一、原位末端标记——TUNEL法检测脊髓凋亡细胞（论文文献综述）
吕建芳[1]（2021）在《肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究》文中指出目的建立SD雄性大鼠肾精亏虚模型,以骨髓造血干细胞为切入点,观察其凋亡情况,研究肾精亏虚对骨髓造血功能的影响,探讨其作用机制。观察龟鹿二仙胶对肾精亏虚骨髓抑制性贫血大鼠的治疗效果,通过其对大鼠的血象、骨髓象以及骨髓造血干细胞凋亡的影响,分析其“从肾论治”治疗肾精亏虚引起的骨髓抑制性贫血的作用机制。方法1、理论研究:系统回顾古今文献,阐述肾精、髓、血的中医理论研究及现代医学研究,立足肾精、髓以及血之间的关系,为肾精亏虚导致贫血提供中医理论依据。剖析龟鹿二仙胶的组方以及总结补肾填精法的现代医学临床应用。2、动物实验:SD雄性大鼠30只,SPF级,8周龄,体重270±20g,随机分为空白组、模型组、补肾组,每组10只。采用模拟地震振动、光电刺激复合应激恐吓以及长期小剂量苯皮下注射和短期大剂量环磷酰胺腹腔注射,建立肾精亏虚大鼠模型。整个造模过程用时49天。前4周模型组和补肾组大鼠按体质量皮下隔天注射苯（lm L/kg）,第25d开始用环磷酰胺（25mg/kg）腹腔注射,连续注射3d,同时每天用仿地震平台模拟地震振动（2次/日,共15-20分钟）以及光电刺激箱足底电击刺激（每日不定时1-3次）。空白组正常喂养。在第4周最后一天随机抽取模型组和补肾组各1只大鼠查外周血象及血清睾酮,检测模型是否成功。第29天开始,补肾组用龟鹿二仙胶灌胃,根据大鼠与人体表面积折算剂量比值,灌胃剂量为11g/Kg,分两次灌胃。给药期间每隔一天称重,根据体重调整给药剂量,连续21天。模型组和空白组大鼠给予等量去离子水灌胃,连续21天。造模过程中,每天观察各组大鼠的皮毛、进食量、活动状态等一般情况。造模结束后,每组大鼠通过眼内眦静脉取血法测外周静脉血红细胞（RBC）和血红蛋白（HGB）,观察其贫血程度;采用ELISA检测血清睾酮T以及用精子分析仪检测附睾精子质量,评价其生殖功能;取睾丸组织包埋切片,HE染色,观察其形态学的改变;分离胫骨,取新鲜骨髓,用PBS制备单细胞悬液,采用血红细胞计数板计数单核细胞数;取新鲜骨髓,制成骨髓涂片,瑞氏-吉姆萨染色,观察骨髓细胞的形态学改变;股骨包埋、切片,HE染色,观察骨髓增生情况;取新鲜骨髓包埋超薄切片,观察其超微病理改变。采用ELISA法检测各组EPO的含量;用流式细胞仪以及TUNEL法检测各组大鼠骨髓组织CD34+细胞凋亡情况;采用WB法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量;采用RT-PCR法检测各组大鼠骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Faslm RNA的表达水平。3、统计学处理:各组组间进行比较,所得数据均以均数±标准差（sx?）表示,采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,单因素方差分析组间比较,采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。结果（1）与正常组相比,模型组大鼠出现毛发干枯、耸立不齐、进食量下降,活动度减少等现象。补肾组大鼠毛发恢复光泽、进食量增加、活动度增加,肾虚症状得到改善。（2）与空白组比较,模型组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从14d开始下降,有显着性差异（p<0.01）;与模型组比较,补肾组血红细胞（RBC）数量、血红蛋白（HGB）含量从42d开始升高,有显着性差异（p<0.05）。（3）与空白组比较,模型组血清EPO含量下降,有显着性差异（P<0.01）;与模型组比较,补肾组血清EPO含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（4）睾丸病理切片显示,空白组睾丸曲细精管被膜完整,支持细胞形态正常,曲细精管管腔内可见大量精子;模型组曲细精管生精上皮明显变薄,细胞层次杂乱,支持细胞形态断裂,曲细精管管腔内精子细胞、精子数量明显减少;补肾组曲细精管被膜完整,细胞排布紧密,生精细胞数略有减少,部分区域可见脱落的少量生精细胞,但结构清楚,层次较分明,管腔内有较多精子。（5）与空白组比较,模型组附睾精子浓度及精子活力均下降（P<0.05）;模型组血清T含量明显下降（P<0.01）;与模型组比较,补肾组附睾精子浓度及精子活力均明显升高（P<0.01）,补肾组血清T含量升高,有显着性差异（P<0.01）。（6）骨髓象显示,与空白组比较,模型组骨髓有核细胞数量减少（P<0.05）;与模型组比较补肾组骨髓有核细胞数量增加,有显着性差异（P<0.05）。骨髓涂片可见空白组骨髓造血结构完整,组织丰富;模型组骨髓增生降低,巨核细胞减少;补肾组造血网织红细胞虽增加,但仍没有恢复正常水平。骨髓病理切片显示:空白组造血细胞多且分布均匀,骨髓造血组织支架结构紧密,脂肪细胞数量少;模型组造血组织面积减少,巨核细胞少见,造血细胞数目减少,内皮细胞、脂肪细胞等非造血细胞数目增多;补肾组造血结构组织基本修复,巨核细胞增多,造血细胞增加,仍可见脂肪细胞等非造血细胞。（7）骨髓超微病理形态学检测示:空白组大鼠可见造血干细胞为圆形,单核,核大,细胞质少,可见线粒体,线粒体内膜折叠成较深的嵴。模型组大鼠造血干细胞可见线粒体数量减少,嵴变浅或消失,线粒体肿胀,可见凋亡小体。补肾组大鼠造血干细胞有核细胞增多,凋亡小体少见,线粒体的数量增多,线粒体嵴有所恢复。（8）与空白组比较,骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测发现模型组可见较多凋亡CD34+细胞的绿色荧光点,流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的数量明显增加（P<0.05）;与模型组比较,补肾组石蜡包埋切片TUNE L法检测骨髓组织绿色荧光点数量减少,流式细胞仪检测CD34+细胞凋亡的数量降低（P<0.05）。（9）WB检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白表达结果与空白组比较,模型组Bcl-2蛋白含量表达降低（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fas和Fasl蛋白含量表达均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2蛋白含量表达升高（P<0.05）,Bax、caspase-3、Fa s和Fasl蛋白含量表达均减少（P<0.05）。（10）RT-PCR检测大鼠胫骨骨髓新鲜组织Bcl-2、Bax、caspase-3、Fa s和Faslm RNA含量与空白组比较,模型组Bcl-2m RNA含量降低（P<0.05）,Baxm RNA、caspase-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均升高（P<0.05）。与模型组比较,补肾组Bcl-2m RNA蛋白含量升高（P<0.05）,Baxm RNA、caspa se-3m RNA、Fasm RNA和Faslm RNA含量均减少（P<0.05）。结论“肾藏精,生髓,化血”,肾藏先天之精,肾气促脾胃化生水谷精微而藏之,而“精血同源”,肾精是化生血液的重要物质基础。肾精亏虚则血液化生无源而导致血虚。肾主人体发育,也主骨髓生长发育,肾精充足,则骨髓充盈,反之肾精不足,骨髓空虚。骨髓具有化生血液的作用,髓化生血液主要取决于肾的功能,肾精亏虚则会导致骨髓功能低下,化生血液出现障碍而致血虚。本课题基于中医“肾藏精、精生髓,髓生血,精化血”理论,以肾精亏虚则会导致血虚为实验的病理依据,以造血干细胞作为切入点。研究肾精亏虚对造血功能的影响及其作用机制。以“恐伤肾”传统病因造模结合药物干预病理造模,采用模拟地震平台复合光电刺激法结合长期小剂量的苯和短期大剂量的环磷酰胺药物干预,建立肾精亏虚大鼠模型。大鼠出现肾虚症状,血液检查可以看到血红细胞数量和血红蛋白含量降低,血清EPO含量下降,血清睾酮含量降低。骨髓象可以见到骨髓有核细胞数量减少,骨髓造血组织结构疏松、造血面积减少、造血细胞减少。超微病理形态学可以观察到骨髓造血干细胞线粒体肿胀,线粒体嵴变浅,出现凋亡小体的超微病理改变。龟鹿二仙胶灌胃治疗后,能够改善肾精亏虚的症状,促进血红细胞数量和血红蛋白含量增高,血清EPO含量升高,血清睾酮含量增加,骨髓有核细胞数量增加,骨髓造血组织得到修复。骨髓造血干细胞线粒体数量增加,凋亡小体减少,减少骨髓CD34+细胞的凋亡。本实验结论归纳如下:（1）利用“仿地震平台及光电刺激+苯+环磷酰胺”成功建立肾精亏虚雄性大鼠模型。（2）肾精亏虚大鼠血清EPO含量下降,骨髓组织抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白、Bcl-2m RNA含量下降,促凋亡蛋白Bax蛋白及Baxm RNA表达增加,激活了线粒体/细胞色素c通路,发生级联效应,激活Caspase-3蛋白,诱导骨髓CD34+细胞的凋亡。骨髓Fas和Fasl蛋白及Fas和Faslm RNA含量升高,激活了死亡受体途径,激活Caspase-3蛋白,诱导CD34+细胞细胞的凋亡。CD34+细胞过度凋亡,骨髓造血干细胞活性降低,可能是肾精亏虚导致骨髓抑制影响骨髓造血功能的机制之一。（3）首次采用龟鹿二仙胶治疗肾精亏虚,改善骨髓造血功能。龟鹿二仙胶能有效缓解肾精亏虚大鼠的症状,治疗骨髓抑制性贫血有效。提高血清EPO含量,促进抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达,抑制促凋亡蛋白Bax蛋白、Fas和Fasl蛋白的表达,减少Caspase-3蛋白的表达,抑制CD34+细胞的凋亡,从而保护造血干细胞。刺激骨髓造血干细胞的增殖,避免其发生过度凋亡,可能是龟鹿二仙胶发挥其疗效机制之一。（4）从生成来源和生物学功能来看,EPO可能是肾精的物质基础之一。（5）造血干细胞是肾精在细胞层次的表现形式,是“肾精化血”功能的执行者。
张娟[2]（2020）在《MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究》文中指出目的:神经管畸形（neural tube defects,NTDs）是由于神经管闭合不全导致的一种严重的先天畸形,其危害严重,病因复杂。Micro RNA（miRNA）在神经管发育过程中起着重要作用,其在NTDs发生中的作用尚不清楚,从miRNA的表观遗传角度深入研究NTDs的发病机制意义重大。本研究目的主要有:1从组学水平系统探讨维甲酸（retinoic acid,RA）诱导的NTDs鼠胚神经管组织中miRNA表达谱的变化情况,筛选NTDs发生相关的重要差异表达miRNAs。2研究miR-10a-5p在NTDs和正常鼠胚神经管中的表达差异,以神经干细胞（neural stem cells,NSCs）为细胞模型,探讨其在RA诱导的NTDs发生中的作用及机制。方法:1 NTDs模型的构建和小RNA组测序（small RNA sequence,s RNA-seq）1.1以C57BL/6小鼠为实验动物,于胚胎7.5天（embryonic day 7.5,E7.5）,实验组孕鼠灌胃28 mg/kg RA构建NTDs鼠胚模型,对照组孕鼠灌胃相同剂量香油。1.2于E8.5、E9.5和E10.5三个时间点（神经管闭合期）分别分离对照组和实验组鼠胚脑泡组织,在Illumina Hi Seq TM2000测序平台进行s RNA-seq,获得正常组（Brc8.5、Brc9.5和Brc10.5）和NTDs组（Bra8.5、Bra9.5和Bra10.5）miRNA表达文库。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1计算对照组和NTDs组文库中miRNA归一化表达的倍数变化（log2 Ratio Bra/Brc）和P值。将符合|log2 Ratio|≥1和错误发生率（false discovery rate,FDR）≤0.001标准的miRNA定义为在两组中显着差异表达的miRNA,获得Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对的差异表达miRNAs,进一步通过交集分析获得共同差异表达miRNAs。2.2用Targetscan在线数据库预测miRNA作用的候选靶基因,并对候选靶基因进行GO和KEGG pathway显着性富集分析,了解候选靶基因参与的生物学过程及信号代谢通路。2.3筛选部分NTDs相关的差异表达miRNAs进行RT-q PCR表达量验证。3基于sRNA-seq数据分析,选取miR-10a-5p这一在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA为本部分研究的靶点,研究其表达异常对神经细胞生物学功能的影响。3.1采用RT-qPCR技术对miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的时空表达模式进行检测。3.2分别使用miR-10a-5p过表达慢病毒（LV-miR-10a）和miR-10a-5p mimics（mim-10a）转染NSCs和小鼠脑神经瘤细胞系Neuro-2a（N2a）,并采用RT-q PCR检测miR-10a-5p的表达情况。3.3采用Brd U法和CCK-8法检测miR-10a-5p过表达对细胞增殖的影响;采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）检测miR-10a-5p过表达对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测miR-10a-5p对NSCs向星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）和神经元（MAP2阳性细胞）分化的影响。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1采用生物信息学预测miR-10a-5p作用的靶基因,筛选在神经系统中高表达且具有重要功能的Chl1为其候选靶基因。4.2采用双荧光素酶报告实验验证Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3采用RT-q PCR和Western Blot（WB）检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1m RNA和蛋白的表达,采用免疫荧光技术检测胚胎脑部切片中CHL1的表达。4.4在NSCs中转染LV-miR-10a,采用RT-q PCR和WB检测靶基因Chl1的m RNA和蛋白的表达。4.5使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用RT-q PCR和WB检测CHL1的m RNA和蛋白的表达情况。采用Brd U法检测CHL1敲低对细胞增殖的影响;采用FCM检测CHL1敲低对细胞周期和细胞凋亡的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1敲低对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.6使用CHL1过表达腺病毒（AV-CHL1）和LV-miR-10a共转染NSCs进行回补实验,采用WB检测CHL1的表达情况。采用Brd U法检测CHL1回复表达对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测CHL1回复表达对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。4.7采用WB检测RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1下游MAPK通路蛋白的表达。采用免疫组化技术检测切片中Ki67的表达;采用组织原位细胞凋亡检测技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）检测切片中细胞的凋亡情况。4.8使用CHL1 si RNA转染NSCs,采用WB检测靶基因下游ERK/MAPK信号通路蛋白的表达情况。4.9用ERK激动剂Honokiol进行回补实验,LV-miR-10a转染NSCs后加入Honokiol,采用Brd U法检测对细胞增殖的影响;采用细胞免疫荧光技术检测对NSCs向星形胶质细胞分化的影响。结果:1 NTDs模型的构建和s RNA-seq1.1在E8.5时,与对照组相比,NTDs组鼠胚神经褶皱形态异常,闭合延迟;在E9.5和E10.5时,NTDs组鼠胚脑部均可观察到发育畸形,神经管未闭合。说明使用本实验方法能够成功构建小鼠NTDs模型,其较好地模拟了无脑畸形这一临床NTDs表型。1.2对提取的RNA、c DNA文库和测序数据进行质控,表明其质量较高,能够用于后续生物信息学分析。2 NTDs鼠胚miRNA表达谱分析2.1 Bra8.5-vs-Brc8.5检测到241个差异表达miRNAs,上调11个,下调230个;Bra9.5-vs-Brc9.5检测到271个差异表达miRNAs,上调47个,下调224个;Bra10.5-vs-Brc10.5检测到213个差异表达miRNAs,上调46个,下调167个。2.2使用Targetscan预测差异表达miRNA的候选靶基因。将s RNA-seq与课题组前期在相同样本上进行的转录组测序（m RNA-seq）数据联合分析过滤靶基因,过滤后的差异表达miRNAs和靶基因结果:在Bra8.5-vs-Brc8.5中有232对miRNA-m RNA,包含147个基因和62个miRNAs;在Bra9.5-vs-Brc9.5中有1223对,包含779个基因和115个miRNAs;在Bra10.5-vs-Brc10.5中有1530对,包含853个基因和84个miRNAs。2.3对过滤后的miRNAs的靶基因进行GO功能性富集分析,我们发现各时期的靶基因涉及的生物学过程主要包括neuron fate commitment、neuron differentiation、central nervous system development、neurogenesis、nervous system development等。分析了在GO term“central nervous system development”中富集的所有靶基因及相应的miRNA-m RNA对,筛选了19个miRNA-m RNA负调控对。2.4对过滤后的miRNAs的靶基因进行KEGG pathway富集分析,我们发现这些基因主要参与ECM-receptor interaction、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction等pathway。2.5通过对Bra8.5-vs-Brc8.5、Bra9.5-vs-Brc9.5和Bra10.5-vs-Brc10.5三组文库对进行交集分析,我们筛选到了41个共同差异表达miRNAs。分层聚类分析将miRNAs亚群分为5类。对其中5个miRNAs进行了RT-q PCR验证,其表达模式均与测序结果一致。2.6对41个共同差异表达的miRNAs和196个共同差异表达的m RNAs进行联合分析,我们筛选了8个miRNA-m RNA对,它们在3个时间点上的表达模式均呈负相关。2.7 miR-10a-5p是在NTDs鼠胚中表达丰度最高、差异倍数最大的上调差异表达miRNA,其可能与NTDs发生密切相关。3 miR-10a-5p异常表达对神经细胞生物学功能的影响3.1 RT-q PCR结果显示:miR-10a-5p在NTDs鼠胚中的表达显着高于对照组。3.2 RT-q PCR结果表明,LV-miR-10a和mim-10a分别转染NSCs和N2a后,miR-10a-5p的表达水平显着升高。3.3 Brd U和CCK-8结果显示:miR-10a-5p过表达抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:miR-10a-5p过表达诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:miR-10a-5p过表达时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显着低于对照组。4 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究4.1生物信息学筛选miR-10a-5p的候选靶基因。4.2双荧光素酶报告实验证实:Chl1为miR-10a-5p的靶基因。4.3 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中CHL1蛋白表达水平降低;免疫荧光结果显示:NTDs组织样本中CHL1表达降低。4.4 NSCs中miR-10a-5p过表达后,CHL1的m RNA和蛋白水平均降低。4.5转染CHL1 si RNA可降低NSCs中CHL1 m RNA和蛋白的表达水平。Brd U结果显示:CHL1敲低抑制细胞的增殖能力;FCM结果表明:CHL1敲低使细胞周期阻滞,细胞被捕获在了G1期,无法进入S期;FCM结果表明:CHL1敲低诱导细胞的凋亡;免疫荧光结果表明:CHL1敲低时NSCs向星形胶质细胞分化的能力显着低于对照组。4.6 WB结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对CHL1表达的抑制作用;Brd U结果显示:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:AV-CHL1回复表达能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。4.7 WB结果显示:在RA诱导的NTDs鼠胚组织样本中MAPK通路的蛋白的磷酸化水平降低;免疫组化结果显示:NTDs组织样本中Ki67表达降低;TUNEL结果显示:NTDs组织样本中细胞凋亡增加。4.8 CHL1 si RNA转染NSCs使其在细胞中低表达后,WB结果显示:CHL1下游ERK/MAPK信号通路的蛋白表达水平降低。4.9 WB结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对p-ERK表达的抑制作用;Brd U结果显示:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞增殖的抑制作用;免疫荧光实验结果表明:ERK激动剂能够挽救miR-10a-5p对细胞分化的影响。结论:1通过对NTDs鼠胚的miRNA表达谱进行差异表达分析、功能富集分析筛选出NTDs相关miRNAs,并分析了预测靶基因参与的生物学功能,应用RT-q PCR对部分miRNAs的表达进行了验证;筛选出miR-10a-5p在RA诱导的NTDs胚胎中异常高表达,其可能与NTDs的发生发展密切相关。2 miR-10a-5p在RA诱导的NTDs中发挥致畸作用,其通过靶向调节CHL1表达抑制下游MAPK信号通路,使细胞增殖、凋亡和分化失调,影响神经管发育。
朱雄[3]（2020）在《EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究》文中研究表明神经退行性疾病（Neurodegenerative Diseases）是一类以中枢神经系统（神经元）和（或）外周神经系统（髓鞘）的变性、凋亡所导致的结构和功能的进行性退化为特征的异质性疾病。随着人口老龄化问题日益突出,神经退行性疾病已成为世界范围内危害人类健康最严重的疾病之一。神经退行性疾病的发病机理极其复杂,至今尚不能被完全解释清楚,到目前为止缺少有效的诊断和治疗方法。目的:在神经退行性疾病中,脑和视网膜神经退行性病变是目前研究的热点。此类疾病引起损害的病理是神经元细胞的不可逆性损伤,目前临床上对此缺乏行之有效的治疗手段。视网膜营养不良（Retinal dystrophy）是一类因光感受器功能丧失而引起的异质性遗传性疾病。在全球尤其是工业化国家中,视网膜变性疾病是致盲的重要原因之一。这些疾病的临床表型复杂性和等位基因的异质性给疾病的正确诊断带来困难。内质网膜蛋白复合物（endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC）首先在酿酒酵母中被鉴定为内质网中蛋白质折叠所需的6亚单位跨膜蛋白复合物。EMC亚基的丢失会导致错误折叠的膜蛋白的积累和未折叠蛋白反应（UPR）的诱导。有研究报道,EMC1基因突变与视网膜营养不良及小脑发育退化综合征相关。在真核生物中,d Pob/EMC3定位于内质网,并与EMC1和钙连蛋白（calnexin）结合并相互作用。此外,内质网膜蛋白复合物（EMC）是其他多通道跨膜蛋白的稳定表达所必需的,如视紫红质和Na+K+-ATP酶等。另外,d Pob/EMC3缺失会导致果蝇单眼细胞的变性。这些结果共同表明,EMC是包括视紫红质1在内的多通道跨膜蛋白生物发生过程中的一个关键因素,其缺失会导致视网膜变性。EMC1和EMC3组成复合物参与内质网相关降解（ERAD）途径,表明EMC与ERAD途径之间存在密切联系。内质网结构和功能的紊乱在神经退行性疾病中已被广泛观察到,但内质网功能障碍是神经退行性疾病病变的原因,还是仅仅是神经元死亡的表现,目前尚不清楚。本论文重点研究EMC3在小脑和视网膜中的功能。方法:构建EMC3、EMC1等表达质粒载体（包括野生型和突变型）,分别进行细胞转染,结合免疫组化等方法,通过高分辨激光共聚焦显微镜、荧光共定位等分析其在细胞中的表达及定位情况,分析EMC1突变是否引起细胞中定位发生变化。研究EMC3与EMC其他亚基的表达及定位分析。在前期工作中,本研究发现小鼠Emc3基因胚胎敲除导致早期胚胎死亡。因此使用Pcp2-cre转基因小鼠和Emc3条件性敲除小鼠建立了一个在小脑浦肯野神经细胞和视网膜双极细胞中特异敲除Emc3基因的动物模型。本论文综合运用分子生物学,细胞生物学和免疫组化等方法,详细研究Emc3在双极细胞和小脑浦肯野细胞中的功能。利用双极细胞和小脑浦肯野细胞中特异蛋白标志物,对Emc3缺失的小鼠视网膜和小脑冰冻切片进行免疫染色,使用高分辨率激光共聚焦显微镜,详细分析这些关键蛋白的运输和定位。结果:EMC3由小鼠Tmem111基因编码,是高度保守的内质网膜蛋白复合物（EMC）的一个亚基。本研究发现Emc3的靶向缺失导致了小鼠严重的神经病变表型。同时Emc3lox P/lox P;Pcp2-Cre小鼠是可以长期存活并是可育的,但行为学上表现出类似于小脑共济失调的表型。与野生型小鼠相比较,三月龄的成年Emc3突变小鼠小脑中浦肯野细胞的树突发育有明显减少。本研究进一步发现,浦肯野细胞中Emc3的选择性缺失导致内质网错误折叠的膜蛋白的积累,阻碍了浦肯野细胞的分泌运输,并导致了树突萎缩。这些表型表现为小脑体积变小和浦肯野细胞数量减少,导致共济失调。浦肯野细胞丢失和共济失调最初出现在出生后两个星期左右,但随着年龄的增长逐渐恶化。Emc3的缺失导致浦肯野细胞缺失区域神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达增加和星形胶质细胞增生。C/EBP同源蛋白（CHOP）和葡萄糖调节蛋白78（GRP78/BIP）表达水平升高表明浦肯野细胞在可见细胞丢失之前存在内质网应激（ER Stress）。TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）分析表明,小脑浦肯野细胞出现细胞凋亡。本文的数据表明,浦肯野细胞中Emc3的缺失导致蛋白质折叠和运输缺陷,树突密度显着降低,星形胶质细胞增生和浦肯野细胞死亡。此外,本研究发现Emc3突变小鼠视网膜中视杆双极细胞与野生型小鼠相比有进行性病变,这表明Emc3在小鼠的视网膜结构和功能维持发挥重要作用。结论:研究结果表明了Emc3在小鼠浦肯野细胞和视网膜双极细胞的发育和功能维持发挥重要作用。本文的研究揭示了EMC3蛋白在小脑浦肯野细胞和视网膜中的重要作用,为研究小脑共济失调和视网膜神经退行性疾病提供了新方向与思路。
谢滔[4]（2020）在《甲烷对小鼠神经炎症损伤的影响及其可能机制》文中进行了进一步梳理研究背景神经炎症反应是神经退行性疾病及认知功能障碍的主要病理机制。神经退行性疾病导致的认知功能障碍,主要表现为学习和记忆能力受损,严重影响患者的生活质量,并增加家庭和社会负担。神经炎症反应的病理特征主要包括中枢神经系统（central nervous system,CNS）小胶质细胞激活,引起促炎因子和趋化因子释放增加导致炎症反应,以及活性氧（reactive oxygen species,ROS）释放增加导致氧化应激,此外还有Aβ淀粉聚集、细胞凋亡等,最终导致神经元损伤。小胶质细胞是CNS中的主要免疫细胞,在固有免疫反应和组织损伤修复过程中发挥重要作用,小胶质细胞过度激活介导的神经毒性作用是神经炎症反应介导神经退行性疾病的重要病理机制。脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）作为革兰氏阴性菌的一种内毒素,是小胶质细胞的强力激活剂。研究表明LPS通过与小胶质细胞表面Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）结合,上调核转录因子（nuclear transcription factor,NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase,MAPK）通路及白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）相关激酶表达从而激活小胶质细胞,分泌大量促炎细胞因子、神经毒性分子、蛋白酶及ROS等。氧化应激,主要由ROS释放和氧化还原防御系统的破坏引起,也是神经炎症反应介导神经退行性疾病及认知功能障碍的另一重要病理机制。氧化应激与小胶质细胞激活密切相关,氧化爆发是小胶质细胞激活的早期生化事件,小胶质细胞激活后通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH）氧化酶,释放大量氧自由基和过氧化氢。细胞凋亡是一种维持细胞内环境稳定的自发程序性死亡过程,是多细胞生物维持内环境稳定的重要机制。研究表明神经炎症反应引起的神经元凋亡被认为是导致认知功能障碍的另一潜在机制。神经炎症损伤导致细胞凋亡,引起突触传递障碍,在认知功能障碍动物模型中发挥重要作用。甲烷是作为最简单的烷烃链有机物,同时也是重要的温室效应气体。由于气体本身的理化性质,甲烷可通过简单扩散方式自由穿过细胞膜进入细胞器。此外,甲烷还能自由透过体内生物屏障,如血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）等。近年来大量研究发现甲烷具有抗炎、抗氧化、抗凋亡作用,在缺血再灌注（ischemia reperfusion injury,IR）心肌损伤、脊髓损伤、以及胰腺炎、肝炎、急性肺损伤,甚至糖尿病视网膜病变等疾病中发挥保护作用。然而甲烷在神经炎症反应及认知功能障碍中是否也具有保护作用,还未见相关报道。本实验通过建立神经炎症损伤动物模型,从动物行为学和分子生物学方面探索LPS诱导小鼠神经炎症损伤及认知功能障碍的可能机制,进一步探究了甲烷的抗炎、抗氧化、抗凋亡特性在小鼠神经炎症损伤中的作用及其可能机制,并在离体环境下进行验证。研究方法1.甲烷改善小鼠神经炎症损伤导致认知功能障碍的研究8-12周雄性C57BL/6小鼠（20-25 g）随机分为:对照组,饱和甲烷盐水（methane-rich-saline,MS）组,LPS组和LPS+MS组,在完成5天的Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）定位导航训练后通过腹腔注射LPS（5 mg/kg）建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后每12 h,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,连续注射7天,共计14次。24 h及第7天时通过旷场试验（open field test,OFT）评估小鼠的自发活动能力,第7天OFT完成2 h后进行MWM空间探索测试评估小鼠的空间记忆能力。2.甲烷通过抗炎作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究实验一:8-12周雄性C57BL/6小鼠（20-25 g）随机分为:对照组和LPS组,通过腹腔注射LPS（5 mg/kg）建立小鼠神经炎症损伤模型,收集前额皮质和海马组织（对照组8 h;LPS组2、4、6、8 h）通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测促炎因子表达。实验二:8-12周雄性C57BL/6小鼠（20-25 g）随机分为:对照组,MS组,LPS组和LPS+MS组,通过腹腔注射LPS（5 mg/kg）建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后12 h时,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,共计2次。LPS腹腔注射4 h时收集前额皮质和海马组织通过ELISA检测促炎因子表达;LPS腹腔注射24 h及第7天时收集小鼠完整脑组织通过免疫荧光染色检测海马组织离子钙接头蛋白抗原-1（ionized calcium binding adaptor molecule-1,IBa-1）表达;LPS腹腔注射24 h及第7天时收集海马组织通过免疫印迹试验检测P65-NF-κB及P38-MAPK表达及磷酸化水平。3.甲烷通过抗氧化作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究实验一:8-12周雄性C57BL/6小鼠（20-25 g）随机分为:对照组,MS组,LPS组和LPS+MS组。通过LPS（5 mg/kg）腹腔注射建立小鼠神经炎症损伤模型,0.5 h及此后12 h时,对照组及LPS组注射生理盐水20 m L/kg,MS组及LPS+MS组注射MS 20 m L/kg,共计2次。LPS腹腔注射24 h时收集海马组织和前额皮质检测丙二醛（malonaldehyde,MDA）表达及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性。实验二:收集第二部分研究中石蜡包埋的完整脑组织切片样本通过免疫荧光染色检测海马组织8-羟基脱氧鸟苷（8-Hydroxy-2 deoxyguanosine,8-OHd G）表达。收集第二部分研究中蛋白变性的海马组织样本通过免疫印迹试验检测诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）和NADPH氧化酶-2（NOX-2）表达。4.甲烷通过抗凋亡作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究收集第二部分研究中石蜡包埋的完整脑组织切片样本通过原位末端转移酶标记技术（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测海马组织中细胞凋亡情况。收集第二部分研究中蛋白变性的海马组织样本通过免疫印迹试验检测Bax及Bcl-2表达。5.体外探索甲烷抗炎抗氧化抗凋亡作用的研究实验一:BV-2细胞铺板后分为对照组和LPS组,对照组加入等量无血清DMEM,LPS组加入LPS（100 ng/m L）,两组各分为4个亚组,分别加入MS（0、5、10、20μL/m L）,通过MTT试验检测BV-2细胞的细胞活力。实验二:BV-2细胞铺板后分为对照组、MS组、LPS组和LPS+MS组,等量生理盐水或MS（20μL/m L）预处理0.5 h后加入LPS（100 ng/m L）刺激BV-2细胞诱导炎症反应。6 h后收集上清培养基通过ELISA检测促炎因子表达。实验三:BV-2细胞铺板后分为对照组、MS组、LPS组和LPS+MS组,等量生理盐水或MS（20μL/m L）预处理0.5 h后加入LPS（100 ng/m L）刺激BV-2细胞诱导炎症反应。1 h后收集细胞样本通过免疫印迹试验检测P65-NF-κB及P38-MAPK表达及磷酸化水平、i NOS及NOX-2表达,以及Bax/Bcl-2表达水平。实验结果1.甲烷改善小鼠神经炎症损伤后认知功能障碍各组小鼠在MWM定位导航训练期间均能寻找到隐藏平台,平均逃避潜伏期和平均游泳距离逐渐缩短。组内比较,除LPS组外,其余三组每天平均速度无明显统计差异;组间比较各组小鼠每天平均潜伏期、平均游泳距离和平均速度均无明显统计差异。OFT结果显示甲烷干预能增加LPS诱导神经炎症损伤24 h时小鼠水平移动距离和活跃时间;而第7天时四组小鼠水平移动距离和活跃时间均无明显统计差异。各组小鼠在MWM空间探索测试期间游泳距离和速度均无明显统计差异,甲烷干预能增加小鼠跨越平台次数和目标象限移动距离百分比。2.甲烷通过抗炎作用减轻小鼠神经炎症损伤LPS诱导神经炎症损伤4 h时促炎因子表达均达峰值。甲烷能抑制LPS诱导神经炎症损伤4 h时促炎因子IL-6、TNF-α及IL-1β表达;还能减弱24 h及第7天时海马组织IBa-1标记的阳性信号强度及细胞体/细胞尺寸比例从而抑制小胶质细胞激活。此外甲烷干预通过抑制LPS诱导小鼠神经炎症24 h时P-38-MAPK及P-65-NF-κB磷酸化,以及第7天时P-38-MAPK的磷酸化,减轻炎症反应。3.甲烷通过抗氧化作用减轻小鼠神经炎症损伤甲烷能降低LPS诱导神经炎症损伤24 h时MDA表达,提高SOD活性;还能减弱海马组织8-OHd G标记的阳性信号强度;并通过抑制i NOS及NOX-2表达抑制LPS诱导神经炎症损伤急性期的氧化应激。4.甲烷通过抗凋亡作用减轻小鼠神经炎症损伤甲烷能减少LPS诱导小鼠神经炎症损伤24 h及第7天时TUNEL标记的细胞凋亡比率;并通过提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达及降低Bax/Bcl-2比率抑制细胞凋亡。5.甲烷通过抗炎抗氧化抗凋亡作用减轻LPS诱导BV-2炎症反应甲烷及LPS对BV-2细胞生长活力无明显影响。甲烷能抑制LPS刺激BV-2细胞炎症反应后促炎因子IL-6及TNF-α表达;并通过抑制P-38-MAPK及P-65-NF-κB磷酸化,i NOS及NOX-2蛋白表达,提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达及降低Bax/Bcl-2比率在离体环境下发挥抗炎、抗氧化和抗凋亡作用。结论甲烷可改善LPS诱导小鼠神经炎症损伤后认知功能障碍。甲烷的保护作用可能与其抑制P65-NF-κB及P38-MAPK的磷酸化从而抑制小胶质细胞的激活和促炎因子释放有关,还与抑制i NOS及NOX-2表达从而减轻氧化应激以及抑制Bax/Bcl-2凋亡系统从而减轻细胞凋亡有关。本研究结果为后续临床进一步探索预防和治疗神经炎症反应导致的认知功能障碍及神经退行性疾病提供了理论依据。
曾友根[5]（2020）在《NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究》文中研究指明目的:本研究通过观察NSCs和OECs联合移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞神经营养因子,凋亡及抗凋亡蛋白因子表达影响,探讨细胞移植对SNHL损伤耳蜗细胞保护作用的部分机制。方法:（1）细胞培养:选取胎鼠作为移植细胞组织来源,对NSCs和OECs培养、形态观察及鉴定。（2）动物造模:采用庆大霉素对大鼠进行SNHL造模,将筛选出符合要求的大鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组予NSCs和OECs联合移植,对照组予输注人工外淋巴液代替细胞移植。（3）细胞移植:将荧光标记的NSCs和OECs通过圆窗植入耳蜗内,术后记录各组大鼠体重变化,检测大鼠ABR听力阈值变化和听觉耳动反射阈值,并采集样本检测。（4）耳蜗切片HE染色。（5）耳蜗免疫荧光染色检测移植后NSCs和OECs荧光标记物。（6）TUNEL法检测凋亡细胞阳性细胞数和MOD值。（7）免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞。（8）Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达影响。结果:（1）细胞培养鉴定结果:NSCs染色鉴定标记物呈nestin阳性,OECs染色鉴定标记物呈p75NTR阳性,培养获得了纯度较高的细胞。（2）听觉耳动反射检测结果:实验组大鼠耳廓反射阈值改善,耳廓抖动变化增强,对照组改变不明显。（3）ABR阈值变化结果:与对照组比较,实验组在1周后ABR阈值变化不明显（P>0.05）,在2周后实验组ABR阈值变化升高（P<0.05）。（4）耳蜗免疫荧光染色结果:实验组移植后NSCs标记分化的细胞部分能表达神经元细胞标志物Nestin,OECs标记分化的细胞分能表部达OECs标志物p75NTR,对照组耳蜗未发现荧光标记的细胞。（5）HE染色结果:对照组见内、外毛细胞变性坏死,SGCs部分坏死,核萎缩,损伤明显,细胞空泡样变性,密度降低,排列疏松混乱不齐,实验组整体病理损伤减低。（6）TUNEL阳性细胞数检测结果:与对照组比较,实验组TUNEL阳性细胞数明显减少（P<0.05）,细胞凋亡指数占比减少,MOD值减少（P<0.05）。（7）免疫组化检测结果:与对照组比较,实验组BDNF和NT-3阳性细胞数及IOD值明显增多（P<0.05）,同时抗凋亡因子Bcl-2阳性细胞数及IOD值升高,促凋亡因子Bax、Caspase-3阳性细胞数及IOD值减少（P<0.05）。（8）Western-blot检测结果:与对照组比较,实验组耳蜗组织样本中BDNF、NT-3,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低（P<0.05）。结论:（1）NSC联合OEC移植对SNHL大鼠耳蜗具有保护作用,能减轻耳蜗细胞的损伤。（2）NSC联合OEC移植可能通过调节神经营养因子的表达水平而参与了耳蜗细胞的保护过程。（3）NSC联合OEC移植可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达路径而参与了对SNHL耳蜗细胞凋亡的保护机制。
李贺[6]（2020）在《靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制》文中认为目的:中枢神经系统神经元内在再生能力不足是导致受损神经元再生和功能恢复失败的主要原因。神经元损伤后多个细胞内信号通路之间协同调节的靶基因可显着促进神经元的存活,增强神经元的内在再生能力,使受损神经元长距离轴突再生、神经回路重建和功能恢复变成可能。因而,找准靶点基因提升受损中枢神经元的内在再生能力是治疗中枢神经损伤的关键所在。莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒插入位点（provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1）为原癌基因,可编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是许多细胞因子及生长因子细胞内信号通路的共同下游效应分子,通过磷酸化下游蛋白质丝氨酸/苏氨酸位点,在细胞增殖、存活及凋亡等过程中发挥重要作用。基于Pim-1是多个信号通路共同下游效应分子,且对细胞的增殖及存活具有重要作用,本研究首先观察Pim-1在体外受损中枢神经元样细胞内的表达变化,睫状神经营养因子（CNTF）和神经突起素（Neuritin,Nrn1）调控下游信号通路对Pim-1表达的影响,以及这种影响对受损神经元的作用及相关机制。以Pim-1基因为靶点,用重组慢病毒（recombinant lentivirus）载体过表达Pim-1,或用Pim-1 siliencer特异性干扰Pim-1表达,探讨直接调控Pim-1表达对体外受损神经元样细胞的活性和突起再生的作用,为临床治疗中枢神经元损伤提供新的方法及其实验和理论依据。本研究还基于长链非编码RNA（long non-coding RNA,Lnc RNA）调控神经发育和损伤的相关研究以及Lnc-Pim1与Pim-1基因位点、序列的密切关系,观测Lnc-Pim1在体外中枢神经元样细胞的序列全长、表达定位、损伤后表达变化、与Pim-1相互作用关系,并以Lnc-Pim1基因为靶点,用重组慢病毒载体过表达Lnc-Pim1,或用Lnc-Pim1siliencer特异性干扰Lnc-Pim1表达,探讨调控Lnc-Pim1表达对体外受损神经元样细胞的修复作用,同时还应用CHIRP-MS和RNA-seq技术探究Lnc-Pim1发挥作用的初步分子机制。方法:（1）在体外用20μmol/ml反式视黄酸（RA）将Neuro-2a细胞诱导成为神经元样细胞（N-2a-N）;用50μmol/L去铁胺亚磺酸盐（DFO）抑制Neuro-2a细胞增殖;用1mmol/L丙烯酰胺（ACR）损伤N-2a-N细胞突起。N-2a-N细胞分为正常对照组、PBS组、300μg/L CNTF组、500μg/L Nrn1组。用Image J 6.0测量细胞突起长度,用CCK-8法检测细胞活性。免疫荧光细胞化学法检测N-2a-N细胞表型及Pim-1蛋白表达,Real-time PCR和Western blotting检测Pim-1在各组的表达变化。Western blotting检测调节Pim-1活性的相关信号转导分子（Stat-3、p-Stat-3、Erk1/2、p-Erk1/2）,细胞存活、凋亡相关分子（Caspase-3、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2）及轴突再生相关分子GAP-43的表达变化。（2）用RACE法获得N-2a-N细胞内Lnc-Pim1全长序列。用Phylo CSF、CPC和CNCI软件对Lnc-Pim1编码能力进行预测。用FISH法和核质分离技术检测Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内的亚细胞定位。用Real-time PCR检测不同时间点受损N-2a-N细胞中Lnc-Pim1的表达变化。（3）构建Pim-1、Lnc-Pim1重组慢病毒载体,用Real-time PCR测定病毒的滴度。（4）设计Pim-1、Lnc-Pim1特异性干扰试剂Pim-1 siliencer和Lnc-Pim1 siliencer,采用Real-time PCR检测不同浓度干扰试剂对N-2a-N细胞内Pim-1、Lnc-Pim1表达的影响。（5）用MOI值为40携带杀稻瘟菌素抗性的Pim-1重组慢病毒载体感染Neuro-2a细胞,用80μg/ml的杀稻瘟菌素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Pim-1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用200nmol/ml的阴性对照物（Negtive control,NC）silencer或Pim-1 siliencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Pim-1 silencer组,并于转染48 h后检测。倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,并对细胞突起长度进行测量、统计。用CCK-8检测各组细胞活性,用Real-time PCR及Western blotting检测各组Pim-1基因及蛋白的表达,用Western blotting检测各组GAP-43蛋白表达。（6）用MOI值为40携带嘌呤霉素抗性Lnc-Pim1的重组慢病毒感染Neuro-2a细胞,用20μg/ml的嘌呤霉素对重组慢病毒感染的Neuro-2a细胞进行抗性筛选。用1mmol/L ACR损伤N-2a-N细胞,实验分为Ctrl组、ACR组、LV-Blank/ACR组和LV-Lnc-Pim1/ACR组,并于损伤24 h后进行检测;用100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer转染N-2a-N细胞,实验分为NC silencer组、Lnc-Pim1 silencer组,并于转染48 h后检测。用CCK-8法检测各组细胞活性,倒置相差显微镜下对各组N-2a-N细胞进行拍照,用Image J对细胞突起长度进行测量、统计。用Real-time PCR检测Lnc-Pim1的表达,用Western blotting检测Erk1/2、p-Erk1/2的表达。（7）N-2a-N细胞用重组慢病毒载体分别过表达Pim-1和Lnc-Pim1,用200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml Lnc-Pim1 silencer分别敲低Pim-1和Lnc-Pim1的表达,用Real-time PCR检测过表达或敲低Pim-1、Lnc-Pim1对彼此基因表达的影响。（8）用CHIRP-MS技术检测正常N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的互作蛋白,用RNA-seq技术检测正常N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达或敲低所导致的差异性表达基因,分别对互作蛋白和差异表达的基因进行GO和KEGG富集分析。结果:（1）细胞免疫荧光显示N-2a-N细胞表达神经元标志分子β-ⅢTubulin和Neurofilament-200,Pim-1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质。50μmol/L DFO能有效抑制Neuro-2a细胞的增殖。用1mmol/L的ACR成功建立N-2a-N细胞突起损伤模型。N-2a-N细胞损伤后,Pim-1基因表达呈现先降低、后升高、再降低的趋势。与PBS组相比,CNTF组和Nrn1组最长神经突起所占比例明显增加,细胞内信号转导分子Erk1/2、p-Erk1/2、Stat3、p-Stat3、Pim-1表达上调,凋亡相关分子Cleaved Caspase-3、Bax表达下调,抗凋亡相关分子Bcl-2表达上调,神经突起生长相关分子GAP-43表达上调。（2）RACE法获得的N-2a-N细胞内Lnc-Pim1序列全长为2262个碱基;Phylo CSF、CPC和CNCI软件证实Lnc-Pim1具有较低的编码蛋白潜能;FISH法和核质分离技术证实Lnc-Pim1在Neuro-2a细胞、正常N-2a-N细胞以及受损N-2a-N细胞内主要表达于细胞质,少部分表达在细胞核。N-2a-N细胞损伤后,Lnc-Pim1基因表达呈现出先降低、后升高、再降低的趋势,变化的时相点早于Pim-1。（3）成功构建LV-Pim-1和LV-Lnc-Pim1过表达载体,LV-Pim-1滴度为2.64×108TU/ml,LV-EGFP滴度为6.82×108TU/ml;LV-Lnc-Pim1滴度为3.65×108TU/ml,LV-mcherry滴度为1.18×109TU/ml。（4）200nmol/ml Pim-1 silencer和100nmol/ml LV-Lnc-Pim1silencer可分别特异性干扰N-2a-N细胞内Pim-1和LV-Lnc-Pim1的表达。（5）MOI值为40的Pim-1重组慢病毒载体具有较高的感染率,且不影响Neuro-2a细胞活性;80μg/ml的杀稻瘟菌素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞。病毒感染的Neuro-2a细胞,经纯化5代后其感染率可达85%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Pim-1表达水平。Pim-1过表达可增强受损N-2a-N细胞的活力,上调GAP-43蛋白的表达,进而促进受损N-2a-N细胞突起再生。200nmol/ml Pim-1 silencer可导致N-2a-N细胞内Pim-1 m RNA和蛋白表达下调、细胞活性减弱、GAP-43蛋白表达下调,N-2a-N细胞突起的生长受到显着抑制。（6）MOI值为40的Lnc-Pim1重组慢病毒具有较高的感染率且不影响Neuro-2a细胞活性;20μg/ml的嘌呤霉素能有效纯化病毒感染的Neuro-2a细胞;病毒感染的Neuro-2a细胞经纯化5代后其感染率可达到90%以上。经筛选、传代培养后的Neuro-2a细胞具有较高的Lnc-Pim1表达水平。Lnc-Pim1过表达可激活Neuro-2a细胞Erk1/2信号通路,具有促进细胞分化的潜能,并能促进受损N-2a-N细胞突起再生。Lnc-Pim1silencer可敲低N-2a-N细胞内Lnc-Pim1的表达,抑制N-2a-N细胞突起的生长,不影响细胞活性。（7）N-2a-N细胞Pim-1过表达导致Lnc-Pim1表达下调,Pim-1表达下调对Lnc-Pim1的表达无显着性影响;Lnc-Pim1过表达可促进Pim-1表达上调,Lnc-Pim1表达下调对Pim-1表达无显着影响。（8）CHIRP-MS共检测出N-2a-N细胞内183个Lnc-Pim1特异性的互作蛋白,GO和KEGG富集分析显示Lnc-Pim1特异性的互作蛋白主要分布在N-2a-N细胞的细胞质、少部分分布在细胞核。这些互作蛋白与N-2a-N细胞内基因和蛋白的表达调控、细胞间黏附、外泌体分泌、蛋白酶体活性、物质代谢等多种生物学过程相关。在这些互作蛋白中,Tubulin与Histone H2的可信度值最高。RNA-seq结果显示N-2a-N细胞Lnc-Pim1过表达导致140个差异表达的基因,其中93个表达上调,47个表达下调;N-2a-N细胞Lnc-Pim1敲低导致982个差异表达的基因,其中732个表达上调,250个表达下调。GO和KEGG富集分析显示MAPK和PI3K/Akt信号通路可能在Lnc-Pim1对N-2a-N细胞突起生长的效应中起重要作用。过表达和敲低Lnc-Pim1后,一些通路上共表达的Ccl2、Ccl5、Ghr、Hgf和Il1b基因可能是Lnc-Pim1作用的靶基因。结论:（1）Pim-1、Lnc-Pim1主要表达在N-2a-N细胞的细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1和Lnc-Pim1的需要。（2）神经营养因子CNTF、Nrn1可激活受损N-2a-N细胞Erk1/2及Stat3信号通路,上调Pim-1,进而增强细胞活性、减少细胞凋亡、上调GAP-43表达,从而促进受损N-2a-N细胞突起再生。（3）Pim-1过表达能够增强受损N-2a-N细胞活性、上调GAP-43表达,进而促进突起再生。敲低N-2a-N细胞Pim-1的表达,细胞活性、GAP-43表达和突起生长受到明显抑制。（4）Lnc-Pim1过表达可促进受损N-2a-N细胞突起再生,还可能具有促进Neuro-2a细胞分化的作用。Lnc-Pim1表达下调抑制N-2a-N细胞突起生长。（5）Lnc-Pim1过表达可能顺式增强Pim-1表达,Pim-1过表达可抑制Lnc-Pim1表达。（6）N-2a-N细胞中一些Lnc-Pim1的互作蛋白及受Lnc-Pim1调节的基因,为下一步研究Lnc-Pim1作用机制提供了初步实验基础。总之,N-2a-N细胞的Pim-1、Lnc-Pim1主要表达于细胞质,修复受损N-2a-N细胞有过表达Pim-1、Lnc-Pim1的需要;外源性CNTF或Nrn1经上调Pim-1表达以及Pim-1、Lnc-Pim1经重组LV载体过表达,均能促进受损N-2a-N细胞突起的再生,并初步阐明了一些相关作用机制。
赵磊[7]（2020）在《Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究》文中提出第一部分脊髓损伤动物模型的建立及评价目的:1.建立合适的脊髓损伤（Spinal Cord Injury,SCI）大鼠模型;2.观察并验证神经元在SCI后的形态变化及凋亡情况。研究方法:1.将雄性SD大鼠54只（体重273-282g）,随机分成空白对照组（Blank,3只）、假手术组（Sham,18只）和脊髓损伤组（SCI,33只）。2.SCI大鼠的造模采用动脉瘤钳夹法（目标节段为T10,动脉瘤夹标定力量70 g,钳夹持续时间30s）。假手术组（Sham）大鼠手术显露T10脊髓节段后,旷置4分钟后缝合。Blank大鼠不予手术。3.对T10及周围脊髓组织取材:随机选取Sham组大鼠3只在手术后72h取材;SCI大鼠18只,在造模后6个时间点分别随机抽取3只大鼠取材（12h、24h、48h、72h、7d、14d）;Blank大鼠在体重=278±2g取材。将取材组织制作成冰冻切片。4.神经行为学评分:采用BBB评分;对脊髓损伤组和假手术组大鼠进行评分（SCI组15只;Sham组15只）,记录术前以及术后12h、24h、48h、72h、7d、14d共7个时间点的BBB评分。5.取不同组的大鼠脊髓冰冻切片进行尼氏染色（Nissl染色）,观察神经元的形态及尼氏小体的变化。进行TUNEL染色观察神经元凋亡情况。结果:大鼠在造模后即发生全瘫（BBB Score=0）,72h的BBB评分略微波动（0.43±0.40）,在7d出现明显的上升（8.03±0.53）;Sham组大鼠术后24h内BBB评分较正常略有下降（24h:20.33±0.61）,48h后恢复正常（BBB Score=21）。尼氏染色见脊髓损伤后神经元的尼氏小体逐渐减少,72h最少,之后稍有恢复。TUNEL染色见脊髓损伤大鼠在72h神经元凋亡数量最大。Sham组与Blank组切片,两种染色后的结果均接近。结论:本研究利用的动脉瘤夹钳夹法可成功制备急性脊髓损伤大鼠模型,是一种经济、可靠的建模方法。本组研究发现SCI后72h的神经元凋亡是峰值。第二部分Miro1在大鼠脊髓损伤不同时间段的变化目的:1.观察Miro1在SCI后的变化规律;2.明确Miro1变化与神经元凋亡的关系。研究方法:1.雄性SD大鼠54只（体重276-285g）,随机分成空白对照组（Blank,6只）、假手术组（Sham,9只）和脊髓损伤组（SCI,39只）。SCI造模、Sham组及Blank组处理同第一部分。2.随机选取Sham组大鼠6只、SCI组大鼠36只与6只Blank大鼠分别取材,提取脊髓的RNA及总蛋白。Sham组在空白手术后72h进行;SCI组在6个时间点进行（12h、24h、48h、72h、7d、14d）n=6×6;Blank组大鼠在体重=278±2g时取材。3.采用qRT-PCR定量检测SCI组6个不同时间点及Blank、Sham组大鼠的T10节段Miro1的基因表达情况（n=3）;采用Western-Blot法检测Miro1的表达量（n=3）。4.Sham组及SCI组在术后72h各取三只大鼠制作脊髓冰冻切片（n=3）,采用免疫荧光法对其Miro1表达阳性的神经元和星形胶质细胞观察和计数。结果:qRT-PCR:SCI后T10节段Miro1的基因表达量逐渐增高,在72h达峰,后有所回落,至14d仍高于对照组。Western-Blot:SCI后T10节段Miro1的表达量增高,72h达最大值。免疫荧光染色:神经元及星形胶质细胞中均可见Miro1的阳性表达;SCI-72h组脊髓节段Miro1表达阳性的神经元细胞占总神经元细胞的比率较Sham对照组明显增高（p<0.01）;星形胶质细胞增多,Miro1表达阳性的细胞亦增多（p<0.01）。结论:Miro1在脊髓损伤之后会出现反应性增高;其变化趋势与神经元凋亡趋势吻合,Miro1可能参与调控了大鼠脊髓损伤后神经细胞的凋亡过程。第三部分Miro1在脊髓损伤中对神经元凋亡的抑制及其机制探讨目的:1.抑制SCI后Miro1在脊髓中的表达并验证;2.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;3.观察与Miro1可能相作用的线粒体转运分子及凋亡相关分子表达的变化,并探索Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.雄性SD大鼠60只（体重273-282g）,随机分为空白对照组（Sham）、生理盐水对照组（NS）、溶剂对照组（MOCK）和实验组（Si RNA）四组。Sham组接受空白手术,同前两部分;其余三组显露T10节段:NS组在T10节段以微量注射泵推注生理盐水8μl;MOCK组推入转染试剂8μl;实验组推入含有Si RNA的转染复合物8μl。上述操作后将NS组、MOCK组及Si RNA组大鼠以动脉瘤夹钳夹造成脊髓损伤。2.每组选取6只大鼠,记录术前、术后12h、24h、48h、72h、7d和14d七个时间点的BBB评分并记录统计。3.实验取材均在手术后72h进行,进行RNA、脊髓总蛋白提取及冰冻切片制作。4.qRT-PCR检测不同组间脊髓节段Miro1的基因表达情况（n=3）;Western-Blot法检测不同组间Miro1的表达情况（n=3）。5.Western-Blot法检测驱动蛋白重链（Kinesin Heavy Chain,KHC）,驱动蛋白轻链1（Kinesin Light Chain 1,KLC-1）,动力蛋白中间链（Dynein Intermediate Chain,DIC）,线粒体锚定蛋白（Syntaphilin,SNPH）,凋亡相关基因蛋白BAX和B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）的表达情况。6.不同组间大鼠脊髓切片TUNEL染色观察凋亡情况（n=3）。结果:1.qRT-PCR及Western-Blot都提示在SCI后72h,Si RNA组Miro1的基因表达或蛋白表达量较MOCK组及NS组均下降。2.Si RNA组较MOCK组及NS组的KHC及SNPH表达明显下降,DIC及KLC-1无显着变化;Si RNA组的BAX表达增加,Bcl-2表达下降,BAX/Bcl-2增大。3.TUNEL染色:Si RNA组阳性细胞较MOCK组及NS组明显增多。4.BBB评分:SCI后Si RNA组的BBB评分（7d:6.5±0.45;14d:8.58±0.80）较MOCK的BBB评分（7d:7.67±0.75;14d:9.67±0.75）在7d和14d均有明显下降（7d:p<0.01;14d:p<0.05）。结论:Miro1通过与驱动蛋白（Kinesin）相结合和线粒体锚定蛋白（Syntaphilin）作用,参与调控的线粒体运动作用于脊髓损伤大鼠神经元的凋亡过程,并且在一定程度上保护神经元。且这一调控过程最可能是通过调节BAX/Bcl-2两种蛋白量的比例这一通路实现的。其中与驱动蛋白作用位点主要考虑为驱动蛋白重链（KHC）。第四部分慢病毒载体注射致Miro1过表达对改善脊髓损伤预后的探讨目的:1.利用慢病毒载体技术使Miro1在脊髓节段中过表达;2.观察并验证SCI后脊髓节段Miro1的表达量改变;3.观察神经元凋亡情况及脊髓功能的改变;4.进一步验证Miro1对SCI后神经元凋亡的影响机制。研究方法:1.依照Miro1基因（RHOT1）设计,对GV492-Miro1慢病毒载体进行构建与生产;2.将空载慢病毒（GV492）和过表达载体慢病毒（GV492-Miro1）调成1×109TU/ml的悬液。SD雄性大鼠6只（体重271-276g）并分成两组,在T10节段分别将8μl空载慢病毒悬液和Miro1过表达载体慢病毒悬液推入大鼠脊髓;术后第7天将两组大鼠处死及取材,制作冰冻切片,DAPI封片,共聚焦显微镜观察计数、统计。证实感染效率。3.60只雄性SD大鼠（体重278-287g）随机分成空白对照组（Sham）、生理盐水对照组（NS组）、空载慢病毒对照组（Lenti-Ctrl）和实验组（Lenti-Miro1）四组。各组大鼠进行两次手术:a.注射手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠显露T10脊髓节段,分别缓慢将8μl生理盐水、空载慢病毒悬液和过表达载体慢病毒悬液推入脊髓T10。Sham组大鼠作为对照,仅暴露不注射,操作同第一部分实验Sham组大鼠相同。第一次术后大鼠饲养七天进行下一阶段。b.脊髓损伤手术:NS组、Lenti-Ctrl组和Lenti-Miro1三组大鼠再次显露T10脊髓节段并钳夹造模。Sham组大鼠接受二次手术作为对照,显露硬膜囊后暴露创面120s后缝合伤口。4.对四组大鼠均随机选取6只进行BBB评分,在第一次手术前和手术后的12h、24h、48h、72h、7d;第二次手术后的12h、24h、48h、72h、7d、14d观察大鼠的BBB评分。5.每组大鼠均在二次手术结束后72h处死进行取材,提取脊髓RNA或总蛋白。6.qRT-PCR检测不同组间Miro1的基因表达情况（n=3）;Western-Blot检测不同组间Miro1的表达情况（n=3）。7.Western-Blot法测定KHC、KLC-1、DIC、SNPH、BAX和BCL-2的表达情况（n=3）。8.不同组间大鼠脊髓节段TUNEL染色观察凋亡情况（n=3）。结果:1.大鼠T10节段在注射空载慢病毒（GV492）和过表达载体慢病毒（GV492-Miro1）后7d,共聚焦显微镜下可检测到病毒转染阳性神经元细胞,且两组阳性细胞数无显着差异。2.qRT-PCR及Western-Blot均提示在SCI-72h,Lenti-Miro1组Miro1的基因表达或蛋白表达量较Lenti-Ctrl组及NS组均上升;3.Lenti-Miro1组较Lenti-Ctrl组的KHC及SNPH表达亦明显上升,DIC及KLC-1无显着变化;Lenti-Miro1组的BAX表达变化不明显,Bcl-2表达升高,BAX/Bcl-2下降。4.TUNEL染色:Lenti-Miro1组阳性细胞较Lenti-Ctrl组及NS组减少。5.BBB评分:Lenti-Miro1组的BBB评分（SCI术后7d:8±0.45;14d:11.75±1.17）及Lenti-Ctrl组评分（7d:7.67±0.75;14d:9.75±0.52）,7d时两组差异不大（p>0.05）;14d显着增高（p<0.01）。结论:慢病毒载体使得脊髓局部过表达Miro1可改善脊髓损伤神经元的凋亡情况,保护神经元功能。进一步证实了Mrio1在脊髓损伤中通过与Kinesin及Syntaphilin作用,调控线粒体转运,进而抑制神经元的凋亡而对神经元起到保护作用。慢病毒载体局部注射使脊髓过表达Miro1,为生物治疗改善脊髓损伤对脊髓功能的损害提供一定的理论基础。
彭科[8]（2020）在《右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤目的:探讨右美托咪定（dexmedetomidine,DEX）后处理对原代乳鼠心肌细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）过程中心肌细胞损伤的影响。方法:（1）新生乳鼠原代心肌细胞的提取和培养。选取新生48小时内的Sprague Dawley（SD）大鼠提取和原代培养心肌细胞,并运用免疫荧光染色法鉴定心肌细胞的纯度。（2）不同浓度的右美托咪定对正常培养的原代心肌细胞的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组,0.1、1、10、50μM不同浓度的右美托咪定处理24小时组。与对照组相比,观察不同浓度的右美托咪定对正常状态下培养的心肌细胞是否存在细胞毒性。（3）不同缺氧复氧时间对原代心肌细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为7组（每组n=6）:对照组和6个H/R组。H/R组通过氧糖剥夺（oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）建立细胞 H/R 模型,分别于缺氧 3、6、12 小时+复氧3小时（H3R3、H6R3、H12R3组）以及缺氧6小时+复氧6、12、24小时（H6R6、H6R12、H6R24组）的不同缺氧复氧时间点使用cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒检测心肌细胞活力,确定本实验条件下细胞缺氧复氧模型的作用时间点。（4）不同浓度右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤后细胞活力和细胞毒性的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组,3个右美托咪定处理组。处理组中分别给予0.1、1、10μM不同浓度的右美托咪定后处理（即在复氧开始时加入到细胞培养基）,使用CCK-8和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）试剂盒检测心肌细胞活力和细胞毒性,以确定本实验中最佳的右美托咪定后处理浓度。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时细胞凋亡的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。在复氧开始时给予1 μM的右美托咪定后处理,复氧结束后采用Annexin V-FITC/PI双染法和流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡率。（6）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时缺氧诱导因子-1α（hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α）、凋亡相关基因 B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2,BCL-2）和BCL2样蛋白X（BCL2-Associated X,BAX）蛋白表达水平影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用Western Blot检测各组HIF-1α、BCL-2、BAX蛋白水平的表达。（7）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和BAX在细胞内的定位的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组。使用双标免疫荧光法检测各组心肌细胞内HIF-1α和BAX蛋白在细胞中的定位情况和表达水平。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）乳鼠原代心肌细胞正常培养至72小时,经免疫荧光染色鉴定其心肌细胞纯度达98%,可稳定供以下实验使用。（2）0.1、1、1 0 μM的右美托咪定对于正常培养的心肌细胞活力均无显着影响,而高浓度的右美托咪定（50μM）则使得细胞活力降低至对照组的82.42±2.39%（P<0.01）,说明右美托咪定大于50μM的浓度时会对原代心肌细胞产生一定的细胞毒性。（3）心肌细胞的活力在H3R3、H6R3、H12R3、H6R6、H6R12、H6R24的各个不同时间点和对照组细胞相比均明显下降（P<0.01）,选取缺氧6小时复氧3小时用于后续的细胞实验（此时细胞活力下降至对照组的63.21±1.74%）。（4）与H/R组相比,使用0.1、1、10μM的右美托咪定后处理显着改善H/R损伤后的心肌细胞活力,减少LDH释放量（P<0.01）。其中浓度为1 μM的右美托咪定后处理效果最好,细胞活力与H/R组相比为75.21±2.23%vs.60.00±1.11%（P<0.01）,培养基中 LDH 释放量与 H/R 组相比为 200.8±7.37%vs.267.5 ± 5.57%（P<0.01）。因此,选取1μM的右美托咪定用于后续的细胞实验。（5）流式细胞凋亡率检测结果显示,与对照组相比,缺氧复氧过程显着增高原代心肌细胞的凋亡率至38.60±0.90%（P<0.01）,而使用1 μM右美托咪定后处理可以使H/R损伤后的心肌细胞凋亡率降低至20.94±0.96%（P<0.01）。（6）Western Blot结果显示,H/R组细胞HIF-1α和BAX的蛋白表达水平显着升高（P<0.01）,而BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX的比值显着降低（P<0.01）。右美托咪定后处理显着降低了 HIF-1α和BAX蛋白的表达水平（P<0.01）,并且翻转了 BCL-2蛋白表达（P<0.05）以及BCL-2/BAX的比值（P<0.01）。（7）双标免疫荧光实验结果显示,HIF-1α与BAX蛋白的表达在原代心肌细胞内存在共定位关系。在H/R组中,HIF-1α和BAX的荧光表达强度较对照组显着升高（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低了H/R损伤时HIF-1α和BAX的荧光表达水平（P<0.01）。结论:1 μM右美托咪定后处理可以显着减轻乳鼠原代心肌细胞缺氧复氧损伤,具体表现为改善H/R损伤导致的细胞活力下降、减轻细胞毒性、抑制LDH释放量、以及降低细胞凋亡率。右美托咪定后处理在细胞水平上减轻缺氧复氧损伤的保护作用很可能与其抑制HIF-1α蛋白的表达,调节凋亡相关蛋白的水平,从而抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡有关。第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制目的:进一步探讨右美托咪定后处理是否通过调控HIF-1α的转录活性、抑制细胞凋亡、从而减轻缺氧复氧导致的心肌细胞损伤及其分子机制。方法:（1）HIF-1α 脯氨酰羟化酶 2（prolyl hydroxylase-2,PHD2）抑制剂 IOX2 对原代心肌细胞常氧和H/R状态下HIF-Iα和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+IOX2组。IOX2是一种特异性的HIF-1α PHD2抑制剂,可通过抑制HIF-1α的降解从而增强其转录活性。IOX2的使用浓度为50μM,在复氧开始时使用右美托咪定前加入到细胞培养基之中。使用Western Blot方法检测HIF-1α、Bcl-2/adenovirus E1B 19kDa相互作用蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19kD interacting protein 3,BNIP3）、半胱氨酸蛋白酶-3 剪切体（cleaved caspase-3）蛋白水平的表达。（2）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时细胞活力的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+IOX2组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为0.1%的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）,用于溶解IOX2。使用CCK-8试剂盒检测各组心肌细胞的活力。（3）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时线粒体膜电位的影响。将原代心肌细胞随机分为5组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2组、H/R+DEX+溶剂组。使用JC-1荧光染色法检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）水平。正常线粒体膜中,JC-1以聚合体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出红色荧光;而凋亡细胞的线粒体膜电位ΔΨm下降或消失,JC-1以单体的形式出现,在荧光显微镜下呈现出绿色荧光。通过分析不同状态下JC-1红色/绿色荧光的比值可以得到细胞线粒体膜电位的相对数值,线粒体膜电位下降提示线粒体的结构性损伤。（4）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:H/R组、H/R+DEX组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot 检测各组细胞 HIF-1α和 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、聚 ADP-核糖聚合酶 1 剪切体（cleaved poly ADP-ribose polymerase 1,cleaved PARP-1）蛋白水平的表达。（5）右美托咪定后处理对原代心肌细胞H/R损伤时HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平的影响。将原代心肌细胞随机分为3组（每组n=6）:对照组、H/R组、H/R+DEX 组。使用荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测各组细胞内HIF-1α及其靶基因BNIP3的mRNA表达水平。（6）通过质粒转染正常培养的原代心肌细胞以证实HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。合成目的基因 HIF-1α DNA,将其构建到质粒载体 pLenti-GⅢ-CMV-GFP-2A-Puro上:并合成启动子BNIP3 promoter和BNIP3启动子突变体,将其构建到双荧光酶素报告质粒载体 pLenti-miniCMV-RenLuc-PGK-Luc-SV40-GFP-2A-Puro 上。将原代心肌细胞随机分为4组（每组n=6）:BNIP3启动子组、BNIP3启动子+空载质粒组、BNIP3启动子+HIF-1α质粒组、BNIP3启动子突变+HIF-1α质粒组。将质粒转染正常培养的心肌细胞24小时后,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达强度,并使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测转录因子HIF-1α对BNIP3启动子的激活情况。（7）IOX2对右美托咪定后处理的原代心肌细胞H/R损伤时BNIP3启动子活性的影响。将原代心肌细胞随机分为6组（每组n=6）:对照组、对照+DEX组、H/R组、H/R+DEX 组、H/R+DEX+IOX2 组、H/R+DEX+溶剂组。将报告基因 BNIP3 promoter质粒分别转染以上细胞24小时之后,按照分组情况对细胞进行H/R、DEX、IOX2的处理。使用双荧光素酶报告基因试剂盒检测BNIP3启动子的活性。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,IOX2使正常培养的原代心肌细胞HIF-1α蛋白表达水平明显着升高为对照组的254.4±22.37%（P<0.01）。在H/R状态下,IOX2仍有进一步升高HIF-1α的趋势,但差异不具有统计学意义（431.1±37.86%vs.353.2±35.61%,P>0.05）。同时,IOX2并不影响BNIP3和cleaved caspase-3在正常培养的细胞和H/R状态下细胞中的表达。该结果说明IOX2可以有效的稳定HIF-1α的表达水平而并不增加细胞凋亡。（2）IOX2对于正常培养的心肌细胞活力没有明显影响。H/R造成细胞活力显着下降至对照组的60.26 ± 2.17%（P<0.01）,使用1 μM的右美托咪定后处理使细胞活力升高为77.72±1.63%（P<0.01）,而IOX2使用后细胞活力又下降为63.10±2.36%（P<0.01）。因此,IOX2逆转了右美托咪定后处理的作用,说明右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致的心肌细胞活力下降。（3）线粒体膜电位JC-1染色结果显示,H/R使原代心肌细胞的线粒体膜电位ΔΨm显着下降,即较高的绿色JC-1单体/红色JC-1聚合体比值。1μM的右美托咪定后处理减轻了线粒体膜电位ΔΨm的下降,使得红色JC-1聚合体增加,绿色JC-1单体减少。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对线粒体膜电位ΔΨm的效果（P<0.01）。这提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡过程中线粒体结构损伤。（4）Western Blot结果显示,1 μM的右美托咪定后处理使H/R时原代心肌细胞的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,而BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻H/R导致心肌细胞凋亡相关蛋白的改变。（5）qPCR结果显示,H/R时HIF-1α和BNIP3的mRNA表达水平显着升高（P<0.01）。1μM的右美托咪定后处理显着降低了 H/R时的BNIP3的激活（P<0.01）,但并没有明显改变HIF-1α的mRNA表达水平。该结果提示右美托咪定后处理在HIF-1α的转录后水平而非mRNA水平抑制了 HIF-1α蛋白对靶基因BNIP3的激活。（6）正常培养的心肌细胞转染BNIP3启动子/启动子突变体、HIF-1α质粒24小时后,双荧光酶素报告基因结果显示BNIP3启动子+HIF-1α质粒组的荧光素酶活性显着升高（P<0.01）,BNIP3启动子突变+HIF-1α DNA质粒组的荧光素酶活性与之相比则显着降低（P<0.01）。该结果说明合成的BNIP3启动子可以被HIF-1α DNA激活,该质粒系统的构建有效。（7）双荧光酶素报告基因结果显示,H/R时荧光素酶活性显着升高、BNIP3启动子被激活（P<0.01）,1 μM的右美托咪定后处理则降低了 H/R引起的高荧光素酶活性（P<0.01）。然而,IOX2的使用逆转了右美托咪定对BNIP3启动子活性的抑制作用（P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α的转录活性抑制了 H/R导致的BNIP3启动子的激活。结论:特异性HIF-1α脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2可以稳定HIF-1α蛋白的表达水平,同时对乳鼠原代心肌细胞的活性和细胞凋亡没有不良影响。1 μM的右美托咪定后处理可以改善H/R后原代心肌细胞的活力、恢复线粒体膜电位、减轻线粒体结构损伤、调控凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平、并在转录后水平抑制了 HIF-1α对靶基因BNIP3的激活。然而,IOX2逆转了上述效果,阻断了右美托咪定后处理对原代心肌细胞缺氧复氧的保护作用。综合本部分机制研究的结果,右美托咪定后处理通过在转录后水平作用于HIF-1α此关键靶点,抑制其对下游靶基因的激活,抑制凋亡级联反应,减少细胞凋亡,从而在细胞水平减轻原代心肌细胞缺氧复氧损伤。第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤目的:阐明右美托咪定后处理对大鼠心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）过程中心肌损伤和凋亡相关蛋白表达的影响,并进一步证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号通路发挥对大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用。方法:（1）大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-lα蛋白表达随再灌注时间的变化。取24只健康成年雄性SD大鼠随机分为4组（每组n=6）:假手术组、心肌缺血30分钟再灌注2小时、6小时、和24小时组。使用Western Blot检测再灌注2、6、24小时大鼠左心室组织中HIF-1α的蛋白表达水平,取其表达变化最显着的时刻作为后续实验的观察时间点。（2）右美托咪定后处理和IOX2对心肌缺血再灌注过程中大鼠心率的影响。使用MedLab生物医学信号处理系统监测大鼠心电图的变化。取42只健康成年雄性SD大鼠随机分为7组（每组n=6）:假手术组、假手术+DEX组、I/R组、I/R+IOX2组、I/R+DEX组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。其中溶剂为5%二甲基亚砜（DMSO）+30%聚乙二醇300（PEG300）,用于溶解IOX2。再灌注开始时,经过右颈内静脉泵注右美托咪定负荷剂量6 μg/kg/h持续10分钟,追加维持剂量0.7μg/kg/h持续15分钟。IOX2组中,使用右美托咪定前经大鼠腹腔给予25μg/mg的IOX2。记录基础值、缺血15和30分钟、再灌注15、30、60分钟的心率值,并比较心率随时间变化的曲线下面积以观察心率在此期间整体的变化。（3）右美托咪定后处理和IOX2对大鼠心肌缺血再灌注过程中动脉血气、电解质、酸碱平衡的影响。上述7组大鼠于再灌注6小时经腹主动脉取血,行动脉血pH、动脉血氧分压（partial pressures of oxygen,PaO2）、动脉血二氧化碳分压（partial pressures of carbon dioxide,PaCO2）、动脉氧饱和度（arterial oxygen saturation,SaO2）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、红细胞压积（hematocrit,Hct）、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、碱剩余（base excess,BE）的分析,以了解各组动物在实验过程中内环境的是否稳定。（4）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组 n=6）:假手术组、假手术+DEX 组、I/R 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2组、I/R+DEX+溶剂组。给药方式同第（2）部分。于再灌注6小时取下腔静脉血,使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA）检测血清cTnI的水平,以明确各组大鼠心肌损伤的程度。（5）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌组织凋亡的影响。上述6组大鼠于再灌注6小时取左心室组织,行冰冻切片。并使用原位末端标记法（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL）标记凋亡细胞断裂基因组 DNA的3’-OH末端,在荧光显微镜下检测各组大鼠心肌绀织的凋亡情况。（6）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注导致的心肌梗死面积的影响。取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。于再灌注 6小时,左心室组织行2%伊文氏蓝/1%氯化二苯四氮唑（Evans blue/2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色,分析心肌组织缺血危险区（area at risk,AAR）和心肌梗死区（infarct area,IA）的面积,心肌切片后以称重法分别记录其重量,心肌梗死面积最终以IA 区的承量占AAR区的市量的百分比（IA总重量/AAR总重量×100%）来表示。（7）IOX2对右美托咪定后处理的大鼠心肌缺血再灌注过程中HIF-1α和凋亡相关蛋白表达的影响。取36只雄性SD大鼠随机分为6组（每组n=6）:假手术组、I/R组、I/R+IOX2 组、I/R+DEX 组、I/R+DEX+IOX2 组、I/R+DEX+溶剂组。使用 Western Blot检测缺血再灌注、右美托咪定、IOX2干预后各组大鼠心肌组织中HIF-1α和凋亡相关蛋白 BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平的变化。（8）心肌缺血再灌注实验过程中各组大鼠死亡率的比较。记录和比较以上所有7部分实验中,在未达到实验终点前由于任何原因引起的的大鼠死亡情况。以上各组数据以均值±标准误表示,使用GraphPad 7软件进行统计学分析处理。结果:（1）Western Blot结果显示,缺血30分钟再灌注2、6、24小时的三组大鼠心肌组织内HIF-1α蛋白表达均较假手术组显着升高（P<0.01）,且再灌注6小时组的表达量显着高于2小时组（P<0.01）和24小时组（P<0.05）。因此,选取缺血30分钟再灌注6小时作为最佳时间点应用于后续大鼠实验。（2）心电图及心率监测结果显示,心肌缺血再灌注过程引起了大鼠心电图的显着变化,即缺血时ST段显着抬高、再灌注时出现快速型心律失常如室性心动过速、甚至室颤。右美托咪定后处理对于ST段变化和心律失常没有显着影响。实验过程中右美托咪定组的大鼠心率有减慢的趋势,但组内和组间比较的差异都不具有统计学意义（P>0.05）,各组的曲线下面积（心率×时间）也相似。（3）血气、电解质、血红蛋白的结果显示,再灌注6小时各组大鼠的动脉血pH、Pa02、PaCO2、SaO2、Hb、Hct、Na+、K+、Ca2+、Cl-、HCO3-、BE 数值都在正常范围。与假手术组相比,经受心肌I/R的大鼠PaCO2、HCO3-、BE的数值偏低,但组间比较差异不具有统计学意义（P>0.05）。因此,实验过程中大鼠的内环境保持稳定。（4）血清cTnI检测结果显示,I/R组大鼠血清cTnI浓度显着升高为9.78±0.42 ng/ml（P<0.01）,右美托咪定后处理则使cTnI降低至5.07±0.33 ng/ml（P<0.01）,但I/R+DEX+IOX2组又升高为8.19±0.43 ng/ml（P<0.01）。右美托咪定后处理显着减少了大鼠心肌I/R导致的cTnI释放,该保护作用被IOX2逆转,提示右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌组织损伤。（5）TUNEL凋亡检测结果显示,I/R组大鼠心肌组织凋亡率为36.67±1.97%（P<0.01）,右美托咪定后处理组则降低至15.59±0.80%（P<0.01）,而I/R+DEX+IOX2组又升高为28.74±1.38%（P<0.01）。此结果证明右美托咪定后处理通过调控HIF-1 α减轻I/R导致大鼠心肌组织的凋亡。（6）Evans Blue/TTC双染检测结果显示,除假手术组外的各组大鼠心肌缺血危险区AAR的面积在45%左右,组间具有可比性（P>0.05）。I/R组和I/R+IOX2组大鼠的心肌梗死面积显着升高为39.27±0.72%和41.53±1.50%（P<0.01）,右美托咪定后处理显着降低梗死面积至20.20±2.07%（P<0.01）,而IOX2又使梗死面积增加至33.90±2.06%（P<0.01）。因此,右美托咪定后处理通过调控HIF-1α减轻I/R导致的大鼠心肌梗死面积。（7）Western Blot的结果显示,右美托咪定后处理使I/R时心肌组织的HIF-1α、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 蛋白表达水平显着减少（P<0.01）,BCL-2/BAX蛋白表达比值显着增加（P<0.01）,而IOX2则逆转了右美托咪定对上述蛋白的效果（P<0.05或P<0.01）。该结果证实右美托咪定后处理通过调控HIF-1α蛋白减轻I/R导致大鼠心肌凋亡相关蛋白的改变。（8）整个实验过程中总共有9只大鼠在实验终点前死亡。死亡原因包括失血、严重心律失常（室性心动过速和室颤）、呼吸衰竭。死亡率分别为:假手术组（1/25,即4.0%）、假手术+DEX组（0/6,即0%）、I/R组（2/38,即5.26%）、I/1R+IOX2组（2/20,即 10%）、I/R+DEX 组（1/1 9,即 5.26%）、I/R+DEX+IOX2 组（2/20,即10%）、I/R+DEX+溶剂组（1/19,即5.26%）。各组死亡率的组间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。结论:右美托咪定后处理可减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,表现为降低血清cTnl水平、减轻心肌组织凋亡、减少心肌梗死面积、调控凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、BNIP3、cleaved caspase-3、cleaved PARP-1 的表达水平。特异性 HIF-1α 脯氨酰羟化酶-2抑制剂IOX2则逆转了右美托咪定后处理的心肌保护作用和以上指标的变化。综合本部分研究结果,右美托咪定后处理通过作用于HIF-1α此关键靶点减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。
毛敏[9]（2020）在《纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用》文中认为核酸疫苗是指将含有编码蛋白基因序列的质粒载体导入宿主体内,通过宿主细胞表达相应的抗原蛋白,诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答。直接将核酸疫苗注射到宿主体内,易过早被体内的核酸酶降解,而不能有效发挥作用。因此,核酸疫苗免疫治疗成功的关键是发展出一种具有靶向特异性与基因高效转移和缓慢表达,并且不产生任何毒副作用的理想佐剂,但现行佐剂存在安全性低、稳定性不强以及局部毒副作用等问题。纳米金（Gold nanoparticles,GNPs）是粒径在10-150 nm间的胶体金颗粒,制备简单,价格低廉,具有高电子密度,能与DNA、蛋白质等多种生物大分子结合,降低大分子在体内的半衰期,且不影响其生物活性,生物相容性好。提示纳米金可能作为一种新型的核酸疫苗佐剂。哺乳动物中枢神经系统（Central nervous system,CNS）损伤后再生困难的一个重要原因是中枢微环境存在髓磷脂抑制因子（myelin-associated inhibitors,MAIs）,现发现四种MAIs:Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp）、髓磷脂相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein,MAG）和硫酸软骨素蛋白多醣（chondroition sulfate proteoglycans,CSPGs）,它们主要通过Nogo受体（Nogo-66 receptor,NgR）和配对免疫球蛋白样受体 B（paired immunoglobulin-like receptor B,PirB）介导对神经再生的抑制作用。因此,以NgR、PirB为双靶点采取干预措施可能会逆转MAls介导的神经再生抑制作用。为探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,本研究以MAls信号为切入点,将GNPs与GMCSF-NgR-PirB双靶向核酸疫苗以不同体积比混合后免疫动物,通过疫苗接种后对血清抗体滴度检测探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,并比较得到质粒与GNPs结合的最佳体积比。体外观察抗血清对神经元突起生长的影响,结合行为学检测、凋亡分析、束路追踪及病理染色等技术在体内观察其对损伤脊髓轴突再生及功能恢复的影响,并利用免疫荧光和Western blot技术进行相关分子机制研究,为脊髓及其他中枢神经系统损伤修复提供新的方法,为核酸疫苗佐剂研究提供新的方向。主要研究内容:1、纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得粒径为15 nm纳米金的制备与鉴定,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB质粒的扩增、鉴定及体外表达检测,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB经GNPs不同体积比包被后免疫动物、抗体滴度检测获得最佳制剂,形成高效价的双靶向融合核酸疫苗。2、纳米金介导的GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用将纳米金和脂质体与质粒以最佳制剂比混合后免疫动物,连续免疫六周后进行脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）)半切造模。行为学采用BBB评分和Catwalk步态分析评估各组大鼠后肢功能恢复情况;组织水平通过神经示踪检测疫苗免疫对脊髓神经束信号传递功能恢复的促进作用,通过HE、Nissl及TUNEL组织病理学染色检测脊髓损伤处神经元的数量、形态、分布及神经元的凋亡情况,观察疫苗免疫对SCI大鼠脊髓神经元的保护作用;免疫荧光染色及Western blot检测损伤处脊髓NgR、PirB及下游分子RhoA和ROCK2,以及神经生长因子GAP-43和突触可塑性相关蛋白Synapsin I的表达情况,从分子水平探讨疫苗免疫对SCI大鼠行为学改善的作用机制。3、体外检测抗血清对神经元突起生长的影响体外以PC12细胞为神经元培养模型,以MAG模拟体内的神经生长抑制作用,探讨抗血清对神经元突起生长的影响,并通过免疫荧光和WB检测相关蛋白表达情况,探讨其作用机制。主要结果及结论:1.ELISA结果显示GNPs和脂质体分别与质粒以1:1体积比混合免疫动物效果最佳。2.以GNPs为佐剂能有效促进双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗进入动物体内,刺激机体免疫系统产生特异性抗体,中和损伤脊髓的NgR和PirB蛋白,逆转其介导的髓磷脂再生抑制信号的传递,促进受损脊髓神经纤维修复及运动功能改善。3.以GNPs为佐剂明显提高了核酸疫苗的免疫效果,且其作为佐剂,免疫效应与阳性对照佐剂脂质体效果相当。
邓亚军[10]（2020）在《PKA通过p38MAPK通路介导脊髓细胞凋亡参与神经病理性疼痛的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨蛋白激酶A（Protein kinase A,PKA）在神经病理性疼痛中的表达及其可能参与机制。方法:从GEO数据库下载神经病理性疼痛的表达谱数据集GSE24982,通过R软件limma包筛选差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）,并利用clusterProfile包对DEGs进行基因本体论和KEGG通路富集分析。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络,Cytoscape软件的cytoHubba插件筛选hub基因。然后选取雄性SD大鼠,体重200-220g,采用坐骨神经分支选择性损伤（Spared Nerve Injury,SNI）方法制备大鼠神经病理性疼痛模型,使用Von Frey丝测定大鼠的机械性痛阈以鉴定模型是否成功。采用蛋白质印迹法检测关键基因、p-p38MAPK、p38MAPK、TNF-α、IL-1β、caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2表达量;免疫荧光单染法显示关键基因的表达及定位;免疫荧光双染法显示关键基因与脊髓星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元的共定位;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TNF-α、IL-1β含量;原位末端标记法（TUNEL）检测脊髓细胞凋亡。大鼠鞘内分别注射PKA和p38MAPK抑制剂后,再次采用蛋白质印迹法检测关键基因、p-p38MAPK、p38MAPK、TNF-α、IL-1β、caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2表达量;酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测TNF-α、IL-1β含量;原位末端标记法（TUNEL）检测脊髓细胞凋亡。结果:本研究共筛选出449个DEGs和20个hub基因,其中PKA被鉴定为参与神经病理性疼痛的关键基因。SNI可诱导大鼠出现机械性痛阈下降（P<0.05）,脊髓PKA表达量增加（P<0.05）,p38MAPK通路激活（P<0.05）,并增加TNF-α、IL-1β、caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2蛋白表达（P<0.05）。免疫荧光单染显示脊髓PKA表达增加,且主要定位于SNI同侧脊髓背角;免疫荧光双染显示PKA与神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞共定位;TUNEL双标染色表明凋亡细胞主要为神经元。鞘内注射PKA抑制剂不仅能缓解SNI大鼠机械性痛觉过敏（P<0.05）,降低TNF-α、IL-1β、caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2蛋白表达（P<0.05）,还能够抑制p38MAPK通路激活（P<0.05）。然而,鞘内注射p38MAPK抑制剂虽能减弱大鼠机械性痛觉过敏（P<0.05）,降低TNF-α、IL-1β、caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2蛋白表达（P<0.05）,但对PKA的表达无影响（P>0.05）。结论:PKA在SNI诱导的神经病理性疼痛大鼠脊髓中显着上调,参与神经病理性疼痛的诱导与维持。其机制可能是通过激活p38MAPK通路介导脊髓细胞凋亡来实现的。
二、原位末端标记——TUNEL法检测脊髓凋亡细胞（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、原位末端标记——TUNEL法检测脊髓凋亡细胞（论文提纲范文）
（1）肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 肾藏精理论研究 |
| 1.1 肾精的生成来源 |
| 1.2 肾精的功能 |
| 1.3 肾精的现代医学研究 |
| 2 “髓”的理论研究 |
| 2.1 “髓”的含义及生理功能 |
| 2.2 “髓”的生成与肾精 |
| 2.3 “骨髓”的现代医学研究 |
| 3 “血”的研究理论 |
| 3.1 血的涵义及生理功能 |
| 3.2 血的生成与肾精 |
| 3.3 贫血的现代医学研究 |
| 4 补肾方龟鹿二仙胶 |
| 5 结语 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验1 肾精亏虚对SD雄性大鼠造血功能影响的实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药物 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 造模方法及分组、给药 |
| 1.6 检测指标及方法 |
| 1.7 统计方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 一般情况 |
| 2.2 红细胞数量(RBC)、血红蛋白(HGB)含量比较 |
| 2.3 血清促红细胞生成素(EPO)、睾酮(T)含量比较 |
| 2.4 附睾精子质量比较 |
| 2.5 睾丸组织病理学比较 |
| 2.6 骨髓象比较 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚大鼠模型的建立 |
| 3.2 肾精亏虚大鼠造血组织形态学的改变 |
| 3.3 肾精亏虚对血清EPO含量的影响 |
| 实验2 肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血细胞及CD34+细胞凋亡的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器设备及试剂 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组大鼠骨髓造血干细胞的超微病理形态学观察 |
| 2.2 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞凋亡的结果 |
| 2.3 骨髓石蜡包埋切片TUNEL法检测CD34+细胞凋亡结果 |
| 3 讨论 |
| 实验3 肾精亏虚对SD雄性大鼠导致骨髓造血细胞凋亡的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 动物及分组 |
| 1.2 造模方法 |
| 1.3 药物及灌胃 |
| 1.4 仪器、试剂及耗材 |
| 1.5 检测指标 |
| 1.6 统计方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 骨髓Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas和 Fasl蛋白表达结果 |
| 2.2 骨髓 Bcl-2、Bax、caspase-3、Fas 和 FaslmRNA RT-PCR 结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 肾精亏虚对大鼠骨髓Fas/Fasl蛋白表达的影响 |
| 3.2 肾精亏虚对大鼠骨髓Bcl-2、Bax蛋白及Bcl-2m RNA、Baxm RNA表达的影响 |
| 3.3 肾精亏虚对大鼠骨髓Caspase-3 表达的影响 |
| 讨论 |
| 1.肾精亏虚与贫血的关系 |
| 2.肾精亏虚大鼠模型建立评估 |
| 3.肾精亏虚对骨髓造血功能影响的可能机制 |
| 4.龟鹿二仙胶改善骨髓造血功能的作用机制 |
| 结论 |
| 展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 综述 肾虚与贫血关系的研究进展 |
| 参考文献 |
| 2 发表论文 |
| 致谢 |
（2）MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 NTDs模型的构建和小RNA组测序 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RA诱导的NTDs鼠胚模型的构建 |
| 2.2 sRNA测序数据质量控制 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 NTDs鼠胚中miRNA表达谱分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 sRNA测序数据基本分析 |
| 2.2 RA诱导的NTDs鼠胚miRNA表达谱的改变 |
| 2.3 sRNA-seq测序数据中部分差异表达miRNAs的 RT-qPCR验证 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 miR-10a-5p异常表达对神经细胞生物学功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RA诱导的NTDs鼠胚组织中miR-10a-5p表达显着升高 |
| 2.2 NSCs的体外培养及鉴定 |
| 2.3 转染慢病毒或miRNA模拟物能有效改变细胞内miR-10a-5p的表达水平 |
| 2.4 miR-10a-5p过表达抑制了细胞的增殖能力 |
| 2.5 miR-10a-5p过表达延迟了细胞周期 |
| 2.6 miR-10a-5p过表达促进了细胞凋亡 |
| 2.7 miR-10a-5p过表达干扰了神经干细胞的分化能力 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第四部分 miR-10a-5p靶向调控CHL1在NTDs发生中的作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验仪器及器械 |
| 1.4 试剂配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.6 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学预测和筛选miR-10a-5p的靶基因 |
| 2.2 双荧光素酶报告实验验证Chl1为miR-10a-5p的靶基因 |
| 2.3 RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1 表达下调 |
| 2.4 NSCs中 miR-10a-5p过表达抑制靶基因Chl1 的表达 |
| 2.5 CHL1 敲低对NSCs细胞生物学功能的影响 |
| 2.6 CHL1 介导了miR-10a-5p对 NSCs增殖和分化能力的调节 |
| 2.7 NSCs中 CHL1 敲低抑制下游MAPK通路的表达 |
| 2.8 miR-10a-5p通过MAPK通路调节NSCs的增殖和分化能力 |
| 2.9 RA诱导的NTDs鼠胚组织中CHL1 下游MAPK通路表达下调 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA在神经管畸形中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 神经退行性疾病国内外研究历史与现状 |
| 1.2.1 Emc3基因研究历史与现状 |
| 1.2.2 神经退行性疾病发病种类和机制研究进展 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.3.1 主要贡献 |
| 1.3.2 创新 |
| 1.4 论文结构安排 |
| 1.5 结语 |
| 第二章 EMC3基因在神经退行性疾病发病机制的功能研究 |
| 2.1 课题背景 |
| 2.1.1 脑神经元病变 |
| 2.1.2 视网膜神经元病变 |
| 2.2 选题依据 |
| 2.2.1 EMC1基因突变导致脑和视网膜退行性疾病 |
| 2.2.2 EMC3是果蝇感光细胞合成视紫红质和多通道膜蛋白所必需 |
| 2.2.3 EMC3和EMC1 是以复合物形式存在 |
| 2.3 研究背景 |
| 2.3.1 内质网相关蛋白的合成和降解途径 |
| 2.3.2 内质网应激介导的非折叠蛋白应答途径 |
| 2.4 研究流程和关键技术 |
| 2.5 前期研究 |
| 2.5.1 已经报道的EMC1突变进行WB分析 |
| 2.5.2 EMC3在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.3 EMC5在COS7 细胞内与EMC其他亚基的表达及定位分析 |
| 2.5.4 内质网膜蛋白复合物亚基免疫共沉淀及WB检测 |
| 2.6 展望未来 |
| 2.7 本章小结 |
| 第三章 Emc3缺失导致小脑共济失调和浦肯野细胞变性 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验技术原理 |
| 3.2.2 实验所用材料 |
| 3.2.3 实验所用方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 利用CRISPR/Cas9-lox P系统构建Emc3 基因敲除小鼠模型 |
| 3.3.2 利用PCR技术对Emc3 CKO小鼠DNA进行基因分型 |
| 3.3.3 Emc3 CKO条件性敲除小鼠生长发育异常 |
| 3.3.4 Emc3 CKO条件敲除型小鼠小脑发育异常 |
| 3.3.5 Emc3 CKO条件敲除型小鼠行为学异常 |
| 3.3.6 Emc3 CKO条件型敲除小鼠的磁共振成像 |
| 3.3.7 Emc3 CKO条件型敲除小鼠进行性小脑萎缩和浦肯野细胞丢失 |
| 3.3.8 Emc3 CKO条件敲除型小鼠浦肯野细胞变性和星形胶质细胞增生 |
| 3.3.9 Emc3 CKO小鼠浦肯野细胞中Emc3 的缺失导致内质网应激 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 浦肯野细胞Emc3缺失影响小鼠的运动协调能力 |
| 3.4.2 星形胶质细胞激活与浦肯野细胞死亡的关系 |
| 3.4.3 浦肯野细胞Emc3缺失怎样激发内质网应激 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 Emc3的丢失导致视网膜杆状双极细胞变性 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 研究目的 |
| 4.3 实验材料和方法 |
| 4.3.1 实验技术原理 |
| 4.3.2 实验所用材料 |
| 4.3.3 实验所用方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 Emc3在视网膜上的表达定位 |
| 4.4.2 Emc3 CKO小鼠Emc3 表达水平降低 |
| 4.4.3 Emc3 CKO小鼠视网膜的生理功能分析 |
| 4.4.4 PKCα抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.5 感光细胞抗体对小鼠视网膜冰冻切片进行免疫染色 |
| 4.4.6 免疫组化和H&E染色结果 |
| 4.4.7 Emc3缺失损害视杆细胞和视杆双极细胞之间的突触传递 |
| 4.4.8 Emc3 CKO视网膜中的反应性神经胶质增生 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 玻璃体视网膜病变FZD4和NDP基因突变研究 |
| 5.1 研究背景 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 伦理声明 |
| 5.2.2 全外显子组测序和变异确认 |
| 5.2.3 表达质粒的构建 |
| 5.2.4 荧光素酶报告分析 |
| 5.2.5 FZD4在细胞中的表达研究 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 测序结果分析 |
| 5.3.2 突变FZD4 蛋白介导的Norrin信号缺陷 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 全文总结与展望 |
| 6.1 全文总结 |
| 6.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩写表 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（4）甲烷对小鼠神经炎症损伤的影响及其可能机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 甲烷改善小鼠神经炎症损伤导致认知功能障碍的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 甲烷通过抗炎作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 甲烷通过抗氧化作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 甲烷通过抗凋亡作用减轻小鼠神经炎症损伤的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第五部分 体外验证甲烷抗炎抗氧化抗凋亡作用的研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 甲烷的抗炎抗氧化抗凋亡作用 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
| 致谢 |
（5）NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要操作仪器 |
| 2.1.4 主要溶剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织来源、细胞提取和培养 |
| 2.2.2 NSCs的传代培养 |
| 2.2.3 OECs培养 |
| 2.2.4 NSCs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.5 OECs的鉴定及细胞纯度的计算 |
| 2.2.6 细胞活力测定 |
| 2.2.7 细胞冻存 |
| 2.2.8 细胞复苏 |
| 2.3 动物实验及样本检测 |
| 2.3.1 实验动物 |
| 2.3.2 主要试剂 |
| 2.3.3 主要仪器 |
| 2.3.4 主要试剂配制 |
| 2.3.5 庆大霉素耳毒性大鼠模型的建立方法 |
| 2.3.6 实验动物分组及给药 |
| 2.3.7 ABR检测大鼠听力阈值 |
| 2.3.8 听觉耳动反射检测 |
| 2.3.9 制作切片 |
| 2.3.10 切片染色 |
| 2.3.11 耳蜗免疫荧光染色 |
| 2.3.12 TUNEL法(原位切口末端标记法)检测凋亡细胞 |
| 2.3.13 免疫组织化学法检测神经营养因子及凋亡免疫阳性细胞 |
| 2.3.14 Western-blot法检测样本BDNF、NT-3和Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 |
| 2.4 统计方法 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 细胞的形态观察及鉴定 |
| 3.1.1 NSCs的培养观察及鉴定 |
| 3.1.2 OECs的培养观察和鉴定 |
| 3.2 各组大鼠体重变化结果 |
| 3.3 大鼠听觉耳动反射检测阈值结果 |
| 3.4 各组大鼠ABR阈值变化结果 |
| 3.5 HE染色结果 |
| 3.6 耳蜗免疫荧光染色观察结果 |
| 3.6.1 耳蜗荧光标记NSC结果 |
| 3.6.2 荧光标记OEC观察结果 |
| 3.7 TUNEL法检测凋亡细胞结果 |
| 3.7.1 各组TUNEL阳性细胞数比较 |
| 3.7.2 各组MOD值比较 |
| 3.8 免疫组化检测结果 |
| 3.9 Western-blot检测各组蛋白表达水平结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 实验性感音神经性耳聋动物模型的制备与机制探究 |
| 4.2 神经营养因子减轻SNHL内耳神经损伤后相关机制 |
| 4.2.1 BDNF对 SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.2.2 NT-3对SGNs的保护作用机制探究 |
| 4.3 细胞移植抑制耳蜗损伤细胞凋亡机制探索 |
| 4.3.1 Caspase结构、功能与促耳蜗细胞凋亡机制探究 |
| 4.3.2 Bcl-2 结构、功能和抗耳蜗细胞凋亡机制探析 |
| 4.3.3 细胞联合移植激活Bcl-2,抑制Caspase、Bax表达路径保护损伤耳蜗细胞探究 |
| 4.4 细胞联合移植上调神经营养因子,抑制细胞凋亡 |
| 4.5 神经性耳聋常见病因概述 |
| 4.6 神经性耳聋治疗方法概述 |
| 4.7 关于NSC和 OEC的取材、培养与鉴定探究 |
| 4.7.1 NSC的组织取材和分离 |
| 4.7.2 NSC的培养和鉴定方法选择 |
| 4.7.3 OECs的组织取材和分离 |
| 4.7.4 OECs的培养与鉴定选择 |
| 第5章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（6）靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分 调控Pim-1表达修复受损神经元样细胞 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)实验细胞系 |
| (二)主要实验试剂 |
| (三)主要溶液配制 |
| (四)主要设备 |
| (五)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)Neuro-2a细胞成功诱导成神经元样细胞(N-2a-N) |
| (二)成功建立ACR损伤N-2a-N细胞突起模型 |
| (三)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞突起的再生 |
| (四)CNTF和 Nrn1 增强受损细胞的活性并减少其凋亡 |
| (五)CNTF和 Nrn1 促进受损N-2a-N细胞内Pim-1 的表达 |
| (六)CNTF和 Nrn1 上调Pim-1 相关信号转导分子的表达 |
| (七)CNTF和 Nrn1 调控N-2a-N细胞突起再生的分子基础 |
| (八)成功构建Pim-1 重组慢病毒载体(LV-Pim-1) |
| (九)Pim-1重组慢病毒载体包装 |
| (十)抗性筛选LV-Pim-1 感染的Neuro-2a细胞 |
| (十一)抗性筛选后Neuro-2a细胞中Pim-1 的表达 |
| (十二)Pim-1 过表达具有修复受损N-2a-N细胞的作用 |
| (十三)沉默Pim-1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| 四、讨论 |
| (一)体外神经元突起损伤模型制备 |
| (二)CNTF、Nrn1 上调Pim-1 表达促进受损神经元样细胞突起再生 |
| (三)Pim-1促进受损神经元样细胞突起再生 |
| 第二部分 Lnc-Pim1 修复受损神经元样细胞的作用及机制 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| (一)主要实验试剂 |
| (二)主要实验设备 |
| (三)实验方法 |
| 三、结果 |
| (一)N-2a-N细胞Lnc-Pim1 序列全长 |
| (二)预测Lnc-Pim1 的编码能力 |
| (三)Lnc-Pim1 在细胞中的表达定位 |
| (四)Lnc-Pim1 在受损N-2a-N细胞表达的时相变化 |
| (五)成功构建Lnc-Pim1 重组慢病毒载体质粒 |
| (六)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体包装 |
| (七)Lnc-Pim1 重组慢病毒载体感染及抗性筛选 |
| (八)Neuro-2a细胞Lnc-Pim1 过表达促进突起生长并激活Erk1/2 通路 |
| (九)Lnc-Pim1 过表达促进受损N-2a-N细胞突起再生 |
| (十)敲低Lnc-Pim1 表达抑制N-2a-N细胞突起生长 |
| (十一)Lnc-Pim1 过表达促进Pim-1 表达上调 |
| (十二)N-2a-N细胞内Lnc-Pim1 的互作蛋白 |
| (十三)调控Lnc-Pim1 表达所导致的差异性基因表达 |
| 四、讨论 |
| (一)Lnc-Pim1 及其在神经元样细胞的表达和损伤后的变化 |
| (二)神经元样细胞Lnc-Pim1与Pim-1 的相互关系 |
| (三)Lnc-Pim1 过表达促进神经元样细胞突起再生及相关机制 |
| 全文小结 |
| 创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述(已发表) LncRNA在视网膜发育和病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论文 |
| 荣誉与奖励 |
| 致谢 |
（7）Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 序言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 :脊髓损伤动物模型的建立及评价 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 :Miro1在大鼠脊髓损伤不同时间段的变化 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 :Miro1在脊髓损伤中对神经元凋亡的抑制及其机制探讨 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 :慢病毒载体注射致Miro1过表达对改善脊髓损伤预后的探讨 |
| 一.引言 |
| 二.材料与方法 |
| 三.结果 |
| 四.讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 综述 线粒体相关蛋白在神经元细胞凋亡中作用的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语及注释 |
| 攻读博士学位期间公开发表的论文及科研成果 |
| 致谢 |
（8）右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 右美托咪定后处理减轻原代乳鼠心肌细胞的缺氧复氧损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 右美托咪定后处理通过在转录后水平抑制HIF-1α信号减轻缺氧复氧过程中心肌细胞凋亡的分子机制 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 右美托咪定后处理通过调控HIF-1α信号抑制细胞凋亡减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论与小结 |
| 参考文献 |
| 结论和展望 |
| 综述 (第一部分)心肌缺血再灌注损伤和右美托咪定心肌保护作用的相关研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述 (第二部分)A systematic Review: Effects of Perioperative Dexmedetomidine Use on Postoperative Mortality and Major Morbidity in Adult Patients Who undergo Cardiac and Non-cardiac Surgery |
| References |
| 附录 |
| 个人简历及博士研究生期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写标注 |
| 绪论 |
| 1. 纳米金及其作为一种新型佐剂在疫苗研究中的应用 |
| 2. 治疗性疫苗接种策略及其在中枢神经损伤修复中的应用 |
| 3. MAIs通过NgR及PirB介导中枢神经轴突再生的抑制效应 |
| 第一章 纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要实验仪器 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要实验试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 纳米金的制备及鉴定 |
| 2.1.1 15 nm纳米金的制备 |
| 2.1.2 15 nm纳米金的鉴定 |
| 2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增、鉴定及体外表达检测 |
| 2.2.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增 |
| 2.2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的酶切鉴定 |
| 2.2.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的测序鉴定 |
| 2.2.4 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的体外表达检测 |
| 2.3 纳米金与pcDNA-GMCSF-NgR-PirB结合效应检测 |
| 2.3.1 波长扫描检测 |
| 2.3.2 核酸电泳检测 |
| 2.4 纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得 |
| 2.4.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB去内毒素质粒的大量提取 |
| 2.4.2 疫苗制备 |
| 2.4.3 动物免疫 |
| 2.4.4 血清抗体滴度检测 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 纳米金的制备及鉴定 |
| 3.1.1 15 nm纳米金的制备 |
| 3.1.2 15 nm纳米金的鉴定 |
| 3.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增、鉴定及体外表达检测 |
| 3.2.1 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的扩增 |
| 3.2.2 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的酶切鉴定 |
| 3.2.3 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的测序鉴定 |
| 3.2.4 pcDNA-GMCSF-NgR-PirB的体外表达检测 |
| 3.3 纳米金与pcDNA-GMCSF-NgR-PirB结合效应检测 |
| 3.3.1 波长扫描检测 |
| 3.3.2 核酸电泳检测 |
| 3.4 免疫条件的确定 |
| 4. 小结 |
| 第二章 纳米金介导的GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用 |
| 1. 实验仪器和试剂 |
| 1.1 主要实验仪器 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 实验试剂配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 动物免疫 |
| 2.2 大鼠变态性脑脊髓炎发生率检测 |
| 2.3 SCI动物模型的制备 |
| 2.4 行为学观察运动功能恢复 |
| 2.4.1 BBB评分 |
| 2.4.2 Catwalk步态分析 |
| 2.5 神经示踪观察损伤脊髓的恢复情况 |
| 2.5.1 BDA神经顺行示踪 |
| 2.5.2 核黄逆行示踪 |
| 2.6 组织病理学检测损伤脊髓恢复情况 |
| 2.6.1 HE染色 |
| 2.6.2 Nissl染色 |
| 2.7 分子水平检测 |
| 2.7.1 TUNEL法检测损伤处脊髓细胞凋亡情况 |
| 2.7.2 免疫荧光染色检测相关蛋白表达情况 |
| 2.7.3 Western blot检测相关蛋白表达情况 |
| 2.8 体外观察抗血清对神经元突起生长影响 |
| 2.8.1 抗血清对神经元突起生长的影响 |
| 2.8.2 免疫荧光检测相关蛋白表达情况 |
| 2.9 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 动物EAE检测 |
| 3.2 行为学检测结果 |
| 3.2.1 BBB评分 |
| 3.2.2 Catwalk步态分析 |
| 3.3 神经示踪观察损伤脊髓的恢复情况 |
| 3.3.1 BDA神经顺行示踪 |
| 3.3.2 核黄逆行示踪 |
| 3.4 组织病理学检测损伤脊髓恢复情况 |
| 3.4.1 HE染色 |
| 3.4.2 Niss1染色 |
| 3.5 分子水平检测 |
| 3.5.1 TUNEL染色检测损伤处脊髓细胞凋亡情况 |
| 3.5.2 免疫荧光染色检测相关蛋白表达情况 |
| 3.5.3 Western blot检测相关蛋白表达情况 |
| 3.6 体外观察抗血清对神经元突起生长影响 |
| 3.6.1 抗血清对神经元突起生长的影响 |
| 3.6.2 免疫荧光检测相关蛋白表达情况 |
| 4. 小结 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果 |
（10）PKA通过p38MAPK通路介导脊髓细胞凋亡参与神经病理性疼痛的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备和仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂和抗体 |
| 2.1.4 主要试剂的配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 mRNA表达谱数据下载 |
| 2.2.2 数据预处理和DEGs的筛选 |
| 2.2.3 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 2.2.4 PPI网络构建及hub基因选择 |
| 2.2.5 Hub基因差异表达展示 |
| 2.2.6 神经病理性疼痛模型构建 |
| 2.2.7 机械痛觉过敏测量 |
| 2.2.8 鞘内注射H89和SB203580 |
| 2.2.9 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.10 免疫荧光检测 |
| 2.2.11 酶联免疫吸附测定法 |
| 2.2.12 TUNEL检测 |
| 2.3 统计分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 数据预处理和DEGs筛选 |
| 3.2 GO和 KEGG通路富集分析 |
| 3.3 PPI网络分析及hub基因选择 |
| 3.4 Hub基因差异表达展示 |
| 3.5 SNI诱导神经病理性疼痛伴随脊髓PKA上调及p38MAPK激活 |
| 3.6 SNI增强神经元和胶质细胞中PKA表达 |
| 3.7 SNI诱导脊髓产生炎症反应及细胞凋亡 |
| 3.8 神经元和胶质细胞发生凋亡 |
| 3.9 PKA和 p38MAPK抑制剂减轻神经病理性疼痛 |
| 3.10 抑制PKA活化能够下调p-p38表达 |
| 3.11 PKA和 p38MAPK抑制剂减轻炎症反应及细胞凋亡 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 英文缩略词对照表 |
| 附录2 行为学测量von Frey纤维丝阳性/阴性对应κ值表* |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、原位末端标记——TUNEL法检测脊髓凋亡细胞（论文参考文献）
- [1]肾精亏虚对SD雄性大鼠骨髓造血功能的影响及其机制研究[D]. 吕建芳. 湖北中医药大学, 2021(01)
- [2]MiRNA-10a-5p靶向CHL1调控神经干细胞生物学行为及在神经管畸形发生中的作用机制研究[D]. 张娟. 山西医科大学, 2020(01)
- [3]EMC3基因视网膜和小脑神经退行性疾病发病机制的功能研究[D]. 朱雄. 电子科技大学, 2020(03)
- [4]甲烷对小鼠神经炎症损伤的影响及其可能机制[D]. 谢滔. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [5]NSC联合OEC移植对SNHL模型大鼠耳蜗细胞凋亡的研究[D]. 曾友根. 南昌大学, 2020(08)
- [6]靶向Pim-1表达修复受损神经元样细胞的作用及机制[D]. 李贺. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [7]Miro1在脊髓损伤中抑制神经元凋亡及其机制研究[D]. 赵磊. 苏州大学, 2020(06)
- [8]右美托咪定调控HIF-1α信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤的分子机制研究[D]. 彭科. 苏州大学, 2020(06)
- [9]纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及其在脊髓损伤免疫治疗中的应用[D]. 毛敏. 重庆理工大学, 2020(01)
- [10]PKA通过p38MAPK通路介导脊髓细胞凋亡参与神经病理性疼痛的研究[D]. 邓亚军. 兰州大学, 2020(01)