一、香烟烟雾溶液对人淋巴细胞的损伤及修复（论文文献综述）
李健[1]（2021）在《PPARγ参与有氧运动调控chemerin改善COPD膈肌功能障碍的机制研究》文中研究指明研究目的慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的高发的慢性系统性疾病,除对肺局部的损伤外,COPD还能造成多种肺外损伤,其中膈肌功能障碍是造成呼吸功能衰退的重要因素。系统性炎症是COPD膈肌功能障碍的关键环节。运动训练是目前COPD膈肌功能障碍康复治疗的有效手段,而运动对炎症反应的调节作用也成为其改善膈肌功能障碍的作用途径之一,然而这一作用的具体机制目前还尚未阐明。近来,脂肪因子在机体中的生物学效应引起了诸多关注,其中chemerin与COPD间的紧密关系也被逐步证实,chemerin是COPD炎症反应不可或缺的一环。运动对chemerin/CMKLR1信号轴的调控效应在其他研究中已被证实,但目前对运动调控chemerin/CMKLR1轴的上游信号仍无明确定论。研究显示,在肥胖与糖尿病模型中PPARγ被证实是运动调控chemerin/CMKLR1的上游信号,参与运动改善糖脂代谢过程,而PPARγ的药理性配基也被用于COPD患者的临床管理中。但对于COPD膈肌功能障碍而言,PPARγ是否是运动调控chemerin/CMKLR1改善COPD膈肌功能障碍的上游信号尚不清楚,且值得探讨。研究方法第一部分实验:运动对COPD大鼠膈肌功能障碍和对PPARγ-chemerin/CMKLR1通路及其下游炎性因子的影响两月龄雄性SD大鼠32只,随机分为空白对照组（CG）、模型对照组（MG）、有氧运动组（AEG）和抗阻运动组（REG）,每组8只。MG、AEG和REG采用香烟烟雾暴露法建立COPD大鼠模型;模型建立后,AEG和REG分别接受为期9周的有氧运动训练或抗阻运动训练;有氧运动采取游泳的方式进行;抗阻运动采用爬梯运动。MG在运动干预期间自由活动,CG在整个研究过程中均不接受任何干预。实验过程中每月检测大鼠体重。运动训练结束后对大鼠肺功能、膈肌功能进行检测;取材后对大鼠肺与膈肌HE染色观察组织结构变化;Western blot法检测大鼠膈肌中PPARγ、chemerin、CMKLR1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、atrogin-1、Mu RF1以及Myo D1的蛋白表达情况。第二部分实验:机械牵拉对LPS诱导炎症环境下L6细胞增殖水平及PPARγ-chemerin/CMKLR1通路及下游因子的影响1.筛选能诱导L6成肌细胞低增殖活性的LPS浓度将L6细胞接种于96孔板中,37℃培养箱中培养24 h,分别设置不同浓度的LPS培养孔,每个浓度设置6个复孔,每孔添加10μL不同浓度LPS溶液,37℃细胞培养箱中培养24 h。CCK-8检测细胞增殖水平。2.机械牵拉对LPS诱导炎症环境下L6细胞的增殖水平影响将L6细胞随机分为空白对照组（CG）、LPS对照组（LG）和LPS牵拉组（LSG）,LSG在Flexcell牵拉装置接受拉伸强度为15%,频率为0.5 Hz,持续时间为6 h的周期性机械牵拉。CG与LG在相同条件下培养,不予以细胞牵拉刺激。牵拉结束后24 h,CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性;收集细胞,Western blot法检测各组细胞中PPARγ、chemerin、CMKLR1、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、atrogin-1、Mu RF1以及Myo D1的蛋白表达情况。第三部分实验:PPARγ在机械牵拉调控chemerin/CMKLR1信号促LPS诱导炎症环境下L6细胞增殖中的作用1.筛选GW9662与罗格列酮溶液影响炎症环境下L6成肌细胞增殖水平的适宜浓度L6成肌细胞接种在96孔板中,贴壁后加入LPS溶液,继续培育24 h,将细胞随机分成10组,包括LPS对照组、DMSO对照组以及4种浓度梯度的罗格列酮和GW9662各自4组细胞;加入药物培养24 h后CCK-8试剂盒检测各组别细胞的增殖活性。2.调节PPARγ蛋白表达对机械应力提升炎症培养环境下L6成肌细胞活性以及PPARγ-chemerin/CMKLR1信号的影响将L6细胞随机分为空白对照组（CG）,LPS对照组（LG）,罗格列酮对照组（RG）,罗格列酮+牵拉组（RSG）,GW9662对照组（GWG）,GW9662+牵拉组（GSG）;两组牵拉组在Flexcell牵拉装置中进行机械牵拉干预,所有对照组在相同环境中培养,不予细胞牵拉刺激。牵拉结束后24 h进行指标检测,指标同第二部分。研究结果1.运动对COPD大鼠膈肌功能障碍和对PPARγ-chemerin/CMKLR1通路及其下游炎性因子的影响（1）相较MG,AEG大鼠肺功能与膈肌功能显着提升（p<0.05）,膈肌组织结构改善;REG大鼠肺功能同样提升（p<0.05）,但膈肌功能改善不明显。（2）相较MG,AEG和REG大鼠膈肌PPARγ蛋白表达上调明显（p<0.05）,且AEG大鼠膈肌chemerin/CMKLR1信号抑制（p<0.05）;但REG大鼠膈肌chemerin/CMKLR1信号变化不明显。（3）相较MG,AEG大鼠膈肌中IL-8的表达被显着抑制（p<0.05）,并且IL-1β和IL-6表达有下降但不具有统计学意义;REG大鼠膈肌中炎症因子变化不明显。（4）AEG大鼠膈肌Myo D1的表达相较MG上升（p<0.05）,atrogin-1和Mu RF1的表达有下降但不具有统计学差异;REG大鼠膈肌Mu RF1的表达被抑制（p<0.05）。2.机械牵拉对LPS诱导炎症环境下L6细胞增殖水平及PPARγ-chemerin/CMKLR1通路及下游因子的影响2.1诱导L6成肌细胞低增殖活性的适宜LPS浓度浓度为2 mg/ml、5 mg/ml以及10 mg/ml LPS溶液能对细胞增殖水平呈抑制作用,经过筛选后,在本次研究的后续部分均采用了2 mg/ml这一浓度作为LPS刺激浓度。2.2机械牵拉对炎症环境下L6细胞的增殖水平影响（1）LG细胞较CG细胞增殖水平下降（p<0.05）,LSG较LG细胞增殖活性显着上升（p<0.05）。（2）LSG细胞相较LG和CG,其细胞PPARγ蛋白的表达水平显着上升（p<0.05）,且细胞中CMKLR1蛋白的表达下降但不具有统计学差异。（3）LG细胞中IL-1β和TNF-α的蛋白水平相较CG上升明显（p<0.05）,而经机械牵拉后的LSG细胞的上述炎症因子水平则显着下降（p<0.05）。（4）LG细胞atrogin-1表达水平较CG显着上升,细胞牵拉后有降低但未呈现统计学差异;各组细胞Mu RF1表达也呈类似趋势;Myo D1的表达在LG呈下降,在LSG上升,但均未产生统计学差异。3.PPARγ在机械牵拉调控chemerin/CMKLR1信号促LPS诱导炎症环境下L6细胞增殖中的作用3.1 GW9662与罗格列酮溶液影响炎症环境下L6成肌细胞增殖水平的适宜浓度50μM的GW9662呈现抑制炎症环境中L6细胞增殖活性的趋势,而10μM和50μM的罗格列酮溶液呈现提升炎症环境中L6细胞的增殖活性的趋势。3.2机械牵拉联合罗格列酮或GW9662对LPS诱导炎症培养环境下L6成肌细胞活性以及PPARγ-chemerin/CMKLR1信号的影响（1）单独罗格列酮/GW9662即可发挥对L6细胞增殖活性的促进/抑制作用（p<0.05）;GSG相较GWG,L6细胞的增殖水平上升（p<0.05）;RSG相较RG,L6细胞的增殖水平也进一步提升（p<0.05）。（2）RG细胞PPARγ蛋白被激活,与GWG、GSG相较明显上升（p<0.05）;RSG蛋白表达水平最高,与CG、LG、GWG以及GSG间均形成显着差异（p<0.05）。RG和RSG中的CMKLR1表达下降,与LG相较差异显着（p<0.05）。（3）RSG细胞IL-1β较GWG显着下降（p<0.05）;相较LG,GWG、RG和RSG细胞中IL-6明显下降（p<0.05）;LG、GWG、GSG和RG细胞中TNF-α相较CG明显上升（p<0.05）,RSG细胞中TNF-α的蛋白表达较LG和GWG下降低明显（p<0.05）。（4）RG细胞atrogin-1和Mu RF1表达被明显抑制（p<0.05）;RSG细胞中Mu RF1的表达呈现明显抑制效应（p<0.05）;GSG、RG和RSG细胞的Myo D1表达上升但未形成统计学差异。结论1.COPD大鼠存在膈肌功能障碍,有氧运动具备更加有效的COPD肺功能、膈肌功能的康复效果;运动能上调膈肌PPARγ蛋白的表达,抑制chemerin/CMKLR1信号,降低膈肌IL-8及TNF-α的水平,调节膈肌蛋白降解/生长失衡状态。2.适宜浓度LPS能诱导L6细胞低增殖活性。机械牵拉能提升LPS环境下培养的L6细胞的增殖活性,并且可以激活细胞中PPARγ蛋白,在一定程度上影响chemerin/CMKLR1信号表达,抑制细胞中IL-1β和TNF-α的蛋白水平,影响E3连接酶及其底物的表达。3.外源性增强PPARγ信号联合机械牵拉可以增强L6细胞的活性,抑制chemerin/CMKLR1信号及IL-6、TNF-α的表达,并进一步抑制肌细胞蛋白降解因子atrogin-1和Mu RF1的表达;相反,抑制PPARγ信号,上述影响被抑制。综上,本次研究从体内和体外实验两方面证实了PPARγ在运动调控chemerin/CMKLR1信号改善COPD膈肌功能障碍中的作用。
蔡甜甜[2]（2021）在《健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究》文中提出目的:1.通过一项探索性临床研究,采用随机、双盲安慰剂对照临床试验方法,观察健脾益肺Ⅱ号方中医药早期干预治疗COPD的有效性和安全性,探讨中医药早期干预能否延缓COPD病情进展,避免或减少急性加重的发生,为中医药防治COPD提供循证医学依据,为进一步研发针对COPD的中药新药提供临床研究基础。2.通过观察香烟暴露对呼吸道病毒感染后小鼠宿主免疫应答的影响,以及呼吸道病毒感染在诱发COPD急性加重过程中的免疫病理改变,建立符合慢阻肺急性加重的急性气道炎症模型,为后续中药减少病毒感染诱发慢阻肺急性加重的药理学研究提供实用性工具。3.利用熏烟联合流感病毒感染的小鼠动物模型,以健脾益肺Ⅱ号减少急性加重为出发点,探讨健脾益肺Ⅱ号减少熏烟联合流感病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制,探讨中医培土生金法的现代科学内涵,为研发针对预防COPD急性加重的药物提供研究基础。方法:1.随机对照探索性临床试验:健脾益肺Ⅱ号治疗COPD稳定期Ⅰ-Ⅱ级探索性临床研究探索性临床研究,采用随机双盲安慰剂平行对照研究方法,纳入符合COPD稳定期Ⅰ-Ⅱ级患者,采用健脾益肺Ⅱ号与健脾益肺Ⅱ号安慰剂进行疗效比较,随机分为治疗组和安慰剂组,治疗组给予健脾益肺Ⅱ号方颗粒剂,每日1剂,分成2袋,每次1袋,1天2次;安慰剂组给予健脾益肺Ⅱ号方安慰颗粒剂,每日1剂,分成2袋,每次1袋,1天2次。筛查期2周,治疗12周,随访12周。记录并测定两组患者治疗前后组间急性加重频次以及急性加重发生率,并且评估组间治疗前后肺功能、SGRQ、CAT量表、mMRC评分、BODE指数改变情况,探索健脾益肺Ⅱ号方干预治疗COPD的疗效并观察药物使用的安全性,探讨中医药干预能否延缓COPD病情进展,避免或减少急性加重的发生,为中医药防治慢阻肺提供循证医学依据。2.基础研究:健脾益肺Ⅱ号方减轻香烟暴露联合病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制（1）香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道免疫细胞的影响选取SPF级雌性Balb/c小鼠,随机分成4组:假熏烟假攻毒组,熏烟假攻毒组,假熏烟攻毒组,熏烟联合攻毒组。第1-4天对小鼠进行熏烟处理,3次/天,每次3支香烟,烟雾用60ml注射器注入熏烟箱中。于9am,12am,3pm进行,每次1h;第5天进行攻毒,用1ml注射器共抽取2ml异氟烷均匀洒在麻醉瓶中,随后将小鼠置于麻醉瓶中旋紧瓶盖,待小鼠出现深快呼吸后取出,迅速向小鼠鼻内滴注PR8病毒30ul/只。假熏烟小鼠放入另一干净且相同大小的塑料箱内,不做熏烟处理;假攻毒组鼻内滴注MEM培养基30ul/只,其余操作同上,分别观察攻毒后5天小鼠变化。第10天取材留取小鼠支气管肺泡灌洗液,检测细胞计数和细胞分类计数:留取小鼠肺组织用实时定量PCR法检测小鼠肺组织细胞因子、趋化因子、金属蛋白酶、病毒复制水平及干扰素mRNA表达水平。（2）健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响选取SPF级雌性Balb/c小鼠,随机分成8组:分别为假熏烟假攻毒组;假熏烟假攻毒+JPYFⅡ治疗组;假熏烟攻毒组;假熏烟攻毒+JPYFⅡ治疗组;熏烟假攻毒组;熏烟假攻毒+JPYFⅡ治疗组;熏烟联合攻毒组;熏烟联合攻毒+JPYFⅡ治疗组,每组10只。熏烟、攻毒方法同上。药物干预组,造模方法同熏烟联合攻毒组,从第1天开始进行药物干预,连续给药10天。第10天部分进行小鼠肺功能检测;其余小鼠取材,留取小鼠支气管肺泡灌洗液,用于检测细胞计数和细胞分类计数;留取小鼠肺组织实时定量PCR法检测各组肺组织细胞因子、趋化因子以及金属蛋白酶、病毒NP以及干扰素mRNA表达情况;化学发光法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液ROS的产生,Western Blot法检测各组小鼠肺组织gp91和HO-1的蛋白表达;病毒空斑实验观察健脾益肺Ⅱ号方对小鼠病毒载量的影响;以及观察健脾益肺Ⅱ号方对小鼠肺功能的影响。（3）熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究选取SPF级雌性Balb/c小鼠60只,随机分成6组:分别为假熏烟假攻毒组;熏烟联合攻毒（3天）组;熏烟联合攻毒（3天）+PYFⅡ治疗组;假熏烟假攻毒组;熏烟联合攻毒（5天）组;熏烟联合攻毒（5天）+JPYFⅡ治疗组;每组10只。熏烟联合攻毒组第1-4天进行熏烟处理,第5天进行攻毒,分别观察攻毒后3天和5天小鼠情况。熏烟联合攻毒+JPYFⅡ治疗组,造模方法同前,从第1天开始进行药物干预,连续给药5天。假熏烟假攻毒组,标准饲养8、10天,不做任何干预。留取小鼠支气管肺泡灌洗液,用于检测细胞计数和细胞分类计数;Real-time PCR法检测肺组织中细胞因子、病毒复制水平,观察健脾益肺Ⅱ号方对熏烟联合病毒感染小鼠持续预防作用。结果:1.临床研究:本次探索性临床试验共入组慢阻肺患者62例,纳入全分析集患者共62例,治疗组和安慰剂组各31例,其中安慰剂组脱落2例。对比治疗组和安慰剂组两组患者性别、年龄,体重指数,两组患者慢阻肺严重程度,包括两组患者基线时CAT、SGRQ、mMRC、BODE指数、6WMT;以及慢阻肺基线肺功能情况,包括舒张前后FEV1、FVC的情况。经过治疗组和安慰剂组的基线情况比较,两组间各指标差异均无统计学意义,具有可比性（P>0.05）。治疗组较安慰剂组可显着性降低患者CAT评分（P<0.05）、SGRQ评分（P<0.05）、mMRC评分（P<0.05）,减少慢阻肺急性加重发生频次（P<0.05）,一定程度降低急性加重发生率（P>0.05）;治疗组对运动耐力具有一定程度的改善作用,但治疗后在BODE指数改善与安慰剂比较无显着性差异（P>0.05）。对于肺功能改善方面,与安慰剂相比,健脾益肺Ⅱ号颗粒剂对于舒张后FVC和舒张后FEV1/FVC具有改善趋势,但组间差异无统计学意义（P>0.05）。治疗组和安慰剂组都有不良事件发生,但两组患者不良事件发生率均较低,且与用药无因果关系。2.基础研究:（1）香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道免疫细胞的影响①熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞计数的影响攻毒5天后,与假熏烟假攻毒组相比,熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞均显着性增多（P<0.05）;熏烟联合攻毒组小鼠细胞总数、中性粒细胞数较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;熏烟联合攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数、巨噬细胞数较假熏烟假攻毒组与假熏烟攻毒组显着性增多（P<0.05）。②熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠肺组织中炎症因子、趋化因子、金属蛋白酶及对支气管肺泡灌洗液ROS产生的影响与假熏烟假攻毒组相比,假熏烟攻毒组小鼠肺组织中IL-6表达水平显着性升高（P<0.01）;与熏烟假攻毒组相比,假熏烟攻毒组小鼠肺组织IL-6、MMP12表达显着性增多（P<0.05）;与熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组相相比,熏烟攻毒组小鼠肺组织MMP12表达水平显着性升高（P<0.01）。假熏烟攻毒组、熏烟攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液R0S产生速率较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;与假熏烟攻毒组相比,熏烟联合攻毒组小鼠支气管肺泡灌洗液R0S产生速率显着性升高（P<0.05）。熏烟攻毒小鼠肺组织CXCL1、CXCL5、CCL2表达水平较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组显着性升高（P<0.05）;与假熏烟攻毒组相比,熏烟攻毒组小鼠肺组织CXCL5表达水平显着性升高（P<0.01）。③熏烟、病毒感染及熏烟联合流感病毒感染对小鼠肺组织肺部病毒复制水平及干扰素表达的影响与熏烟假攻毒组相比,假熏烟假攻毒组、假熏烟攻毒组、熏烟联合攻毒组小鼠肺组织IFN α、IFN β表达水平有显着性升高（P<0.05）。熏烟联合攻毒组小鼠肺组织Influenza matrix、NP表达水平较假熏烟假攻毒与熏烟假攻毒组均显着性升高（P<0.05）。（2）健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响①健脾益肺Ⅱ号可减轻熏烟联合流感病毒诱导的气道炎性细胞浸润与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性减少小鼠细胞总数、中性粒细胞数（P<0.01）。②健脾益肺Ⅱ号可降低香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的肺组织炎症因子、趋化因子及金属蛋白酶表达与熏烟攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低小鼠肺组织IL-6、CXCL1、CXCL2表达水平（P<0.05）,也可降低小鼠肺组织CXCL5、CCL2表达,但无统计学差异（P>0.05）。③健脾益肺Ⅱ号方可减轻香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的肺部氧化应激攻毒5天后,与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着降低小鼠支气管肺泡灌洗液中ROS表达水平,可显着性降低熏烟联合攻毒小鼠肺组织HO-1、gp91的表达水平（P<0.05）。④健脾益肺Ⅱ号可减少香烟暴露、流感病毒感染及二者联合小鼠肺部病毒复制水平及干扰素表达病毒空斑实验发现,与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低熏烟联合攻毒小鼠病毒载量（P<0.05）。与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性降低小鼠肺组织NP表达水平（P<0.01）。⑤健脾益肺Ⅱ号方增加香烟联合流感病毒感染小鼠吸气量（IC）和用力肺活量（VC）小鼠肺功能实验发现,与假熏烟假攻毒组相比,熏烟联合攻毒组小鼠功能残气量FRC有显着性升高（P<0.01）;与熏烟联合攻毒组相比,健脾益肺Ⅱ号可显着性升高小鼠IC深吸气量、VC肺活量（P<0.05）。（3）熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究①健脾益肺Ⅱ号对熏烟联合病毒感染小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数持续作用的影响健脾益肺Ⅱ号未能降低熏烟联合攻毒小鼠支气管肺泡灌洗液细胞总数,与之前结果相反,健脾益肺Ⅱ号增加了攻毒后第5天细胞总数的数量。②健脾益肺Ⅱ号对熏烟联合病毒感染小鼠肺组织炎症因子、Influenza matrix持续作用的影响与熏烟联合攻毒组相比,感染前给予健脾益肺Ⅱ号未能改善感染后第3天和第5天免疫细胞浸润与炎症因子的表达。与之前结果相反,健脾益肺Ⅱ号增加了攻毒后第5天小鼠肺组织IL-1 β和IL-6的表达水平。结论:1.本研究为一项随机、双盲安慰剂对照的探索性临床研究,通过观察健脾益肺Ⅱ号对急性加重发生的影响,发现健脾益肺Ⅱ号颗粒剂可减少患者急性加重的频次,提高早期慢阻肺患者生活质量、改善临床症状,疗效优于安慰剂,且具有良好的安全性。早期对COPD患者进行干预,特别是稳定期有效干预,将改善患者生存质量,是减少COPD急性加重的重要手段,对于延缓疾病进展以及减轻患者经济负担具有重要的意义。本研究证实健脾益肺Ⅱ号可减少慢性肺病人急性加重,基于这一发现我们对健脾益肺Ⅱ号在减少慢阻肺急性加重发生方面的潜在作用机制将进行深入探讨。2.香烟暴露联合低剂量流感病毒感染会增加小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞数量,尤其是诱导小鼠气道以巨噬细胞和中性粒细胞增多为主的气道炎症,伴随急性炎症因子升高,过氧化物的增多和金属蛋白酶表达升高,且气道炎症浸润、氧化应激、金属蛋白酶以及肺部病毒载量水平明显高于单纯熏烟或单纯病毒感染小鼠。本研究一方面明确了香烟烟雾暴露和流感病毒感染是小鼠发生气道炎症重要的致病因素,初步探讨了香烟暴露对病毒诱导气道炎症的影响;另一方面通过熏烟联合病毒感染,成功建立了慢阻肺气道炎症模型,为后续中药减少病毒感染诱发慢阻肺急性加重的药理学研究提供实用性工具。3.健脾益肺Ⅱ号方减少了熏烟联合病毒感染小鼠气道炎症细胞的浸润,尤其中性粒细胞下调明显,并可抑制熏烟联合病毒感染小鼠促炎细胞因子、趋化因子的表达,减少了肺组织免疫细胞的募集,对氧化应激起到了抑制作用,并可减少流感病毒的复制。表明健脾益肺Ⅱ号方对熏烟联合病毒感染小鼠肺部炎症、氧化应激具有抑制作用,可能与健脾益肺Ⅱ号方的抗病毒作用密切相关。从而可保护小鼠肺组织免受病毒感染所引起的炎症攻击,可能具有治疗流感病毒诱发慢性阻塞性肺疾病急性加重的作用。4.健脾益肺Ⅱ号方未能在熏烟阶段通过改善肺部损伤及炎症状态,从而减少病毒诱导的急性炎症;健脾益肺Ⅱ号方减少流感病毒诱导的熏烟小鼠气道炎症和氧化应激的主要环节可能在于流感病毒感染阶段;此外单纯的抗病毒作用,可能不足以改善病毒诱导的熏烟小鼠肺组织急性炎症。
马惠苗[3]（2021）在《香烟烟雾诱导慢性阻塞性肺病的发生和向肺癌转化的作用及白头翁皂苷B4的干预机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究白头翁皂苷B4对单纯香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺病的保护作用并探讨其可能的作用及机制,为治疗慢阻肺防止其向肺癌转变提供实验依据。第一部分白头翁皂苷B4对慢性阻塞性肺病小鼠的药效以及作用机制研究方法:80只C57BL/6小鼠,雌雄各半,通过连续香烟烟雾诱导法建立COPD小鼠模型。在造模第9周,按照体重将小鼠随机分为正常组、CS诱导组、白头翁皂苷B4高中低剂量组,剂量依次为6mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg,阳性对照组为地塞米松,剂量为1.5mg/kg。熏烟前1h给药,持续4周。在造模及给药期间连续观察小鼠体重变化情况。造模及给药结束后,采用肺功能仪测定模型及各给药组小鼠肺功能参数的变化;高通量蛋白芯片技术测定支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎性因子的含量;HE染色观察肺组织病理变化及上皮细胞增生情况;实时荧光定量PCR法测定小鼠肺组织中转化生长因子-β（TGF-β）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）基因表达水平以及基质金属蛋白酶2（MMP2）、基质金属蛋白酶9（MMP9）、基质金属蛋白酶12（MMP12）、基质金属蛋白酶抑制剂（TIMP1）的表达;采用试剂盒测定小鼠血浆中髓过氧化物酶（MPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力以及丙二醛（MDA）含量;免疫组织化学法测定肺组织中抑癌基因P53、增殖细胞核抗原ki67以及核内不均一核糖核蛋白hnRNP的表达;蛋白免疫印迹（Western blot）检测小鼠肺组织中DNA甲基转移酶（Dnmt1）、脆性组氨酸三联体（FHIT）、抑癌基因CDKN2A/P16蛋白表达水平的变化。结果:在造模期间,烟雾诱导组小鼠体重增长基本停滞,易聚堆,精神倦怠,偶有脱毛现象。白头翁皂苷B4不同剂量组体重变化不明显,地塞米松组小鼠体重有下降趋势;白头翁皂苷B4能够显着降低吸气时间（Ti）、肺阻力（LR）（P<0.05）,升高最大呼气流速（PEF）（P<0.05）,对肺功能具有一定程度的改善作用;同时,白头翁皂苷B4能够降低支气管肺泡灌洗液中炎性因子白介素2（IL-2）、白介素5（IL-5）、白介素8（IL-18）、白介素10（IL-10）的含量（P<0.01）;HE染色对COPD肺组织病理切片进行观察发现,香烟烟雾诱导组小鼠大量炎症细胞包围肺组织,且肺泡间隔变大,白头翁皂苷B4各个剂量组及地塞米松组可缓解炎性细胞浸润情况;与正常组比较,模型组肺组织上皮细胞基底膜出现细胞增生现象,而给与白头翁皂苷B4后增生现象不明显。RT-PCR结果表明,模型组小鼠肺组织中炎性因子TGF-β、TNF-α及IL-1β基因表达水平显着上调（P<0.01）,白头翁皂苷B4能够显着下调其基因表达水平;此外,白头翁皂苷B4能够显着降低MMP2、MMP12基因表达并升高MMP9、TIMP1基因表达水平（P<0.01）;对于氧化应激指标,模型组MDA含量及MPO显着升高,而GSH-PX活力显着降低（P<0.01）,白头翁皂苷B4给药组能够不同程度降低MDA含量及MPO活力,同时能够显着提升GSH-PX活力（P<0.05,P<0.01）;免疫组织化学实验结果表明模型组P53蛋白表达显着上调,白头翁皂苷B4中剂量和高剂量组均能够显着上调P53蛋白表达（P<0.01）,模型组Ki67及hnRNP蛋白表达与正常组相比无差异;最后,western blot结果表明模型组Dnmt1、Cdkn2a/P16蛋白表达显着降低（P<0.01）,白头翁皂苷B4不同剂量组对Dnmt1、Cdkn2a/P16蛋白表达无影响。模型组FHIT蛋白表达显着升高,白头翁皂苷B4不同剂量组及地塞米松组可显着下调该蛋白表达水平（P<0.01）。结论:1、白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺功能具有一定程度改善作用,能够缓解肺功能相关参数变化,减轻肺组织炎性症状。2、白头翁皂苷B4能够通过平衡小鼠肺组织中蛋白酶与抗蛋白酶表达,降低氧化应激水平,改善肺组织氧化应激进而起到抗炎作用。3、白头翁皂苷B4对慢性阻塞性肺病小鼠具有一定的保护作用,可通过减轻支气管柱状上皮细胞增生,降低肺组织中FHIT,升高P53蛋白表达进而延缓COPD向肺癌转化。第二部分白头翁皂苷B4对香烟烟雾提取物CSE诱导的人支气管上皮细胞16HBE的影响方法:自制香烟烟雾CSE提取装置,作用于人支气管上皮细胞进而建立COPD体外实验模型,CCK8细胞毒性实验探究不同浓度香烟烟雾CSE,不同浓度白头翁皂苷B4及地塞米松对16HBE细胞的安全剂量范围和最适作用时间。此外,CCK8法继续探究造模24/36/48h后,白头翁皂苷B4对16HBE细胞活力的影响;PT-PCR测定CSE作用不同时间点时炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8,TGF-β基因表达水平及白头翁皂苷B4干预CSE诱导48h后TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8,TGF-β,Slug,Snail1基因表达水平的影响;WB检测CSE诱导的16HBE细胞中MAPK信号通路相关蛋白及TTF-1、E-cadherin、Fox A2、ZO-1蛋白表达。结果:CCK8结果表明,随着CSE作用时间,作用浓度的不断延长,细胞活力显着下降,当香烟烟雾CSE浓度达到5%及以上时,细胞存活率显着降低（P<0.01）。当白头翁皂苷B4孵育24及36h时,B4不同浓度对细胞存活率无影响,当时间延长至48h时,细胞存活率显着下降（P<0.01）。与对照组相比,在24h及36h时,地塞米松给药浓度达到2000μM,细胞活力显着下降。此外,白头翁皂苷B4药效实验结果显示,与对照组比较,5%CSE诱导不同时间组细胞活力显着降低（P<0.01）,与模型组比较白头翁皂苷B4不同浓度组对细胞活力有一定升高趋势,但无明显差异。RT-PCR结果表明,随着CSE孵育时间的延长,炎性因子IL-6,IL-1β,TGF-β基因表达水平逐渐升高（P<0.05,P<0.01）,而TNF-α,IL-8在CSE诱导48h时有一定升高趋势,但无显着差异。白头翁皂苷B4干预后能够显着降低IL-1β,TGF-β、IL-8、TNF-α基因表达水平（P<0.05,P<0.01）。同时,可显着降低Snail1 mRNA表达（P<0.05,P<0.01）。WB结果表明,CSE诱导后MAPK信号通路中p-P38、AP-1（c-jun/c-Fos）蛋白表达显着升高（P<0.01）,白头翁皂苷B4中高剂量组及地塞米松组均能显着降低蛋白表达（P<0.01）。同时,白头翁皂苷B4可上调TTF-1、E-cadherin、ZO-1的表达,下调Fox A2蛋白表达（P<0.05,P<0.01）。结论:香烟烟雾提取物（CSE）对人支气管上皮细胞（16HBE）具有不同程度的抑制作用,呈现浓度和时间依赖性,随着时间的延长,细胞存活率越来越低。且香烟烟雾提取物能够上调相关炎性因子的表达。白头翁皂苷B4能够通过降低炎性因子,调节MAPK信号通路相关蛋白及上皮细胞分化蛋白表达,从而发挥一定程度保护16HBE细胞免受CSE损害的作用。其机制可能与调节MAPK/TGFβ/TTF-1信号通路有关。
王明哲[4]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中指出背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
崔立伟[5]（2021）在《解聚素基质蛋白酶9（ADAM9）在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中作用的研究》文中研究说明研究背景慢性阻塞性肺疾病（简称慢阻肺）是呼吸系统的一种常见病,多发病,居全球死亡原因的第三位,严重危害人类健康。最新流行病学资料显示,我国慢阻肺的患病率约为8.6%,而在40岁以上人群中高达13.7%。自2001年GOLD问世以来,人们对慢阻肺的认知、诊断、预防和诊疗水平有了很大的提高,但是发病率、病死率仍居高不下。慢阻肺的有效防控是今后很长一段时间内我们必须面对的严峻挑战。在慢阻肺的防控工作中,对于其发病机制的深入探讨和诊治措施的优化改进是不可或缺的重要环节,更是慢阻肺临床基础研究和转化医学研究的热点区域。小气道病变气道重塑和肺气肿是慢阻肺的主要组织病理改变。其中小气道病变是慢阻肺发病机制研究的重点和难点。越来越多的研究证实小气道的病变是慢阻肺发病的起始环节。慢阻肺患者气道病变主要包括炎症细胞浸润、气道上皮再生紊乱、鳞状上皮化生、胶原沉积增多等。晚近研究表明,慢阻肺患者在疾病早期即有远端小支气管数目的显着减少,伴有气道壁的增厚,且小气道病理改变早于肺气肿形成。因此,对于小气道病变的探究可以让我们对慢阻肺发病机制有不断深入的了解。我们的前期研究显示,慢阻肺患者肺组织小气道上皮的ADAM9表达明显高于非慢阻肺患者。一项基因敲除动物实验报告,敲除ADAM9后的小鼠与野生型小鼠相比,暴露于香烟烟雾（制作慢阻肺动物模型）后肺气肿程度有明显减轻,提示ADAM9可能参与了肺气肿为主的慢阻肺发病过程。众所周知,蛋白酶-抗蛋白酶失衡是慢阻肺发病的重要机制之一。多种基质金属蛋白酶（MMP）家族成员,如MMP-1,8,9,12等分子参与慢阻肺的发病,尤其在肺气肿形成过程中发挥关键作用。而解聚素基质蛋白酶（ADAM）家族与MMP分子同属锌依赖蛋白酶超家族,虽然两个家族分子结构相近,但ADAM家族分子多具有独特的基质蛋白酶结构域、解聚素结构域和半胱氨酸富集结构域。这些特殊结构域赋予ADAM家族分子除了具有降解细胞外基质作用外,还具有剪切细胞表面粘附和信号分子功能,从而参与细胞间的粘附、迁移、增殖、分化和凋亡等生物活动。近年来的研究显示,ADAM8、ADAM9、ADAM17以及ADAM33等分子在慢阻肺人群中表达上调。ADAM9是ADAM家族中的经典成员,主要在上皮细胞中表达,在炎症细胞和平滑肌细胞等细胞中也有表达。ADAM9在慢阻肺气道上皮中显着高表达的病理意义是什么?鉴于ADAM9上述的分子生物学特性,其在慢阻肺气道重塑扮演什么角色?机制如何?本研究试图回答这些问题,从而为慢阻肺发病机制的研究积累有益的资料。本研究分为两个部分第一部分慢阻肺患者气道ADAM9水平与临床指标的相关性研究一、慢阻肺诱导痰ADAM9水平与临床指标的相关性目的:研究慢阻肺患者诱导痰中ADAM9水平及其与慢阻肺临床指标的相关性。方法:1.研究对象:收集2015年至2017年期间于山东大学齐鲁医院肺功能特检室行通气检查的受试者,慢阻肺诊断标准根据当年的GOLD文件,即受试者在吸入支气管舒张剂（万托林200ug）15分钟后,肺功能检查报告示FEV1/FVC<0.7。结合受试者吸烟史和肺功能检查结果对受试者进行分组,包括慢阻肺组,非吸烟对照组和吸烟对照组。2.诱导痰标本收集与处理（1）高渗盐水雾化诱导留取痰标本:诱导前10 min时嘱托受试者吸入沙丁胺醇400 ug,静坐休息。给予高渗盐水（3%NaCl溶液）雾化吸入10 min,受试者再次漱口、擤鼻后用力咳痰至痰液收集盒内。（2）痰标本处理:留取痰标本后,4℃保存,2 h内处理完毕。处理时用镊子挑取痰栓或不透明的痰块至新的痰盒,称量痰标本净重,加入4倍体积0.1%二硫苏糖醇（DTT）溶液,充分混匀,并于冰上充分裂解15 min去除粘液成分。标本经过滤、离心后,吸取上清,分装至200 ul的EP管内,-80℃冻存备用。对细胞沉淀重悬后图片,留取合格痰标本检测。（3）ELISA免疫酶联检测ADAM9和炎症指标IL-8:按照ADAM9和IL-8酶联检测试剂盒操作说明书的流程进行实验。3.慢阻肺主要临床指标（1）肺功能检查:第一秒用力呼气量占预计值百分比（FEV1%预计值）、一秒率（FEV1/FVC）,最大呼气中期流速占预计值百分比（MMEF%预计值）等。（2）CT影像资料定量分析:选取和收集入组时受试者于我院完成的CT检查结果。将患者CT数据传输至工作站进行后处理工作,利用影像分析软件3D slicer中Airway Inspector模块进行定量分析。①肺气肿指数计算:用软件计算CT值低于-950 Hu的低衰减区域占全肺体素总数的百分比（%LAA-950）。②气道壁厚度参数:选择受试者3级支气管中的右上肺尖段支气管（RB1）,右肺下叶后基底段支气管（RB10）,左肺下叶后基底段支气管（LB10）,左上肺尖段支气管（LB1）为测量目标气道,计算3级-5级气道壁厚度（WT）,气道壁截面积百分比（WA%）和内周径10mm的气道壁面积的平方根（Pi10）。4.统计分析:采用学生t检验及Mann-Whitney U检验进行组间连续变量的比较和分析。相关性分析采用Pearson线性相关系数对连续变量进行分析,采用Spearman等级相关系数对分类变量进行相关性分析。结果:1.共纳入84例,其中非吸烟对照组21例,吸烟对照组21例,慢阻肺组42例。2.在校正年龄、性别和BMI因素后,慢阻肺组诱导痰中ADAM9水平较吸烟对照组和非吸烟对照组高（P=0.036和0.039）;吸烟对照组和非吸烟组间则无明显差异（P>0.05）。3.相关性分析显示,受试者诱导痰ADAM9水平与肺通气功能指标FEV1%预计值、FEV1/FVC和MMEF%预计值之间均呈显着负相关（相关系数r1=-0.395,P<0.001;r2=-0.344,P=0.001;r3=-0.403,P<0.001）。4.诱导痰ADAM9水平与肺气肿指数%LAA-950、3-5级支气管WA%以及Pi-10间均未见明显相关性（P值均>0.05）。5.诱导痰ADAM9水平与炎症因子IL-8水平呈显着正相关（r=0.558,P<0.001）小结1.慢阻肺患者诱导痰ADAM9水平明显高于吸烟对照组和非吸烟组;2.慢阻肺患者诱导痰ADAM9水平与FEV1%预计值和FEV1/FVC呈负相关,与胸部定量CT肺气肿指数%LAA-950和气道壁厚度指标WA%均无明显相关性。3.慢阻肺患者诱导痰ADAM9与IL-8两者之间呈显着正相关。二、慢阻肺患者气道上皮ADAM9表达与临床指标的相关性目的:研究慢阻肺患者气道组织中ADAM9的表达情况及其与慢阻肺主要临床指标的相关性。方法:1.研究对象:收集2018年至2019年期间于山东大学齐鲁医院因肺部病变（孤立性肺部结节、外周性占位）行肺叶切除的手术患者,根据GOLD 2018文件中慢阻肺的诊断标准及患者的吸烟史,将受试者分为慢阻肺组、非吸烟对照组和吸烟对照组。2.肺组织标本收集及处理收集肺组织标本后,修剪组织块约1× 1×0.5 cm大小;完全浸泡于4%多聚甲醛固定液中固定48 h;流水漂洗组织块过夜;脱水、浸蜡;石蜡包埋并制备切片。3.免疫组织化学染色检测肺组织ADAM9表达预先烤片1h,全自动脱蜡脱水机内脱蜡至水,柠檬酸抗原修复缓冲液微波加热修复,阻断过氧化物酶,孵育1抗,4℃过夜,滴加聚合物辅助剂和山羊抗兔二抗,DAB显色至目的蛋白呈深棕色（各组显色条件以及拍摄条件保持一致）,苏木素复染3 min并分化,梯度脱水后封片。应用Image-Pro Plus 6.0软件进行气道上皮中ADAM9的表达进行定量分析,采用ADAM9平均光密度（累积光密度/测量气道上皮面积,IOD/area）计算ADAM9的相对表达量。4.慢阻肺主要临床指标（1）肺功能检查:FEV1%预计值、一秒率（FEV1/FVC）,MMEF%预计值等。（2）CT影像资料定量分析①胸部CT扫描数据的获取、肺气肿指数计算、气道壁厚度测量方法同第一节。②支气管计数:选择RB1作为计数的目标气道,选择3级支气管（airway generation of 3,AG3）作为气道计数第0级气道,逐层扫描RB1下游支气管分叉,根据Weibel气道解剖模型计算预期的下级支气管数目,计算4级至9级、6级至9级支气管计数。5.数据分析:采用学生t检验及Mann-Whitney U检验进行组间连续变量的比较,应用卡方检验进行分类变量的组间比较。相关性分析采用Pearson线性相关系数对连续变量进行分析,采用Spearman等级相关系数对分类变量进行相关分析。结果1.共纳入98例受试者,其中非吸烟对照组28例,吸烟对照组34例,慢阻肺组36例,各组在年龄、BMI方面均无明显差异。2.ADAM9蛋白几乎表达于所有受试者的气道上皮中,定位显示ADAM9蛋白的表达主要位于气道上皮的刷状缘处;慢阻肺组气道上皮ADAM9的表达显着高于吸烟对照组和非吸烟对照组（ADAM9相对表达量IOD/area:0.069±0.029 vs.0.052±0.025,0.033±0.020,P值均<0.01）,吸烟组较非吸烟对照组气道上皮ADAM9表达明显增多（P<0.01）。3.受试者气道上皮ADAM9表达与其吸烟量（包-年）之间呈正相关关系（r=0.226,P=0.027）,与肺功能指标FEV1%预计值,FEV1/FVC,MMEF%预计值之间均呈明显负相关关系（r1=-0.259,P=0.017;r2=-0.398,P<0.001;r3=-0.256,P=0.046）。4.气道上皮ADAM9相对表达量与%LAA-950之间亦呈明显正相关（r=0.395,P=0.001）;与第3-5级支气管WA%相关系数分别为0.317,0.418和0.297（P值均<0.05）;与Pi10相关系数为0.268（P=0.026）;与4级至9级支气管数目和6级至9级支气管数目相关系数分别为-0.508和-0.512（P值均<0.01）。小结1.慢阻肺患者气道上皮ADAM9表达水平显着高于吸烟对照组和非吸烟对照组;与吸烟量之间呈正相关。2.慢阻肺患者气道上皮ADAM9表达水平与肺通气功能指标FEV1%预计值之间呈显着负相关。3.慢阻肺患者气道上皮ADAM9表达水平与胸部CT测定气道WA%呈正相关,与4级-9级支气管的计数明显负相关。第一部分结论1.慢阻肺气道ADAM9水平显着高于非慢阻肺对照组。2.慢阻肺气道上皮ADAM9水平的增高与肺功能气流受限严重程度和CT测定气道重塑指标均显着相关。第二部分ADAM9在慢阻肺气道重塑中作用及其机制探讨一、ADAM9对人原代支气管上皮细胞（HPBECs）增殖影响的研究及机制初探目的:研究ADAM9对HPBECs细胞增殖的作用及其可能机制。方法:1.研究对象:收集2018年4月至2020年8月期间于我院行电子支气管镜检查的受试者。入组标准:非吸烟,肺通气功能FEV1%预计值和FEV1/FVC在正常范围;因单侧外周性结节行气管镜检查者,结节直径≤2cm;或单纯因咳嗽症状行支气管镜查体,肺部影像学无其他明显病变者。2.HPBECs的细胞培养:用无菌支气管镜毛刷于患者健侧2-3级支气管处轻轻刷检4次,刷取后将毛刷置于4℃预冷上皮细胞培养基中,将细胞刷检物的混悬液低温离心,弃上清,0.25%胰酶消化,血清终止消化,再次离心后以PneumaCult气道上皮细胞培养基重悬细胞,接种于细胞培养瓶中,置于5%CO2、37℃细胞孵育箱中培养。3.免疫荧光化学染色:荧光双标抗体组合包括KRT5+ADAM9,ADAM9+EGFR,KRT5+Caspase3。4.CCK-8实验对细胞活性进行检测:HPBECs（取P1或P2代）接种于96孔板内,给予梯度浓度的或低估rhADAM9干预,24h后加CCK-8试剂进行检测。5.Western Blot蛋白印迹:蛋白定量检测ADAM9、周期蛋白D1、周期蛋白E1、凋亡蛋白剪切Caspase3,EGFR等蛋白的表达情况。6.活细胞Caspase3活性/细胞凋亡检测:活性rhADAM9蛋白处理HPBECs经48 h后,对活细胞状态下细胞内Caspase3活性和Annexin V染色凋亡活性进行检测。7.EdU-594细胞增殖检测:梯度浓度重组ADAM9干预48h后,按照试剂盒说明进行操作,对细胞合成DNA进行分裂增殖能力进行研究。7.支气管上皮细胞成球实验:HPBECs（取P1或P2代细胞）,经0.25%胰酶消化、血清终止消化、350×g离心5 min,以PneumaCult培养基重悬细胞,各EP管细胞悬液中分别加入梯度浓度的人重组ADAM9蛋白和抑制剂GM6001,接种于超低吸附U型底的单一成球实验细胞板内,继续培养48-72h,于倒置显微镜下观察各组成球效果,拍照并测量细胞球的直径。8.数据统计:应用SPSS 20.0统计学分析软件进行组间数据的比较等分析。P<0.05为有统计学差异。结果1.本部分研究共纳入40例非吸烟者受试者,肺功能检查FEV1/FVC和FEV1%均在正常范围。2.免疫荧光染色定位:非吸烟对照者肺组织标本中,气道上皮ADAM9表达主要位于上皮顶部刷状缘附近,此处细胞组成中纤毛细胞比例高;基底膜侧上皮细胞仅见有少量表达。在吸烟对照者和慢阻肺组患者中,气道上皮ADAM9荧光染色阳性细胞比例较非吸烟组明显增多,同时ADAM9在气道上皮结构各层表达均明显上调。3.应用4%、6%、8%浓度香烟提取物（CSE）刺激HPBECs后,细胞中ADAM9表达随CSE浓度升高而上调（P值均<0.05）。4.给予梯度浓度的活性rhADAM9干预HPBECs,24h后CCK-8实验显示细胞活性无明显改变。5.随活性rhADAM9处理浓度（10ng/ml,50ng/ml,100ng/ml）的增高,上皮细胞成球尺寸较对照组明显减小（P<0.05）,继续培养后高浓度组（100ng/ml）球周裂解细胞碎片明显增多。6.EdU594检测结果显示,100ng/ml活性rhADAM9可显着抑制HPBECs的细胞增殖活性。7.应用活性rhADAM9可下调HPBECs中周期蛋白D1、E1表达且上调凋亡蛋白酶Caspase3的表达。8.应用100ng/ml活性rhADAM9处理组HPBECs中caspase3活性和Annexin V阳性凋亡细胞比例较对照组增高。8.活性rhADAM9可减少细胞中EGFR的表达。小结1.ADAM9可抑制HPBECs细胞成球能力和增殖活性;下调周期蛋白D1和E1的表达并上调凋亡蛋白酶Caspase3的表达。2.下调上皮细胞EGFR的表达可能是ADAM9抑制HPBECs增殖的机制之一。二、ADAM9对HPBECs分化影响的研究目的:研究ADAM9对HPBECs分化的作用,探讨ADAM9通过HPBECs对成纤维细胞的影响。方法:1.研究对象:同第二部分第一节。2.HPBECs培养同前。3.HPBECs 的气液界相（air-liquid interface,ALI）培养（1）HPBECs进行原代培养,消化、终止、离心、PneumaCult气道上皮细胞培养基重悬后,将细胞悬液小心接种于带有24mm直径、0.4um孔径聚酯膜（PE membrane）的Transwell上室内,下室内加入工作容积的PneumaCult气道上皮细胞培养基。（2）待细胞长满上室PET膜后,吸除上室及下室气道上皮细胞培养基,下室内加入ALI分化培养基,上室不加任何培养基,暴露于空气中。（3）每2天更换Transwell下室的ALI分化培养基,定期PBS缓冲液冲洗上室细胞去除细胞分泌的粘液。（4）ALI培养后第3天起,即在下室培养基中加入CSE、活性rhADAM9蛋白和GM6001等干预刺激,并在后期细胞培养中,定期换液维持各组刺激的工作浓度。4.Transwell-ALI细胞冰冻切片及染色（1）使用预冷的4%多聚甲醛,固定长有气道上皮细胞的Transwell小室30min;轻轻撕下上室底部的PE膜,裁剪成0.3×0.3cm大小的正方形小片,用OCT包埋剂将PE膜连同膜上的细胞一同固定与包埋剂中,注意膜的方向应与底座平面垂直,以保证后续切膜时得到细胞的纵向切面。将包埋好的样品托置于-20℃冰箱上冷冻固定。（2）冰冻切片:于冰冻切片机内,切片厚度5um。（3）染色:同前免疫荧光染色。5.上皮细胞-成纤维细胞共培养模型构建（1）成纤维细胞培养:常规复苏细胞,使用含10%胎牛血清的Ham’s F12K培养基培养。（2）支气管上皮细胞-HFL-1共培养模型的构建及干预①HPBECs种板:取对数生长期的第2代HPBECs,经0.25%胰酶消化、血清终止消化、350×g离心5 min后,使用PneumaCult培养基重悬细胞,调整细胞密度为约2.5×105/ml,接种于配有24mm直径、0.4um孔径PE膜的Transwell上室内。②HFL-1细胞种板:取对数生长期的HFL-1细胞,消化、终止、离心,含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培养基重悬细胞,调整细胞密度为1× 105/ml,接种于另一 6孔板内。③待两种细胞均贴壁并生长融合至80%培养面积时,将Transwell上室转移至含HFL-1的6孔板中,上室加入PneumaCult培养基,下室则更换培养基为以PneumaCult气道上皮细胞培养基和含15%胎牛血清的Ham’s F-12K培养基以1:1的比例配制的混合培养基,继续培养24h。④在上室培养基中加入活性rhADAM9蛋白等刺激,处理48h分别收集上室及下室细胞,对HPBECs和HFL-1中蛋白表达进行定量分析。6.数据分析:应用SPSS 20.0分析软件进行组间数据的比较等统计学分析。结果:1.对鳞状上皮化生标记物表达的影响:活性rhADAM9可上调HPBECs以及ALI模型鳞状上皮化生标记物involucrin、KRT14等表达。involucrin的表达随ADAM9干预浓度增高而增高;若同时给予基质酶抑制剂GM6001（10umol/L）处理,则联合组较单独ADAM9干预组,HPBECs中involucrin表达则降低。2.对粘液高分泌标记物表达的影响:rhADAM9抑制HPBECs粘蛋白分子MUC5AC的表达,其中1ng/ml、10ng/ml和50ng/ml浓度组ADAM9干预后,MUC5AC表达明显减少;MUC5B表达随活性rhADAM9表达的增高无明显改变。3.对EMT分子标记物表达的影响:rhADAM9对HPBECs中EMT标记物Vimentin和E-cadherin等表达无明显影响。4.对细胞膜EGFR表达的影响:rhADAM9可下调HPBECs-ALI模型中细胞EGFR的表达。10ng/mlADADM9处理组EGFR表达较对照组和4%CSE组均明显减低（P<0.05）。5.对共培养模型中成纤维细胞合成纤维蛋白功能的影响:rhADAM9刺激HPBECs后成纤维细胞表达Ⅲ型胶原蛋白增高,随上室内重组ADAM9浓度增加,共培养模型中成纤维细胞HFL-1中Ⅲ型胶原蛋白表达增加（10ng/ml ADAM9干预组vs.对照组,P=0.012;50ng/ml ADAM9干预组vs.对照组,P=0.011）,同时弹性蛋白表达量随重组ADAM9浓度增高而减少。小结1.活性rhADAM9上调HPBECs中involucrin的表达,促进支气管上皮向鳞状上皮化生;粘蛋白MUC5AC被抑制。2.活性rhADAM9作用于HPBECs-成纤维细胞共培养模型,引起Ⅲ型胶原蛋白增多、弹性蛋白合成减少,提示ADAM9通过HPBECs增强了成纤维细胞胶原合成的功能,此系气道重塑的重要病理过程之一。第二部分结论1.ADAM9抑制HPBECs的增殖,下调上皮细胞EGFR的表达是可能的调控机制之一。2.ADAM9促进支气管上皮细胞向鳞状上皮化生,并通过上皮细胞增强成纤维细胞胶原合成的功能,从而参与慢阻肺气道重塑的病理过程。全文结论1.慢阻肺气道上皮中ADAM9显着高表达,ADAM9表达水平与肺通气功能指标呈负相关,与CT气道壁增厚指标和气道数目减少呈正相关。2.ADAM9可抑制HPBECs的增殖,下调细胞中EGFR表达是可能的调控机制之一。3.ADAM9可引起支气管上皮细胞出现鳞状上皮化生、粘蛋白分泌减少和成纤维细胞合成Ⅲ型胶原蛋白增多、弹性蛋白减少等改变。创新性及意义1.本研究揭示了气道上皮ADAM9表达与气道重塑管壁增厚和小支气管结构破坏之间的相关性。2.应用成球实验等方法探讨ADAM9抑制HPBECs增殖的作用。3.构建气液界相培养和共培养模型等,研究ADAM9对HPBECs分化及间质成纤维细胞胶原合成的影响。局限性与不足1.对EGFR下游信号通路的改变缺乏深入的验证;2.缺少动物模型探讨ADAM9在体内环境中对气道上皮增殖和分化功能的改变。
白爽[6]（2021）在《PHLDA1抑制COPD肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的机制研究》文中研究说明目的:肺气肿表型是慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）临床表型之一,其发病率和死亡率均高,患者肺部组织破坏呈进行性发展,且对目前临床用药应答不良,寻找针对患者气肿病变进行修复及防止进展的治疗靶点尤为重要。Ⅱ型肺泡上皮细胞（Type II alveolar epithelial cell,AECII）是肺组织中发挥再生修复功能的“干性细胞”,其数量减少及功能障碍将会严重影响肺泡上皮细胞的修复功能,造成肺泡组织结构受损,研究显示,AECII凋亡增强是肺气肿形成过程中的重要机制之一。PHLDA1（Pleckstrin Homology Like Domain Family A Member 1）属于血小板-白细胞激酶C底物同源（PH）结构域家族,可通过多种途径直接或间接参与机体凋亡调控。目前对其在凋亡中的具体作用尚存在争议,且其在肺组织相关疾病中的具体作用及机制尚不明确。本研究旨在探讨PHLDA1在COPD肺气肿表型中对Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的调控作用及具体机制,为肺气肿表型患者靶向治疗的实现提供新的策略。研究方法:第一部分:慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡水平研究1.根据患者临床表现及肺功能检查结果筛选出纳入研究的COPD患者,随后根据胸部CT图像分析结果,将所有受试者被分成COPD非肺气肿表型（COPD non-emphysematous phenotype,COPD-NE）和COPD肺气肿表型（COPD emphysematous phenotype,COPD-E）两组。2.采用免疫荧光和TUNEL（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling）试剂盒比较COPD-NE和COPD-E两组患者肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞的数量及细胞凋亡水平的差异。3.采用CT图像分析软件及苏木素-伊红染色技术（HE）比较肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型患者肺组织形态学变化的差异。4.采用蛋白免疫印迹及实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（rt-q PCR）比较肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型患者蛋白酶及蛋白酶抑制分子、凋亡相关分子水平和炎症因子水平的差异。随后采用总谷胱甘肽-氧化型谷胱甘肽试剂盒和超氧化物歧化酶测定试剂盒比较肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型抗氧化物质水平的差异。第二部分:PHLDA1通过抑制Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡影响COPD肺气肿表型的形成1.应用GEO（Gene Expression Omnibus database）数据库分析慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型差异基因表达及功能。2.采用蛋白免疫印迹及rt-q PCR比较PHLDA1在COPD-NE和COPD-E两组患者肺组织中的表达水平差异。随后采用免疫组织化学及免疫荧光检测人肺组织内PHLDA1的蛋白表达水平及定位。3.采用不同浓度香烟烟雾抽提物对人Ⅱ型肺泡上皮细胞进行处理,构建香烟烟雾影响人Ⅱ型肺泡上皮细胞细胞模型。通过CCK8（Cell Counting Kit-8）试剂盒检测细胞活力。4.采用si RNA（small interfering RNA）转染和p EX4质粒转染分别下调及上调PHLDA1在细胞中的表达水平。随后采用流式细胞术检测在香烟烟雾影响人Ⅱ型肺泡上皮细胞模型中,PHLDA1的表达对细胞凋亡水平的影响。蛋白免疫印迹检测上述细胞模型中,香烟烟雾抽提物处理24h及48h后凋亡相关分子的水平变化,进一步探索PHLDA1的表达对细胞凋亡水平的影响。第三部分:人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中PHLDA1与14-3-3结合1.采用免疫共沉淀检测PHLDA1在香烟烟雾抽提物诱导凋亡的人Ⅱ型肺泡上皮细胞中的相互结合蛋白,从而验证人Ⅱ型肺泡上皮细胞中PHLDA1和14-3-3的蛋白间结合关系。2.采用蛋白免疫印迹检测香烟烟雾抽提物诱导凋亡的人Ⅱ型肺泡上皮细胞中14-3-3 epsilon和theta亚型的水平变化,探索PHLDA1对14-3-3上述亚型蛋白表达潜在的调控关系。随后采用si RNA和p EX4质粒分别下调及上调14-3-3 epsilon在细胞中的表达,明确PHLDA1对14-3-3 epsilon亚型蛋白表达水平的调控。3.采用细胞免疫荧光及组织免疫荧光技术分别在香烟烟雾抽提物诱导凋亡的人Ⅱ型肺泡上皮细胞中,和COPD患者的肺组织切片中,对PHLDA1和14-3-3蛋白在细胞中的共定位关系进行检测。结果:第一部分:慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡增强1.免疫荧光和TUNEL检测结果提示,COPD-E组患者肺组织SP-C阳性的Ⅱ型肺泡上皮细胞数显着低于COPD-NE组,且在SP-C染色阳性的Ⅱ型肺泡上皮细胞中,COPD-E组患者肺组织内Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡比例显着升高。2.CT图像分析软件和HE染色结果提示,肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型在肺气肿程度及分布上均无显着差异。3.Rt-q PCR、Western blot及氧化应激相关试剂盒检测结果提示,肺功能保留的“肺气肿”和COPD肺气肿表型受试者的炎症因子水平、蛋白酶水平、蛋白酶抑制分子水平、凋亡相关蛋白水平及抗氧化物质水平均无明显差异。第二部分:PHLDA1通过调控Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡影响COPD肺气肿表型形成的研究1.GEO数据库分析结果提示PHLDA1可能是COPD-E组与COPD-NE组的差异表达基因。2.Western Blot、免疫组化及免疫荧光结果提示,相较于COPD-NE组,PHLDA1在COPD-E组患者肺组织中低表达,主要表达于肺组织人Ⅱ型肺泡上皮细胞中,且主要定位于细胞浆内,在细胞核中也有少量表达。相关性分析结果提示,PHLDA1的表达量与COPD患者肺气肿指数基本呈负相关趋势,与COPD患者第15百分位肺密度呈正相关。3.过表达PHLDA1可在一定程度上逆转6%香烟烟雾抽提物导致的人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡,但未能恢复到加入6%香烟烟雾抽提物之前的水平。而敲减PHLDA1后可在4%香烟抽提物处理的条件下造成细胞的显着凋亡。细胞中PARP裂解水平及Caspase3活化程度变化与上述细胞凋亡变化结果相一致。第三部分:人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中PHLDA1与14-3-3结合的研究1.Western Blot结果提示,6%香烟烟雾抽提物处理24h之后,人Ⅱ型肺泡上皮细胞中14-3-3 epsilon水平显着下降。2.过表达PHLDA1后细胞内14-3-3 epsilon蛋白水平显着升高,而应用si RNA对细胞内PHLDA1进行敲减之后,14-3-3 epsilon蛋白水平显着下降。3.细胞及组织免疫荧光结果提示,无论是否存在香烟烟雾抽提物的刺激,PHLDA1与14-3-3 epsilon均在完整人Ⅱ型肺泡上皮细胞中共表达。在COPD患者的肺组织切片中,PHLDA1与14-3-3 epsilon存在共定位关系,且COPD-E组PHLDA1及14-3-3 epsilon的水平均低于COPD-NE组。4.免疫共沉淀结果提示,无论是否存在香烟烟雾抽提物的刺激,细胞中PHLDA1与14-3-3 epsilon的结合均存在。但在施加了香烟烟雾抽提物后,PHLDA1结合的14-3-3 epsilon蛋白量明显下降。结论:1.慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞数量减少,且凋亡水平升高。2.肺功能保留的“肺气肿”与慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型影像学和病理表现相似,且发病机制相同。3.PHLDA1在慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型中蛋白水平降低且与肺气肿程度相关。4.PHLDA1抑制香烟烟雾抽提物诱导的人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡。5.PHLDA1可调节人Ⅱ型肺泡上皮细胞中14-3-3 epsilon水平。6.香烟烟雾抽提物诱导凋亡可使PHLDA1和14-3-3 epsilon蛋白间结合力降低。
郝滋辰[7]（2020）在《长期吸烟在骨折愈合早期的抑制作用及机制研究》文中认为研究背景长期吸烟患者骨折后延迟愈合和骨不连的发生率升高,由于致病机制不明确,目前缺乏有效的针对性的干预方法。长期吸烟所致骨折愈合不良与全身多器官系统的改变相关,想要系统地阐释这种复杂的关系网非常困难。在骨折局部,自然的骨折愈合过程中的细胞学、分子学特点已经获得了较深入的认识,而在长期吸烟作用下,骨折愈合过程的生物学变化有待进一步研究。研究表明长期吸烟对骨折愈合的不利影响早在软骨形成阶段即有表现,骨折愈合早期局部的细胞学和分子学改变可能是长期吸烟导致骨折愈合不良的重要机制。因此,本研究拟（1）构建贴近长期吸烟者骨折愈合表型的小鼠模型,（2）在该模型上研究长期吸烟作用下骨折愈合早期的关键细胞学和分子学特点,（3）基于细胞学和分子学特点探索长期吸烟所致骨折愈合不良的分子生物学机制并采用动物实验进行验证,为未来的临床干预治疗以减轻甚至防止长期吸烟所致骨折愈合不良提供可能的新靶点。研究方法一、构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型1、将C57BL/6J、129X1/Sv J和BALB/c J三种小鼠每种品系分为吸烟组（CS）和对照组（NS）,采用烟雾暴露装置对吸烟组小鼠进行香烟烟雾暴露,具体为:每只小鼠每天接受2支3R4F研究型香烟暴露,每日上、下午各对小鼠进行香烟烟雾暴露一次,间隔6小时,每周暴露6天,持续3个月。对对照组小鼠采用同样的方法进行空气暴露。通过分析烟雾暴露后小鼠体重变化、静脉血白细胞数目变化、血浆可替宁浓度和系统性炎症因子的变化来评估模拟长期吸烟的有效性。2、在香烟烟雾/空气暴露3个月的小鼠上制作股骨中段横形骨折并给予髓内固定,术后继续暴露4周后对骨折的股骨进行取材并进行X线、Micro-CT和生物力学对骨折愈合情况进行分析,挑选骨折愈合情况最接近长期吸烟者骨折愈合表型的小鼠品系用于后续研究中构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型。二、探索长期吸烟作用下骨折愈合早期的细胞学和分子学特点1、对吸烟组和对照组股骨骨折术后7天的骨痂进行H&E和番红O染色,观察骨痂和软骨的形成情况。2、采用流式细胞术对吸烟组和对照组完整股骨、骨折术后3天、7天骨痂内小鼠骨骼干细胞（SSC（CD45-Ter-119-Tie2-Alpha V+Thy-6C3-CD105-））及其下游的骨、软骨、基质细胞的祖细胞（BCSP（CD45-TER119-Tie2-Alpha V+Thy-6C3-CD105+））进行检测分析。3、采用多重免疫荧光染色对吸烟组和对照组骨折术后7天的骨痂进行Ki67和CD105染色,观察骨痂内荧光共表达（增殖的BCSP）情况。4、Brd U标记小鼠,流式细胞学方法对不同组小鼠骨折术后3天骨痂内的SSC增殖活动进行分析。5、CCK-8方法体外检测不同组小鼠股骨来源的SSC的增殖能力。6、长期吸烟作用下骨折早期血肿环境特点:收集吸烟组和对照组骨折术后6h和24h的血肿,采用基于Luminex微球的多重细胞因子分析技术对血肿内的32种标志性炎症因子的浓度进行检测;并采用流式细胞术对骨折术后6h血肿内的主要免疫细胞（中性粒细胞（Ly-6G+,F4-80-）、巨噬细胞（Ly-6G-,F4-80+）、B细胞（CD3-,CD19+）和T细胞（CD3+,CD19+））进行检测分析。7、正常组小鼠血肿环境（NS-Hematoma）和吸烟组小鼠血肿环境（CS-Hematoma）对SSC增殖能力的影响:体外CCK-8检测不同培养环境下SSC增殖情况。三、长期吸烟抑制骨折早期骨骼干细胞增殖的分子机制研究1、IL-6 Trans信号通路对SSC增殖的调节作用:使用sgp130Fc选择性抑制IL-6Trans信号通路后CCK-8法检测SSC增殖能力变化。2、STAT3基因对SSC增殖活动的调控:（1）RT-PCR检测吸烟组与对照组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达水平。（2）RT-PCR检测正常小鼠股骨来源SSC在体外NS-Hematoma和CS-Hematoma培养后STAT3的表达水平。（3）使用AG490对STAT3特异性抑制后,CCK-8法检测SSC体外增殖能力变化。3、IL-6 Trans信号通路对STAT3基因的调控作用:使用sgp130Fc选择性抑制IL-6 Trans信号通路后RP-PCR检测SSC中STAT3基因的表达变化。4、构建长期吸烟组（CS）、对照组（NS）、吸烟+干预组（CS+sgp130Fc）骨折小鼠模型,CS+sgp130Fc组小鼠骨折术后30分钟和48小时分别给予sgp130Fc腹腔内注射以选择性抑制IL-6 Trans信号通路,其余组注射等量Ig G抗体作为对照。5、不同组小鼠术后4周骨折愈合情况评价分析:X线、Micro-CT和生物力学分析。6、不同组小鼠骨折术后7天的骨痂进行番红O染色,观察骨痂和软骨的形成情况。7、采用流式细胞术对不同组小鼠骨折术后3天、7天骨痂内SSC和BCSP的数量进行检测。Brd U标记小鼠,流式细胞学方法对不同组小鼠骨折术后3天骨痂内的SSC增殖活动进行分析。8、流式细胞术分离获得不同组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC,RT-PCR检测STAT3的表达水平。研究结果一、129X1/Sv J小鼠在长期烟雾暴露后的骨折愈合表型较贴近临床长期吸烟者1、吸烟组小鼠体重明显低于同期对照组小鼠,该现象在C57BL/6J和129X1/Sv J较显着;吸烟组小鼠血常规分析表明白细胞数量明显升高;吸烟组小鼠血浆可替宁浓度明显升高,CRP浓度无明显变化,大量促炎因子浓度升高或趋向升高,系统性炎症反应增强;该模型与长期吸烟者的临床特征具有相似性。2、典型X线图像显示129X1/Sv J的吸烟组小鼠样本中,骨痂量少、桥接较差,且骨折线清晰;RUST评分发现129X1/Sv J小鼠吸烟组评分明显低于对照组。Micro-CT图像显示吸烟组骨折端存在广泛的松质骨,而对照组骨折端主要为紧实的密质骨,BMD明显下降,三种品系小鼠的吸烟组较对照组均表现出明显的骨痂重塑延迟。生物力学特性分析表明三种品系小鼠吸烟组在抗弯强度和抗扭强度上均弱于对照组,而最大扭矩上只有129X1/Sv J表现出显着的下降。二、长期吸烟导致骨折术后早期炎症反应增强,抑制SSC/BCSP扩增,破坏软骨形成1、骨折术后7天的骨痂H&E显示吸烟组与对照组的骨痂面积并无明显差异,而番红O染色表明吸烟组软骨骨痂的面积及其在骨痂的百分比均明显下降。2、吸烟组小鼠术后7天骨痂内SSC和BCSP的数量均显着少于对照组。3、多重免疫荧光染色结果表明,吸烟组样本骨痂内共表达荧光（Ki67+CD105+）的面积占骨痂面积的百分比明显低于对照组,说明吸烟组样本较对照组样本骨痂内处于增殖状态的BCSP细胞数目明显减少。4、吸烟组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC增殖受到明显抑制。5、分离自吸烟组和对照组小鼠完整股骨的SSC在体外增殖能力上无明显差异。6、对吸烟组和对照组骨愈合早期血肿内32种炎症因子的浓度分析发现,在两个时间点,吸烟组小鼠相比于其对照组均出现大量促炎因子的浓度上升,少量抗炎因子的浓度出现下降。在术后6小时吸烟组中趋化因子MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、MCP-1、RANTES、KC、LIX和细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL6、IL-9、IL-15、TNF-α的浓度明显上升,细胞因子VEGF-A和G-CSF的浓度明显下降;在术后24小时吸烟组中趋化因子MIP-1α、MIP-2、MCP-1、KC、IP-10、LIX和细胞因子IL-1α、IL-6、IL9、IL-12p40、IL-15、IFN-γ的浓度明显上升,趋化因子G-CSF和细胞因子LIF、VEGF-A及IL-13的浓度明显下降。对骨折术后6小时血肿内的免疫细胞分析显示,吸烟组小鼠较对照组小鼠骨折术后6小时血肿样本内的主要变化为中性粒细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞的数量显着升高,且中性粒细胞、B细胞和T细胞的比例显着升高,而单核细胞的比例下降。7、培养于CS-Hematoma环境中的SSC增殖活动弱于培养于NS-Hematoma环境中的SSC。三、IL-6 Trans信号通路激活,上调STAT3是长期吸烟抑制骨折早期骨骼干细胞增殖的分子机制1、IL-6 Trans信号通路对SSC增殖具有调控作用:IL-6 Trans信号通路选择性抑制改善了SSC体外增殖潜能。2、STAT3基因对SSC增殖具有调控作用:（1）吸烟组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达水平显着高于对照组。（2）相比于培养于NS-Hematoma环境中,培养于CS-Hematoma环境的SSC中的STAT3基因的表达明显升高。（3）STAT3特异性抑制后,SSC体外增殖能力明显升高,表明STAT3的表达对SSC的增殖具有调控作用。3、IL-6 Trans信号通路能调控STAT3的表达:在选择性抑制IL-6 Trans信号通路后,同样培养于CS-Hematoma环境的SSC中STAT3基因表达出现显着下降。4、IL-6 Trans信号通路选择性抑制能改善因长期吸烟所致的骨折愈合不良:X线显示,CS+sgp130Fc组有明显骨痂生成与桥接、骨折线较模糊,RUST评分较CS组显着提高;Micro-CT显示,CS+sgp130Fc组比CS组骨折周围松质骨痂体积少,骨痂内骨小梁数目较吸烟组少,且结构更有序,骨折愈合进程明显加快。生物力学显示,CS+sgp130Fc组较CS组抗弯强度、抗扭强度及最大扭矩均显着升高。5、CS+sgp130Fc组样本新生软骨面积和新生软骨占骨痂总面积的百分比均明显高于CS组样本,少于NS组样本。6、在骨折术后7天的骨痂内,NS组SSC和BCSP的数目均显着高于另外两组,CS+sgp130Fc组BCSP的数量显着高于CS组,SSC的数量较CS组呈增多趋势,但未达到统计学差异。三组在骨折后3天骨痂内BCSP的增殖活动上未见明显差异,但在SSC的增殖活动方面,CS+sgp130Fc组虽然弱于NS组,但显着强于CS组。7、CS+sgp130Fc组小鼠骨折术后3天骨痂内SSC中STAT3的表达显着低于CS组,高于NS组。研究结论1、本研究通过构建并比较三种品系小鼠长期吸烟作用下骨折愈合模型,发现129X1/Sv J小鼠骨折愈合情况接近长期吸烟者骨折愈合表型,适合用来构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型。2、借助129X1/Sv J小鼠长期吸烟骨折模型,首次揭示了长期吸烟在骨折愈合早期的抑制作用,报道了该阶段关键的细胞学和分子学改变:长期吸烟能够增强骨折愈合早期局部炎症环境,抑制SSC的增殖活动,导致SSC和BCSP在骨痂内扩增不足,可能是引起软骨形成障碍和最终骨折愈合不良的原因。3、通过体外细胞实验,发现IL-6 Trans信号通路是长期吸烟作用下骨折愈合早期局部环境中调节SSC功能的关键分子通路,该通路受到长期吸烟作用而激活,上调SSC中STAT3的表达水平,抑制SSC的增殖活动。在动物实验中,选择性抑制IL-6 Trans信号通路后,吸烟小鼠骨折愈合早期SSC中STAT3表达降低,增殖活动增强,SSC和BCSP在骨痂内扩增增强,软骨形成部分恢复,骨折愈合的质量明显改善。该部分体内、外实验为解释长期吸烟所致骨折愈合不良提供了可能的分子生物学机制,也为未来的进一步研究和临床干预提供了潜在靶点。
黎攀[8]（2021）在《白茶对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺病的作用研究》文中指出慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary,COPD）是一种由于大量接触有害颗粒或气体引起的呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,吸烟可以显着增加其患病风险。并且认为COPD的主要发病机制包括炎症反应、氧化应激与蛋白酶过表达。目前从抗氧化和抗炎的天然产物中寻找用于预防与改善COPD等慢性病的药物已成为研究热点。本文通过烟熏法建立小鼠COPD模型,测定肺组织病理学变化和各样品的生化指标,研究白茶提取物对小鼠COPD的改善效果和作用机制。主要研究结果如下:1.对福鼎白毫银针、白牡丹与寿眉提取物进行了主要理化成分与体外抗氧化活性测定。三个白茶提取物的茶多酚、黄酮、咖啡碱与氨基酸含量较高,体外抗氧化活性强。但是三种提取物因活性成分含量与组成的差异,在体外抗氧化方面表现出一定的差异,其中YZ提取物抗氧化活性最高,对DPPH清除率的IC50仅需14.15μg·ml-1。2.试验表明,三种白茶提取物和EGCG均可显着改善COPD小鼠肺泡、肺间质与气管的病理损伤,尤其对抑制炎性浸润和肺气肿效果显着;其次,可显着下调模型组炎症因子IL-6和TNF-α水平。三种白茶提取物对COPD小鼠肺组织病理学与炎症反应的改善效果有所差异,MD与YZ提取物效果最好。3.在安全剂量范围内,白茶提取物和EGCG处理能显着降低COPD小鼠MDA含量与MPO活性,上调SOD活性,调节NO异常,并且呈现出显着的肝保护作用,其可能的机制是上调AMPK磷酸化水平。综上所述,白茶提取物能够明显改善COPD小鼠的氧化应激、炎症反应和调节NO异常。
于多[9]（2020）在《基于NF-κB通路探讨异甘草素抗炎与抗肿瘤双重作用及其机制的研究》文中提出炎症反应与肿瘤的发生发展密不可分,炎症过程是肿瘤发生发展的诱因,当炎症反应不可控制发展成为慢性过程时,可以诱发周围组织恶性生长并形成肿瘤。免疫应答可以促发抗肿瘤的保护性反应,但同时也通过直接或间接作用参与肿瘤血管新生和肿瘤细胞生长、侵袭的转移。核转录因子NF-κB在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中起关键作用,NF-κB的错误调节与慢性炎症以及多种恶性肿瘤的发生有关,同时NF-κB通路激活与促活相关。异甘草素（Isoliquiritigenin,ILG）是从中药甘草的根茎中提取出的一种黄酮类化合物,具有多种生物学效应和药理学活性。研究表明ILG可以抗炎、抗氧化应激,且能抑制肿瘤细胞的增殖、迁移,并促进肿瘤细胞凋亡,但其作用机制以及是否对肺部炎症和肺部恶性肿瘤具有同样作用并不明确,此外NF-κB是否为ILG抗炎、抗肿瘤的效应通路仍有待于探索。研究目的:炎症与肿瘤发生发展的关系越来越受到关注,合并炎症反应的肺癌给临床治疗更加了难度。本研究旨在观察ILG是否能够双向调控肺部慢性炎症与肺恶性肿瘤,明确NF-κB以及PI3K/AKT和Nrf2/HO-1信号通路相关基因在其中的调控作用,阐明ILG通过NF-κB通路发挥抗炎与抗肿瘤双重作用。为肺部炎症和肺癌的临床治疗以及新药物研发提供科学依据。研究方法:一、异甘草素抗COPD炎症反应的作用COPD是是由于肺部异常炎症反应和氧化应激引起的常见慢性病,通过构建COPD模型阐明异甘草素的抗炎机制。通过自制烟雾暴露装置,给予C57BL/6小鼠每日烟雾暴露处理1小时,经过12周烟雾处理后构建COPD小鼠模型,分别给予10、20、30mg/kg ILG,采用HE染色法、小鼠肺湿/干比观察小鼠肺部炎症及水肿情况;通过测定小鼠肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性及丙二醛（MDA）含量,计数小鼠支气管肺泡灌洗液中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,以及检测支气管肺泡灌洗液中炎性因子TNF-α和IL-1?,了解ILG对COPD模型小鼠的抗氧化应激和炎性反应的改善作用;采用Real time-PCR法和Western Blot法检测肺组织NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路相关基因的表达水平,明确NF-κB和Nrf2/HO-1信号通路在ILG对COPD保护效应中的调控作用。二、异甘草素抑制肺癌的作用体外实验:使用RPMI 1640培养基培养A549细胞,给予不同剂量的ILG。采用MTT法测定A549细胞活力;利用流式细胞术检测细胞凋亡率,通过Real time-PCR和Western Blot法测定A549细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的表达变化;采用Transwell法测定A549细胞的迁移能力,采用Real time-PCR和Western Blot法检测A549细胞炎性和迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9和COX-2的表达水平,明确ILG对A549细胞凋亡、迁移和炎性反应的影响。采用Western Blot法检测A549细胞NF-κB和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达水平,阐明NF-κB和PI3K/AKT信号通路在ILG抑制A549细胞中的调控作用。体内实验:利用BALB/c裸鼠构建A549移植瘤建模,随机分为空白对照组（NC）,肿瘤模型组（TC）,ILG低剂量组（ILG-L）,ILG高剂量组（ILG-H）,通过对肿瘤大小、体重及脏器系数的检测分析ILG对A549移植瘤小鼠的抑瘤作用;采用ELISA法检测荷瘤小鼠血清肿瘤标志物CEA、NSE、CA125、SCC水平;通过Real time-PCR和Western Blot法检测小鼠肿瘤组织凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 8及Caspase 9 mRNA和蛋白表达水平,观察ILG对荷瘤小鼠移植瘤细胞凋亡的影响。采用Real time-PCR和Western Blot法测定小鼠肿瘤组织炎性和迁移相关基因MMP-2、MMP-9及COX-2mRNA和蛋白表达水平,明确ILG对荷瘤小鼠肿瘤细胞迁移和炎性反应的影响;采用Western Blot法检测NF-κB和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达水平,进一步验证NF-κB和PI3K/AKT信号通路在ILG抑制A549细胞中的调控作用。研究结果:一、异甘草素抗COPD炎症反应的作用1.构建吸烟引起COPD小鼠模型,给予不同组小鼠10、20、30mg/kg ILG,小鼠的肺湿/干比测量结果显示,COPD模型小鼠的肺水肿程度明显高于对照组小鼠（P<0.05）,随着ILG剂量的小鼠肺部水肿明显改善（P<0.05）。小鼠肺部病理学结果显示吸烟可以诱发小鼠肺部COPD典型的炎性改变,并随着ILG剂量的增加,小鼠肺部炎性改变明显减轻。2.对小鼠肺部组织中MPO和MDA含量检测结果显示,吸烟可导致小鼠肺组织MPO和MDA含量显着增加,COPD模型小鼠肺组织MPO和MDA含量明显高于对照组（P<0.05）,随着ILG剂量的增加MPO与MDA含量下降（P<0.05）。3.COPD小鼠BALF中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数显着增加（P<0.05）,ILG的使用可减少小鼠BALF中总细胞数、中性粒细胞数和巨噬细胞数,且随着ILG剂量的增加细胞数下降明显（P<0.05）。COPD小鼠BALF中炎性因子TNF-α和IL-1?含量明显增加（P<0.05）,ILG的使用可使两种炎性因子含量明显下降,且随着ILG使用浓度增加表达量逐步降低（P<0.05）。4.对炎性和氧化应激相关通路NF-κB相关基因表达检测结果显示,COPD小鼠肺组织p-p65,p-IκB被激活,表达明显高于对照组（P<0.05）,而ILG能够显着抑制p-p65,p-IκB蛋白的表达,阻遏了NF-κB通路,且随着ILG剂量的增加,抑制作用增强（P<0.05）。5.Nrf2是抑制NF-κB的关键蛋白,COPD小鼠肺组织Nrf2和HO-1表达含量均明显增高,ILG的使用增加了Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,且随着ILG剂量的增加两种基因和蛋白的表达量显着增加（P<0.05）。ILG可能通过影响NF-κB与Nrf2/HO-1通路进而调控COPD小鼠的炎性反应和氧化应激反应,Nrf2/HO-1通路可能会协助增加ILG对NF-κB的阻遏效果。二、异甘草素抑制肺癌的作用1.体外实验（1）随着ILG浓度的增加及作用时间的延长,A549细胞存活率逐渐降低（P<0.05）,在24h和48h,ILG对A549细胞的IC50分别为16.7μM和14.6μM。因此,后续实验采用药物浓度为4μM、8μM和16μM。（2）A549细胞经不同浓度ILG作用24 h后,随着ILG给药浓度的增加,A549细胞凋亡率显着增加（P<0.05）;促凋亡基因Bax mRNA和蛋白的表达水平显着升高（P<0.05）,抗凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显着下降（P<0.05）;Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的活化程度逐渐增强,mRNA表达水平显着升高（P<0.05）。（3）A549细胞经不同浓度ILG作用24 h后,随着ILG给药浓度的增加,A549细胞迁移能力显着降低（P<0.05）;MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量均显着低于空白对照组（P<0.05）,且随着给药剂量的增加,MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量逐渐降低。（4）A549细胞经8μM和16μM ILG作用24 h后,NF-κB信号通路和PI3K/AKT信号通路被抑制,且呈浓度依赖性。2.体内实验（1）不同浓度剂量的ILG药物治疗组小鼠肿瘤体积均小于TC组,且ILG高剂量组肿瘤体积显着小于低剂量组（P<0.05）。（2）与肿瘤模型组相比,Caspase 3、Caspase 8和Caspase 9的蛋白和mRNA表达水平在ILG给药组中均显着升高（P<0.05）。（3）ILG给药组MMP-2、MMP-9和COX-2 mRNA和蛋白表达量显着低于TC组（P<0.05）,且高剂量ILG对MMP-2、MMP-9和COX-2表达的抑制效果更强。（4）较之与TC组,ILG的使用降低了小鼠肿瘤组织中的p-IκB及p-p65的表达,抑制了NF-κB通路的激活;同时随着ILG剂量的增多,抑制作用明显上升（P<0.05）。ILG的使用也降低了小鼠肿瘤组织中AKT和PI3K的磷酸化水平,且具有浓度依赖性（P<0.05）。（5）TC组相较于NC组小鼠血清肿瘤标志物NSE和CA125显着上升（P<0.05）,而不同剂量ILG给药后,血清NSE和CA125水平较TC组明显下降（P<0.05）。结论:1.异甘草素可能通过调节NF-κB和Nrf2/HO-1在COPD小鼠肺部炎症模型中起到抗炎作用。2.异甘草素可能通过NF-κB和PI3K/AKT通路发挥抗肿瘤效应。3.异甘草素作用靶标可能是NF-κB相关分子,其可能发挥抗炎、抑制肿瘤细胞存活的双重作用。虽然初步发现下游机制有所不同,但是具体机制还需要进一步研究。综上实验结果,进一步支持作为中药提取物的异甘草素可能作为一种抗肿瘤药物或辅助药物的可能。
关雪娃[10]（2020）在《中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究》文中提出慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是以持续气流受限为特征的进行性炎症加重疾病,目前居疾病死亡原因第三位。COPD的急性加重（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是导致COPD患者死亡的主要原因,具体临床症状表现为脓样痰液增加、呼吸困难、咳嗽及喘息等。呼吸道感染能够引起AECOPD的发生,主要包括病毒和细菌感染,其中细菌感染占AECOPD发病原因的50%左右。从AECOPD患者下呼吸道分离出的细菌包括不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable haemophilus infuenza,NTHi）、卡他莫拉菌、肺炎链球菌和铜绿假单胞菌等,其中NTHi是COPD患者痰液中最常见的细菌。因此,明确NTHi诱导AECOPD的发生机制有助于深入了解疾病进程并进行有效干预。中性粒细胞是机体抵抗外源性感染的重要防线,在趋化因子的募集作用下能够迅速迁移至感染部位发挥吞噬作用。但过量的中性粒细胞聚集会导致中性粒细胞弹性蛋白酶、金属蛋白酶以及氧化活性物质的过度分泌,进而引起局部组织损伤。中性粒细胞伪足的形成及细胞骨架肌动蛋白的重塑对细胞迁移发挥重要作用,这一过程受磷脂酰肌醇（PtdIns）3-激酶（phosphatidylinositol（PtdIns）3–kinases,PI3K）信号通路的主要调节。化学趋化剂（如N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸,fMLP）刺激后,中性粒细胞表面G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）被激活,Gβγ亚基解离并激活PI3K,磷酸化下游效应因子蛋白激酶B（protein kinase B,AKT）,促进F-肌动蛋白（F-actin）极化聚集在细胞边缘伪足区域,进而参与中性粒细胞的迁移。中性粒细胞被认为是COPD患者气道中最常见的炎症细胞之一,气道中性粒细胞的增多与NTHi感染密切相关。临床上将外周血中性粒细胞绝对值>7.5×109/L定义为中性粒细胞增多症。NTHi通过感染内皮细胞,产生一系列的炎症因子和趋化因子（如（interleukin,IL）-1β、IL-8等）,募集大量中性粒细胞迁移至气道,而气道中性粒细胞的过度迁移则会导致患者肺功能下降与气道功能障碍。因此,深入探讨中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD发生中的作用,抑制中性粒细胞迁移从而降低气道炎症是预防治疗AECOPD疾病的关键性科学问题。目前,AECOPD的临床治疗包括吸入性支气管扩张剂、皮质类固醇及抗生素等,但受机体不良反应及耐药性的限制,并不能有效控制疾病的发展,因此,迫切需要安全有效的新型AECOPD治疗药物。有研究显示,人参等植物源药物具有抗炎作用,且无明显副作用,其主要活性成分为人参皂苷。目前从人参中已鉴定出100余种单体,其中人参皂苷Rg3单体具有多种药理活性,如抗炎、抗肿瘤和抗疲劳等。近来研究发现人参皂苷Rg3具有治疗呼吸道疾病的作用,如:人参皂苷Rg3可以通过调节癌细胞岩藻糖基化以及p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）和核转录因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路,抑制上皮-间质转化和肺癌的侵袭;人参皂苷Rg3能够抑制NF-κB的活性并减少相应炎症细胞因子的分泌;人参皂苷Rg3通过调节PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路可减轻脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱发的急性肺损伤。综上,本文的研究目的是基于NTHi诱导的AECOPD模型,探讨中性粒细胞在AECOPD发生中的作用,明确人参皂苷Rg3能否通过抑制中性粒细胞的迁移进而调节气道炎症,从而对AECOPD起到治疗作用,并基于超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）的代谢组学方法初步探讨人参皂苷Rg3对AECOPD小鼠内源性代谢物和相关代谢途径的作用机制。一、NTHi诱导小鼠AECOPD的发生方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为4组（n=16）,正常对照（Normal Control,NC）组,不可分型流感嗜血杆菌（NTHi）感染组,香烟烟雾（Cigarette Smoke,CS）组和联合作用（NTHi+CS）组。其中CS和NTHi+CS组应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,NC和NTHi组暴露于正常空气。于第14周末,NTHi和NTHi+CS组小鼠滴鼻接种NTHi,NC和CS组滴入等量生理盐水。24 h后将各组小鼠麻醉固定。肺功能仪检测小鼠肺功能损伤情况,苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色观察小鼠肺组织结构变化,细胞迪夫染色法和流式细胞术分析小鼠支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中性粒细胞细胞及巨噬细胞数量和比例,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测小鼠BALF中炎症因子的含量。结果:与NC组相比,NTHi组小鼠第0.1秒用力呼气量/用力肺活量（forced expiratory volume in 100 ms/forced vital capacity,FEV0.1/FVC）下降,气道发生中性粒细胞浸润。CS组小鼠经14周香烟烟雾暴露后,体重显着下降,肺功能残气量（functional residual capacity,FRC）和气道阻力（airway resistance,RI）增加,FEV0.1/FVC和肺动态顺应性（dynamic compliance,Cydn）下降,肺组织结构损伤,平均肺泡截距增加,小鼠BALF中炎症细胞增多,IL-6和Keratinocyte–derived细胞因子（KC,同人源IL-8）表达增多。当NTHi接种烟雾暴露的小鼠后,上述症状加重,小鼠体重下降,Cydn显着低于CS组,RI和平均肺泡截距显着高于CS组,BALF里中性粒细胞及巨噬细胞数量增多,IL-6和KC分泌升高,且差异具有统计学意义。二、中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD中的作用方法:首先将分离纯化的中性粒细胞与人支气管上皮细胞（BEAS-2B）培养,建立中性粒细胞跨气道上皮细胞迁移模型,分为NC组,NTHi组,CS组和NTHi+CS组,依次用NTHi和香烟烟雾刺激BEAS-2B细胞。ELISA法检测细胞上清液中IL-6和IL-8的含量。迪夫染色法观察中性粒细胞的迁移数量和形态。随后NTHi及香烟烟雾直接刺激中性粒细胞,分为NC组、NTHi组、CS组和NTHi+CS组,ELISA法检测中性粒细胞脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PtdIns（4,5）P2,PIP2）和磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PtdIns（3,4,5）P3,PIP3）的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布和表达。结果:与NC组相比,NTHi和香烟烟雾刺激气道上皮细胞后,NTHi组和CS组上清液中炎性细胞因子IL-6和IL-8的含量显着升高,中性粒细胞跨上皮细胞迁移数量增多,且NTHi+CS组IL-6和IL-8的表达及中性粒细胞迁移数量显着高于CS组。NTHi和香烟烟雾刺激中性粒细胞后,与NC组相比,模型组中性粒细胞PI3K信号通路被激活,相关信号分子表达显着变化,PIP3及AKT蛋白磷酸化水平显着增加,F-actin蛋白发生极化表达,且NTHi+CS组变化最为显着。三、人参皂苷Rg3对AECOPD以中性粒细胞增多为特征的炎症反应的预防治疗作用1.人参皂苷Rg3对NTHi诱导的AECOPD模型小鼠的影响方法:将8周龄雌性BALB/C小鼠随机分为9组（n=16）:NC组,CS组,低、中、高浓度Rg3干预CS（CS+10 mg/kg Rg3、CS+20 mg/kg Rg3和CS+40mg/kg Rg3）组,NTHi+CS组,低、中、高浓度Rg3干预NTHi+CS（NTHi+CS+10mg/kg Rg3、NTHi+CS+20 mg/kg Rg3和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3）组。应用14周香烟烟雾鼻部暴露法建立小鼠COPD模型,于第12周开始,每天进行人参皂苷Rg3灌胃给药治疗,于第14周末进行NTHi滴鼻接种。应用小动物肺功能仪检测各组小鼠肺功能指标,HE染色观察肺组织结构变化,流式细胞术分析BALF中中性粒细胞比例,ELISA法检测小鼠BALF中炎性因子IL-6和KC的含量。结果:与模型组相比,高浓度Rg3可显着增加模型组小鼠体重,中、高浓度Rg3可改善CS组和NTHi+CS组的各项肺功能指标,减少肺部病理损伤,降低小鼠BALF中炎症细胞的浸润,中性粒细胞比例以及IL-6、IL-8的含量,结果与CS组和NTHi+CS组相比具有统计学差异。2.人参皂苷Rg3对中性粒细胞迁移的抑制作用及机制研究方法:人参皂苷Rg3作用于人外周血分离纯化的中性粒细胞,将细胞分为6组:NC组,fMLP阳性对照（fMLP）组,Rg3低、中、高浓度药物（fMLP+Rg3（10μM）、fMLP+Rg3（20μM）、fMLP+Rg3（40μM））组和抑制剂（LY294002）组。在中性粒细胞跨上皮细胞（BEAS-2B）迁移模型的基础上,检测各浓度药物对中性粒细胞迁移数量的影响。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别先后作用于各组中性粒细胞,ELISA法检测细胞脂质PIP2和PIP3的含量,Western blot法检测PI3K信号通路相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测中性粒细胞内F-actin的蛋白分布及表达水平。结果:与未加药物空白对照组相比,各浓度药物组中性粒细胞跨上皮细胞迁移的数量均显着减少。将fMLP、人参皂苷Rg3以及LY294002分别作用于各组中性粒细胞后发现,与NC组相比,fMLP组PI3K通路相关信号分子PIP2的含量显着降低,PIP3的含量显着增高,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显着增加,F-actin蛋白极化表达。与fMLP组相比,各浓度Rg3组均在一定程度上抑制了PI3K相关信号分子表达,其中40μM Rg3组PIP3的含量显着降低,PI3K及AKT蛋白磷酸化水平显着降低,F-actin蛋白极化表达降低,均匀分布于整个细胞质,结果与LY294002组结果相似。3.人参皂苷Rg3对AECOPD模型小鼠的代谢组学影响的研究方法:收集上述NC组,NTHi+CS组和NTHi+CS+40 mg/kg Rg3组小鼠尿液,并命名为NC组,AECOPD组和Rg3组（n=6）。应用UPLC-QTOF-MS对样本进行检测,应用MassLynx V4.1工作站进行数据采集分析。结果:与NC组相比,AECOPD模型组小鼠尿液中许多内源性代谢物含量发生了明显改变,人参皂苷Rg3干预可显着回调L-色氨酸、花生四烯酸、亚油酸、白细胞三烯A4、核黄素和皮质醇等19种内源性代谢物水平,推测人参皂苷Rg3通过干预亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径而发挥对AECOPD的保护作用。结论:1.NTHi感染联合香烟烟雾刺激建立的AECOPD模型,特点为中性粒细胞迁移引起的以中性粒细胞浸润为主的气道炎症。2.AECOPD发生的可能机制为AKT磷酸化引起的PI3K相关分子信号通路激活,引起中性粒细胞迁移。3.人参皂苷Rg3通过抑制中性粒细胞内PI3K信号通路的活化,从而抑制中性粒细胞迁移,减少炎症的发生,对AECOPD发生具有一定程度的预防作用。4.人参皂苷Rg3对AECOPD发生的预防作用,与其调节亚油酸代谢、核黄素代谢、花生四烯酸代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成和鞘脂代谢等6条代谢途径有关。创新性:1.本文发现了PI3K信号通路的激活是NTHi感染联合烟雾刺激引起AECOPD中性粒细胞迁移浸润增多的主要机制,提示PI3K可能是AECOPD的治疗靶点之一。2.本文发现了人参皂苷Rg3能够通过抑制中性粒细胞PI3K信号通路的激活,从而减轻AECOPD中性粒细胞增多引起的炎症反应,提示人参皂苷Rg3具有开发为防治AECOPD药物的潜力。
二、香烟烟雾溶液对人淋巴细胞的损伤及修复（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、香烟烟雾溶液对人淋巴细胞的损伤及修复（论文提纲范文）
（1）PPARγ参与有氧运动调控chemerin改善COPD膈肌功能障碍的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 1.研究背景 |
| 2.研究目的意义 |
| 3.研究内容 |
| 文献综述 |
| 1.Chemerin及其受体 |
| 2.Chemerin与 COPD炎症反应 |
| 2.1 COPD肺内外的炎症反应 |
| 2.2 Chemerin对 COPD炎症的双向作用 |
| 2.3 Chemerin对 COPD相关炎症的影响 |
| 3.Chemerin与 COPD糖脂代谢 |
| 3.1 COPD糖脂代谢异常 |
| 3.2 chemerin调节COPD糖脂代谢 |
| 4.运动调控机体chemerin与运动防治COPD |
| 4.1 慢性阻塞性肺病的炎症与代谢异常 |
| 4.2 PPARγ-运动调节的chemerin的潜在机制 |
| 5.小结 |
| 第一部分 运动对 COPD大鼠膈肌功能障碍和对 PPARγ-chemerin/CMKLR1 通路及其下游炎性因子的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 技术路线图 |
| 2.3 实验对象 |
| 2.4 实验分组 |
| 2.5 模型建立方案 |
| 2.6 运动干预 |
| 2.7 大鼠体重 |
| 2.8 肺功能检测 |
| 2.9 膈肌离体肌力检测 |
| 2.10 取材 |
| 2.11 肺与膈肌组织学检测 |
| 2.12 Western blot |
| 2.12.1 蛋白抽提 |
| 2.12.2 蛋白浓度测定 |
| 2.12.3 Western blot蛋白免疫印迹 |
| 2.13 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 CSE与运动训练影响大鼠体重 |
| 3.2 运动训练提升COPD大鼠肺功能 |
| 3.3 有氧运动提升大鼠膈肌功能 |
| 3.4 运动训练对COPD大鼠肺结构影响不明显 |
| 3.5 有氧运动影响COPD大鼠膈肌结构 |
| 3.6 运动影响膈肌PPARγ、chemerin/CMKLR1 的表达 |
| 3.7 运动抑制大鼠膈肌炎症因子的表达 |
| 3.8 运动调节大鼠膈肌降解与生长水平失衡 |
| 4.讨论分析 |
| 4.1 CSE及运动训练对COPD大鼠体重的影响 |
| 4.2 运动训练对COPD大鼠肺功能的影响 |
| 4.3 运动训练对COPD大鼠膈肌功能障碍的影响 |
| 4.4 运动训练对COPD大鼠肺与膈肌结构的影响 |
| 4.5 运动训练对COPD大鼠膈肌PPARγ-chemerin/CMKLR1 信号的影响 |
| 4.6 运动训练对COPD大鼠膈肌炎症因子的影响 |
| 4.7 运动训练对COPD大鼠膈肌泛素E3 连接酶的影响。 |
| 5.结论 |
| 第二部分 机械牵拉对LPS诱导炎症环境下L6细胞增殖水平及PPARγ-chemerin/CMKLR1通路及下游因子的影响 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 技术路线图 |
| 2.3 实验对象 |
| 2.4 细胞冻存和复苏 |
| 2.5 适宜LPS浓度诱导L6 成肌细胞炎症环境下培养 |
| 2.6 细胞牵拉 |
| 2.7 CCK-8 检测细胞增殖水平 |
| 2.8 Western blot |
| 2.8.1 蛋白抽提 |
| 2.8.2 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.8.3 Western blot蛋白免疫印迹 |
| 2.9 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同浓度LPS对L6 细胞增殖水平的影响 |
| 3.2 机械牵拉促进炎症环境中L6 细胞增殖水平 |
| 3.3 机械牵拉影响PPARγ、chemerin/CMKLR1 信号表达 |
| 3.4 机械牵拉抑制L6 细胞促炎症因子的表达 |
| 3.5 机械牵拉影响L6 细胞蛋白降解与细胞激活情况 |
| 4.分析与讨论 |
| 4.1 LPS对L6 细胞增殖的影响 |
| 4.2 机械牵拉应力对LPS环境中L6 细胞活性的影响 |
| 4.3 机械牵拉对LPS刺激下L6 细胞PPARγ、chemerin/CMKLR1 表达的影响 |
| 4.4 机械牵拉对LPS刺激下L6 成肌细胞炎症水平的影响 |
| 4.5 机械牵拉对LPS刺激下L6 细胞蛋白降解与激活的影响 |
| 5.结论 |
| 第三部分 PPARγ在机械牵拉调控chemerin/CMKLR1 信号促LPS诱导炎症环境下L6 细胞增殖中的作用 |
| 1.引言 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 主要仪器及试剂 |
| 2.1.1 主要仪器 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配置 |
| 2.2 技术路线图 |
| 2.3 LPS诱导L6 细胞炎症培养环境 |
| 2.4 不同浓度GW9662 和罗格列酮对LPS环境中L6 细胞活性的影响 |
| 2.5 实验对象及分组 |
| 2.6 细胞牵拉 |
| 2.7 CCK-8 检测细胞增殖水平 |
| 2.8 Western blot |
| 2.9 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 不同浓度GW9662 和罗格列酮对L6 细胞活性的影响 |
| 3.2 调控PPARγ的表达影响机械牵拉促炎症环境下L6 细胞增殖的作用 |
| 3.3 调控PPARγ表达影响细胞机械牵拉后chemerin/CMKLR1 信号表达 |
| 3.4 调控PPARγ表达影响细胞机械牵拉后炎症因子表达 |
| 3.5 调控PPARγ表达影响细胞机械牵拉后细胞降解与激活 |
| 4.分析与讨论 |
| 4.1 PPARγ对细胞增殖活性的影响 |
| 4.2 抑制或激活PPARγ后机械牵拉对细胞增殖活性的影响 |
| 4.3 抑制或激活PPARγ后机械牵拉对细胞PPARγ、chemerin/CMKLR1 蛋白表达的影响 |
| 4.4 抑制或激活PPARγ后机械牵拉对LPS环境下细胞炎症因子的影响 |
| 4.5 抑制或上调PPARγ后机械牵拉对肌蛋白降解、成肌细胞激活的影响 |
| 5.结论 |
| 全文总结 |
| 1.主要结论 |
| 2.研究创新点 |
| 3.研究不足及展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 大学本科至研究生学习经历 |
| 攻读博士学位期间学术科研成果及获奖情况 |
（2）健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 慢性阻塞性肺疾病研究背景 |
| 第二节 慢性阻塞性肺疾病防治策略 |
| 一、慢性阻塞性肺疾病早期干预 |
| 二、中医药防治慢性阻塞性肺疾病作用机制研究 |
| 三、健脾益肺Ⅱ号防治慢性阻塞性肺疾病前期基础 |
| 第三节 慢性阻塞性肺疾病急性加重与呼吸道病毒感染的关系 |
| 一、呼吸道病毒感染在诱发慢阻肺急性加重过程中的免疫病理改变 |
| 二、吸烟对呼吸道病毒感染后宿主免疫应答的影响 |
| 第四节 气道炎症反应在慢性阻塞性肺疾病急性加重中的作用 |
| 一、慢阻肺炎症反应过程中的免疫细胞 |
| 二、炎症反应过程中的炎症介质 |
| 第五节 慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型的研究概况 |
| 一、病毒及其模拟物致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 二、细菌感染致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 三、熏烟联合LPS致慢性阻塞性肺疾病急性加重动物模型 |
| 第二章 健脾益肺Ⅱ号干预治疗COPD Ⅰ-Ⅱ级患者探索性临床研究 |
| 一、研究目标 |
| 二、研究对象 |
| 三、治疗方案 |
| 四、数据管理 |
| 五、统计分析 |
| 六、研究结果 |
| 七、讨论 |
| 第三章 健脾益肺Ⅱ号减少熏烟联合流感病毒感染小鼠肺部炎症的主要环节和作用机制 |
| 第一节 香烟暴露对低剂量流感病毒诱导的气道炎症的影响 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第二节 健脾益肺Ⅱ号方对香烟暴露、低剂量流感病毒感染及二者联合诱导的气道免疫细胞的影响 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 第三节 熏烟期间给药对熏烟联合低剂量流感病毒感染小鼠持续预防作用的研究 |
| 一、实验仪器及材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 结语 |
| 一、研究总结 |
| 二、研究创新点 |
| 三、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况、参与课题与获奖情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）香烟烟雾诱导慢性阻塞性肺病的发生和向肺癌转化的作用及白头翁皂苷B4的干预机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 文献综述 慢性阻塞性肺病的发病机制及其向肺癌转化的研究进展 |
| 第一部分 白头翁皂苷B4对慢性阻塞性肺病小鼠的药效及作用机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 慢性阻塞性肺病小鼠模型的建立及分组给药 |
| 2.2 形态学观察 |
| 2.3 肺功能测定 |
| 2.4 COPD小鼠支气管肺泡灌洗液BALF中炎性因子的测定 |
| 2.5 HE染色观察小鼠肺组织病理形态学变化及支气管上皮化生的影响 |
| 2.6 RT-PCR测定COPD小鼠肺组织中相关炎性因子mRNA的表达 |
| 2.7 肺组织中氧化应激指标MPO、MDA、GSH-PX酶活性检测 |
| 2.8 免疫组织化学法测定肺组织中相关癌变蛋白表达 |
| 2.9 Western Blot检测小鼠肺组织中癌变相关蛋白Dnmt1、CDKN2A/P16、FHIT蛋白的表达 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 白头翁皂苷B4对COPD小鼠形态学及体重的影响 |
| 3.2 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺功能的影响 |
| 3.3 白头翁皂苷B4对COPD小鼠支气管肺泡灌洗液BALF中炎性因子表达水平的影响 |
| 3.4 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺组织病理形态学的影响 |
| 3.5 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺支气管上皮增生的影响 |
| 3.6 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺组织中相关基因表达水平的影响 |
| 3.7 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺组织中氧化应激指标MPO、MDA、GSH-PX酶活力的影响 |
| 3.8 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺组织中癌变相关蛋白P53、Ki67、hnRNPA2/B1 表达水平的影响 |
| 3.9 白头翁皂苷B4对COPD小鼠肺组织中甲基化相关蛋白Dnmt1、P16、FHIT表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 白头翁皂苷B4对香烟烟雾提取物CSE诱导的人支气管上皮细胞16HBE的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药物及配制 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 人支气管上皮细胞16HBE的培养 |
| 2.2 香烟烟雾提取物CSE的制备 |
| 2.3 CSE对16HBE细胞活力的影响 |
| 2.4 白头翁皂苷B4对16HBE细胞活力的影响 |
| 2.5 地塞米松(DEX)对16HBE细胞活力的影响 |
| 2.6 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞活力的影响 |
| 2.7 RT-PCR检测16HBE细胞炎性因子表达水平 |
| 2.8 荧光探针DCFH-DA法检测CSE诱导的16HBE细胞内活性氧(ROS)水平 |
| 2.9 Western Blot法测定CSE诱导的16HBE细胞中相关蛋白表达 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 香烟烟雾提取物CSE对16HBE细胞活力的影响 |
| 3.2 白头翁皂苷B4对16HBE细胞活力的影响 |
| 3.3 地塞米松(DEX)对16HBE细胞活力的影响 |
| 3.4 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞活力的影响 |
| 3.5 不同时间点香烟烟雾提取物CSE对16HBE细胞炎性因子mRNA表达水平的影响 |
| 3.6 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞活性氧ROS表达水平的影响 |
| 3.7 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞炎性因子mRNA表达水平的影响 |
| 3.8 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞Snail1、Slug mRNA表达水平的影响 |
| 3.9 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞MAPK信号通路相关蛋白表达水平的影响 |
| 3.10 白头翁皂苷B4对CSE诱导的16HBE细胞上皮化生相关蛋白表达水平的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（4）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）解聚素基质蛋白酶9（ADAM9）在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 研究背景 |
| 第一部分 慢阻肺患者气道ADAM9水平与临床指标的相关性研究 |
| 一、慢阻肺诱导痰ADAM9蛋白水平与临床指标的相关性 |
| 研究背景 |
| 研究目的 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 二、慢阻肺患者气道上皮ADAM9表达与临床指标的相关性 |
| 研究背景 |
| 研究目的 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 第二部分 ADAM9在慢阻肺气道重塑中作用及其机制探讨 |
| 一、ADAM9对HPBECs增殖影响的研宄及机制初探 |
| 研究背景 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 二、ADAM9对HPBECs分化影响的研宄 |
| 研究背景 |
| 研究目的 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分结论 |
| 全文结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表学术论文 |
| English Article Ⅰ |
| EngIish ArticIe Ⅱ |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（6）PHLDA1抑制COPD肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡水平研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 COPD受试者筛选 |
| 2.3.2 具有肺气肿表现的受试者筛选 |
| 2.3.3 肺功能检查 |
| 2.3.4 CT图像分析 |
| 2.3.5 样本收集与制备 |
| 2.3.6 免疫荧光 |
| 2.3.7 TUNEL |
| 2.3.8 苏木素-伊红(HE)染色 |
| 2.3.9 蛋白质定量(BCA) |
| 2.3.10 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.11 DNA印迹杂交(Southern Blot) |
| 2.3.12 实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-q PCR) |
| 2.3.13 谷胱甘肽及超氧化物歧化酶测定 |
| 2.3.14 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 COPD肺气肿表型患者肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡增强 |
| 3.1.1 COPD受试者人口统计学特征及肺功能指标 |
| 3.1.2 COPD受试者肺气肿相关影像学参数 |
| 3.1.3 COPD肺气肿表型患者肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞数目减少 |
| 3.1.4 COPD肺气肿表型患者肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡增强 |
| 3.2 肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型具有相似的发病机制 |
| 3.2.1 肺气肿受试者人口统计学特征及临床特征 |
| 3.2.2 肺功能保留的“肺气肿”与COPD肺气肿表型具有相似的发病机制 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:PHLDA1 通过调控Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡影响COPD肺气肿表型形成的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 数据集来源 |
| 2.3.2 生信分析 |
| 2.3.3 DNA印迹杂交(Southern Blot) |
| 2.3.4 实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-q PCR) |
| 2.3.5 蛋白质定量(BCA) |
| 2.3.6 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.7 免疫组织化学实验(IHC) |
| 2.3.8 香烟烟雾抽提物制备 |
| 2.3.9 细胞培养 |
| 2.3.10 细胞活力测定(CCK-8) |
| 2.3.11 香烟烟雾影响人Ⅱ型肺泡上皮细胞模型构建 |
| 2.3.12 siRNA转染 |
| 2.3.13 过表达质粒p EX-4 转染 |
| 2.3.14 细胞凋亡检测 |
| 2.3.15 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PHLDA1在COPD肺气肿表型中水平降低并与肺气肿程度相关 |
| 3.1.1 GEO数据集筛选COPD肺气肿表型差异基因 |
| 3.1.2 PHLDA1在COPD肺气肿表型患者肺组织中水平降低 |
| 3.1.3 PHLDA1 表达量与肺气肿程度呈负相关 |
| 3.2 PHLDA1 抑制人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡 |
| 3.2.1 COPD肺气肿表型差异表达基因功能富集 |
| 3.2.2 PHLDA1 主要表达于COPD肺气肿表型患者肺组织人Ⅱ型肺泡上皮细胞中 |
| 3.2.3 香烟烟雾影响人Ⅱ型肺泡上皮细胞模型构建 |
| 3.2.4 PHLDA1 在人Ⅱ型肺泡上皮细胞系中敲减及过表达效率验证 |
| 3.2.5 PHLDA1 抑制香烟烟雾抽提物引起的人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:人Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡中PHLDA1与14-3-3 结合的研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 研究对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 免疫共沉淀 |
| 2.3.3 考马斯亮蓝染色 |
| 2.3.4 蛋白质定量(BCA) |
| 2.3.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot) |
| 2.3.6 细胞免疫荧光 |
| 2.3.7 组织免疫荧光 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PHLDA1 调节人Ⅱ型肺泡上皮细胞中14-3-3 epsilon水平 |
| 3.1.1 PHLDA1 在香烟烟雾抽提物诱导凋亡的人Ⅱ型肺泡上皮细胞中具有相互结合蛋白 |
| 3.1.2 香烟烟雾抽提物诱导凋亡的人Ⅱ型肺泡上皮细胞中14-3-3 epsilon水平降低 |
| 3.1.3 人Ⅱ型肺泡上皮细胞中PHLDA1 调节14-3-3 epsilon水平 |
| 3.2 香烟烟雾抽提物诱导凋亡后PHLDA1和14-3-3 epsilon结合力降低 |
| 3.2.1 PHLDA1与14-3-3 在完整人Ⅱ型肺泡上皮细胞中共表达 |
| 3.2.2 香烟烟雾抽提物处理后PHLDA1与14-3-3 epsilon结合力减弱 |
| 3.3 COPD患者肺组织中PHLDA1与14-3-3 epsilon共表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 慢性阻塞性肺疾病肺气肿表型诊断及发病机制概述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）长期吸烟在骨折愈合早期的抑制作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 引言 |
| 课题设计 |
| 第一章 构建长期吸烟所致骨折愈合不良小鼠模型 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果与分析 |
| 四、小结与讨论 |
| 第二章 长期吸烟作用下骨折愈合早期的细胞学和分子学特点 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果与分析 |
| 四、小结与讨论 |
| 第三章 长期吸烟抑制骨折早期骨骼干细胞增殖的分子机制研究 |
| 一、前言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果与分析 |
| 四、小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 综述 骨骼干细胞(SSC)研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）白茶对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺病的作用研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写、符号清单和术语表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白茶的生物活性研究进展 |
| 1.1.1 白茶的主要功能性成分 |
| 1.1.2 白茶的抗氧化能力 |
| 1.1.3 白茶的防癌与抗癌活性 |
| 1.1.4 白茶减轻体重与改善代谢综合征 |
| 1.1.5 白茶对肝脏的保护作用 |
| 1.1.6 白茶对神经的保护作用 |
| 1.2 COPD研究进展 |
| 1.2.1 COPD概况 |
| 1.2.2 COPD发病机制 |
| 1.2.3 COPD现有的治疗方法 |
| 1.3 天然产物改善COPD的研究现状 |
| 1.4 茶改善COPD的研究现状 |
| 1.5 研究的内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第二章 白茶提取物的理化成分分析及体外抗氧化活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及仪器 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 白茶提取物的制备 |
| 2.3.2 白茶提取物理化成分的测定 |
| 2.3.3 白茶提取物体外抗氧化能力的测定 |
| 2.3.5 数据统计方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 白茶提取物的主要理化成分 |
| 2.4.2 白茶提取物的体外抗氧化活性 |
| 2.5 讨论及小结 |
| 2.5.1 讨论 |
| 2.5.2 小结 |
| 第三章 小鼠烟雾造模及其对肺病理与炎症的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及仪器 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 小鼠烟雾造模及给药 |
| 3.3.2 样本采集与处理 |
| 3.3.3 肺组织的HE染色实验 |
| 3.3.4 IL-6和TNF-α酶联免疫的测定 |
| 3.3.5 数据统计方法 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 白茶提取物对小鼠生存质量的影响 |
| 3.4.2 白茶提取物对COPD小鼠肺组织病理学的影响 |
| 3.4.3 白茶提取物对COPD小鼠炎症因子水平的影响 |
| 3.5 讨论及小结 |
| 3.5.1 讨论 |
| 3.5.2 小结 |
| 第四章 白茶提取物对COPD小鼠氧化应激与肝毒性的改善效果及机制 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料及仪器 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 小鼠烟雾造模及给药 |
| 4.3.2 样本采集及处理 |
| 4.3.3 MDA含量的测定 |
| 4.3.4 SOD活性的测定 |
| 4.3.5 NO含量的测定 |
| 4.3.6 MPO活性的测定 |
| 4.3.7 谷丙和谷草转氨酶活性的测定 |
| 4.3.8 磷酸化AMPK含量的测定 |
| 4.3.9 数据统计方法 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 白茶提取物对COPD小鼠抗氧化能力的影响 |
| 4.4.2 白茶提取物对COPD小鼠NO异常的影响 |
| 4.4.3 白茶提取物对COPD小鼠AMPK磷酸化水平的影响 |
| 4.4.4 白茶提取物对COPD小鼠肝毒性的影响 |
| 4.5 讨论与小结 |
| 4.5.1 讨论 |
| 4.5.2 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）基于NF-κB通路探讨异甘草素抗炎与抗肿瘤双重作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 COPD概述 |
| 1.2 肺癌的国内外研究现状 |
| 1.3 肺癌与炎症 |
| 1.4 COPD与肺癌的关系 |
| 1.5 炎症与机体防御机制 |
| 1.6 吸烟引发COPD的氧化应激机制 |
| 1.7 Nrf2与氧化应激相关机制 |
| 1.8 NF-κB与炎症 |
| 1.9 NF-κB与肿瘤 |
| 1.10 非小细胞肺癌治疗概况 |
| 1.10.1 非小细胞肺癌化疗药物治疗 |
| 1.10.2 非小细胞肺癌的中药治疗 |
| 1.10.3 非小细胞肺癌的外科手术治疗 |
| 1.11 异甘草素概述及抗炎机制 |
| 1.11.1 异甘草素的抗炎作用 |
| 1.11.2 异甘草素的抗氧化作用 |
| 1.11.3 异甘草素的抗肿瘤作用 |
| 第2章 异甘草素抗COPD炎症反应的作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 主要仪器和试剂 |
| 2.1.1.1 主要仪器 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要试剂配制方法 |
| 2.1.2 实验动物与分组 |
| 2.1.3 肺湿/干重比测定 |
| 2.1.4 肺组织病理学评估 |
| 2.1.5 小鼠肺组织MPO活性和MDA含量测定 |
| 2.1.6 小鼠BALF中细胞计数和炎性细胞因子检测 |
| 2.1.7 小鼠肺组织NF-κB和Nrf2信号通路相关蛋白水平检测 |
| 2.1.8 小鼠肺组织Nrf2和HO-1 mRNA表达水平检测 |
| 2.1.9 数据统计与分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 各组小鼠的肺湿/干比结果 |
| 2.2.2 各组小鼠的肺组织病理学变化 |
| 2.2.3 各组小鼠肺组织MPO活性和MDA含量比较 |
| 2.2.4 各组小鼠BALF中细胞数和炎症因子水平比较 |
| 2.2.5 各组小鼠肺组织NF-κB通路相关蛋白表达水平 |
| 2.2.6 各组小鼠肺组织Nrf2/HO-1通路相关基因表达水平 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 ILG可能改善小鼠肺部炎症和氧化应激效应 |
| 2.3.2 ILG可以抑制COPD小鼠的炎性反应 |
| 2.3.3 ILG可能通过调控NF-κB及Nrf2通路抑制使炎症反应和氧化应激程度降低 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 异甘草素抑制肺癌的作用 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 主要仪器和试剂 |
| 3.1.2 A549细胞培养与分组 |
| 3.1.3 A549裸鼠移植瘤建模、分组及组织样本收集 |
| 3.1.4 检测指标及方法 |
| 3.1.5 数据统计与分析 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 LG对A549细胞存活率影响 |
| 3.2.2 ILG对A549细胞凋亡的影响 |
| 3.2.3 ILG对A549细胞迁移的影响 |
| 3.2.4 ILG对A549细胞中NF-κB信号通路影响 |
| 3.2.5 ILG对A549细胞的PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 3.2.6 ILG对A549荷瘤裸鼠体重及脏器指数的影响 |
| 3.2.7 ILG对A549移植瘤小鼠实体肿瘤生长影响 |
| 3.2.8 ILG对A549移植瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的影响 |
| 3.2.9 ILG对A549移植瘤小鼠肿瘤细胞迁移的影响 |
| 3.2.10 ILG对A549移植瘤小鼠肿瘤细胞中NF-κB信号通路影响 |
| 3.2.11 ILG对A549移植瘤小鼠肿瘤细胞中PI3K/AKT信号通路的影响 |
| 3.2.12 ILG对A549移植瘤小鼠血清中肿瘤标志物影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 ILG可能通过降低MMP-2与MMP-9的表达影响A549细胞的转移 |
| 3.3.2 ILG可能通过调节COX-2影响A549细胞的炎症反应 |
| 3.3.3 ILG可能通过调节NF-κB和PI3K/AKT通路抑制肿瘤生长、转移和炎症反应 |
| 3.3.4 ILG可能促使A549细胞凋亡 |
| 3.3.5 ILG使肿瘤标志物NSE与CA125下降 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 结论 |
| 局限性与未来实验展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在校科研成果 |
| 致谢 |
（10）中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1.1 慢性阻塞性肺疾病(COPD) |
| 1.1.1 COPD的定义及诊断标准 |
| 1.1.2 COPD的流行病学概况 |
| 1.1.3 COPD的诱发因素 |
| 1.2 呼吸道感染与COPD急性加重(AECOPD) |
| 1.2.1 AECOPD的定义及诱因 |
| 1.2.2 病毒感染与AECOPD |
| 1.2.3 细菌感染与AECOPD |
| 1.2.4 AECOPD与中性粒细胞 |
| 1.3 常见COPD的治疗方法 |
| 1.3.1 支气管扩张剂治疗 |
| 1.3.2 皮质类固醇治疗 |
| 1.3.3 抗生素治疗 |
| 1.3.4 中药治疗及人参皂苷Rg3对肺疾病的保护作用 |
| 研究内容 |
| 第一部分 NTHi诱导的小鼠AECOPD的发生 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与方法 |
| 1.2.1 实验材料 |
| 1.2.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 NTHi诱导的AECOPD小鼠模型体重变化 |
| 1.3.2 NTHi诱导的AECOPD小鼠模型肺功能改变 |
| 1.3.3 NTHi诱导的AECOPD小鼠肺组织结构变化 |
| 1.3.4 NTHi诱导的AECOPD小鼠BALF中炎症细胞变化 |
| 1.3.5 NTHi诱导的AECOPD小鼠BALF中炎症因子变化 |
| 1.4 讨论 |
| 第二部分 中性粒细胞在NTHi诱导的AECOPD中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 NTHi及香烟烟雾刺激BEAS-2B细胞诱导炎症细胞模型 |
| 2.3.2 中性粒细胞在BEAS-2B细胞模型中迁移的变化 |
| 2.3.3 NHTi及香烟烟雾诱导中性粒细胞迁移的分子机制 |
| 2.4 讨论 |
| 第三部分 人参皂苷Rg3对AECOPD以中性粒细胞增多为特征的炎症反应的预防治疗作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 人参皂苷Rg3对NTHi诱导的AECOPD模型小鼠的影响 |
| 3.3.2 人参皂苷Rg3对中性粒细胞迁移的影响及机制研究 |
| 3.3.3 人参皂苷Rg3 作用于AECOPD模型小鼠的代谢组学研究 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、香烟烟雾溶液对人淋巴细胞的损伤及修复（论文参考文献）
- [1]PPARγ参与有氧运动调控chemerin改善COPD膈肌功能障碍的机制研究[D]. 李健. 上海体育学院, 2021
- [2]健脾益肺Ⅱ号治疗慢阻肺临床疗效及减轻香烟暴露联合流感病毒感染小鼠肺炎症作用研究[D]. 蔡甜甜. 广州中医药大学, 2021(02)
- [3]香烟烟雾诱导慢性阻塞性肺病的发生和向肺癌转化的作用及白头翁皂苷B4的干预机制研究[D]. 马惠苗. 江西中医药大学, 2021
- [4]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [5]解聚素基质蛋白酶9（ADAM9）在慢性阻塞性肺疾病气道重塑中作用的研究[D]. 崔立伟. 山东大学, 2021(10)
- [6]PHLDA1抑制COPD肺气肿表型Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的机制研究[D]. 白爽. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]长期吸烟在骨折愈合早期的抑制作用及机制研究[D]. 郝滋辰. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(05)
- [8]白茶对香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺病的作用研究[D]. 黎攀. 浙江大学, 2021(01)
- [9]基于NF-κB通路探讨异甘草素抗炎与抗肿瘤双重作用及其机制的研究[D]. 于多. 吉林大学, 2020(01)
- [10]中性粒细胞在AECOPD发生中的作用及人参皂苷Rg3的保护机制研究[D]. 关雪娃. 吉林大学, 2020(01)