一、胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生（论文文献综述）
张超[1]（2021）在《骨髓间充质干细胞对毛囊周期转换调控的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的:头发作为外型的一部分,对人十分重要。雄激素性脱发、休止期脱发、斑秃等多种原因引起的脱发,既影响美观,又会对患者的心理健康产生负面影响。随着人们对脱发治疗的期望值增高,越来越多的研究人员致力于寻找有效促进毛囊再生、治疗脱发的药物或治疗方法并探究其作用机制。骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,BMSCs）是一种多能成体干细胞,可以很容易地分离,培养和扩增,并显示出低的异体免疫原性,以及体外分化为多种细胞谱系的能力。基于上述特性,BMSCs被认为是理想的种子细胞,在再生医学和组织工程中具有很大的应用潜力。但是,BMSCs及其去细胞条件培养基（conditioned medium,MSCs-CM）诱导毛囊再生的分子机制尚待充分阐明。串联质量标签（tandem mass tags,TMT）定量蛋白质组学是一种特异性高,用于探索蛋白质动力学及其复杂调控机制的技术。与双向电泳相比,液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）分析可以对低丰度的蛋白质进行高精度的全面分析。平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）是一种基于质谱、可靶向蛋白质组学的技术,可对蛋白质组学的结果进行进一步验证。因此本实验分别在毛囊器官共培养模型和皮内注射动物模型中探究BMSCs和MSCs-CM对毛囊生长和周期转换的作用,并进一步寻找毛囊再生相关的调控蛋白,为毛发相关疾病的治疗起到指导作用。材料与方法:1、分离、提取、培养小鼠BMSCs:分离7周龄雌性C57BL/6N小鼠的股骨和胫骨并提取骨髓,选择全骨髓贴壁分离筛选法对BMSCs进行分离、培养。流式细胞仪检测培养细胞的表面抗原。同时应用定向诱导分化培养基诱导其向成骨、成脂细胞的多向分化。增强型CCK8检测BMSCs的增殖能力。2、分离、共培养小鼠触须毛囊器官:分离7周龄雌性C57BL/6N小鼠触须毛囊,随机等分为四组,构建共培养模型。四组分别为加入William’s E无血清培养基进行共培养的空白对照组（Control组）;加入William’s E无血清培养基+未培养过BMSCs的完全培养基进行共培养的培养基对照组（CM-control组）;加入William’s E无血清培养基+培养过BMSCs的去细胞条件培养基进行共培养的培养基共培养组（MSCs-CM共培养组）;BMSCs接种在transwell培养板的下室,毛囊器官放入上室,加入William’s E无血清培养基+未培养过BMSCs的完全培养基进行共培养的干细胞共培养组（BMSCs共培养组）。培养前和培养第7天,体视解剖显微镜下对毛囊器官进行拍照,测量并记录每根毛囊的长度,计算培养前和培养后毛囊的相对增加长度。Luminex多功能流式点阵技术检测四个组共培养7天培养上清中VEGF、PDGF-AA、PDGF-BB、IGF-1、b FGF和EGF的水平。3、BMSCs和MSCs-CM对诱导小鼠毛囊周期转换的作用:将45只7周龄雌性C57BL/6N小鼠随机等分为三组,空白对照组（Control组）:注射未培养过BMSCs的完全培养基;培养基处理组（MSCs-CM处理组）:注射培养过BMSCs的去细胞条件培养基;干细胞处理组（BMSCs处理组）:注射完全培养基重悬的BMSCs（106个/ml）。每只小鼠全背部共注射250μl,平均分为16个点进行皮内注射,隔日注射1次,共注射2周。注射前及注射后7天、10天、15天,观察3个处理组小鼠背部皮肤颜色和毛发生长的变化,拍照记录并统计毛发再生面积百分比。注射前及注射后7天、10天和15天,HE染色检测毛囊周期情况并统计毛囊长度,免疫荧光检测皮肤组织中Krt15和Ki67,Sox9和Ki67的定位和表达水平。应用Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白Fzd4、Lrp5、β-Catenin、Tcf1和Lef1的表达水平。4、BMSCs和MSCs-CM皮内注射后背部全层皮肤蛋白质组学分析:提取空白对照组、MSCs-CM处理组和BMSCs处理组皮内注射后7天的小鼠背部全层皮肤组织蛋白,进行TMT定量蛋白质组学检测。筛选与空白对照组相比上下调的差异表达蛋白,进行包括功能分类和富集分析在内的生物信息学分析,预测与毛囊再生及周期转换相关的蛋白,并进一步通过PRM方法对预测的蛋白进行验证。结果:1、分离、提取、培养的小鼠BMSCs为贴壁细胞。随着传代数的不断增加,细胞分布均匀,大小统一,形态与原代更加一致,呈典型的类成纤维细胞样。流式检测出细胞表面抗原CD44、CD90和CD105呈阳性高表达并且在体外能定向诱导分化成骨和成脂肪细胞。CCK8细胞增殖能力检测提示:培养至第3代第5天的细胞处于增殖旺盛的生长对数期,可用于后续实验。2、共培养7天后,BMSCs共培养组和MSCs-CM共培养组对触须毛囊器官生长的促进作用强于空白对照组和CM-control组,毛囊器官相对生长增加（P<0.01）。培养上清中,BMSCs共培养组和MSCs-CM共培养组相较于空白对照组和CM-control组,BMSCs共培养组相较于MSCs-CM共培养组,VEGF、PDGF-AA和IGF-1浓度均有显着升高（P<0.05）。b FGF、PDGF-BB和EGF浓度低且各组间无统计学差异。3、BMSCs和MSCs-CM皮内注射后,大体水平观察显示MSCs-CM处理组和BMSCs处理组的小鼠较空白对照组提前进入生长期,毛发生长速度快。注射第7天、10天和15天的相同时间点,小鼠背部皮肤进入生长期面积均大于空白对照组,且BMSCs处理组相较于空白对照组有统计学差异（P<0.05）,BMSCs处理组与MSCs-CM处理组组间注射后7天和15天有统计学意义（P<0.05）。HE染色在组织病理水平印证了与大体水平的一致性。毛囊长度定量分析结果显示,相同注射天数下,BMSCs处理组和MSCs-CM处理组的毛囊长度均大于空白对照组（P<0.05）,BMSCs处理组与MSCs-CM处理组组间注射后7天和15天有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光染色显示,与空白对照组相比,相同时间点BMSCs处理组和MSCs-CM处理组在毛囊隆突区观察到更多的Krt15+细胞,毛囊球部和漏斗部观察到更多的Ki67+细胞。在毛囊隆突区和外根鞘检测到Sox9表达,毛囊球部和漏斗部检测到Ki67表达,同样BMSCs处理组和MSCs-CM处理组表达量高于空白对照组。Western Blot结果显示注射后7天,BMSCs处理组和MSCs-CM处理组Fzd4、Lrp5、β-Catenin、Tcf1和Lef1的表达量均高于空白对照组。4、对BMSCs和MSCs-CM皮内注射的小鼠全背部皮肤组织进行TMT定量蛋白质组学检测分析,共检测出5046个蛋白。当差异倍数≥1.3或≤1/1.3,且p<0.05时,BMSCs处理组与空白对照组相比有1,060个差异表达蛋白,其中上调的有638个,下调的有422个;MSCs-CM处理组与空白对照组相比有770个差异表达蛋白,其中上调的有511个,下调的有259个;BMSCs处理组与MSCs-CM处理组相比有100个差异表达蛋白,其中上调的有45个,下调的有55个。功能分类和富集分析表明,差异表达蛋白主要参与遗传物质复制、转录翻译、信号转导、细胞周期调控和酶参与的代谢调节等过程。多个差异表达蛋白与毛囊的毛干骨架发育、黑色素形成、免疫细胞募集和细胞增殖调控相关,并且通过PRM方法进行验证。结果表明,与空白对照组相比,BMSCs处理组和MSCs-CM处理组中,Krt25、Tyrp1、Dct、Cpm、Ctps1、Flg、Stmn1、Tgm3和Ncapd2蛋白表达显着升高,Mb、Hspb7、Cox7a1、Scara5和Fbp2蛋白表达显着降低。其中Cpm,Ctps1,Flg,Stmn1,Tgm3,Ncapd2,Mb、Cox7a1、Scara5和Fbp2有统计学意义（P<0.05）。结论:1、全骨髓贴壁分离筛选法可分离培养出纯度较高,有自我更新和多向分化能力,表达特异性表面抗原的骨髓间充质干细胞。2、BMSCs可通过旁分泌VEGF、PDGF-AA、IGF-1等生长因子促进触须毛囊器官生长。3、BMSCs和MSCs-CM皮内注射通过激活毛囊干细胞和Wnt/β-catenin信号通路启动促进毛囊由静止期转换到生长期。4、BMSCs和MSCs-CM诱导的毛囊再生相关差异表达蛋白在功能分类、富集分析等蛋白质组学分析中呈现相似性。Krt25、Tyrp1、Dct、Cpm、Ctps1、Flg、Stmn1、Tgm3和Ncapd2蛋白显着上调,Mb、Hspb7、Cox7a1、Scara5和Fbp2蛋白显着下调。Stmn1、Ncapd2、Krt25和Ctps1是促进毛囊再生的关键蛋白。
梁欣玥[2]（2020）在《组蛋白甲基化修饰对绒山羊次级毛囊干细胞再生过程调控的研究》文中指出山羊绒来源于山羊皮肤的次级毛囊,是由次级毛囊干细胞诱导分化而形成。次级毛囊呈季节性周期生长,重复经历生长期、休止期、退行期这三个循环周期。本论文旨在将转录组与染色质图谱结合,从DNA水平到RNA水平较为全面的揭示次级毛囊干细胞周期生长中关键基因的调控机制。首先,我们对辽宁绒山羊的次级毛囊干细胞进行原代分离培养并进纯度鉴定;其次通过高通量转录组测序,获得了在绒山羊次级毛囊干细胞生长时期表达的RNAs;最后,对次级毛囊干细胞进行组蛋白H3K27me3,H3K4me3,H3K36me3以及H3K79me2染色质免疫共沉淀试验。本试验主要研究了生长初期以及兴盛期辽宁绒山羊次级毛囊干细胞生长过程中的分子机制以及组蛋白甲基化对辽宁绒山羊次级毛囊干细胞生长过程中的调控。本研究主要结果如下:（1）辽宁绒山羊次级毛囊干细胞的分离培养与鉴定:利用两步酶法以及组织贴壁法对辽宁绒山羊次级毛囊干细胞进行体外的分离培养并进行细胞纯化。并通过观察体外培养细胞的形态以及细胞的增殖能力,根据结果显示本试验体外培养的辽宁绒山羊次级毛囊干细胞呈现鹅卵石铺路状生长且折光度较高,细胞形态较小并有数个细胞核,细胞的粘附力较强,综上我们体外培养的次级毛囊干细胞形态符合毛囊干细胞的形态。对毛囊干细胞特异标记基因进行鉴定,鉴定结果显示毛囊干细胞标记基因在本试验培养的辽宁绒山羊次级毛囊干细胞中有较高的表达。免疫荧光鉴定显示毛囊干细胞标记基因Krt14在本试验培养的辽宁绒山羊次级毛囊干细胞阳性率为99.5%以上,纯度较高。本试验成功进行了原代辽宁绒山羊次级毛囊干细胞的分离培养,获得辽宁绒山羊次级毛囊干细胞系。（2）通过对两个月份次级毛囊干细胞进行高通量转录组测序,得到28921个m RNAs,其中20441个有表达的RNAs.（3）通过高通量转录组测序和生物信息学分析,在生长初期和兴盛期找到147个差异基因,其中在生长初期上调的m RNA有44个;其中在生长兴盛期上调的m RNA有103个,生长初期上调的基因功能注释与毛囊的形态发生有关;兴盛期上调的基因功能注释与毛囊成熟相关（4）通过Ch IP-seq以及生物信息学分析得到了辽宁绒山羊次级毛囊干细胞全基因组组蛋白修饰图谱（5）通过H3K27me3,H3K4me3,H3K36me3,H3K79me2的染色质免疫共沉淀发现组蛋白修饰信号影响基因的表达,发生H3K4me3修饰的基因表达水平较高;发生H3K27me3修饰的基因表达水平较低。
苏义群[3]（2020）在《头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成》文中认为研究背景毛发具有十分重要的生理学和社会学的价值,而脱发一直是医学界的一大难题。为此全球各大医药公司每年投入大量的人力物力以寻求治疗脱发的有效疗法。尽管如此,可供选择的治疗手段依然十分有限,而毛囊相关的研究主要受限于缺乏安全高效的药物筛选系统。类器官作为一种由干细胞为原料,经体外培养自我组装成的三维结构,具有与实际器官相似的特征及功能,为研究器官发育、组织再生及疾病发病机理提供了新的可能。近年来,已成功培育多种上皮类器官,例如乳腺,唾液腺以及结肠和肝管,但是在体外培育毛囊类器官仍是一大难题,本研究通过体外悬浮共培养头皮真皮祖细胞及表皮干细胞形成具有毛囊早期发育特征的真皮-表皮细胞聚集体,探究了 WNT信号通路在毛囊类器官形成过程中的作用,并通过体内实验证实其促生发能力,为实现高效培育毛囊类器官提供了新的途径。实验目的1.通过构建真皮祖细胞和表皮干细胞的三维聚集体探索体外培育毛囊类器官的实验方法。2.对成功构建的毛囊类器官进行组织学及遗传学评估。3.探究WNT信号通路在毛囊类器官形成早期发挥的作用。4.探究培育的毛囊类器官在移植后是否可以有效促进毛发生成。实验方法1.依照本课题组创立的“一步消化法”,从新生儿包皮组织中分离原代表皮细胞,并通过克隆形成实验及流式细胞术检测干细胞标志物α6-integrin的表达对表皮干细胞进行鉴定。通过免疫荧光检测相应的特异性标志物对成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞多向分化能力进行鉴定。2.将分离的头皮真皮祖细胞和表皮干细胞重悬于配制好的DMEM/F12（3:1）完全培养基中,然后将其接种到低粘附力Costar（?）6-孔板中进行悬浮共培养以形成细胞聚集体。通过倒置显微镜观察细胞聚集体的形态及生长状态。3.将培养成功的真皮-表皮聚集体制成冰冻标本,通过HE染色探究聚集体的构成结构并通过免疫荧光染色检测聚集体中毛囊发育相关基因的表达,对共培养过程中形成的不同真皮-表皮细胞聚集体进行分类及鉴定。4.利用qRT-PCR检测真皮-表皮细胞聚集体中毛囊发育相关基因的表达。5.在悬浮共培养基中加入WNT3a重组蛋白和WNT抑制剂IWP2,观察聚集体的形成并通过qRT-PCR探究WNT通路相关信号分子在毛囊类器官形成过程中的表达。6.通过裸鼠移植检测真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集构成的毛囊类器官在移植后对毛发再生的作用。实验结果1.从新生儿包皮组织中成功分离出表皮干细胞,传代培养后子代细胞可以形成符合干细胞评价标准的全克隆,并表达表皮干细胞标志物α6-integrin。免疫荧光结果显示,成人及胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞在分化诱导后表达成骨、成脂、成肌、成神经的相关标志蛋白,具有多向分化潜力。2.体外悬浮共培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞自组装为两种类型的聚集体,免疫荧光结果显示其中Ⅰ型聚集体表达毛囊发育早期标志基因,符合毛囊类器官的鉴定标准。3.RT-PCR结果显示,真皮-表皮聚集体中毛囊早期发育相关信号分子差异性表达,其中WNT信号通路在聚集体形成早期被显着激活。4.WNT通路激活剂WNT3a重组蛋白及WNT通路抑制剂IWP-2,可分别促进和抑制毛囊类器官的形成,表明WNT通路的激活是体外成功培养毛囊类器官形成的必要条件。5.胎儿头皮组织来源真皮祖细胞与表皮干细胞经悬浮共培养聚集后在体内移植中的毛发再生效率明显高于未经预聚集培养的头皮真皮祖细胞与表皮干细胞混合液。6.在与表皮干细胞悬浮共培养的过程中,胎儿头皮来源的真皮祖细胞形成Ⅰ型聚集体（毛囊类器官）的效率明显高于成人头皮来源的真皮祖细胞,表明Ⅰ型聚集体的形成能够反映细胞在移植后毛发再生的能力。结论在本实验中,我们建立了可以在体外高效形成大量毛囊类器官（Ⅰ型聚集体）的实验系统,该系统为检测毛发干细胞的生发潜能,评估诱导多能干细胞及促毛囊再生药物的大规模筛选提供了新的平台。此外,我们还证实了WNT信号通路的早期激活是符合毛囊类器官特征的Ⅰ型聚集体形成的必要条件。本研究还清楚地表明,使用胎儿头皮组织来源的真皮祖细胞培育的毛囊类器官在移植后具有良好的毛发再生能力,而使用成年头皮组织来源的真皮祖细胞在体外有效地再生毛囊类器官仍然是一个巨大的挑战。出于伦理学考虑,在科研及临床应用中不宜广泛使用胎儿组织来源的细胞。因此,未来将致力于从诱导性多能干细胞（iPSC）转化为毛囊干细胞,并探索将成年细胞重编程为胎儿样细胞,以取代本实验中的胎儿来源的细胞。
谢贝[4]（2019）在《成纤维细胞向毛乳头样细胞转化的机制研究及在毛囊再生中的应用》文中提出目前药物治疗和自体毛囊移植这两种治疗脱发的方法不能促进新的毛囊的形成。真皮毛乳头细胞（Dermal papilla cells,DPCs）在毛囊形态发生和调节毛发循环中起着至关重要的作用,但是体外传代培养会快速丢失其诱导毛发生成的能力。所以,如何在体外获得大量具有诱导毛发再生能力的DPCs已经成为目前毛囊再生研究的热点和难点。本研究的主要目的是探究海藻酸钠的三维培养环境是否能够诱导真皮成纤维细胞向毛乳头样细胞的转化及可能的作用机制。为促进成纤维细胞的聚集,我们利用静电喷雾的方法制备包裹真皮成纤维细胞的海藻酸-多聚赖氨酸-海藻酸（Alginate-poly-L-lysine-alginate,APA）微球,分别通过CCK-8和RT-PCR的方法检测人真皮成纤维细胞的增殖和人毛乳头特异性基因的表达;碱性磷酸酶染色和定量及流式细胞技术的方法检测人毛乳头标记基因的蛋白表达水平。发现在一定的培养时间内APA微球具有良好的生物相容性,并且人真皮成纤维细胞的DPC标记基因在转录和蛋白水平都随着APA微球培养时间的增加而增强。为探究人毛乳头样细胞是否具有诱导毛发再生的能力,诱导产生的毛乳头样细胞和新生鼠表皮细胞共同通过皮下注射的方法注射到裸鼠背部来观察新生毛发的再生情况。H&E染色、免疫荧光染色及免疫组织化学染色的方法确定新生毛囊的来源和功能,发现4周后裸鼠背部能够产生类似于阳性对照的黑色团状结构和毛囊样结构,并且人线粒体标记进一步确定新生毛囊结构至少部分来自于人毛乳头样细胞,同时毛乳头标记性基因的染色也进一步说明产生的毛囊样结构具有毛发的功能。随后对人毛乳头细胞、人真皮成纤维细胞及人毛乳头样细胞进行了转录组水平的测序分析,结果表明人真皮成纤维细胞向人毛乳头样细胞转化过程中Wnt信号通路激活,并且APA三维培养环境下分别加入Wnt信号的抑制剂或激活剂后DPC特异性基因也随之分别发生下调或上调,揭示了Wnt信号通路在人真皮成纤维细胞向人毛乳头样细胞转化过程中起着重要作用。此外,我们发现APA微球处理的鼠真皮成纤维细胞同样能够转化为鼠毛乳头样细胞。并且与鼠新生鼠表皮细胞构建的毛囊再生模型后具有诱导毛囊样结构的形成和毛发色素沉着的能力,证明了APA微球诱导DF-DPC转化的普适性。综上,本研究证明了APA微球处理能够分别诱导人/鼠成纤维细胞转化为人/鼠毛乳头样细胞,并且人/鼠毛乳头样细胞聚集和毛乳头功能活性的获得能够诱导毛囊再生,在此过程中Wnt信号通路起着重要的调控作用。通过APA微球处理得到的毛乳头样细胞能够为毛囊再生提供一种新颖、充分而且更安全的毛乳头细胞的来源。
郭景旭[5]（2019）在《小鼠触须毛囊外根鞘体外再生模型的建立及干细胞迁移特征分析》文中认为目的观察小鼠触须毛囊外根鞘体外再生过程中形态变化,探究小鼠触须毛囊外根鞘体外再生过程中干细胞动态分布、增殖分化以及迁移特征,初步探讨这些特征与小鼠触须毛囊外根鞘体外再生的关系。方法体外无菌条件下,使用解剖显微外科剪对3 d龄昆明乳鼠触须解剖并分离出毛囊外根鞘,进行体外毛囊外根鞘气液界面三维培养,OCT包埋,HE染色观察毛囊外根鞘再生形态;免疫荧光染色法观察干细胞及中性粒细胞在毛囊外根鞘体外再生过程中的动态变化。结果1、通过HE染色观察体外培养不同时期的小鼠触须毛囊外根鞘组织结构,创伤第5 d毛囊外根鞘再生趋于完整。2、细胞增殖EdU染色发现,细胞增殖由玻璃膜外围启动,并逐渐向玻璃膜内部表达,最终形成毛囊样结构。3、细胞凋亡TUNLE染色发现,小鼠触须毛囊外根鞘培养1 d时,玻璃膜处细胞凋亡增多;在培养至5 d时,随着玻璃膜内部细胞增殖逐渐增加,凋亡细胞散落分布于玻璃膜内部。4、α-SMA染色结果发现,小鼠触须毛囊外根鞘再生后新生细胞由骨架蛋白相连,再生结构趋于完整。5、干细胞标记物CD34、CD200免疫荧光显示,外根鞘再生过程中CD34、CD200阳性细胞向再生部位迁移。6、巨噬细胞F4/80及中性粒细胞LY6G免疫荧光结果发现:创伤后发生炎症反应,巨噬细胞受到创伤刺激后向炎症部位迁移,并在外根鞘玻璃膜外围形成一层细胞层。结论分离的小鼠触须毛囊外根鞘在培养第5d时初步重塑毛囊基本形态,毛囊干细胞由隆突部开始表达并参与母体外根鞘形态重塑,中性粒细胞和巨噬细胞在再生过程中发挥着重要作用。
刘公言[6]（2019）在《维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究》文中认为獭兔是着名的裘皮用兔,主要产品是獭兔皮,具有重要的经济价值。被毛密度是评定獭兔皮张质量的重要指标之一。近年来,如何提高獭兔皮张质量中的被毛密度成为獭兔研究中的热点。被毛由毛囊生成,毛囊是皮肤附属器官,由表皮和真皮相互作用形成,能够控制被毛生长,且具有独特的生理结构和周期性生长的特性。毛囊的形成与分化过程中,有毛乳头、毛母质、内根鞘、外根鞘等20多种不同类型的细胞参与。毛乳头细胞是动物皮肤中的一类特异化的间充质来源的细胞,在毛囊周期生长变化过程中发挥重要调控作用,是整个毛囊中直接参与毛囊周期生长调控的关键组分。miRNA是大小约为2024个核苷酸的一类非编码小分子RNA,近年的研究报道miRNA在小鼠、大鼠、山羊和绵羊等多种哺乳动物毛囊形态发生,毛囊干细胞增殖分化和凋亡中发挥了重要的调控作用。本课题首先对獭兔皮肤毛乳头细胞进行分离培养鉴定,然后对不同被毛密度獭兔毛乳头细胞进行差异表达的miRNA筛选,最后对维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制进行研究,以期为提高獭兔皮张质量提供新的思路和线索。研究的主要内容如下:1.獭兔皮肤毛乳头细胞的分离培养及鉴定选取30 d獭兔,背部剃毛后屠宰,碘酊消毒后剪取皮肤置于100 U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的无菌PBS中,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5 cm皮条,至于0.25 mg/mLⅡ型分离酶溶液中4℃过夜消化,次日37℃培养箱中消化30 min后PBS冲洗,揭去表皮。将真皮部分剪碎,至于0.1 mg/mL D型胶原酶中37℃消化46 h,显微镜下可见大量毛乳头游离出来时,用含FBS的DMEM终止消化,差速离心后用70μm滤器过滤后,去除未消化的组织。基础培养基重悬细胞,铺板,37℃,5%CO2培养箱培养。经过形态学观察、生长曲线绘制及毛乳头细胞特异表达物Vim和α-SMA细胞免疫化学鉴定,该方法分离培养所获得的细胞为獭兔皮肤真皮源性毛乳头细胞。2.不同被毛密度獭兔毛乳头细胞小RNA表达谱分析分别构建30 d高低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞小RNA文库,并进行高通量测序,结果显示6个小RNA文库分别获得的高质量序列读数分别为37930744、39442011、40965907、38502653、40622117、41149163,其中绝大多数序列长度在23 nt,与哺乳动物miRNA的大小一致。将干净序列和已知的小RNA数据库进行比对,6个文库中大约90%以上的序列可以匹配,分别为91.91%、91.05%、92.46%、92.77%、90.13%、91.61%。小RNA分类注释结果显示,miRNA分别占到80.80%、82.50%、81.60%、85.80%、76.50%、81.8%。通过DEGs筛选了240个显着差异表达miRNA,包括122个上调miRNA和118个下调miRNA。其中,显着差异表达的ocu-miR-205在高被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中低表达,在低被毛密度獭兔皮肤毛乳头细胞中高表达,且在獭兔皮肤中高表达,具有表达组织特异性。差异miRNA靶基因GO分析结果显示,这些靶基因被富集到生物学过程、细胞组分和分子功能等多个GO条目中,KEGG富集分析显示,24162个差异表达miRNA靶基因被注释到Pathway中的325条通路,其中富集程度排名靠前的有Wnt信号通路、Notch信号通路等条目。3.ocu-miR-205对獭兔毛乳头细胞影响的研究构建HBAD-GFP,HBAD-ocu-miR-205-GFP,HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒,以MOI 200转染獭兔毛乳头细胞。转染后24h观察转染效果,48 h检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因和蛋白变化。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔毛乳头细胞,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显着升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显着降低（P<0.05）。ocu-miR-205能够提高细胞凋亡率,同时改变细胞周期进程,提高细胞增殖（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着抑制PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Frk和Phlda3基因表达（P<0.05）;显着促进Wnt信号通路中DKK1基因表达,显着抑制Wnt10b、Fzd4、Lrp5、Lrp6、CTNNB1、Axin、APC、GSK-3β、TCF3和Lef1基因表达（P<0.05）;显着抑制Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;显着促进BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达;显着影响IGF1、EGF、FGF5、FGF7、SHH和TNF等毛囊发育相关因子的基因表达（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着抑制CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,促进GSK-3β蛋白磷酸化（P<0.05）。4.ocu-miR-205对獭兔皮肤组织影响的研究选择100只体重相近健康状况良好的3月龄獭兔,随机分为4组,背部皮肤局部剃毛后,以每只獭兔50μL分别皮内注射HBAD-GFP、HBAD-ocu-miR-205-GFP、HBAD-ocu-miR-205-5p-sponge-GFP腺病毒。注射转染24 h后,每组选取1只观察转染效果,并分别在7 d、14 d和21 d每组分别随机选取獭兔各8只,屠宰后采集注射部位皮肤置于冻存管和4%多聚甲醛固定液中,冻存样品用于检测ocu-miR-205-5p及毛囊发育相关基因蛋白变化;固定样品用于制作石蜡切片,HE染色后统计被毛密度。结果表明,构建的腺病毒能够成功转染獭兔皮肤及毛囊,且过表达后ocu-miR-205-5p表达量显着升高,干扰表达后ocu-miR-205-5p显着降低（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着影响PI3K/Akt、Wnt、Notch和BMP信号通路中基因表达（P<0.05）;显着影响毛囊发育相关因子的基因表达量（P<0.05）。ocu-miR-205能够显着影响CTNNB1、GSK-3β、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平（P<0.05）。ocu-miR-205过表达后,初级毛囊密度无显着变化（P>0.05）,次级毛囊密度和总毛囊密度显着降低（P<0.05）;ocu-miR-205-5p干扰表达后,初级毛囊密度无显着变化（P>0.05）,次级毛囊密度和总毛囊密度显着升高（P<0.05）;在注射14 d,ocu-miR-205-5p干扰表达组次/初比（S/P）显着升高（P<0.05）。5.维生素B6对獭兔毛乳头细胞影响的研究在基础培养基加入0、10、20、40、80、160μmol/L浓度维生素B6,培养72 h观察维生素B6对毛乳头细胞细胞增殖、细胞周期、ocu-miR-205-5p和毛囊发育相关基因蛋白表达量的变化。MTT结果显示在培养基中添加160μmol/L的维生素B6 OD值显着低于其他各组（P<0.05）。添加维生素B6组与不添加对照组相比细胞周期有明显差异,处于G0/G1期的细胞比率显着低于对照组（P<0.05）,G2/M期细胞比率显着高于对照组（P<0.05）,对S期细胞比率无显着影响（P>0.05）。适宜浓度（10和20μmol/L）的维生素B6能够显着抑制细胞凋亡（P<0.05）,但高浓度（80和160μmol/L）的维生素B6能够显着促进细胞凋亡（P<0.05）。维生素B6能够显着影响ocu-miR-205-5p的表达（P<0.05）,随着培养液中维生素B6浓度的增大,ocu-miR-205-5p的表达量显着降低P<0.05)。维生素B6能够促进PI3K/Akt信号通路中Inppl1、Inpp4b和Phlda3基因表达（P<0.05）;促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、Lrp6、CTNNB1、APC和Lef1基因表达,抑制DKK1（P<0.05）;显着促进Notch信号通路中Notch1、Jagged1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显着影响（P>0.05）;显着影响毛囊发育相关因子IGF1、EGF、FGF5、SHH和TNF的基因表达量（P<0.05）。维生素B6能够显着促进CTNNB1、Akt蛋白磷酸化水平和NOG蛋白表达水平,显着抑制GSK-3β蛋白磷酸化水平（P<0.05）。6.维生素B6对獭兔毛囊毛干生长影响的研究选取30 d獭兔,屠宰后剪取触须部皮肤,75%酒精浸泡后用无菌剪刀剪成2 cm*5cm皮条置于0.2 mg/mL D型胶原酶4℃过夜消化,解剖显微镜下分离游离毛囊。将所得的触须毛囊随机分为6组,每组10根,加入维生素B6浓度为0、10、20、40、80和160μmol/L的William E基础培养液,31℃,5%CO2培养。共培养6 d,每隔24 h统计毛干生长长度。结果表明:体外培养的獭兔触须毛囊培养144 h生长长度达到23.33μm,平均生长速度为3.89μm/d,且前期生长速度快于后期。培养液中添加维生素B6后,能够促进毛干生长速度,80μmol/L的添加组培养144 h生长长度达到36.15μm,平均生长速度最快,为6.03μm/d,显着高于对照组（P<0.05）。因此,维生素B6能够促进毛干生长速度,延缓毛囊衰退死亡。7.维生素B6对獭兔生产性能及毛囊发育影响的研究试验选取200只3月龄健康獭兔,随机分成5组,分别饲喂在基础饲粮中添加0、5、10、20和40 mg/kg维生素B6,经过预试期7 d后进入54 d正试期。试验结果表明:维生素B6能够显着影响ADG和ADFI（P<0.05）,随着维生素B6添加水平的升高,F/G有先降低后升高趋势,并在20 mg/kg时达到最低值。维生素B6对獭兔皮张重量和对皮张面积有显着影响（P<0.05）,其中20 mg/kg添加组的皮张重量和皮张面积高于对照组。饲粮维生素B6对总毛囊密度、次级毛囊密度和S/P影响显着（P<0.05）,随着饲料中维生素B6添加水平的升高,毛囊密度先增大后降低,并在20 mg/kg时达到最大值。维生素B6能够显着影响ocu-miR-205-5p的表达（P<0.05）,随着饲粮中维生素B6水平增大,ocu-miR-205-5p的表达量显着降低（P<0.05）。饲粮维生素B6能够显着提高PI3K/Akt信号通路中Inppl1基因表达（P<0.05）;显着促进Wnt信号通路中Wnt10b、Fzd4、CTNNB1和APC基因表达,显着抑制Wnt信号通路中GSK-3β的表达（P<0.05）;显着提高Notch信号通路中Notch1、Hes1和Hes5基因表达（P<0.05）;对BMP信号通路中BMP2、BMP4和TGF-β1基因表达无显着影响（P>0.05）;显着影响毛囊发育相关因子IGF1、IGF1R、EGF、FGF5和SHH的基因表达量（P<0.05）。维生素B6能够显着提高CTNNB1和Akt蛋白磷酸化水平,降低GSK-3β蛋白磷酸化水平（P<0.05）。综上所述,维生素B6提高獭兔被毛密度的分子机理是通过抑制ocu-miR-205-5p表达,激活PI3K/Akt、Wnt和Notch等信号通路中相关基因和蛋白的表达,使毛囊生长期延长,推迟休止期到来。
陈宇新[7]（2019）在《低代毛乳头细胞来源外泌体对毛囊再生及毛囊周期的影响及其机制的研究》文中研究指明背景和目的毛囊（HF）是哺乳动物一个复杂的小器官,由上皮和间充质成分相互作用而组成。毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPCs）被认为是一种独特的间充质干细胞,具有自体干细胞治疗的潜力,位于毛囊底端的毛球部,被真皮鞘和毛母质细胞包绕。DPCs作为HF的信号中心,在调节毛发生长、形成和循环中发挥重要作用。外泌体（exosome or extracellular vesicles,EV）是由不同细胞类型分泌的纳米囊泡,它们本身携带大量生物信息:如调节蛋白、mRNA和microRNA（miRNA）。干细胞来源的外泌体具有类似干细胞的功能,在多种病理模型中起积极的治疗作用,且具有细胞疗法所不具备的优势。因此,我们在本实验中通过体内和体外实验验证DP来源的外泌体（DP derived exosome,DP-Exo）在部分损伤毛囊中的作用并验证其对毛囊周期的影响,最后,通过对外泌体miRNA测序和生信分析,进一步研究DP-Exo作用靶点基因及其相关通路,探讨其作用机制。方法1.人DPCs来源的外泌体对人毛母质细胞的作用利用显微解剖法联合酶消化法分别提取培养人的毛乳头细胞,收集低代毛乳头细胞（P1-P3）的条件培养基,通过高速离心法提取人DPCs来源的外泌体,将不同浓度的外泌体加入到人毛母质细胞培养基中,用CCK8增殖试验检测毛母质细胞增殖情况,并进行免疫荧光、划痕实验、细胞周期检测,评估外泌体在体外对毛母质细胞的生物学活性和特性的影响。2.小鼠DPCs来源的外泌体对小鼠HFSCs的作用利用显微解剖法和酶消化法获取小鼠的毛囊干细胞并进行培养。将小鼠毛乳头细胞外泌体以不同的浓度梯度加入到毛囊干细胞培养基中,观测小鼠DPCs来源的外泌体对小鼠毛囊干细胞增殖、迁移活性的影响。3.小鼠毛乳头细胞来源的外泌体对部分损伤后的毛囊再生的影响构建部分损伤毛囊再生动物模型:取C57小鼠触须垫,分离单根生长期鼠须毛囊,将进行下三分之一横断后的上三分之二横断毛囊移植入裸鼠背部中线左侧皮下,完整毛囊作为对照移植入背部中线右侧皮下。对模型分别用低代小鼠毛乳头细胞,低代DP-Exo和PBS进行干预,30天后观测横断毛囊再生情况并进行HE染色。4.毛乳头细胞来源的外泌体对毛囊生长周期的影响取7周龄C57雌性小鼠,进行背部脱毛,每隔2天注射小鼠毛乳头细胞来源的外泌体,局部涂抹米诺地尔作为阳性对照,PBS注射作为阴性对照,每隔7天观测鼠背毛囊生长情况,并取材做组织学检测,评估毛囊生长周期。5.毛乳头来源的外泌体生发作用的机制探讨提取小鼠毛乳头细胞外泌体miRNA,并送检做miRNA高通量测序,检测外泌体miRNA成分并进行定量,利用miRWalk 2.0和DAVID 6.8生信分析软件进行miRNA靶基因预测,利用GO和KEGG基因富集通路,并用STRING database数据库进行靶基因相关蛋白互作分析,并筛选出外泌体miRNA作用的关键通路靶基因。免疫荧光染色检测外泌体干预后再生毛囊干细胞标记物变化,细胞增殖情况,利用RT-PCR,Western-blot和免疫荧光检测关键靶基因在治疗中期和末期的表达情况的变化。结果1.外泌体促进毛母质细胞的增殖,迁移细胞周期测试以及Ki67免疫荧光结果提示:人来源的DP-Exos被毛母质细胞摄取后,能显着促进毛母质细胞的增殖,其中10μg/ml的外泌体具有最强的促毛母质细胞增殖的作用。划痕实验实验结果提示,DP-Exos能显着促进毛母质细胞的迁移能力,其中10μg/ml浓度的外泌体作用效果最为显着。2.DPCs来源的外泌体对毛囊干细胞的作用CCK-8和Ki67免疫荧光提示:10μg/ml小鼠来源外泌体能显着促进小鼠HFSCs的增殖。Transwell迁移实验结果提示:10μg/ml小鼠来源外泌体能显着促进小鼠HFSCs的迁移。3.小鼠DP-Exo对部分损伤的毛囊再生的影响上三分之二横断毛囊移植30天后有一定几率获得再生,再生率低且再生毛乳头小,再生毛囊细小,上三分之二横断毛囊移植并用毛乳头细胞和毛乳头来源外泌体干预后毛囊再生率显着提高,细胞治疗组和外泌体治疗组间无显着性差异。用Dil标记毛乳头细胞和外泌体,治疗后30天进行荧光示踪,结果为发现:移植的毛乳头细胞大部分整合于真皮鞘,少量进入毛乳头内部,毛乳头移植组和外泌体注射组毛乳头里可以看到Dil点状荧光信号。4.毛乳头细胞来源的外泌体对毛囊生长周期的影响DP-Exo治疗开始后14天内显示超过80%的毛干长出皮外,毛囊完全再生,到第21天几乎完全毛发再生。米诺地尔治疗组21天毛发再生率约为77%,而PBS组为35%。在14天时,DP-Exo是米诺地尔组背部毛发覆盖率的3.8倍,是对照组14倍。治疗21天后DP-Exo治疗组皮肤厚度高于米诺地尔组和PBS组。5.毛乳头来源的外泌体生发作用的机制探讨miRNA高通量测序定量分析得出Top30外泌体miRNA,GO富集到66个关键靶基因,KEGG富集到41条通路。PPI蛋白互作结果显示:Wnt5a,BMP2和BMP4为关键的中枢基因。免疫荧光实验结果提示,外泌体治疗中期和晚期,再生毛囊中K15、CD34阳性细胞显着增加,免疫荧光、Wb和RT-PCR等实验结果提示,关键通路基因Wnt5a,BMP2和BMP4表达量较对照组显着下调。结论1.低代毛乳头来源的外泌体能促进毛母质细胞的增殖迁移。2.代毛乳头来源的外泌体能促进毛囊干细胞增殖迁移。3.DP-Exo能促进部分损伤的毛囊再生。4.DP-Exo能促进毛囊由休止期向生长期转换。5.DP-Exo通过其携带的miRNA影响毛囊信号通路,通过作用于Wnt5a,BMP2,BMP4等关键通路基因,下调相关毛囊抑制信号蛋白从而促进毛囊再生和进入生长期。
王海涛[8]（2017）在《小鼠触须毛囊体外再生及皮肤创面愈合形态学分析》文中研究指明目前,毛囊和皮肤是细胞生物学和皮肤创面修复及皮肤病学等学科研究的热点,它涉及毛囊干细胞的定位、毛囊的形态学分析、毛囊信号转导、生长因子、细胞因子和真皮和表皮之间的相互作用等多个方面的生物学功能研究。毛囊作为皮肤中具有独特的结构和周期性再生能力的重要附属器官,其毛囊干细胞在皮肤创伤修复及病理生理免疫机制中发挥了重要作用。建立和完善体外培养触须毛囊外根鞘重建新生毛囊的方法,及对毛囊再生过程与相关机制的探讨,可为进一步对毛囊细胞生长、发育、分化、凋亡等规律的研究奠定基础。另外,胎鼠皮肤创面愈合培养的条件优化及细胞活跃区定位,为后期建立胎鼠皮肤人工微创体外愈合模型奠定基础。同时,初步分析皮肤新生疤痕中短暂扩增细胞的形成及迁移方向,为干细胞在皮肤创面修复中的迁移提供理论支持。1、显微解剖分离触须毛囊外根鞘并体外培养。结果显示,毛囊外根鞘体外培养到第5 d可以初步重建毛囊基本形态;毛囊再生过程中毛囊外根鞘原玻璃膜作为创面伤口被新形成的伪玻璃膜所代替;通过EdU标记毛囊可增殖细胞演绎细胞迁移方向,还原出新生毛囊再生过程的三维立体空间形态。2、通过对胎鼠皮肤无瘢痕愈合培养液优化及皮肤细胞增殖活跃区分析。结果显示,胎鼠微创皮片培养3 d后,DMEM组、DMEM+5%FBS组、DMEM+10%FBS组、MEM组、MEM+5%FBS组、MEM+10%FBS组皮片愈合率分别为0、3.33%、6.67%、3.33%、46.67%、26.67%,6组皮片愈合率差异有统计学意义（χ2=41.39,P<0.05）。两两比较显示,MEM+5%FBS组皮片愈合率显着高于除MEM+10%FBS组外的其他4组（均P<0.01）。logistic回归分析显示,MEM（OR=11.717,95%CI 3.27441.934,P<0.001）及FBS浓度（5%FBS:OR=24.625,95%CI 3.027200.299,P=0.003;10%FBS:OR=13.449,95%CI 1.618111.813,P=0.016）均是促进胎鼠微创皮片愈合的因素。在MEM+5%FBS培养条件下,真皮和表皮愈合形态最好,且创面处表皮无增厚现象。EdU细胞增殖标记分析显示,胎鼠皮肤的真皮乳头层和表皮基底层是创面愈合过程中两个主要的细胞增殖活跃区,同时AP-1蛋白在这两个细胞增殖活跃区也有大量表达。3、对新生小鼠皮肤创面愈合形态以及细胞迁移进行观察。结果显示,创面愈合过程中表皮层中表达Sox2的阳性细胞逐渐连贯,并且发现真皮乳头层中Sox2和角蛋白14同时大量表达,可见致密细胞网和向下凸起的新生毛囊样结构形成。同时,创面愈合初期细胞迁移主要由创面底部开始,向上迁移并填充创面。综上所述,毛囊外根鞘体外培养到第5 d可以初步重建毛囊基本形态,毛囊内部中心可以达到无疤痕愈合状态。MEM+5%FBS的培养条件,是胎鼠皮肤创面无瘢痕愈合的最适培养条件,且胎鼠皮肤的真皮乳头层和表皮基底层是创面愈合过程中两个主要的细胞增殖活跃区。初步分析得出创面愈合初期细胞迁移主要由创面底部开始,并向上迁移填充创面。
宋峰[9]（2017）在《构建有毛发生长能力的组织工程皮肤的研究》文中研究指明研究背景皮肤是人体面积最大的器官,覆盖全身,发挥着保护、感觉、调节体温、分泌与排泄、吸收、代谢、免疫等作用。作为人体的第一道屏障,皮肤直接与外界接触,各种物理、化学、生物等因素都能引起皮肤的损伤,不及时有效治疗会给患者带来极大痛苦,甚至威胁生命。对于皮肤缺损,传统的治疗方法是进行皮肤移植或皮瓣移植术,但存在供体不足和免疫排斥等问题。组织工程皮肤（Tissue Engineering Skin,TES）是将种子细胞与细胞外基质替代物混合制成的人工皮肤,可用于创面修复,重建皮肤功能,具有良好的发展前景。现在已能制备比较成熟的表皮-真皮组织工程皮肤,基本能够快速覆盖创面,但是缺乏毛囊等皮肤附属器。毛囊含有丰富的毛囊干细胞,在皮肤创伤的修复、重建中有重要作用。毛囊所生长出的毛发除了调节体温、分泌与排泄等基本功能之外,对于人类还有影响美观,进而进一步影响心理及社交的作用。构建有毛发生长能力的组织工程皮肤不但能促进皮肤损伤修复,还可以重建皮肤功能,而且对于脱发等疾病有一定治疗作用。研究目的1.观察毛囊胚胎发育及毛囊干细胞动态衍变过程,探讨毛囊的发生、发展过程,为寻找有诱导毛发形成能力的种子细胞提供依据。2.掌握体外构建表皮-真皮组织工程皮肤的技术及明确移植后的体内转归,探讨表皮-真皮组织工程皮肤的皮肤缺损修复以及毛发生长能力。3.寻找具有诱导毛发形成能力的种子细胞,明确其能维持诱导能力的培养方式及构建方式,为构建有毛发生长能力的组织工程皮肤奠定基础。4.构建有毛发生长能力的组织工程皮肤并修复皮肤缺损。研究方法1.以C57BL/6不同胎龄胎鼠的皮肤为模型,通过HE染色观察毛囊胚胎发育过程,免疫荧光染色标记相关毛囊干细胞并观察毛囊干细胞动态衍变过程。2.分离、培养儿童包皮表皮细胞及真皮成纤维细胞,以自制SD大鼠鼠尾胶原为基质,应用气-液面培养,构建表皮-真皮组织工程皮肤。制备大鼠背部急性全层皮肤损伤模型,将构建的表皮-真皮组织工程皮肤覆盖伤口,观察其体内转归。将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备组织工程皮肤,并进行体内移植观察其转归。3.将新鲜分离的C57BL/6新生鼠（24小时以内）真皮细胞、贴壁培养的原代真皮细胞、悬浮培养的原代真皮细胞以及悬浮培养后吹打成单细胞悬液,和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处,三周后观察毛发生长情况并组织学染色观察毛囊结构。将C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下,三周后进行观察。4.将成人头皮来源毛乳头细胞、儿童包皮成纤维细胞、人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞分别复合儿童包皮表皮细胞为种子细胞,进行2D或3D的构建及培养方式,将其移植裸鼠体内,验证不同种子细胞毛发形成能力的异同,寻找能稳定诱导毛发形成的种子细胞。5.以儿童包皮来源的表皮细胞和成纤维细胞为种子细胞,使用3D打印的方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印毛囊样3D结构,构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;此外,还以人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞混合儿童包皮来源的表皮细胞为种子细胞直接构建有毛发生长能力的组织工程皮肤;将构建的组织工程皮肤移植裸鼠体内修复皮肤缺损并观察有无毛发生长能力。研究结果1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程（1）HE染色显示:C57BL/6小鼠从胚胎发育E14.5天开始出现表皮局部增厚,形成基板,真皮细胞在下方聚集;E15.5天增厚的表皮细胞逐渐形成毛芽,基板下方聚集的真皮细胞开始被形成的毛芽包裹;E16.5-E17.5天毛芽进一步发育,真皮细胞逐渐被毛芽包裹,形成毛囊的毛乳头结构;E18.5天至出生后,继续完成毛囊的胚胎发育,出生时毛囊的结构基本形成。（2）毛囊干细胞免疫荧光标记显示:随着毛囊发育和延长,标记的毛囊干细胞呈时空动态表达。2.体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤（1）体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤气-液面培养5天后,HE染色可观察到表皮和真皮两层结构,且表皮呈现复层化。表皮细胞及成纤维细胞状态良好,分布均匀。胶原蛋白交织成网将成纤维细胞固定在基质中。移植3周后,皮肤创口处完全愈合,与周围组织紧密连接,未见毛发;组织学显示缺损处皮肤形成表皮、真皮双层结构,且表皮复层化,未见毛囊结构。（2）将原代培养的成人毛乳头细胞与成人毛囊干细胞以上述方式制备的组织工程皮肤植入裸鼠体内三周后也未见毛发生长,组织学染色观察未见毛囊结构。3.寻找具有诱导毛囊形成能力的种子细胞（1）新鲜分离的C57BL/6新生鼠真皮细胞和表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部制备的皮肤全层缺损处三周后可见黑色毛发生长。（2）贴壁培养的原代真皮细胞组,三周后未见毛发生长,组织学染色未见毛囊结构;而在悬浮培养的原代真皮细胞组,三周后可见黑色毛发生长;悬浮培养的原代真皮细胞吹打成单细胞悬液组,三周后无毛发生长。提示3D悬浮培养可保留新生鼠原代真皮细胞的诱导毛发形成能力。（3）C57BL/6成鼠胡须毛乳头细胞P1代与新鲜分离的新生鼠表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,植入C57BL/6小鼠肾外膜下三周后可见黑色毛发生长,组织学染色观察见毛囊结构。（4）成人毛乳头细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮肤皮下观察3周,见白色毛纤维生长。（5）儿童包皮成纤维细胞P1与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞制备成类似毛囊样3D结构,经3D培养后,移植至裸小鼠背部皮下观察3周,见白色毛纤维生长。植入皮内,导丝引导,三周后有白色毛纤维长出,经线粒体DNA检测毛发含有人类源性的DNA。（6）人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的新生鼠表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞、新鲜分离的儿童包皮来源表皮细胞与鼠尾胶原蛋白混合,植入裸鼠背部皮下能长出黑色毛发。4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤（1）使用3D打印方法在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层中打印含儿童包皮来源表皮细胞和成纤维细胞的毛囊样3D结构,将构建的组织工程皮肤移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见白色毛发。（2）人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮表皮细胞混合制备组织工程皮肤,皮下移植及移植到裸鼠背部全层皮肤缺损处,三周后可见黑色毛发。研究结论1.毛囊胚胎发育及相关毛囊干细胞动态衍变过程毛囊胚胎发育进一步确认了毛囊的胚胎发育是表皮细胞与真皮细胞相互作用的结果,E14.5-E17.5是C57BL/6毛囊形态学发育的关键时间。2.构建表皮-真皮组织工程皮肤（1）体外构建的表皮-真皮组织工程皮肤经气-液面培养5天后呈现表皮、真皮双层结构,表皮呈现复层化。体外移植至裸鼠全层皮肤创伤模型能使皮肤创口的愈合良好。（2）培养的人毛乳头细胞以单细胞的方式接种于真皮层中表皮-真皮组织工程皮肤体内移植后不具备形成毛发的能力。3.寻找能够诱导毛发形成的种子细胞（1）能够诱导毛发形成的细胞制备成类似毛囊样3D结构,并经3D培养后,可较好的维持其诱导毛囊形成的能力。（2）儿童包皮的成纤维细胞与表皮细胞制备成类似毛囊样的3D结构具有诱导毛发形成的能力,但是所生长出的毛发不含黑色素。（3）人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞具有良好的诱导毛发形成的能力,并且长出的毛发是含黑色素的。4.构建带有毛囊的表皮-真皮组织工程皮肤（1）使用3D打印机将能诱导毛发形成的种子细胞在表皮-真皮组织工程皮肤的真皮层上接种成含种子细胞的3D结构,体内移植3周后可构建带有白色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。（2）人神经嵴细胞诱导的毛乳头细胞与新鲜分离的儿童包皮细胞制备成表皮-真皮组织工程皮肤皮下移植及移植到裸鼠体内,可构建带有黑色毛发的表皮-真皮组织工程皮肤。
王潇潇[10]（2016）在《皮肤干细胞毛囊再生研究》文中指出干细胞是人体各种组织细胞的最初来源,具有自我复制和分化能力,是生物及医学领域关注的焦点。干细胞可以用于组织器官的修复,为治疗许多重大疾病提供了新的思路和方法。皮肤是一个很好的用来研究器官再生的生物学和再生医学的模型。而毛囊作为一个微小器官,存在多种干细胞并受复杂信号通路调控。实现干细胞毛囊再生,不仅有助于研发功能更加完善的新一代组织工程皮肤,还能为干细胞器官再生提供理论依据。本论文研究中,我首先建立了表皮干细胞和真皮干细胞的分离和培养体系,并将两种扩增培养的皮肤干细胞移植到裸鼠的皮肤伤口中,实现了用扩增培养的皮肤干细胞再生毛囊。结果显示,表皮干细胞生成了新生皮肤的表皮和毛囊主体结构,而真皮干细胞形成了毛囊中的毛乳头以及真皮中的许多细胞。更进一步,我利用扩增培养的人源的两种皮肤干细胞,实现了完整毛囊的再生。这为临床运用皮肤干细胞进行皮肤再生奠定了基础。同时,我还针对真皮干细胞体外扩增稳定性的影响因素进行了研究,发现BMP4显着促进真皮干细胞毛囊诱导能力的维持。论文研究还显示,当两种皮肤干细胞在进行毛囊再生的时候,会伴随有皮脂腺的再生。在此基础上,我针对皮脂腺形成过程中的基因调控,找出了有效促进干细胞皮脂腺再生的分子组合。进一步研究显示,再生的皮脂腺与正常皮肤皮脂腺分泌的脂质成分相似,并有效保护皮肤减少皮肤水分的丢失。另外,论文还对支持干细胞毛囊再生的支架材料功能化自组装多肽水凝胶进行了研究,结果显示,RADA-PRG,一种含有RGD序列的混合多肽,在体外培养中可以有效地促进真皮干细胞的存活、增殖以及维持毛囊诱导能力相关基因的表达,并且在体内有效地支持皮肤干细胞再生毛囊,提示该材料具有较理想的组织工程支架材料的性能。
二、胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生（论文提纲范文）
（1）骨髓间充质干细胞对毛囊周期转换调控的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:C57BL/6N小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验试剂 |
| 2.3 主要试剂的配制 |
| 2.4 主要实验仪器 |
| 2.5 实验方案 |
| 2.5.1 C57BL/6N小鼠BMSCs分离、原代培养 |
| 2.5.2 C57BL/6N小鼠BMSCs培养及传代 |
| 2.5.3 流式细胞仪表面抗原检测 |
| 2.5.4 BMSCS多向诱导分化 |
| 2.5.5 CCK8 细胞增殖能力检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 分离提取的原代细胞形态观察 |
| 3.2 细胞传代后形态观察 |
| 3.3 细胞表面表达特异性抗原 |
| 3.4 细胞定向诱导分化成骨和脂肪 |
| 3.5 细胞生长曲线表达细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:骨髓间充质干细胞对小鼠触须毛囊器官生长作用的研究 |
| 6 前言 |
| 7 材料与方法 |
| 7.1 实验动物 |
| 7.2 实验试剂 |
| 7.3 主要试剂配制 |
| 7.4 主要实验仪器 |
| 7.5 实验方案 |
| 7.5.1 构建BMSCs和 MSCs-CM与触须毛囊器官共培养模型 |
| 7.5.2 BMSCs和 MSCs-CM对触须毛囊器官生长的影响 |
| 7.5.3 共培养模型生长因子水平检测 |
| 7.5.4 数据分析 |
| 8 结果 |
| 8.1 BMSCs和 MSCs-CM促进触须毛囊器官生长 |
| 8.2 BMSCs旁分泌多种生长因子 |
| 9 讨论 |
| 10 结论 |
| 第三部分:骨髓间充质干细胞对小鼠毛囊周期转换调控的体内研究 |
| 11 前言 |
| 12 材料与方法 |
| 12.1 研究对象 |
| 12.2 主要试剂 |
| 12.3 主要实验仪器 |
| 12.4 实验方案 |
| 12.4.1 C57BL/6N小鼠全背部皮内注射BMSCs |
| 12.4.2 动物大体水平观察三个处理组毛发生长情况 |
| 12.4.3 组织取材 |
| 12.4.4 组织病理苏木素-伊红(HE)染色 |
| 12.4.5 免疫荧光染色 |
| 12.4.6 Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白表达水平 |
| 12.4.7 数据分析 |
| 13 结果 |
| 13.1 大体观察表明BMSCs和 MSCs-CM促进小鼠毛囊由静止期转入生长期 |
| 13.2 HE染色表明BMSCs和 MSCs-CM促进小鼠毛囊由静止期转入生长期 |
| 13.3 免疫荧光染色表明BMSCs和 MSCs-CM促进毛囊干细胞增殖 |
| 13.4 BMSCs和 MSCs-CM对 Wnt/β-catenin信号通路的影响 |
| 14 讨论 |
| 15 结论 |
| 第四部分:通过TMT定量蛋白质组学探究骨髓间充质干细胞对小鼠毛囊周期转换调控的机制 |
| 16 前言 |
| 17 材料与方法 |
| 17.1 主要试剂 |
| 17.2 主要实验仪器 |
| 17.3 实验方案 |
| 17.3.1 皮肤组织蛋白提取 |
| 17.3.2 蛋白浓度测定 |
| 17.3.3 电泳进行蛋白提取质控 |
| 17.3.4 胰酶酶解 |
| 17.3.5 TMT肽段标记 |
| 17.3.6 高PH条件下反向高效液相色谱(HPLC)分级 |
| 17.3.7 液相色谱-质谱联用分析 |
| 17.3.8 数据库搜索 |
| 17.3.9 生物信息学分析 |
| 17.3.10 平行反应监测 |
| 17.3.11 蛋白互作网络分析 |
| 18 结果 |
| 18.1 蛋白浓度测定结果 |
| 18.2 SDS-PAGE质控结果 |
| 18.3 蛋白鉴定 |
| 18.4 蛋白差异表达分析 |
| 18.5 样品重复性检验 |
| 18.6 差异表达蛋白的功能分类 |
| 18.6.1 GO二级注释分类 |
| 18.6.2 亚细胞结构定位分类 |
| 18.6.3 KOG功能分类 |
| 18.7 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 18.7.1 GO富集 |
| 18.7.2 KEGG通路富集 |
| 18.7.3 蛋白结构域富集 |
| 18.8 平行反应监测技术验证差异表达蛋白 |
| 18.9 蛋白互作网络 |
| 19 讨论 |
| 20 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 多种来源干细胞调控毛囊周期转换及促进其再生的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）组蛋白甲基化修饰对绒山羊次级毛囊干细胞再生过程调控的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言介绍 |
| 1.1 绒山羊简介 |
| 1.2 毛囊介绍 |
| 1.2.1 毛囊结构 |
| 1.2.2 毛囊发生 |
| 1.2.3 毛囊的周期生长以及次级毛囊生长发育规律 |
| 1.3 干细胞介绍 |
| 1.3.1 毛囊干细胞的定位 |
| 1.3.2 毛囊干细胞与毛囊再生 |
| 1.3.3 毛囊干细胞生长的分子调控 |
| 1.3.4 毛囊干细胞的应用 |
| 1.3.5 毛囊干细胞标记基因的研究 |
| 1.3.6 毛囊干细胞培养方法 |
| 1.4 组蛋白修饰介绍 |
| 1.4.1 表观遗传学 |
| 1.4.2 组蛋白修饰的研究 |
| 1.4.3 ChIP-seq应用 |
| 1.4.4 组蛋白修饰对基因表达的影响 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 第二章 次级毛囊干细胞分离培养与转录组分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 2.1.3 主要试剂的配制 |
| 2.1.4 统计及分析软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 次级毛囊干细胞分离培养 |
| 2.2.2 次级毛囊干细胞的传代 |
| 2.2.3 次级毛囊干细胞的纯度鉴定 |
| 2.2.4 次级毛囊干细胞转录组测序 |
| 2.2.5 次级毛囊干细胞标记基因鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 次级毛囊干细胞形态鉴定 |
| 2.3.2 次级毛囊干细胞免疫组化纯度鉴定 |
| 2.3.3 次级毛囊干细胞标记基因鉴定 |
| 2.3.4 次级毛囊干细胞生长期与兴盛期分子特征分析 |
| 2.3.5 调控次级毛囊干细胞再生过程的基因功能分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 次级毛囊干细胞的分离培养 |
| 2.4.2 免疫荧光鉴定细胞纯度 |
| 2.4.3 次级毛囊干细胞RNA的提取 |
| 2.4.4 高通量测序和生物信息学分析 |
| 2.4.5 mRNA在干细胞中的表达 |
| 第三章 组蛋白甲基化对次级毛囊干细胞再生过程的研究 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要仪器设备与试剂 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 3.2.2 染色质免疫共沉淀(ChIP)样品的建库与测序 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 3.3.2 组蛋白甲基化对次级毛囊干细胞的调控 |
| 3.3.3 组蛋白甲基化调控次级毛囊干细胞基因表达 |
| 3.3.4 组蛋白甲基化复杂状态对次级毛囊干细胞基因的调控 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 3.4.2 组蛋白甲基化修饰与基因表达 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间文章发表情况 |
（3）头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 种子细胞的分离培养及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 体外毛囊类器官的构建及鉴定 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 毛囊类器官的体内移植及生发潜力的评估 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（4）成纤维细胞向毛乳头样细胞转化的机制研究及在毛囊再生中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文中所用英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 毛囊再生 |
| 1.1.1 毛囊的解剖学和生物学特性 |
| 1.1.2 毛囊的发育、生长和再生 |
| 1.1.3 毛囊的形态发生三个主要阶段:诱导,器官形成和细胞分化 |
| 1.1.4 体内诱导毛囊再生模型 |
| 1.2 不同来源成纤维细胞的分类及功能 |
| 1.3 成纤维细胞聚集和迁移的平衡 |
| 1.3.1 不同类型的细胞聚集行为 |
| 1.3.2 成纤维细胞聚集的分子机制 |
| 1.4 海藻酸钠微球在生物医学中应用 |
| 1.5 本文研究背景及内容 |
| 第二章 人真皮成纤维细胞在体外3D微环境中重编程为DPC样细胞 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞、实验试剂及耗材 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 APA微球的制备 |
| 2.3.3 APA微球中细胞增殖的测定 |
| 2.3.4 APA微球中细胞总RNA的提取及RT-PCR检测 |
| 2.3.5 BCA法蛋白浓度的测定 |
| 2.3.6 APA微球的蛋白水平分析 |
| 2.3.7 APA微球中细胞碱性磷酸酶显色 |
| 2.3.8 APA微球中AKP含量的测定 |
| 2.3.9 流式细胞仪计数 |
| 2.3.10 统计分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 海藻酸钠微球形态学观察 |
| 2.4.2 APA微球和人真皮成纤维细胞具有良好的生物相容性 |
| 2.4.3 APA微球诱导人真皮成纤维细胞中DP特异性标记基因上调 |
| 2.4.4 APA微球中DP特异性基因的蛋白表达情况 |
| 2.4.5 APA微球培养过程中相关信号通路的改变 |
| 2.5 讨论分析 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 APA微球诱导的人DPC样细胞具有诱导毛发再生的能力 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞、实验试剂及耗材 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞培养 |
| 3.3.2 APA微球的制备 |
| 3.3.3 新生鼠表皮细胞和真皮细胞的提取 |
| 3.3.4 CM-Dil活细胞染色剂标记细胞 |
| 3.3.5 毛囊重建模型的构建 |
| 3.3.6 冰冻切片 |
| 3.3.7 冰冻切片H&E染色 |
| 3.3.8 冰冻切片免疫荧光染色 |
| 3.3.9 冰冻切片免疫组化 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 C57 新生鼠表皮细胞和真皮细胞的分离 |
| 3.4.2 皮下毛发再生模型的构建 |
| 3.4.3 APA微球诱导的人毛乳头样细胞诱导毛发再生 |
| 3.4.4 APA微球毛发诱导能力依赖于人真皮成纤维细胞的代数 |
| 3.4.5 新生毛囊样结构来源于APA微球诱导的人毛乳头样细胞 |
| 3.4.6 DPC样细胞诱导毛发生成具有DP功能 |
| 3.5 讨论分析 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 人毛乳头样细胞的产生依赖于Wnt信号通路 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞、实验试剂及耗材 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 海藻酸钠微球的制备 |
| 4.3.3 转录组测序 |
| 4.3.4 抑制剂和激活剂的添加 |
| 4.3.5 总RNA的提取及RT-PCR |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果分析 |
| 4.4.1 转录组质量的整体评估 |
| 4.4.2 差异聚类分析 |
| 4.4.3 人毛乳头样细胞与人真皮成纤维细胞的差异分析 |
| 4.4.4 人毛乳头样细胞和人真皮成纤维细胞的转录差异基因的GO富集分析 |
| 4.4.5 人毛乳头样细胞和人真皮成纤维细胞的转录本差异基因的KEGG富集分析 |
| 4.4.6 APA微球诱导人毛乳头样细胞Wnt信号上调 |
| 4.4.7 抑制WNT信号DP相关基因表达下调 |
| 4.4.8 Wnt下游信号在人DPC样细胞获得中起重要作用 |
| 4.4.9 激活WNT信号DP相关基因表达上调 |
| 4.5 讨论分析 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 APA微球诱导鼠真皮成纤维细胞到鼠毛乳头样细胞 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞、实验试剂及耗材 |
| 5.2.2 主要实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 C57 新生鼠表皮细胞和真皮细胞的获得 |
| 5.3.2 C57 新生鼠真皮成纤维细胞的获得 |
| 5.3.3 细胞培养 |
| 5.3.4 APA微球的制备 |
| 5.3.5 APA微球中AKP活性测定 |
| 5.3.6 APA微球中细胞碱性磷酸酶显色 |
| 5.3.7 APA球中细胞总RNA的提取,c DNA的合成,RT-PCR测定 |
| 5.3.8 流式细胞计数 |
| 5.3.9 毛囊重建模型的构建 |
| 5.3.10 统计分析 |
| 5.4 结果分析 |
| 5.4.1 C57 新生鼠成纤维细胞的形态 |
| 5.4.2 APA微球诱导鼠DP特异性基因的表达 |
| 5.4.3 鼠真皮成纤维细胞在APA微球中ALP的表达分析 |
| 5.4.4 C57 新生鼠真皮细胞CD133 阳性细胞含量 |
| 5.4.5 毛囊重建模型的建立 |
| 5.4.6 相关信号通路的改变情况 |
| 5.5 讨论分析 |
| 5.6 小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 致谢 |
（5）小鼠触须毛囊外根鞘体外再生模型的建立及干细胞迁移特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 毛囊概述 |
| 1.1.2 毛囊生长发育特点 |
| 1.1.3 毛囊发育中不同信号通路的作用机制 |
| 1.1.4 毛囊干细胞(HFSCs)国内外研究进展 |
| 1.1.5 巨噬细胞及中性粒细胞概述 |
| 1.2 实验技术 |
| 1.2.1 EdU检测 |
| 1.2.2 TUNEL检测 |
| 1.2.3 免疫荧光技术 |
| 1.3 研究目的及意义 |
| 第2章 小鼠毛囊外根鞘体外再生模型建立及形态学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验材料来源 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 实验溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 小鼠触须毛囊外根鞘体外再生模型的建立 |
| 2.2.2 细胞增殖标记 |
| 2.2.3 EdU标记检测 |
| 2.2.4 HE常规染色 |
| 2.2.5 免疫荧光化学染色 |
| 2.2.6 TUNEL细胞凋亡染色 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 正常小鼠毛囊及外根鞘观察 |
| 2.3.2 不同天数下毛囊外根鞘体外培养再生情况 |
| 2.3.3 毛囊再生过程形态学观察 |
| 2.3.4 毛囊再生区域α-SMA表达特点 |
| 2.3.5 EdU标记细胞增殖及动态迁移 |
| 2.3.6 TUNEL标记细胞凋亡及动态分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 小鼠触须毛囊外根鞘体外再生过程中干细胞的动态分布 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 溶液配制 |
| 3.1.5 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 小鼠触须毛囊外根鞘再生区域CD200阳性细胞定位 |
| 3.2.2 小鼠触须毛囊外根鞘再生区域CD34阳性细胞定位 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 免疫细胞在小鼠触须毛囊外根鞘体外再生过程中的作用 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验样品 |
| 4.1.2 主要实验仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 溶液配制 |
| 4.1.5 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 毛囊外根鞘再生区域中性粒细胞动态分布 |
| 4.2.2 小鼠触须毛囊外根鞘再生结构巨噬细胞定位 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 獭兔生产现状及皮张质量评定 |
| 1.1.1 獭兔生产现状 |
| 1.1.2 獭兔皮张质量评定 |
| 1.2 毛乳头细胞在毛囊发育中作用 |
| 1.2.1 皮肤毛囊结构及功能 |
| 1.2.2 毛乳头细胞与毛囊发育 |
| 1.2.3 毛乳头细胞与毛囊周期性生长 |
| 1.3 毛囊体外培养的研究模型及研究现状 |
| 1.3.1 毛囊体外培养的研究模型 |
| 1.3.2 毛囊体外培养的研究现状 |
| 1.4 毛乳头细胞分离培养及鉴定 |
| 1.4.1 毛乳头细胞分离培养 |
| 1.4.2 毛乳头细胞鉴定方法 |
| 1.5 小RNA研究概述 |
| 1.5.1 miRNA生物合成 |
| 1.5.2 miRNA生物学功能 |
| 1.5.3 miRNA在动物毛囊发育中的研究现状 |
| 1.6 维生素B6 的生物学作用及在动物生产上研究进展 |
| 1.6.1 维生素B6 的生物学作用 |
| 1.6.2 维生素B6 在动物生产上研究进展 |
| 1.7 课题目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验设计 |
| 2.1.1 獭兔皮肤毛乳头细胞分离培养与鉴定 |
| 2.1.2 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞差异miRNA筛选 |
| 2.1.3 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 2.1.4 ocu-miR-205 对獭兔皮肤组织影响的研究 |
| 2.1.5 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 2.1.6 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长影响的研究 |
| 2.1.7 维生素B6 对獭兔生产性能及毛囊发育影响的研究 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 主要试剂耗材 |
| 2.2.2 主要仪器参数 |
| 2.2.3 主要数据库及分析软件 |
| 2.2.4 荧光定量PCR引物序列 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 獭兔毛乳头细胞分离培养鉴定方法 |
| 2.3.2 小RNA文库构建及测序分析方法 |
| 2.3.3 ocu-miR-205 过表达及干扰表达腺病毒载体构建生产及转染方法 |
| 2.3.4 獭兔毛乳头细胞的细胞增殖、周期和凋亡的测定方法 |
| 2.3.5 獭兔触须毛囊分离培养方法 |
| 2.3.6 獭兔生产性能指标测定方法 |
| 2.3.7 獭兔皮肤毛囊密度测定方法 |
| 2.3.8 獭兔毛囊发育基因及miRNA表达量测定方法 |
| 2.3.9 獭兔毛囊发育蛋白表达量测定方法 |
| 2.4 数据处理与统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 獭兔皮肤毛乳头细胞分离培养及鉴定 |
| 3.1.1 形态学观察 |
| 3.1.2 姬姆萨染色 |
| 3.1.3 特异标记物表达 |
| 3.1.4 毛乳头细胞生长曲线绘制 |
| 3.1.5 不同代次毛乳头细胞增殖特性变化 |
| 3.1.6 不同代次毛乳头细胞周期性变化 |
| 3.1.7 毛乳头细胞冻存及复苏能力 |
| 3.2 不同被毛密度獭兔皮肤毛囊密度统计及毛乳头细胞RNA质量检测 |
| 3.2.1 不同被毛密度獭兔皮肤毛囊密度统计结果 |
| 3.2.2 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞RNA质量检测结果 |
| 3.3 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞小RNA测序结果 |
| 3.3.1 测序数据过滤 |
| 3.3.2 小RNA分类注释 |
| 3.3.3 小RNA表达分析 |
| 3.3.4 差异表达小RNA筛选 |
| 3.3.5 差异表达miRNA层次聚类 |
| 3.3.6 miRNA靶基因预测 |
| 3.3.7 差异表达miRNA靶基因富集分析 |
| 3.4 不同被毛密度獭兔毛乳头细胞ocu-miR-205 测序结果 |
| 3.4.1 ocu-miR-205 序列及结构信息 |
| 3.4.2 ocu-miR-205 在不同被毛密度獭兔毛乳头细胞中的表达 |
| 3.4.3 ocu-miR-205-5p在獭兔不同组织中的表达 |
| 3.5 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 3.5.1 ocu-miR-205 转染獭兔毛乳头细胞效果观察 |
| 3.5.2 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖的影响 |
| 3.5.3 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞周期的影响 |
| 3.5.4 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞凋亡的影响 |
| 3.5.5 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞细胞周期及凋亡基因表达的影响 |
| 3.5.6 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.5.7 ocu-miR-205 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.6 ocu-miR-205 对獭兔皮肤组织影响的研究 |
| 3.6.1 ocu-miR-205 转染獭兔皮肤组织效果观察 |
| 3.6.2 ocu-miR-205 对獭兔皮肤毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.6.3 ocu-miR-205 对獭兔皮肤毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.6.4 ocu-miR-205 对獭兔毛囊密度的影响 |
| 3.7 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞影响的研究 |
| 3.7.1 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖的影响 |
| 3.7.2 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞周期的影响 |
| 3.7.3 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞凋亡的影响 |
| 3.7.4 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞细胞增殖及凋亡基因表达的影响 |
| 3.7.5 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞ocu-miR-205-5p表达的影响 |
| 3.7.6 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.7.7 维生素B6 对獭兔毛乳头细胞毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 3.8 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长的影响 |
| 3.9 维生素B6 对獭兔生产性能及毛囊发育的影响 |
| 3.9.1 维生素B6 对獭兔生长性能的影响 |
| 3.9.2 维生素B6 对獭兔屠宰性能的影响 |
| 3.9.3 维生素B6 对獭兔皮张质量的影响 |
| 3.9.4 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊密度的影响 |
| 3.9.5 维生素B6 对獭兔皮肤ocu-miR-205-5p表达的影响 |
| 3.9.6 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊发育相关基因表达的影响 |
| 3.9.7 维生素B6 对獭兔皮肤毛囊发育相关蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 毛乳头细胞分离培养及形态特征 |
| 4.1.1 毛乳头细胞分离培养 |
| 4.1.2 毛乳头细胞形态特征 |
| 4.2 miRNA通过信号通路参与毛囊发育的分子机制 |
| 4.2.1 miRNA通过Wnt信号通路参与毛囊发育 |
| 4.2.2 miRNA通过Notch信号通路参与毛囊发育 |
| 4.2.3 miRNA通过BMP信号通路参与毛囊发育 |
| 4.3 miRNA通过细胞因子参与毛囊发育的分子机制 |
| 4.4 miR-205 参与动物毛囊发育的分子机制 |
| 4.5 维生素B6 对獭兔毛囊毛干生长的影响分析 |
| 4.6 维生素B6 对獭兔生产性能影响机制的分析 |
| 4.6.1 维生素B6 对獭兔生长性能影响机制的分析 |
| 4.6.2 维生素B6 对獭兔屠宰性能影响机制的分析 |
| 4.6.3 维生素B6 对獭兔皮张质量影响机制的分析 |
| 4.6.4 维生素B6 对獭兔被毛密度影响机制的分析 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 附录 |
| 8 致谢 |
| 基金资助 |
| 9 攻读博士期间发表论文情况 |
（7）低代毛乳头细胞来源外泌体对毛囊再生及毛囊周期的影响及其机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 DP-Exo对毛母质细胞及毛囊干细胞生物学的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 DP-Exo对毛囊损伤后再生的影响 |
| 引言 |
| 材料及方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 DP-Exo对毛囊周期的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DP-Exo对毛囊生长影响的机制研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 攻读学位期间的成果 |
| 致谢 |
（8）小鼠触须毛囊体外再生及皮肤创面愈合形态学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 小鼠毛囊及皮肤概述 |
| 1.2 毛囊 |
| 1.2.1 毛囊的生长发育特点 |
| 1.2.2 毛囊干细胞研究进展 |
| 1.3 皮肤 |
| 1.3.1 皮肤的结构特点 |
| 1.3.2 皮肤创面无瘢痕研究进展 |
| 1.4干细胞转录因子Sox2 |
| 1.5激活蛋白AP-1 |
| 1.6 实验技术 |
| 1.6.1 干细胞标记技术 |
| 1.6.2 免疫荧光技术 |
| 1.7 研究目的意义 |
| 第2章 小鼠触须毛囊体外重建及形态学分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验样品来源 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 溶液配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 再生毛囊结构HE染色及形态观察 |
| 2.2.2 EdU标记毛囊再生干细胞及其迁移演化 |
| 2.2.3 再生毛囊结构中巨噬细胞定位及Sox2表达鉴定 |
| 2.2.4 再生毛囊结构中AP-1蛋白表达鉴定 |
| 2.2.5 毛囊形态重塑过程中的伪玻璃膜结构 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 皮肤无瘢痕愈合培养液优化及细胞增殖活跃区分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 正常胎鼠皮肤结构观察 |
| 3.2.2 胎鼠皮片人工微创口愈合形态学观察 |
| 3.2.3 胎鼠微创皮片愈合最佳培养条件的筛选 |
| 3.2.4 胎鼠皮肤细胞增殖标记 |
| 3.2.5 AP-1在胎鼠皮肤无瘢痕愈合中的表达 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 皮肤创面愈合形态学观察及干细胞迁移 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 创面外观及病理学特征 |
| 4.2.2 创面部位Sox2、CK14的表达特点 |
| 4.2.3 创面皮肤干细胞增殖与迁移 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）构建有毛发生长能力的组织工程皮肤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 观察毛囊胚胎发育过程及相关毛囊干细胞动态衍变过程 |
| 一、实验动物与器材 |
| 二、实验摊 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二章 体外构建表皮-真皮组织工程皮肤 |
| 一、实验试剂与器材 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第三章 寻找能够诱导毛发形成的种子细胞 |
| ―、实验动物、试剂与器材 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第四章 构建有毛发生长能力的组织工程皮肤 |
| 一、实验动物、试剂与器材 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 组织工程皮肤及组织工程毛囊的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 致谢 |
（10）皮肤干细胞毛囊再生研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 毛囊的发育和周期 |
| 1.1.1 毛囊的发育 |
| 1.1.2 毛囊周期 |
| 1.2 皮肤干细胞 |
| 1.2.1 表皮干细胞 |
| 1.2.2 真皮干细胞 |
| 1.3 毛囊再生的研究现状 |
| 1.3.1 用于毛囊再生的细胞成分 |
| 1.3.2 用于毛囊再生的实验方法 |
| 1.3.3 毛囊再生待解决问题 |
| 1.4 皮脂腺概述 |
| 1.4.1 皮脂腺的结构和功能 |
| 1.4.2 皮脂腺的发育 |
| 1.5 组织工程皮肤 |
| 1.5.1 无细胞的组织工程皮肤 |
| 1.5.2 同种异体细胞组织工程皮肤 |
| 1.5.3 自体细胞组织工程皮肤 |
| 1.5.4 组织工程皮肤待解决的问题 |
| 1.6 自组装多肽水凝胶 |
| 1.7 研究意义和内容 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 1.7.3 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验仪器 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 分子生物学实验方法 |
| 2.4.2 细胞生物学实验方法 |
| 2.4.3 动物实验与组织分析方法 |
| 2.4.4 多肽材料的物理性质分析 |
| 第3章 小鼠皮肤干细胞再生毛囊研究 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 表皮干细胞的分离和培养体系的建立 |
| 3.2.2 真皮干细胞的分离和培养体系的建立 |
| 3.2.3 皮肤干细胞体外共培养实验 |
| 3.2.4 皮肤干细胞体内重组毛囊实验 |
| 3.2.5 皮肤干细胞体内追踪实验 |
| 3.3 小结 |
| 第4章 人源皮肤干细胞再生毛囊研究 |
| 4.1 本章引言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 人包皮来源的表皮干细胞再生毛囊 |
| 4.2.2 人头皮来源皮肤干细胞诱导毛囊再生 |
| 4.3 小结 |
| 第5章 真皮干细胞的优化培养 |
| 5.1 本章引言 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 TSA在真皮干细胞体外培养中的作用 |
| 5.2.2 BMP在真皮干细胞体外培养中的作用 |
| 5.3 小结 |
| 第6章 表皮干细胞再生皮脂腺 |
| 6.1 本章引言 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 皮脂腺染色方法的建立 |
| 6.2.2 表皮干细胞体外诱导成皮脂腺干细胞 |
| 6.2.3 表皮干细胞再生皮脂腺 |
| 6.2.4 新生皮脂腺的功能研究 |
| 6.3 小结 |
| 第7章 自组装多肽水凝胶对皮肤干细胞再生毛囊的支持作用 |
| 7.1 本章引言 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 自组装多肽的物理性质分析 |
| 7.2.2 自组装多肽水凝胶对真皮干细胞的支持作用 |
| 7.2.3 自组装多肽水凝胶对皮肤干细胞再生毛囊的支持作用 |
| 7.3 小结 |
| 第8章 讨论与展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 论文展望 |
| 8.2.1 皮肤干细胞用于毛囊再生的思考 |
| 8.2.2 对于皮脂腺再生的探讨 |
| 8.2.3 自组装多肽水凝胶作为组织工程支架材料的探讨 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
四、胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生（论文参考文献）
- [1]骨髓间充质干细胞对毛囊周期转换调控的作用及机制研究[D]. 张超. 中国医科大学, 2021(02)
- [2]组蛋白甲基化修饰对绒山羊次级毛囊干细胞再生过程调控的研究[D]. 梁欣玥. 沈阳农业大学, 2020(03)
- [3]头皮真皮祖细胞与表皮干细胞体外预聚集激活WNT通路促进体内毛囊的形成[D]. 苏义群. 山东大学, 2020(02)
- [4]成纤维细胞向毛乳头样细胞转化的机制研究及在毛囊再生中的应用[D]. 谢贝. 湖南大学, 2019(01)
- [5]小鼠触须毛囊外根鞘体外再生模型的建立及干细胞迁移特征分析[D]. 郭景旭. 塔里木大学, 2019(07)
- [6]维生素B6通过miRNA调控獭兔毛囊发育作用机制的研究[D]. 刘公言. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]低代毛乳头细胞来源外泌体对毛囊再生及毛囊周期的影响及其机制的研究[D]. 陈宇新. 南方医科大学, 2019(09)
- [8]小鼠触须毛囊体外再生及皮肤创面愈合形态学分析[D]. 王海涛. 塔里木大学, 2017(04)
- [9]构建有毛发生长能力的组织工程皮肤的研究[D]. 宋峰. 北京协和医学院, 2017(11)
- [10]皮肤干细胞毛囊再生研究[D]. 王潇潇. 清华大学, 2016(12)