋白进行了全面综合分析，并从亲水性和表面可及性，抗原性和蛋白二级结构四个方面对其B细胞表位进行分析预测，优选出B细胞表位，引入GPG（甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸）间隔序列将表位串联，设计出G2蛋白的多表位抗原基因mea。（2）利用重叠PCR方法构建mea，并利用pET原核系统表达以获得多表位抗原蛋白MEA，并进行镍亲和层析纯化。（3）利用真核表达载体pcDNA3．1（+）构建L99株G2蛋白的真核表达重组质粒，并经脾和肌肉复合DNA免疫BALB／c小鼠，以获得针对HV G2蛋白抗血清，用IFA法检测抗体效价，用免疫酶细胞化学技术检测抗体特异性。（4）利用G2蛋白抗血清对MEA进行特异性鉴定，并建立MEA-ELISA方法用于临床HFRS患者和健康人特异性抗体的检测。【结果】（1）优选出HV G2蛋白的5个B细胞表位，并构建了长度为534 bp的多表位抗原基因。（2）构建了重组蛋白表达质粒pET32a-mea，对多表位抗原基因mea进行了表达和纯化，获得了纯度为95％的多表位抗原MEA蛋白，得率为0．14mg／mL。（3）构建了真核表达质粒pcDNA3．1-L99G2，并DNA免疫BALB／c小鼠，获得了针对HV G2蛋白的抗血清，抗体效价1：80，质粒转染后胞内产生的瞬时表达G2蛋白证实其抗体特异性。（4）对多表位抗原MEA的抗原性研究表明，DNA免疫抗血清与多表位抗原MEA反应阳性，与重组N蛋白（rNP）反应阴性。（5）MEA-ELISA方法检测30例HFRS患者IgG的阳性率为76．67％，检测10例健康人IgG全部为阴性。【结论】首次构建了汉坦病毒GP的多表位抗原基因，并进行pET原核表达系统表达，获得了多表位抗原MEA，具有高度特异性，可替代HV G2蛋白用于HFRS临床患者特异性抗体的检测，并为构建新型表位疫苗奠定基础。
孙东波[10]（2008）在《猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选》文中研究表明猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。在过去30年间,虽然PEDV常规疫苗被广泛应用,但是PED在各国猪场中的感染仍然非常严重,给养猪业带来巨大经济损失。所以,关于PEDV的新型疫苗、侵入机制和免疫机理的研究是十分必要的。众所周知,病毒的抗原表位、受体与受体结合域在病毒侵染和抗病毒免疫中起着重要作用。S蛋白是PEDV一个表面的结构蛋白,它既含有介导病毒侵入宿主细胞的受体结合域,又拥有介导机体产生病毒中和抗体的抗原表位。鉴于此,本研究对PEDV S蛋白的抗原表位和受体结合域进行筛选与鉴定,为PEDV诊断方法和新型疫苗的研究以及抗病毒免疫策略的设计提供信息。为获得PEDV S基因及其分子特性,本试验克隆了PEDV CV777毒株细胞适应毒的S基因,序列比对结果表明,获得的S基因与PEDV CV777毒株S基因参考序列核苷酸的同原性为99.4 %,推导氨基酸的同原性为99.8 %。S蛋白氨基酸的疏水性、信号肽序列和N-侧链连接糖基化位点分析表明,克隆的S基因保持了其亲本毒株CV777 S基因的分子特性。根据冠状病毒II群成员S蛋白S1和S2亚基之间的保守基序（GxCx和保守九肽）,PEDV S蛋白可以被划分为2个功能区即S1（第1～789位氨基酸）和S2（第790～1383位氨基酸）,其中S1区包含了病毒主要的中和表位和受体结合域。为了分析S蛋白S1区抗原表位特征,利用fd丝状噬菌体展示系统,构建了S1基因特异性肽库,以PEDV多克隆血清为靶蛋白对构建的肽库进行3轮生物淘选,结果获得了3个高亲和力序列,分别命名为S1P1（第248～280位氨基酸）、S1P2（第442～499位氨基酸）和S1P3（第697～742位氨基酸）。ELISA和Western blot结果显示,S1P1、S1P2和S1P3的GST融合蛋白均与PEDV多克隆血清反应,其中S1P3反应性最强。为了进一步揭示S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性,三个短肽GST融合蛋白和它们串联后GST融合蛋白（S1P123-GST）的单因子鼠血清被制备。间接免疫荧光试验（IFA）和ELISA结果证实,抗S1P2、S1P3和S1P123 GST融合蛋白的单因子鼠血清能识别天然的PEDV。本试验结果表明,S1P1、S1P2和S1P3是PEDV S蛋白3个线性抗原表位,S1P2和S1P3表位具有良好的免疫原性。PEDV S蛋白S1区在介导中和抗体产生过程中发挥重要作用。为了鉴定S蛋白S1区的免疫优势区,利用PCR扩增了4个相互重叠、覆盖S1基因的片段,分别命名为S1A、S1B、S1C和S1D。四个片段PCR产物分别克隆到pGEX-6p-1原核表达载体后,经IPTG诱导均获得了表达。Western blot和ELISA结果显示,S1D-GST融合蛋白（第636～789位氨基酸）与PEDV的多克隆抗体具有强反应性。IFA和Western blot结果表明,抗S1D-GST融合蛋白的鼠血清能够识别天然的S蛋白。病毒中和试验表明,S1D-GST融合蛋白能介导鼠产生对PEDV具有中和作用的抗体。为了对中和表位区（S1D）的抗原表位进行精确定位,制备并获得了6株抗S1D特异性的单克隆抗体,Western blot结果显示,6株单克隆抗体均能识别天然的S蛋白。利用噬菌体展示和肽扫描技术对6株单克隆抗体识别的表位进行了鉴定,结果显示,单克隆抗体2C4、3C3和5F8识别的表位是S蛋白的第744～759位氨基酸（S1D5）,单克隆抗体3G3、6E6和3G5识别的表位是S蛋白的第756～771位氨基酸（S1D6）。ELISA和IFA结果表明,抗S1D5和S1D6表位融合蛋白的鼠血清均能识别天然的S蛋白。进一步的肽扫描（Pepscan）结果显示,S1D5表位的核心序列是Y748SNIGVCK755（SS5）,S1D6表位的核心序列是L764QDGQVKI771（SS6）。病毒细胞受体和受体结合域的信息能为病毒疫苗和抗病毒药物设计提供策略。为了揭示PEDV的受体结合域信息,本试验以PEDV可溶性的细胞受体猪氨基肽酶N（pAPN）为靶蛋白对S1基因特异性肽库进行3轮生物淘选,然后对30个淘选的噬菌体克隆进行测序。序列分析发现,2个噬菌体克隆展示无义氨基酸序列,其余28个噬菌体克隆展示的氨基酸序列位于S蛋白第249～529位氨基酸区域,这个区域被命名为MRR。为了进一步印证MRR区与pAPN在体外的相互作用,利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统对MRR基因进行真核表达。Western blot结果表明,表达的MRR重组蛋白能够与兔抗PEDV的多克隆抗体反应。但是,进一步的pull-down实验结果显示,利用抗pAPN的鼠血清通过Western blot检测不到与MRR重组蛋白结合的pAPN。本试验结果提示,PEDV S蛋白第249～529位氨基酸区域（MRR）是pAPN细胞受体的一个潜在的结合区域。本研究鉴定出PEDV S蛋白5个线性抗原表位即S1P1（第248～280位氨基酸）、S1P2（第442～499位氨基酸）、S1P3（第697～742位氨基酸）、SS5（第748～755位氨基酸）和SS6（第764～771位氨基酸）,1个中和表位区（S1D,第636～789位氨基酸）,1个猪氨基肽酶N潜在的受体结合域（MRR,第249～529位氨基酸）。这些抗原表位以及受体结合域的揭示对进一步分析PEDV S蛋白的结构与功能以及建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位的疫苗设计具有指导意义。
二、应用噬菌体随机9肽库淘筛汉滩病毒核衣壳蛋白B细胞表位（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、应用噬菌体随机9肽库淘筛汉滩病毒核衣壳蛋白B细胞表位（论文提纲范文）
（1）噬菌体展示技术筛选人IFN-γ抗原表位（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 噬菌体展示技术 |
| 1.1.1 噬菌体展示技术简介 |
| 1.1.2 丝状噬菌体展示系统 |
| 1.1.3 应用噬菌体肽库研究蛋白抗原表位 |
| 1.2 IFN-γ及其研究进展 |
| 1.2.1 IFN-γ简介 |
| 1.2.2 IFN-γ的结构和理化性质 |
| 1.2.3 IFN-γ的信号通路 |
| 1.2.4 IFN-γ的生物学功能 |
| 1.2.5 IFN-γ与临床的联系 |
| 1.3 选题意义 |
| 1.4 实验路线 |
| 第2章 实验材料 |
| 1.1 菌株与抗体 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 培养基的配制 |
| 1.7 抗生素的配制 |
| 第3章 实验方法 |
| 3.1 噬菌体多肽库的构建 |
| 3.1.1 扩增IFN-γ基因片段 |
| 3.1.2 IFN-γ基因片段化和平齐化 |
| 3.1.3 构建重组载体 |
| 3.1.4 制备电击转化感受态 |
| 3.1.5 电穿孔 |
| 3.1.6 菌落PCR |
| 3.1.7 文库的收集与保存 |
| 3.1.8 测序与结果分析 |
| 3.2 噬菌体多肽库的淘筛 |
| 3.2.1 制备辅助噬菌体M13KO7 |
| 3.2.2 噬菌体多肽文库的扩增 |
| 3.2.3 噬菌体多肽文库的淘选 |
| 3.2.4 多克隆phage ELISA |
| 3.2.5 单克隆phage ELISA |
| 3.2.6 phage ELISA结果判定 |
| 第4章 结果与分析 |
| 4.1 噬菌体多肽库的构建 |
| 4.1.1 扩增IFN-γ基因片段 |
| 4.1.2 IFN-γ基因酶切片段化 |
| 4.1.3 pComb-EcoRV载体酶切 |
| 4.1.4 噬菌体原始文库库容测定 |
| 4.1.5 菌落PCR验证 |
| 4.1.6 测序与文库统计结果 |
| 4.2 噬菌体多肽库的淘筛 |
| 4.2.1 噬菌体原始文库的含菌量和滴度测定结果 |
| 4.2.2 淘选的产率 |
| 4.2.3 多克隆phage ELISA结果 |
| 4.2.4 单克隆phage ELISA结果 |
| 4.2.5 测序结果 |
| 第5章 讨论 |
| 5.1 噬菌体载体的选择 |
| 5.2 噬菌体肽库的种类 |
| 5.3 影响噬菌体肽库多样性的因素 |
| 5.4 抗体人源化与全人源抗体 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结果 |
| 6.2 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（2）人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 1 汉坦病毒概述 |
| 2 汉坦病毒人工制备抗体研究进展 |
| 3 病毒感染与内质网应激 |
| 第一部分 HFRS疫苗接种者和患者BLCLs的建立、筛选和克隆化 |
| 实验一 国产与进口人HFRS IgG抗体ELISA检测试剂盒的性能比较 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 利用EBV转化技术建立HFRS疫苗接种者BLCLs |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 中国西部地区人群HFRS疫苗接种后的抗体反应 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 具有潜在中和活性的HTNV噬菌体抗体库的构建及筛选 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 人源性抗HTNV Fab抗体的可溶性表达及中和活性的检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四部分 HTNV感染巨噬样人急性单核白血病细胞（dTHP-1）诱导内质网应激（ER stress）反应的初步探讨 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（3）猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌体免疫纳米抗体库构建及抗Cap纳米抗体的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 噬菌体展示技术研究进展 |
| 1.1.1 丝状噬菌体结构和生活史 |
| 1.1.2 噬菌体文库的构建 |
| 1.1.3 淘筛 |
| 1.1.4 噬菌体展示技术的发展现状 |
| 1.2 猪圆环病毒2型（PCV2）研究概况 |
| 1.2.1 PCV2遗传型和抗性 |
| 1.2.2 易感类群和传播途径 |
| 1.2.3 病毒生活史及致病机制 |
| 1.2.4 PCVAD |
| 1.2.5 PCV2衣壳蛋白Cap |
| 1.2.6 目前可以使用的商业化疫苗 |
| 1.2.7 试验性PCV2疫苗 |
| 1.2.8 病毒样颗粒（VLP）疫苗 |
| 1.3 纳米抗体及其在诊断上的应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 噬菌粒载体的改造及Cap的病毒样颗粒的制备 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂及仪器 |
| 2.1.3 主要溶液 |
| 2.1.4 引物设计与合成 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 pCANTAB5E-linker载体的构建 |
| 2.2.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm载体的构建 |
| 2.2.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比较 |
| 2.2.4 pET32a-SUMO-Cap表达载体的构建 |
| 2.2.5 重组Cap蛋白的诱导表达 |
| 2.2.6 重组Cap蛋白的大量表达与纯化 |
| 2.2.7 SUMO蛋白酶Ulp的表达与纯化 |
| 2.2.8 His-SUMO-Cap融合蛋白的酶切与纯化 |
| 2.2.9 Cap的病毒样颗粒的鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 pCANTAB5E-linker载体的构建 |
| 2.3.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm载体的构建 |
| 2.3.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比较 |
| 2.3.4 重组Cap蛋白的诱导表达 |
| 2.3.5 重组Cap蛋白的纯化与浓缩 |
| 2.3.6 SUMO蛋白酶Ulp的表达与纯化 |
| 2.3.7 His-SUMO标签的去除及酶切纯化 |
| 2.3.8 Cap蛋白的Western Blotting分析 |
| 2.3.9 VLPs形成的鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 噬菌体展示抗体库的构建和特异性抗体的筛选 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 试验动物及疫苗 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.1.5 主要培养基的配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 动物免疫 |
| 3.2.2 淋巴细胞的分离 |
| 3.2.3 淋巴细胞总RNA的提取 |
| 3.2.4 VHH片段的扩增 |
| 3.2.5 载体和VHH片段的两步酶切 |
| 3.2.6 VHH抗体库的构建及鉴定 |
| 3.2.7 特异性抗体的淘选 |
| 3.2.8 Phage ELISA鉴定抗原阳性重组抗体 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 淋巴细胞分离与RNA提取 |
| 3.3.2 VHH基因的扩增 |
| 3.3.3 载体和VHH片段的两步酶切 |
| 3.3.4 抗体库的构建和插入率检测 |
| 3.3.5 抗体库的丰度和多样性鉴定 |
| 3.3.6 抗体库的淘选 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用（论文提纲范文）
| 0 引 言 |
| 1 噬菌体展示技术的原理和特点 |
| 1.1 噬菌体展示技术原理 |
| 1.2 噬茵体展示技术的特点 |
| 2 噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用 |
| 2.1 抗原表位检测 |
| 2.2 汉坦病毒抗体的研究 |
| 2.3 筛选抗汉坦病毒多肽 |
| 3 结 语 |
（5）汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、汉坦病毒致病的多样性及其治疗现状 |
| 二、噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用 |
| 实验一 利用噬菌体展示技术筛选与汉坦病毒β3 整合素结合的高亲和力肽 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 实验二 噬菌体DNA 的序列测定及生物信息学分析 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 引言 |
| 1.1 猪流行性腹泻研究进展 |
| 1.1.1 猪流行性腹泻的历史背景 |
| 1.1.2 猪流行性腹泻病毒 |
| 1.1.3 猪流行性腹泻的流行病学 |
| 1.1.4 猪流行性腹泻的临床症状和病理变化 |
| 1.1.5 猪流行性腹泻诊断方法 |
| 1.2 PEDV S 蛋白研究进展 |
| 1.3 噬菌体展示技术的研究进展 |
| 1.3.1 噬菌体展示技术的基本原理 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统的类型 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术的应用 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 菌种、载体及质粒 |
| 2.1.3 工具酶、试剂盒和抗体试剂 |
| 2.1.4 标准参照物 |
| 2.1.5 实验试剂的配制 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 重组质粒在大肠杆菌表达系统中的诱导表达 |
| 2.2.3 重组蛋白的纯化、复性及活性鉴定 |
| 2.2.4 多克隆抗血清的制备 |
| 2.2.5 多克隆抗血清的鉴定及生物活性的检测 |
| 2.2.6 噬菌体随机十二肽库对靶分子亲和配体的生物淘选 |
| 2.2.7 结合克隆的特征鉴定 |
| 2.2.8 所选多肽配体共有氨基酸序列的推导及合成 |
| 2.2.9 所选多肽的生物活性鉴定 |
| 2.2.10 噬菌体体内抗病毒活性 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 原核表达载体pET30a-S1 的构建 |
| 3.1.1 S1 基因的亚克隆 |
| 3.1.2 重组表达质粒的PCR 鉴定和限制性酶切鉴定 |
| 3.2 重组蛋白的表达及活性鉴定 |
| 3.2.1 重组蛋白的表达 |
| 3.2.2 重组蛋白的纯化 |
| 3.2.3 重组蛋白的活性鉴定 |
| 3.3 S1 多克隆抗血清的制备及活性鉴定 |
| 3.3.1 多克隆抗血清效价的测定 |
| 3.3.2 多克隆抗血清的免疫荧光实验结果 |
| 3.3.3 多克隆抗血清的病毒抑制试验结果 |
| 3.4 噬菌体十二肽库对S1 重组蛋白亲和配体的生物淘选 |
| 3.4.1 噬菌体十二肽库对靶分子的四轮淘洗结果 |
| 3.4.2 所选多肽的生物活性检测结果 |
| 3.4.3 小鼠外周血液抗PEDV IgG 抗体含量动态变化 |
| 3.4.4 小鼠外周血液抗S1 蛋白IgG 抗体含量动态变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 S1 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 4.2 S1 基因原核载体表达质粒的设计与构建 |
| 4.3 S1 基因的原核表达及表达条件的优化 |
| 4.4 重组蛋白的纯化与活性鉴定 |
| 4.5 多克隆抗血清的制备及活性鉴定 |
| 4.6 S1 蛋白亲和肽的筛选与鉴定 |
| 4.7 噬菌体体内免疫试验 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
（7）汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 一、HFRS 及 HTNV 概述 |
| 二、HTV 诱导的免疫应答 |
| 1. HTV 诱导的体液免疫应答 |
| 2. HTV 诱导的细胞免疫应答 |
| 3. HTV 感染与固有免疫应答 |
| 三、B 细胞表位及研究方法 |
| 1. B 细胞表位研究方法 |
| 2. HTV 结构蛋白 B 细胞表位的研究 |
| 第一部分 HTNV 核蛋白线性 B 细胞表位的筛选和鉴定 |
| 实验一 PEPSCAN 法 HTNV 核蛋白 B 细胞表位作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解 |
| 2.2 间接 ELISA 检测患者血清抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.3 间接 ELISA 检测单克隆抗体抗 NP 合成肽的反应谱 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 HFRS 患者血清抗体与 HTNV NP 合成肽反应谱 |
| 3.2 PepScan 数据处理 |
| 3.3 HTNV 特异性单克隆抗体与 HTNV NP 合成肽的反应谱 |
| 4 讨论 |
| 实验二 竞争 ELISA 证明患者血清抗体与合成肽反应的特异性 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 滴定实验 |
| 3.2 竞争 ELISA 预实验 |
| 3.3 竞争 ELISA 实验 |
| 4 讨论 |
| 实验三 HTNV 核蛋白抗原肽特异性血清 IgG 在急性期的动态变化 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 终点滴定法确定 HFRS 患者血清抗原肽特异性 IgG 滴度 |
| 3.2 HFRS 患者不同时间点血清抗原肽特异性 IgG 变化 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 鼠源性 HTNV 中和抗体 3D8 识别线性 B 细胞表位 |
| 实验一 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的鉴定 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 合成肽的溶解和分装 |
| 2.2 间接 ELISA 行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 2.3 竞争实验证明抗体-抗原肽结合的特异性 |
| 2.4 点杂交法行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3 结果 |
| 3.1 PepScan 法筛选含有阳性 B 细胞表位的混合肽 |
| 3.2 PepScan 法筛选含有 B 细胞表位的单条肽 |
| 3.3 竞争实验进一步证实单克隆抗体结合单条肽的特异性 |
| 3.4 阳性反应肽临近肽与单克隆抗体的反应性 |
| 3.5 竞争 ELISA 证实单克隆抗体 3D8 与 G221 结合的特异性 |
| 3.6 硝酸纤维素（NC）膜包被混合肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 3.7 NC 膜包被单个 HTNV GP 合成肽行 PepScan 法 B 细胞表位作图 |
| 4 讨论 |
| 实验二 鼠源性中和抗体 3D8 识别 HTNV 糖蛋白线性 B 细胞表位的精细作图 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELISA 法检测单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与 G221 周围肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 丙氨酸扫描突变分析鼠源性中和抗体3D8识别的线性B细胞表位关键氨基酸残基 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 iELSA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.2 点杂交法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 2.3 ECL-ELISA 法观察单克隆抗体 3D8 与丙氨酸替换肽的反应性 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（8）噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用（论文提纲范文）
| 1. 噬菌体展示系统 |
| 1.1 丝状噬菌体展示系统: |
| 1.2 其他噬菌体展示系统: |
| 2. 噬菌体展示技术在感染性疾病中的应用 |
| 2.1 用于宿主与病原体相互作用的研究 |
| 2.2 用于抗原表位和表位疫苗的研究 |
| 2.2.1 细菌与寄生虫方面: |
| 2.2.2 病毒方面: |
| 3. 展望 |
（9）天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 汉坦病毒GP多表位抗原基因的构建与表达 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 |
| 汉坦病毒包膜蛋白抗原表位的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（10）猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 PED概述 |
| 1.1.1 流行病学 |
| 1.1.2 临床症状 |
| 1.1.3 发病机理 |
| 1.1.4 病理变化 |
| 1.1.5 诊断 |
| 1.1.6 组织嗜性和免疫 |
| 1.1.7 防治 |
| 1.2 PEDV的生物学特性 |
| 1.2.1 PEDV的形态结构 |
| 1.2.2 PEDV理化特性 |
| 1.2.3 PEDV抗原性 |
| 1.2.4 PEDV细胞培养特性 |
| 1.2.5 PEDV病毒学学分类地位 |
| 1.2.6 PEDV的基因组结构和复制 |
| 1.2.7 PEDV基因组编码蛋白及其功能 |
| 1.3 PEDV及其它冠状病毒B细胞抗原表位和细胞受体的研究进展 |
| 1.3.1 PEDV及其它冠状病毒S蛋白B细胞抗原表位的研究进展 |
| 1.3.2 PEDV及其它冠状病毒受体蛋白的研究进展 |
| 1.3.3 PEDV及其它冠状病毒受体结合域的研究进展 |
| 1.4 抗原表位研究方法 |
| 1.4.1 B细胞抗原表位研究方法 |
| 1.4.2 T细胞表位研究方法 |
| 1.4.3 抗原表位研究的应用及意义 |
| 1.5 病毒受体结合域研究的方法 |
| 1.5.1 常规方法 |
| 1.5.2 生物物理学方法 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 PEDV S基因的克隆及其分子特性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒与菌种 |
| 2.1.3 生化试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 PEDV的细胞培养 |
| 2.1.6 PEDV病毒RNA的提取 |
| 2.1.7 cDNA合成的引物 |
| 2.1.8 Sa、Sb和Sc片段的克隆 |
| 2.1.9 S基因及其编码蛋白的分子特性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PEDV的细胞培养 |
| 2.2.2 Sa、Sb和Sc片段的RT-PCR扩增 |
| 2.2.3 PEDV S基因序列分析及分子特性 |
| 2.2.4 S蛋白S1 和S2 功能区的划分 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 PEDV S蛋白S1 区B细胞抗原表位的筛选和鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 质粒和菌种 |
| 3.1.2 试剂盒与主要生化试剂 |
| 3.1.3 实验动物与血清 |
| 3.1.4 仪器设备 |
| 3.1.5 PEDV S1 基因特异性肽库的构建 |
| 3.1.6 S1 基因特异性肽库的生物淘选及展示表位的鉴定 |
| 3.1.7 S1P1、S1P2 和S1P3 抗原短肽ELISA与Western blot分析 |
| 3.1.8 S1P1、S1P2 和S1P3 抗原短肽的免疫原性分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 PEDV S1 基因PCR扩增 |
| 3.2.2 PEDV S1 基因DNaseI消化 |
| 3.2.3 S1 基因特异性肽库鉴定 |
| 3.2.4 S1 基因特异性肽库生物淘选 |
| 3.2.5 抗原短肽ELISA和Western blot分析 |
| 3.2.6 抗原短肽的免疫原性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 PEDV S蛋白S1 区原核表达及其免疫优势区鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒、细胞和菌种 |
| 4.1.2 试剂盒与生化试剂 |
| 4.1.3 实验动物和血清 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.1.5 S1A、S1B、S1C和S1D片段的原核表达与纯化 |
| 4.1.6 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白的免疫活性分析 |
| 4.1.7 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清制备及其免疫活性分析 |
| 4.1.8 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清的病毒中和试验 |
| 4.1.9 PEDV S蛋白S1D区的序列比对分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 S1A、S1B、S1C和S1D片段PCR扩增 |
| 4.2.2 S1A、S1B、S1C和S1D片段的表达与纯化 |
| 4.2.3 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白的免疫活性分析 |
| 4.2.4 S1A、S1B、S1C和S1D重组蛋白单因子血清的免疫活性分析 |
| 4.2.5 S1D重组蛋白单因子血清中和活性 |
| 4.2.6 PEDV S蛋白S1D区序列比对分析 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 PEDV S蛋白S1D区单克隆抗体的制备及表位鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒、菌种和病毒 |
| 5.1.2 试剂盒与主要生化试剂 |
| 5.1.3 实验动物 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.1.5 单克隆抗体制备 |
| 5.1.6 McAbs免疫活性与中和活性鉴定 |
| 5.1.7 S1D单克隆抗体对PEDV S1 基因特异性肽库的生物淘选及噬菌体ELISA |
| 5.1.8 S1D淘选表位区（MER）的原核表达与表位鉴定 |
| 5.1.9 S1D5 和S1D6 抗原表位免疫原性鉴定 |
| 5.1.10 S1D5 和S1D6 表位的核心氨基酸鉴定 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 S1D重组蛋白纯化 |
| 5.2.2 S1D单克隆抗体亚型鉴定和腹水效价测定 |
| 5.2.3 S1D单克隆抗体免疫活性和中和活性的鉴定 |
| 5.2.4 S1 基因特异性肽库的生物淘选及噬菌体ELISA |
| 5.2.5 S1D淘选表位区MER抗原表位的精确定位 |
| 5.2.6 S1D5 和S1D6 抗原表位免疫原性鉴定 |
| 5.2.7 S1D5 和S1D6 表位的核心氨基酸鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 PEDV S蛋白受体结合域的筛选与鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 质粒、细胞、菌种和肽库 |
| 6.1.2 试剂盒与主要生化试剂 |
| 6.1.3 实验动物 |
| 6.1.4 仪器设备 |
| 6.1.5 pAPN对PEDV S1 基因特异性肽库的淘选 |
| 6.1.6 pAPN多克隆血清制备 |
| 6.1.7 MRR重组蛋白的真核表达 |
| 6.1.8 MRR重组蛋白的免疫活性分析 |
| 6.1.9 MRR重组蛋白与pAPN相互作用检测 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 PEDV S1 基因特异性肽库的pAPN淘选 |
| 6.2.2 MRR基因重组pFastBacHTB真核表达载体的构建 |
| 6.2.3 MRR基因重组杆状病毒制备及鉴定 |
| 6.2.4 MRR重组蛋白的表达与免疫活性鉴定 |
| 6.2.6 MRR重组蛋白与pAPN的相互作用 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、应用噬菌体随机9肽库淘筛汉滩病毒核衣壳蛋白B细胞表位（论文参考文献）
- [1]噬菌体展示技术筛选人IFN-γ抗原表位[D]. 冯凌譞. 南昌大学, 2020(08)
- [2]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓. 第四军医大学, 2017(05)
- [3]猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌体免疫纳米抗体库构建及抗Cap纳米抗体的筛选[D]. 刘丹丹. 西北农林科技大学, 2015(01)
- [4]噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用[J]. 杨栋强,白雪帆. 医学研究生学报, 2012(07)
- [5]汉坦病毒β3整合素受体拮抗剂的筛选及其特性的初步鉴定[D]. 杨栋强. 第四军医大学, 2012(02)
- [6]猪流行性腹泻病毒S1蛋白亲和肽的筛选与鉴定[D]. 杨巍. 东北农业大学, 2011(04)
- [7]汉滩病毒结构蛋白线性B细胞表位的筛选和鉴定[D]. 闫果林. 第四军医大学, 2011(05)
- [8]噬菌体展示技术及其在感染性疾病中的应用[J]. 冯烨,涂长春. 中国生物制品学杂志, 2009(08)
- [9]天津地区汉坦病毒的分子流行病学分析及其GP多表位抗原基因的构建与表达的研究[D]. 杨东靖. 天津医科大学, 2009(11)
- [10]猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位鉴定及受体结合域的初步筛选[D]. 孙东波. 中国农业科学院, 2008(10)