一、对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识（论文文献综述）
任星旭[1]（2021）在《玉米种子转基因成分新型分子检测体系的建立》文中研究表明随着全球转基因技术的迅猛发展,截止2020年,全球玉米转化体已高达240种,我国自主研制并发放安全证书的共5种。目前,我国转基因检测标准方法以琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR为主,随着转基因复合性状品种的增加,现有检测方法存在通量低、时间长、成本高等不足,技术手段有限,检测难度不断加大。为解决以上情况,本文利用荧光毛细管电泳建立可快速筛查转基因成分的三重PCR和一步锁定国内玉米转化体的五重PCR,同时将真实性和转基因组合检测,在确认种子指纹信息的同时筛查转基因成分,达到对玉米种子进行一次性双重验证的目的。以我国最具代表性的玉米转化体C0030.3.5和双抗12-5转化体为研究材料,分别设定0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%共7个转基因含量梯度,用玉米内标ZSSIIb、Ca MV35S启动子、T-NOS终止子、C0030.3.5、双抗12-5共5对引物组合后基于荧光毛细管电泳进行单重、三重、五重PCR扩增。1、转基因荧光毛细管电泳检测体系的建立。对5对引物进行单重PCR,荧光毛细管电泳结果表明,C0030.3.5的T-NOS引物和双抗12-5的Ca MV35S引物检出限为0.05%,高于琼脂糖凝胶电泳和q PCR两方法0.1%的检出限,毛细管电泳中其余引物检出限为0.1%,与标准方法持平。2、三重PCR体系建立与验证。将ZSSIIb、Ca MV35S、T-NOS组成三重PCR,扩增C0030.3.5玉米样品,三重PCR检出限为0.1%,T-NOS引物检出限由单重PCR时的0.05%变为0.1%。使用转基因含量分别为0.5%、1%、2%的TC1507、NK603、Mon810玉米标准品验证体系,扩增结果与事实相符,证明三重体系可用于玉米种子转基因成分的快速筛查。3、五重PCR体系建立与验证。组合5对引物,扩增两个玉米样品,五重PCR检出限均为0.1%,C0030.3.5的T-NOS和双抗12-5的Ca MV35S检出限由单重PCR时的0.05%变为0.1%。用混入C0030.3.5和双抗12-5样品的100份玉米盲样验证体系,共检测出4份C0030.3.5,2份双抗12-5,13份含转基因成分,与预期相符。4、真实性、转基因一体化检测。ZSSIIb、Ca MV35S、T-NOS与8对SSR真实性检测引物组合,采用11重PCR,基于荧光毛细管电泳平台可实现同时检测真实性和转基因。5、三种检测平台的比较。综合灵敏度、特异性、易用性、通量、时间、成本等6个方面,琼脂糖凝胶电泳适合少量样品转基因定性检测,q PCR可进行相对定量的转基因检测,荧光毛细管电泳用于检测大批量转基因样品。本研究基于荧光毛细管电泳平台建立多重转基因检测体系,可将真实性和转基因一体化检测,为未来转基因种子市场提供检测新方案,在玉米种子转基因检测中具有较高应用价值及前景。
张翕宇[2]（2019）在《参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能及肠道菌群的实验研究》文中研究表明目的:基于“脾胰同源”理论,以自发性2型糖尿病GK大鼠为研究对象,应用基因芯片及微生物16Sr DNA基因测序技术,旨在深入探讨参芪复方调节胰岛细胞功能及肠道菌群的分子机制,为中医药防治2型糖尿病提供理论依据。方法:60只GK大鼠适应性喂养1周,筛选出两次随机血糖≥11.1mmol/L的大鼠,将其纳入本实验,并且根据随机原则分为5组,分别命名为模型组、西药组、参芪复方高剂量、中剂量、以及低剂量组。另设Wistar大鼠为正常组。Wistar大鼠每日予普通饲料喂养,GK大鼠每日予高脂饲料喂养,连续4周,从GK大鼠各组中随机选取大鼠检测随机血糖,验证糖尿病模型成功。造模成功后,参芪复方高、中、低剂量组分别予高、中、低剂量参芪复方浸膏灌胃,西药组予西格列汀混悬液灌胃,正常组、模型组予生理盐水灌胃。连续给药8周,药物干预期间观察大鼠一般情况,每周定时测量大鼠体重,并根据体重变化调整灌胃量。干预期间每周一次测定一日内8:00,10:00,14:00,16:00,18:00五个时间点的血糖情况。根据五点血糖值,用平均血糖水平（mean blood glucose,MBG）、平均血糖的标准差（standard deviation of blood glucose,SDBG）、最大血糖波动幅度（largest amplitude of glycemic excursions,LAGE,日内血糖最高值与最低值之差）反映干预4周、8周后大鼠血糖波动的情况。各组大鼠于药物干预8周后处死,采集血液标本,运用双抗体夹心ABC-ELISA法测定血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、胰岛素（INS）、胰高血糖素（GC）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）、超敏C反应蛋白（hs CRP）的水平;运用Dead End TM TUNEL荧光法检测胰岛β细胞凋亡情况;运用苏木精-伊红染色法于光镜下观察各组大鼠胰腺组织病理形态;正常组、模型组、参芪复方中剂量组、西药组中每组检测3只大鼠的胰腺组织50-100mg,运用Agilent4*44k全基因组表达谱芯片对全部样本的RNA进行差异基因检测,结合GO、Pathway富集,并对关键差异基因GCG、KCNN4、PIK3R1、AKT1、CRY1、DBP行PCR验证;无菌采集正常组、模型组、参芪复方中剂量组、西药组每组5只大鼠粪便1-2粒,运用微生物16Sr DNA基因测序技术检测大鼠肠道菌群。结果:1.宏观表现---干预8周后,参芪复方可改善GK大鼠一般情况,其毛色、色泽及精神状态较模型组更佳。随药物干预时间延长,参芪复方可降低大鼠日摄食量、日饮水量,对大鼠体重无明显影响。参芪复方高、中剂量与西药均能有效降低TC水平;参芪复方高、中、低剂量与西药均能有效降低TG水平;参芪复方各剂量及西药均能升高GLP-1水平;参芪复方高、中剂量及西药均能降低hs CRP水平;其中,参芪复方中剂量效果最显着。参芪复方各剂量及西药均能一定程度改善INS、GC水平,其中,参芪复方高剂量及西药效果最显着。参芪复方各剂量及西药均能一定程度降低MBG、SDBG、LAGE水平,减少血糖波动幅度,其中,参芪复方中剂量及西药改善血糖波动的效果最为显着。干预8周后,参芪复方中剂量及西药均能减少胰岛β细胞凋亡,其中,参芪复方中剂量效果最显着。参芪复方高、中剂量可一定程度改善胰腺组织病理形态。2.基因芯片及PCR结果---基因芯片差异基因筛选发现:模型组与正常组比较,共有差异基因349条,其中211条基因表达下调,128条基因表达上调。参芪复方中剂量组与模型组比较,共有差异基因77条,其中23条基因表达下调,54条基因表达上调。西药组与模型组比较,共有差异基因95条,其中49条基因表达下调,46条基因表达上调。差异基因经GO功能富集分析显示:模型组与正常组的差异基因涉及的生物学过程包括代谢过程、细胞分泌、凋亡、昼夜节律、对光刺激的反应等。参中组与模型组的差异基因涉及的生物学过程包括对胰岛素刺激的反应、凋亡、调节磷脂酰肌醇3-激酶、昼夜节律、对光刺激的反应等。西药组与模型组差异基因涉及的生物学过程包括胰岛素分泌、凋亡、磷脂酰肌醇3-激酶信号通路、昼夜节律、稳态过程的调节、调节炎症反应等。差异基因经pathway富集分析显示:模型组与正常组差异基因涉及的主要信号通路依次为代谢途径、阿米巴病、卵母细胞减数分裂、孕酮介导的卵母细胞成熟、精氨酸及脯氨酸代谢、糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列。参芪复方中剂量组与模型组差异基因涉及的主要信号通路依次为胰腺癌、调节肌动蛋白细胞骨架、m TOR信号通路、局部粘着、肾细胞癌、细菌侵入上皮细胞、VEGF信号通路、小细胞肺癌、Erb B信号通路、FcγR介导的吞噬作用、Gn RH信号通路、T细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、轴突指导、癌症途径、神经营养因子信号通路、弓形体病。西药组与模型组差异表达基因涉及的主要信号通路依次为精氨酸及脯氨酸代谢、唾液分泌、Gn RH信号通路。大鼠胰腺组织基因芯片差异基因结合GO功能和pathway富集分析发现:与模型组相比,参芪复方及西药均可上调胰岛素分泌相关基因GCG的表达,下调胰岛素分泌相关基因KCNN4的表达,且PCR验证结果与基因芯片一致。与模型组相比,参芪复方可上调胰岛细胞凋亡相关基因PIK3R1、AKT1的表达,且PCR验证结果与基因芯片基本一致。与模型组相比,参芪复方及西药均可上调生物钟节律相关基因CRY1、DBP的表达,且PCR验证结果与基因芯片一致。3.肠道菌群结果---大鼠粪便16Sr DNA基因测序结果显示:与正常组相比,GK大鼠肠道菌群丰富度较高,其中,西药组菌群丰富度高于模型组及参芪复方中剂量组。门水平上,各组大鼠厚壁菌门和拟杆菌门均占有较高比例,为主要优势菌群。与正常组相比,各GK大鼠组拟杆菌门/厚壁菌门比值下降,而经参芪复方干预后,拟杆菌门/厚壁菌门比值增加。属水平上,与模型组相比,参芪复方中剂量组、西药组的拟杆菌属（Bacteroides）、丁酸菌属（Butyricimonas）、Blautia菌属（Blautia）、罗氏菌属（Roseburia）丰度相对升高。结论:参芪复方可改善GK大鼠一般情况,降低大鼠日摄食量、日饮水量,降低血清TC、TG、GC、hs CRP水平,升高INS、GLP-1水平,减少血糖波动幅度,抑制胰岛β细胞凋亡,改善胰腺组织病理形态。推测参芪复方防治2型糖尿病的分子机制,可能与其调节胰岛素分泌相关基因GCG、KCNN4,胰岛细胞凋亡相关基因PIK3R1、AKT1,生物钟节律相关基因CRY1、DBP的表达;调节肠道菌群,改善拟杆菌门/厚壁菌门比值,增加产丁酸菌的相对丰度,进而改善胰岛细胞功能,维持血糖稳态相关。体现了参芪复方多途径、多靶点、多环节的治疗特点,其优势可能与中医学“脾胰同源”的理论相关。
宋莉,刘鲁滨,孙莹莹,肖宁,宋燕,张银辉,孟宪敏,陈敬洲[3]（2018）在《凝胶内长片段基因克隆的实验方法研究》文中研究指明目的量少、片段长的目的基因受纯化回收效率低的影响而难于克隆,本实验的目的是探索快速高效克隆量少,片段长DNA的实验方法。方法以lnc RNA AL110200 5’RACE大片段PCR产物为目的基因,应用高纯度、高分辨率的低熔点琼脂糖,分离得到含5.0 kb和2.0 kb的凝胶,直接用于连接和转化反应,通过克隆PCR和Sanger测序法鉴定克隆的正确性。结果经测序验证了5.0 kb和2.0 kb重组克隆的正确性,说明应用高纯度的低熔点琼脂糖凝胶可以快速克隆长达5.0kb基因片段。结论该方法是一种省时、高效、易行的长片段基因克隆方法。
王越[4]（2018）在《鱼藤酮诱导SH-SY5Y帕金森模型中对FOXO3a在自噬凋亡中作用的研究》文中提出背景帕金森病（PD）是全球散发的慢性神经退行性疾病。其病因多样,病理表现为脑内多巴胺能神经元细胞凋亡。残存细胞内路易小体为该疾病典型病理表现,始终为研究者重视。路易小体实际是神经元出现蛋白代谢功能异常后,自噬溶酶体内突触核蛋白等物质降解紊乱所遗留的一种特殊病理形式。细胞自噬的分子机制因与细胞的代谢、免疫、营养、应激及死亡等多种机制相关而备受关注。进一步研究中我们发现,因该疾病中多巴胺能神经元的特殊性,进行动物实验的诱导剂在相应细胞试验中较难复制出令人满意的自噬细胞模型。方法及结果:本研究者通过文献检索,首先通过不同浓度鱼藤酮对SH-SY5Y细胞进行不同时段诱导筛选,经荧光染色后镜下凋亡观察、流式细胞仪计数定量、细胞活性试验（CCK8法）验证,自噬诱导后蛋白测定、荧光染色观察、溶酶体抑制剂反向验证等多种实验手段,终选定以特定时长特定浓度鱼藤酮对SH-SY5Y细胞诱导,来进行下一步以自噬为中心目的的帕金森病早期的细胞分子生物学研究。在该细胞模型的进一步研究中,我们发现FOX03a蛋白作为一种复杂功能的转录因子,通过磷酸化能活动所致浆核间移动及转录的启动,调控下游因子在SH-SY5Y细胞的自噬与凋亡中均起到重要作用。通过对该细胞模型FOXO3a的过表达质粒构建及siRNA干扰转染后,我们经过PCR及蛋白检测验证,再次进行了该PD细胞模型凋亡试验。通过上述实验,我们认为FOXO3a蛋白在该细胞模型中的表达对细胞的凋亡主要起促进作用。而后,我们对该PD细胞模型对FOXO3a上游可能的作用分子进行了进一步的筛查性试验分析。结果提示JNK的磷酸化在转录因子FOXO3a的促凋亡通路中可能起到重要的作用。最后,我们利用p-JNK抑制剂及siRNA-FOXO3a作用于该PD细胞模型,进行了影响FOXO3a蛋白表达及细胞死亡的检测认定,结果显示p-JNK抑制剂及FOXO3蛋白干扰RNA均可抑制该细胞模型的凋亡。结论1、以特定时间、浓度鱼藤酮对SH-SY5Y细胞诱导可作为较满意的细胞模型,来模拟帕金森病早期的神经细胞病理变化,以进行以自噬为中心目的的细胞分子学研究。2、以流式细胞仪与CCK8法比照,证实后者可用来进行该帕金森细胞模型的细胞活性检测,来准确的反映细胞病理状态。3、FOXO3a蛋白在该PD细胞模型中对应激的过度表达促进了细胞凋亡,JNK的磷酸化激活在其中起到关键的作用。4、p-JNK抑制剂及FOXO3蛋白干扰RNA均可抑制该细胞模型的凋亡,可为PD的治疗提供新的思路方法。以上结论在相关细胞模型中均未见报道。
杨波[5]（2018）在《一种快速凝胶电泳及实时成像装置的研制》文中提出凝胶电泳技术是一种依据分离对象不同物理性质实现分离的技术,其操作简单,所需设备价格相对低廉,因此被广泛应用于核酸及蛋白质分离等领域。传统的平板电泳（Slab Gel Electrophoresis,SGE）装置存在电泳时间长、试剂消耗量大、激发光是紫外波段,对人体有潜在危害等不足,而且需要离线的成像装置。为能够克服上述不足,本文研制出一种能快速电泳且能对电泳过程实时成像的电泳仪,该仪器能够有效缩短电泳时间,降低试剂消耗量,使用可见光光源对人体无害。本文主要包括快速凝胶电泳及实时成像装置中的机械、电路控制系统、软件三个部分。（1）机械部分主要包括装置零部件以及SGE芯片,其中SGE芯片是完成凝胶电泳的核心部件,芯片泳道的三维尺寸是经过大量理论与实验摸索总结出来的,能够分离不同长度的DNA片段。（2）电路控制系统主要介绍单端反激隔离式开关电源以及相应的驱动电路。根据实验需求,单端反激隔离式开关电源的控制电压范围0.5-10.5 V,输出功率25 W,输出电压的范围为12-250 V,输出电压的纹波不超过350 mV,且输出电压可步进增加,步进长度为1 V,产生高压时的过冲电压不超过5 V。驱动电路主要介绍STM32F103RBT6芯片,此芯片主要功能是与PC端相连,将PC上的电压值命令以ASCII码的形式发送到下位机,下位机通过驱动芯片对其进行处理,在电路中产生与输出电压相匹配的控制电压,之后通过开关电源输出与PC上电压一致,同时驱动芯片对输出电压进行实时采样,再把信号传送到PC端,这样就可以完成在PC端对下位机进行参数设定。（3）软件部分主要介绍SGE软件如何对电泳过程进行实时监控,以及对凝胶电泳结果的识别和分析。此软件可以通过串口通信控制下位机的开始和结束,可以设置不同的电泳电压和电泳时间,同时实时采集CCD上的图像信息并且呈现在软件界面上;还可以对某一时间的电泳图像进行拍照采集。此外,软件可以对凝胶电泳的结果进行分析,通过Canny轮廓检测算法和局部自适应阈值二值化算法对条带进行识别,运用霍夫变换-直线检测以及聚类分析算法,分析哪些条带属于同一泳道,且软件将每个条带的相对迁移距离做成表格,通过此表格可以对数据进行线性拟合,推算出待测DNA样品的长度,方便研究员对未知DNA样品的判断。
魏凯[6]（2016）在《喜树亭碱类似物的设计、合成及抗肿瘤活性研究》文中认为天然产物及其衍生物在历史上一直是化学药物的源泉,特别是抗肿瘤类药物,有超过60%是来自于天然产物及其衍生物.拓扑异构酶Ⅰ是抗肿瘤新药研发的重要靶标.目前,天然产物喜树碱的衍生物已经作为靶向拓扑异构酶Ⅰ的抗肿瘤药物在临床上广泛使用.然而,由于其溶解性和化学稳定性较差,毒性较大且易于产生耐药性,限制了它在临床上的应用.基于结构更稳定的靶向拓扑易异构酶Ⅰ的天然产物骨架来研发新的抗肿瘤化合物,成为了当前抗肿瘤新药研发的重要研究领域.本论文以天然产物22-hydroxyacuminatine的衍生物喜树亭碱的骨架为基础,在我们总结出的拓扑异构酶Ⅰ药效团模型的指导下,研究了喜树亭碱类似物的设计、合成及其生物活性研究,共合成了 30个目标化合物.抗肿瘤活性初筛结果表明:绝大部分化合物均表现出了很强的抗肿瘤活性,IC50值的范围在0.31到11.97 μM之间.选取化合物3e为代表进行具体的抗肿瘤作用机制的研究.研究结果证实:化合物3e可以将肿瘤细胞阻滞在细胞周期的S期,提高细胞内活性氧水平（ROS）、钙离子浓度（[Ca2+]）和降低线粒体膜电位水平（ΔΨm）并诱导细胞凋亡.Western blot蛋白印记实验结果显示,化合物3e可以使Bak蛋白的表达上调,Bcl-2,Bax,Bcl-xL蛋白表达水平下调,这一结果也证明了化合物3e能够通过蛋白的作用诱导细胞凋亡.利用琼脂糖凝胶电泳实验研究了化合物3e与pBR322质粒DNA相互作用和对Topo Ⅰ催化解旋抑制作用.结果表明化合物3e既可直接作用于DNA,同时还可以明显抑制Topo Ⅰ的催化解旋作用.化合物3e,4e和5e与DNA-Topo Ⅰ靶标进行分子对接实验,结果表明化合物可以与DNA-Topo Ⅰ复合物相互作用.本文所述工作不仅为设计新型靶向拓扑异构酶Ⅰ抗肿瘤药物提供了新思路,同时也为开发新型靶向Topo Ⅰ的抗肿瘤新药提供参考.
孔晓,崔丙健,金德才,吴尚华,杨波,邓晔,庄国强,庄绪亮[7]（2015）在《农村污水膜生物反应器系统中微生物群落解析》文中提出农村污水的随意排放和未加限制的灌溉回用可能会导致水源地环境污染加剧,并且其中潜在的病原微生物对周边淡水资源安全和农村居民的身心健康造成潜在的威胁.为了解农村污水的微生物群落组成,为后续污水灌溉的病原微生物风险评价提供理论依据,采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）和16S r DNA基因克隆文库技术研究农村污水膜生物反应器（MBR）系统中的微生物群落多样性,并结合实时荧光定量PCR方法监测处理前后典型病原菌——弓形菌（Arcobacter spp.）以及总细菌数量的变化.从未处理的农村污水中获取的73个阳性克隆测序结果表明,其主要细菌类群为变形菌门（91.8%）、厚壁菌门（2.70%）、拟杆菌门（1.40%）,以及部分不可培养细菌（4.10%）.其中弓形菌属是ε-变形菌门的优势菌,也是农村污水中的优势菌株,占克隆总数的68.5%.TRFLP的结果表明,不同处理工艺阶段的主要细菌类群及丰度明显不同,调节池的物种丰度（S）、Shannon-Wiener（H）和物种均匀度（E）最高,分别为43.0、3.56和0.95.定量PCR结果显示未处理的农村污水中弓形菌数量高达（1.09±0.064 0）×1011copies·L-1,该结果与克隆文库结果均表明弓形菌在污水中确实占较高比例.与未处理的农村污水相比,处理后的出水中所监测的弓形菌及细菌总拷贝数分别减少了23个数量级,说明MBR处理系统在一定程度上能够去除微生物.处理后的再生水理化指标及指示菌卫生指标均符合农田灌溉用水标准,但其中残留病原微生物引发的健康风险仍需进一步评价.
林建[8]（2013）在《体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究》文中进行了进一步梳理目前我国的奶山羊品种与发达国家相比差距明显,缺乏国际竞争力,突出表现为产量奶低,多数羊的年产奶量不足300kg,经济效益不高。为解决这一问题,本研究通过转基因技术培育高产奶量的奶山羊。本试验选取在乳腺发育和泌乳中起着重要作用的类胰岛素生长因子（IGF-1）基因作为转入的目的基因。通过分子生物学的方法,构建了乳腺特异性表达类胰岛素生长因子的载体pIN；然后分别转染人乳腺癌细胞系（Bcap-37）和山羊乳腺上皮细胞（GMEC）以验证乳腺特异性表达载体pIN表达IGF-1的能力,进一步的研究将载体pIN灌注泌乳期山羊乳腺以验证其生物学功能。在确认了载体pIN可以表达IGF-1后,我们使用脂质体法将载体pIN转染山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,通过抗性筛选和单克隆挑选获得转IGF-1基因阳性克隆细胞。将获得的转IGF-1基因阳性克隆细胞通过体细胞核移植技术移植到去核的卵母细胞中,融合激活后待其发育到囊胚期,移植至代孕母羊,最后获得4只克隆奶山羊。提取克隆奶山羊的血液基因组,通过荧光定量PCR、Southern-blot以及TAIL-PCR等方法一方面鉴定本研究获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊,另一方面检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因插入的拷贝数以及部分插入位点的侧翼序列。总的来说,转IGF-1基因奶山羊的培育,为通过转基因技术提高山羊奶产量奠定了基础。本研究中主要试验内容分为以下五部分：1.山羊乳腺特异性表达载体的构建及其验证本研究的目的是构建山羊乳腺特异性表达载体pIN,并在体内体外检验载体pIN的生物学活性,为下一步生产高产奶量转基因奶山羊奠定基础。第一步,以萨能奶山羊为材料,采用RT-PCR的方法从奶山羊的肝脏组织中扩增465bp的类胰岛素生长因子1（insulin-like growth factors-1,igf-1）基因；同时以真核表达载体pCDNA3.1为模板,扩增1505bp的真核筛选标记neo基因。第二步,以乳腺特异性表达载体pBC1为骨架载体,先将扩增的igf-1基因插入p-酪蛋白5’端启动子的下游,再将克隆的neo基因克隆到β-酪蛋白3’端终止子的下游,构建乳腺特异性表达载体pIN。第三步,采用脂质体法将构建好的乳腺特异性表达载体pIN转染人乳腺癌细胞系（Bcap-37）和山羊乳腺上皮细胞,同时使用乳腺灌注法将载体pIN导入泌乳期山羊乳腺组织中去检测乳腺特异性表达载体pIN的生物学功能。体外试验结果显示：在Bcap-37细胞中,载体pIN转染组的IGF-1蛋白和mRNA表达量均显着高于对照组（p<0.05）；在山羊乳腺上皮细胞中,转染载体pIN的细胞可以成功诱导表达IGF-1。体内试验结果进一步证实本研究所构建的乳腺特异性表达载体pN可以在山羊乳腺组织中成功表达IGF-1,为增加羊奶产量奠定基础。2.双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究简单、快速和高效地将目的基因转入细胞核将会有利于加速转基因阳性细胞的筛选过程。转染增强剂的使用可以有效的促进外源基因的转运。在众多增强剂中,双亲性小分子化合物二甲基亚枫（DMSO）和薄荷醇可以有效的提高基因的转染效率。本研究首先使用MTT法检测DMSO和薄荷醇的细胞毒性,摸索出对细胞没有伤害或者伤害很小的最适使用浓度；接着在人乳腺癌细胞系（Bcap-37）上,使用荧光定量PCR和流式细胞检测法去评价DMSO和薄荷醇对转染效率的影响。研究结果表明2%（V/V）的DMSO和12.5μM薄荷醇可以显着提高外源基因的转染效率。荧光定量PCR结果显示,在薄荷醇后处理和DMSO前处理的Bcap-37细胞上,生长激素（GH）的mRNA表达量提高了10倍以上；而在DMSO后处理和薄荷醇前处理的Bcap-37细胞上,GH的mRNA表达量则提高了30倍以上。荧光显微镜观察结果和流式细胞检测结果进一步证明DMSO和薄荷醇处理细胞可以增加表达绿色荧光的细胞数量。与单独脂质体转染组相比较,DMSO后处理组和薄荷醇前处理组表达绿色荧光的细胞比例增加了15%。进一步细胞周期分析发现,DMSO和薄荷醇处理均可以显着影响细胞周期,大大的改变了细胞周期停滞的比例。这一结果表明DMSO和薄荷醇可能是通过影响细胞周期来增加转染效率的。总的来说,DMSO和薄荷醇处理细胞均可以显着增加转染效率,其中DMSO后处理细胞的方式可以更有效的增加转染效率3.核定位信号肽增加转染效率的研究转基因阳性细胞筛选效率低下的问题严重限制转基因动物的发展；其中外源DNA片段（尤其是大分子DNA片段）转运进入细胞核是转基因阳性细胞筛选中最重要的限速步骤。研究发现核定位信号（NLS）可以协助大分子亲核蛋白的入核转运；补骨脂素（SPB）可以非共价结合DNA片段以保护其在转运过程中不被核酸酶降解。因此,本研究人工合成经典的核定为信号肽"CGGPKKKRKVP （NLS）"以及核定为信号肽-补骨脂素复合物"SPB-PKKKRKV（SPB-NLS）"去协助大分子DNA片段的转运,希望能够增加转染效率,继而可以应用到转基因阳性细胞的筛选中去。本研究通过荧光定量PCR,激光共聚焦观察以及流式细胞检测等技术对NLS及SPB-NLS的生物学功能进行检测。荧光定量PCR结果显示：在NLS和SPB-NLS介导的转染中,生长激素（GH）的mRNA表达量分别增加了69%和330%。流式细胞检测发现绿色荧光阳性细胞的数量在SPB-NLS组中增加了32.4%；然而在NLS组中,其阳性细胞的数量却减少了75%。进一步试验（western-blot）证实SPB-NLS介导的转染可以显着的增加转染基因的表达效率（在人乳腺癌细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了GFP的表达量；在山羊乳腺上皮细胞的研究中,SPB-NLS介导的转染增加了IGF-1的表达量）。最后,本研究通过激光共聚焦显微镜观察发现SPB-NLS介导的转染可以增加外源基因如何的效率。总的来说,本研究证实SPB-NLS是一种优良的转染增强剂,很有希望被广泛用于外源基因的转染以及转基因阳性细胞的筛选。4.转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备转基因动物的制备一直以来就是人们关注的焦点和难点,尤其是转基因大型家畜的制备。本研究首先分离培养奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞,摸索不同浓度的G418对两种细胞的毒性,选取2周内能将细胞全部杀死的临界浓度作为抗性筛选浓度（800ng/mL G418:胎儿成纤维细胞,600ng/mL G418:小羊耳皮成纤维细胞）。然后通过电转染法将乳腺特异性表达载体pIN转染到小羊耳皮成纤维细胞和胎儿成纤维细胞中去。转染48小时后,更换培养基并添加G418进行抗性筛选,筛选10天左右出现明显的单克隆细胞团。此时将G418的浓度降至维持浓度（300ng/mL）,维持3-5天后,挑取单克隆细胞至48孔细胞培养板。待单克隆细胞扩大培养至6孔板后,将一部分单克隆细胞提取基因组DNA进行PCR验证,另一部分单克隆细胞冻存后用于核移植试验。本试验共筛选到46个单克隆细胞株,挑选其中生长状态良好的12个单克隆细胞进行PCR鉴定；PCR鉴定结果显示igf-1和neo基因整合进入细胞基因组的阳性克隆有2个。挑选验证阳性的单克隆细胞进行体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊。本试验共获得4只转IGF-1基因奶山羊。5.转IGF-1基因奶山羊的鉴定转基因动物基因组中不但含有特定的外源基因序列,还包括特定的启动子、调控元件和标记基因等,这些是进行转基因鉴定的基础。在鉴定转基因动物时,除了检测外源基因的存在、表达与否外,还需要对转入基因的完整性、整合位点以及拷贝数等情况进行分析。本研究首先通过普通PCR和Southern-blot鉴定所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊；然后通过绝对荧光定量PCR和热不均一交错PCR（TAIL-PCR）进一步检测体细胞核移植技术生产的转IGF-1基因奶山羊中插入的外源基因拷贝数和整合位点。普通PCR检测结果表明转IGF-1基因奶山羊基因组中整合有igf-1基因和neo基因；Southern-blot结果进一步证实所获得的克隆羊为转IGF-1基因奶山羊。绝对荧光定量可以精确的分析外源基因在基因组中的拷贝数,本研究首先制备标准曲线（log2N（拷贝数）=-1.0244△Ct+5.3576（R2=0.9963））,接着检测转IGF-1基因奶山羊中外源IGF-1基因的拷贝数,结果显示4只转IGF-1基因奶山羊中外源基因拷贝数均为8个拷贝；进一步TAIL-PCR成功鉴定了转IGF-1基因奶山羊中外源基因的部分整合位点。3轮特异性的TAIL-PCR得到的多条特异性条带,经测序和BLAST比对得到4个特异性位点,这四个位点分别位于牛基因组的2,11,16和18四条染色体中。本研究初步建立了绝对荧光定量PCR和TAIL-PCR检测外源基因拷贝数和整合位点侧翼序列分析的体系,为今后研究外源基因在转基因奶山羊的中遗传和表达奠定了基础。
陈倩[9]（2012）在《民间酵面及相关基物中酿酒酵母菌的遗传多样性和群体分化研究》文中指出本文对民间酵面及其相关基物中的酵母菌种类及其遗传多样性进行了研究。采用直接稀释涂布、酒精富集培养或直接发酵后稀释涂布的方法，从民间酵面及相关基物样品中分离出1040株酵母菌。先根据形态进行初步分类，然后依据菌株ITS1区、ITS1P区的单链构象多态性（SSCP），挑选不同带型的代表性的菌株进行ITS区和D1/D2区测序，通过国际核酸数据库分析鉴定菌种。从分离到的酵母菌中共鉴定出30个种、11属，其中包括283株酿酒酵母菌。发现了Kazachstania属新种1个，对其进行了详细的常规和分子分类学研究。以酵面中分离得酿酒酵母菌为研究对象，对其核糖体RNA基因间隔区IGS1中的高变区进行SSCP分析，结果表明民间酵面酿酒酵母菌具有很高的遗传多样性。对不同来源的酿酒酵母菌的进行多基因分析，构建系统发育树，揭示了民间酵面与其他来源的酿酒酵母菌的群体演化关系，发现酵面酿酒酵母菌属于一个独立的驯化群体，与原始森林来源的野生菌株存在明显的群体分化。本研究增加了民间酵面及其相关基物中酿酒酵母菌的数量及来源，对民间酵面酿酒酵母菌的起源有了新的认识，也为国内酵母菌多样性的研究和开发利用提供了丰富的菌株资源。
王芙蓉[10]（2010）在《Ⅰ、西洛他唑改善糖尿病大鼠肾脏炎症及其机制研究 Ⅱ、中国汉族人群OCTN2基因多态性分布及相关研究》文中提出研究目的近年来,糖尿病发病率急剧升高。糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病最常见最严重的慢性并发症之一,但其发生的确切机制未明。已有研究表明,炎症反应在糖尿病肾病发生发展中起重要作用。由免疫球蛋白超家族成员如血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1）、细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）和趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein, MCP-1）介导的单核细胞粘附至内皮细胞表面是这一炎症反应的起始步骤,参与介导糖尿病肾病的发生；另外一种重要的致炎性细胞因子血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）在糖尿病大鼠肾脏中也呈现高表达,并与微量蛋白尿的病理机制密切相关。上述致炎因子的表达均受到转录因子如核因子-κB （nuclear factor-KB, NF-κB）、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs）等的调控。因此,抑制这些致炎因子,或其相关信号通路,可做为预防或延缓糖尿病肾病的重要策略之一。西洛他唑（cilostazol）是一种磷酸二酯酶Ⅲ抑制剂,具有显着的扩张血管和抑制血小板聚集作用,广泛用于治疗代谢综合征等引起的外周血管性疾病及间歇性跛行。近来有大量研究观察到西洛他唑强大的抗炎作用,这可能是西洛他唑治疗糖尿病部分并发症的重要机制。但关于西洛他唑对糖尿病肾病的研究非常少,更难以见到关于西洛他唑对糖尿病时肾脏炎症影响的报道。本研究在前期工作基础上,采用空腹腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠肾脏病变,如肾脏肥大指数、尿微量蛋白、肾小球体积,并从分子、基因水平检测肾脏组织VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、VEGF表达,转录因子NF-κB、PPARα、PPARy表达和活性,及cAMP含量,同时观察应用西洛他唑治疗后上述指标的改变,以进一步探讨西洛他唑对DN的保护作用及可能机制。从而为糖尿病肾病的发生机制和临床治疗提供实验性理论依据,也为西洛他唑新适应症的开发提供理论基础。研究方法健康雄性SD大鼠,以65 mg.kg-1链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）腹腔注射诱发糖尿病。随机将已制备成糖尿病模型的大鼠分为3组：糖尿病对照组（DM）15只,高剂量西洛他唑治疗组（西洛他唑27 mg.kg-1.d-1灌胃给药）13只；低剂量西洛他唑组（西洛他唑9 mg.kg-1.d-1灌胃给药）13只。另设正常对照组共10只大鼠。连续治疗8周后处死动物。收集处死前1天24h尿液测尿中微量白蛋白,并计算24h尿蛋白排泄率（urine albumin excretion, UAE）。取肾脏称重,计算肾重／体重。分离肾皮质,用于下列检查：（1）HE染色观察肾脏病理改变；（2） Western blotting检测VCAM-1、ICAM-1蛋白表达；（3） RT-PCR、real-time PCR检测VCAM-1、ICAM-1、PPARα、PPARy基因表达；（4）ELISA检测MCP-1、VEGF、cAMP含量；（5）凝胶电泳迁移率分析（electrophoresis mobility shift assay, EMSA）检测转录因子NF-κB活性。研究结果1.西洛他唑对糖尿病大鼠体重、血糖和HbAlc水平无显着影响。2.糖尿病大鼠肾重／体重较正常组明显升高（p<0.01）,西洛他唑有减轻肾脏肥大的趋势。3.糖尿病组大鼠出现肾小球明显肥大,有轻度炎细胞浸润,肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚,系膜区增宽,细胞外基质增多,近端肾小管上皮细胞肿胀并玻璃样变性；低剂量西洛他唑治疗后上述病理改变得到改善,肾小球系膜区增宽、基底膜增厚均减轻,肾小管变性减少；而高剂量西洛他唑治疗后,几乎恢复至正常状态。糖尿病大鼠肾小球体积比正常大鼠增加2.1倍,高、低剂量西洛他唑可使这种肥大分别减轻51%（p<0.01）和38%（p<0.01）,证实了西洛他唑对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。4. Western blotting结果显示,糖尿病组VCAM-1表达较正常组升高近1倍（p<0.01）,高、低剂量西洛他唑可使VCAM-1表达分别下降40%（p< 0.01）和28%（p<0.01）。糖尿病大鼠ICAM-1蛋白表达量较正常组升高1倍左右,西洛他唑可剂量性依赖性地降低糖尿病大鼠肾脏ICAM-1蛋白表达。5.既往RT-PCR实验结果显示,DM组VCAM-1、ICAM-1 mRNA表达明显升高；各治疗组较糖尿病组明显降低,以高剂量组降低更明显。Real-time PCR实验进一步验证了上述结果。糖尿病大鼠VCAM-1 mRNA表达是正常组的2倍（p<0.01）, ICAM-1 mRNA表达为正常组的1.7倍（p<0.01）；高、低剂量西洛他唑分别引起VCAM-1 mRNA表达下降43%（p<0.01）和40%（p<0.05）,使得ICAM-1 mRNA表达下降38%（p<0.01）和25%（p<0.05）。6.糖尿病大鼠肾脏MCP-1含量明显升高,为正常大鼠的2倍（p<0.01）,西洛他唑明显降低MCP-1含量,且高剂量降低效果比低剂量更显着；VEGF含量与之类似,糖尿病大鼠为正常大鼠的1.6倍（p<0.01）,VEGF水平下降趋势随西洛他唑剂量增加逐渐增高,即高剂量西洛他唑组下降最为明显,低剂量组较弱。7.糖尿病大鼠肾脏组织细胞核内NF-κB-DNA结合活性显着升高,与正常组相比p<0.01；经西洛他唑治疗后NF-κB活性显着下降（在高、低剂量组分别p<0.01、p<0.05）。8. Peason相关性分析显示,VCAM-1 mRNA表达（r=0.967, p=0.000）、ICAM-1 mRNA表达（r=0.880, p=0.000）与NF-κB-DNA结合活性均呈明显正相关。9.糖尿病大鼠肾脏PPARα、PPARy mRNA表达均较正常组明显下降（p<0.01）,分别降低31%、34%；西洛他唑则显着增加两种转录因子表达,且均呈现剂量依赖性。10.肾脏中cAMP含量在各组间差异无显着性（p>0.05）。结论我们的研究表明,西洛他唑对糖尿病肾病的保护作用是通过抗炎机制实现的。包括对炎性转录因子NF-κB活性和PPARs表达的抑制,及其下游粘附分子VCAM-1、ICAM-1,趋化因子MCP-1,细胞因子VEGF表达减少。西洛他唑的抗炎作用与cAMP无关。上述结果为应用西洛他唑治疗糖尿病肾病提供了理论依据。研究目的药物基因组学研究认为,药物代谢酶、药物转运蛋白、药物作用受体或靶位等的基因变异是引起药物反应个体差异的根本原因。继药物代谢酶、药物作用靶位多态性研究之后,转运蛋白多态性在药物处置中所起作用的研究正得到越来越多的重视。新型有机阳离子转运体（novel organic cation transporters, OCTN） 2为有机阳离子型药物及内源性物质的新型转运蛋白,在人体组织广泛分布。生理作用为转运肉毒碱参与脂肪酸线粒体β-氧化,对维持心血管、神经及生殖等系统正常功能具有重要的作用。OCTN2还参与多种药物在体内的转运,如p内酰胺类抗生素、维拉帕米、螺内酯、丙戊酸盐、氟喹诺酮类抗菌药等。OCTN2基因变异可改变相应药物体内药动学过程,进而造成药物效应的改变；也可引起OCTN2功能完全丧失,使肉毒碱自尿液排泄增多,引起致死性系统性肉毒碱缺乏；还可导致OCTN2转录和转运功能改变,单独或与其他炎症性肠病相关基因相互作用,增加Crohn’s病、溃疡性结肠炎发生的危险性。迄今为止,已先后完成西方人种及日本人OCTN2基因突变（单核苷酸多态性,single nucleotide polymorphisms, SNPs）测定,且证实某些SNPs与转运功能异常有关。但占世界人口总数1／4的中国汉族人群的相关研究尚未启动。由于几乎所有已知的转运体变异均呈种族依赖性,而难以将从某一种族获得的数据运用于另一种族。目前,检测OCTN2基因变异的主要方法有RFLP、SSCP、DNA直接测序等,这些方法各有其局限性,未在大多数实验室得到应用。变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC）技术在筛查单核苷酸多态位点或基因突变方面具有高通量、特异、敏感、高效、廉价等优点,尤为适用于大样本量的未知突变筛查,在人类功能基因SNPs研究中已获得良好的应用。本研究基于OCTN2在介导生理功能和药理效应中的重要作用,旨在查明OCTN2基因多态性在中国汉族健康人群中的分布特征,这将有助于丰富人类OCTN2基因多态性数据库；有助于为药物反应个体差异提供分子水平的解释,促进个体化治疗的实施；也有助于相关疾病发病风险的预测。本研究的另外一个目的是建立DHPLC方法检测OCTN2基因变异的技术平台,结合DNA测序法对中国汉族人群进行OCTN2基因突变分析,从而为临床提供一种快速、高效、自动化的OCTN2基因变异检测方法。研究方法收集92例中国汉族健康成年志愿者,其中男性49名,女性43名,平均年龄23±1.2岁。从外周血中抽提基因组DNA。针对OCTN2基因启动子及1-10号外显子设计引物进行PCR扩增。应用DHPLC技术对扩增产物进行OCTN2基因突变筛查（待测样品与野生型样品以2：1比例混合）,通过峰形的差异对样品基因型进行区分,建立检测OCTN2基因的PCR-DHPLC技术平台。根据DHPLC的分析结果,从各种基因型中选取一定数量的样品进行DNA直接测序分析,以确认变异样本的基因型,并验证DHPLC方法的准确性。研究结果1.PCR反应共扩增1012个片段,扩增质量高,且片段大小与预期目的片段一致。2. DHPLC筛查结果显示在扩增片段中出现杂合峰与纯合峰两种情况,单个色谱峰显示为纯合链,双峰则表示是杂合异源双链。共111个扩增产物显示出杂合峰,提示有突变的异源双链存在。3.38例受试者第1外显子发生变异,经DNA测序验证为285T>C（rs2631365）,为同义突变,变异发生频率为41.3%。4.40例受试者第4外显子发生变异,经DNA测序验证为1071A>G（rs274558）,为同义突变,变异发生频率为43.5%。38例受试者第4外显子／内含子接头处发生变异（T>C）,经DNA测序验证为rs274557变异,发生频率为41.3%。16例受试者同时存在上述2种变异,发生频率为17.4%。5.11例受试者第10外显子发生变异,经DNA测序验证为3’端非翻译区碱基缺失（*92delA,rs60522531）,发生频率为12%。6.通过一系列DHPLC检测前和检测时各条件的摸索和优化,初步建立了SLC22A5突变筛查的DHPLC检测平台；经DNA直接测序证实,DHPLC筛查基因突变准确率在100%。结论及意义1.本研究系统地对OCTN2基因进行了多态性位点的扫描,这是首次用较大样本量在中国汉族人群中对OCTN2基因遗传多态性进行全面的扫描和分析,查明了中国汉族人群中基因变异情况,及变异发生频率,有助于完善中国汉族人群OCTN2基因多态性数据库,为指导华人个体化治疗并进一步研发相关的检测芯片打下了基础。2.建立了检测OCTN2基因的PCR-DHPLC技术平台,为进一步开展相关检测提供了一种有效可行的方法。采用DHPLC技术筛查点突变其准确性和敏感性都有较大优势,可以极大提高选择性DNA测序的效率。DHPLC对于检测新的点突变是一种很好的方法,作为一种高效、简便、经济可靠的基因突变筛选方法,适合于大规模的基因突变筛查。3.更大样本量的筛查,相应的功能学研究及临床研究正在进行中。
二、对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识（论文提纲范文）
（1）玉米种子转基因成分新型分子检测体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 全球转基因作物 |
| 1.2 我国转基因玉米现状 |
| 1.3 转基因作物的检测方法及研究成果 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 玉米种子转基因检测体系的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 实验结果验证 |
| 第三章 讨论 |
| 3.1 三种平台的应用比较 |
| 3.2 转基因玉米检测的现存问题及发展趋势 |
| 3.3 荧光毛细管电泳及多重PCR的优势 |
| 3.4 多重在体系构建中的难点 |
| 3.5 应用与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录A:常用转基因玉米品种分子特征信息表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能及肠道菌群的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词词表 |
| 引言 |
| 第一部分 参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验饲料 |
| 1.3 实验饲养环境 |
| 1.4 实验使用药品 |
| 1.5 主要实验仪器及实验试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 实验动物造模方法及分组 |
| 2.2 给药方法 |
| 2.3 实验检测标本的采集与处理 |
| 2.4 实验研究指标及检测方法 |
| 2.4.1 大鼠一般情况观察 |
| 2.4.2 一日内血糖波动情况测定 |
| 2.4.3 血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平检测 |
| 2.4.4 血清胰岛素(INS)水平检测 |
| 2.4.5 血清胰高血糖素(GC)水平检测 |
| 2.4.6 血清胰高血糖素样肽-1(GLP-1)水平检测 |
| 2.4.7 血清超敏C反应蛋白(hsCRP)水平检测 |
| 2.4.8 胰岛β细胞凋亡检测 |
| 2.4.9 胰腺组织病理形态学观察 |
| 2.4.10 基因表达谱芯片技术检测胰腺组织 |
| 2.4.10.1 基因芯片技术 |
| 2.4.10.2 本次基因芯片实验流程 |
| 2.4.10.3 样本总RNA的抽提、质检与纯化 |
| 2.4.10.4 荧光标记样本RNA |
| 2.4.10.5 芯片杂交 |
| 2.4.10.6 芯片的洗涤 |
| 2.4.10.7 芯片的扫描 |
| 2.4.10.8 芯片质控情况 |
| 2.4.10.9 基因芯片数据分析 |
| 2.4.11 实时荧光定量PCR检测关键差异基因 |
| 2.4.11.1 实时荧光定量PCR |
| 2.4.11.2 实验步骤 |
| 2.4.11.3 PCR扩增的基因引物序列 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 实验观察及检测结果 |
| 3.1 各组大鼠一般情况 |
| 3.2 灌胃前、4周、8周各组大鼠日摄食量比较 |
| 3.3 灌胃前、4周、8周各组大鼠日饮水量比较 |
| 3.4 灌胃前、4周、8周各组大鼠体重比较 |
| 3.5 大鼠血脂总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平 |
| 3.6 大鼠血清胰岛素(INS)、胰高血糖素(GC)水平 |
| 3.7 大鼠GLP-1水平 |
| 3.8 大鼠超敏C反应蛋白(hsCRP)水平 |
| 3.9 大鼠血糖波动情况 |
| 3.9.1 灌胃前血糖情况 |
| 3.9.2 灌胃4周血糖波动情况 |
| 3.9.3 灌胃8周血糖波动情况 |
| 3.10 大鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡情况 |
| 3.10.1 各组大鼠胰腺组织胰岛β细胞Tunel荧光双染图 |
| 3.10.2 各组大鼠胰腺组织胰岛β细胞凋亡数水平 |
| 3.10.3 各组大鼠胰腺组织胰岛素阳性IOD值/整个视野IOD值的比值 |
| 3.11 大鼠胰腺组织病理形态学观察 |
| 3.12 大鼠胰腺组织表达谱芯片结果与分析 |
| 3.12.1 差异基因筛选 |
| 3.12.2 基因与样本聚类程度分析 |
| 3.12.4 各组间差异基因统计 |
| 3.12.5 表达谱差异基因的GO功能富集分析 |
| 3.12.5.1 模型组VS正常组差异基因的GO功能富集分析 |
| 3.12.5.2 参芪复方中剂量组VS模型组差异基因的GO功能富集分析 |
| 3.12.5.3 西药组VS模型组差异表达基因GO功能富集分析 |
| 3.12.6 差异基因的pathway富集分析 |
| 3.12.6.1 模型组VS正常组差异基因的pathway富集分析 |
| 3.12.6.2 参中组VS模型组差异基因的pathway富集分析 |
| 3.12.6.3 西药组VS模型组差异基因的pathway富集分析 |
| 3.12.7 关键差异基因GCG、KCNN4、PIK3R1、AKT1、CRY1、DBP的基因芯片及PCR验证结果 |
| 3.12.7.1 胰岛素分泌相关基因分析 |
| 3.12.7.2 胰岛细胞凋亡相关基因分析 |
| 3.12.7.3 生物钟节律相关基因分析 |
| 4 小结 |
| 第二部分 参芪复方调节糖尿病GK大鼠肠道菌群的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物及饲养 |
| 1.2 主要实验试剂及实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 分组及造模方法 |
| 2.2 标本采集与处理 |
| 2.3 微生物16SrDNA测序 |
| 2.3.1 16SrDNA测序原理 |
| 2.3.2 样本的抽提与质检 |
| 2.3.3 样本测序流程 |
| 2.3.4 测序文库的构建及质检 |
| 2.3.5 上机测序 |
| 2.3.6 项目分析内容 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 OTU聚类分析 |
| 3.1.1 OTU聚类生成 |
| 3.1.2 组间OTU分布差异 |
| 3.2 Alpha多样性分析 |
| 3.2.2 Alpha多样性指数 |
| 3.2.2 香农-威纳(Shannon-Wiener)曲线 |
| 3.3 群落结构分析 |
| 3.4 Beta多样性分析 |
| 4 小结 |
| 第三部分 分析与讨论 |
| 1 祖国医学对糖尿病的认识 |
| 1.1 消渴及其变证的文献记载 |
| 1.2 祖国医学对消渴及其变证的病因病机认识 |
| 1.3 现代医家对消渴及其变证的辨治 |
| 2 现代医学对2型糖尿病的认识 |
| 2.1 2型糖尿病的流行病学研究 |
| 2.2 2型糖尿病的危险因素 |
| 2.3 2型糖尿病的发病机制 |
| 2.3.1 胰岛细胞功能与2型糖尿病 |
| 2.3.2 血糖波动与2型糖尿病 |
| 2.3.3 生物钟与2型糖尿病 |
| 2.3.3.1 生物钟及生物钟基因 |
| 2.3.3.2 生物钟节律与2型糖尿病及胰岛细胞功能的相关性 |
| 2.3.4 肠道菌群与2型糖尿病 |
| 2.3.4.1 糖尿病患者肠道菌群发生明显变化 |
| 2.3.4.2 肠道菌群失调通过多途径诱发糖尿病 |
| 3 本实验动物模型评价 |
| 4 药物选择 |
| 4.1 参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能及肠道菌群的理论思考 |
| 4.1.0 参芪复方单味药物分析 |
| 4.1.1 消渴脾(胰)亏虚,布散失常,胰岛细胞功能受损 |
| 4.1.2 消渴脾(胰)亏虚,邪气乘虚而入,肠道菌群失调 |
| 4.1.3 参芪复方健脾益气,助脾(胰)散精,保护胰岛细胞功能;扶正祛邪,调节脏腑亏虚,维持肠道菌群稳定 |
| 4.2 参芪复方前期研究 |
| 4.3 阳性对照药物的选择 |
| 4.3.1 改善胰岛细胞功能 |
| 4.3.2 减少血糖波动 |
| 4.3.3 调节肠道菌群 |
| 5 参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能及肠道菌群的机制探讨 |
| 5.1 参芪复方发挥作用的宏观指标评价 |
| 5.1.1 参芪复方对糖尿病GK大鼠一般状态、摄食量、饮水量、体重的影响 |
| 5.1.2 参芪复方对糖尿病GK大鼠血清胆固醇、甘油三酯的影响 |
| 5.1.3 参芪复方对糖尿病GK大鼠血清胰岛素、胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1的影响 |
| 5.1.4 参芪复方对糖尿病GK大鼠血清hsCRP的影响 |
| 5.1.5 参芪复方对糖尿病GK大鼠血糖波动的影响 |
| 5.1.6 参芪复方对糖尿病GK大鼠胰岛β细胞凋亡情况的影响 |
| 5.1.7 参芪复方对糖尿病GK大鼠胰腺组织损伤的影响 |
| 5.2 参芪复方调节胰岛细胞功能的微观机制分析 |
| 5.2.1 胰岛素分泌信号通路与糖尿病胰岛细胞功能的相关性分析 |
| 5.2.2 凋亡信号通路与糖尿病胰岛细胞功能的相关性分析 |
| 5.2.3 生物钟昼夜节律与糖尿病胰岛细胞功能的相关性分析 |
| 5.3 参芪复方调节肠道菌群的机制分析 |
| 5.4 参芪复方通过健脾益气,助脾(胰)散精,保护胰岛细胞功能;扶正祛邪,调节脏腑亏虚,维持肠道菌群稳定,达到防治2型糖尿病的作用 |
| 6 创新性及特色 |
| 7 结论 |
| 8 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的学术论文 |
（3）凝胶内长片段基因克隆的实验方法研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 单核细胞系THP1的培养与m RNA制备 |
| 1.2 5’RACE c DNA的制备 (5’Rapid Amplification of c DNAEnds, 5’RACE) |
| 1.3 5’RACE的PCR扩增 |
| 1.4 凝胶电泳检测PCR产物和目的片段的回收PCR |
| 1.5 PCR产物凝胶内连接、转化和鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 5’RACE扩增的特异性基因片段 |
| 2.2 凝胶内连接、转化及单克隆的获得 |
| 2.3 测序验证阳性克隆的序列 |
| 3 讨论 |
（4）鱼藤酮诱导SH-SY5Y帕金森模型中对FOXO3a在自噬凋亡中作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 相关背景知识介绍 |
| 第一节 关于PD、路易小体与a-synuclein蛋白 |
| 第二节 关于自噬的一些基础知识 |
| 第三节 自噬溶酶体,路易小体以及细胞死亡的关系探讨 |
| 第四节 多巴胺能神经元细胞死亡、自噬与帕金森病 |
| 第二章 建立理想的帕金森细胞模型 |
| 第一节 如何选择与自噬连接紧密的相关细胞模型 |
| 第二节 为什么选择鱼藤酮建立PD细胞模型 |
| 第三节 为什么选择SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型 |
| 第三章 预试验判断细胞凋亡 |
| 第一节 预试验1 |
| 第二节 预试验2 |
| 第三节 预试验3 |
| 第四章 预试验细胞内自噬情况 |
| 第一节 筛查该模型是否与自噬相关分子相关 |
| 第二节 预试验4 |
| 第三节 选择适当的自噬抑制剂进行反向验证 |
| 第四节 预实验5 |
| 第五节 实验总结 |
| 第五章 自噬在SH-SY5Y细胞凋亡中扮演的角色 |
| 第一节 自噬抑制细胞凋亡试验 |
| 第二节 自噬激活影响细胞凋亡的试验 |
| 第三节 实验总结 |
| 第六章 关于FOXO3a蛋白的背景知识 |
| 第一节 基本情况介绍 |
| 第二节 FOXO的磷酸化作用与生物学效应 |
| 第三节 Akt与FOXO3a蛋白 |
| 第四节 FOXO3a蛋白的磷酸化与核内外运输代谢 |
| 第五节 FOXO蛋白的下游转录蛋白 |
| 第六节 神经细胞与FOXO3蛋白 |
| 第七节 帕金森病与FOXO3a |
| 第七章 在SH-SY5Y细胞模型上关于FOXO3a的预试验 |
| 第一节 预试验1 FOXO3a蛋白与诱导药物剂量对比验证 |
| 第二节 预试验2 FOXO3a蛋白表达量与细胞凋亡变化测试 |
| 第三节 预试验3 FOXO3a与相关应激后代谢修复\凋亡蛋白的影响变化 |
| 第四节 前七章试验总结 |
| 第八章 FOXO3a过表达质粒构建及与siRNA质粒的验证 |
| 第一节 细胞培养 |
| 第二节 siRNA转染SH-SY5Y细胞 |
| 第三节 实时荧光定量PCR检测 |
| 第四节 在SH-SY5Y细胞系内构建FOXO3a过表达载体 |
| 第四节 过表达质粒转染SH-SY5Y后的蛋白质验证 |
| 第六节 过表达质粒与siRNA共同对照FOXO3a蛋白表达测定 |
| 第七节 实验总结 |
| 第九章 FOXO3a蛋白抑制与过表达对细胞模型凋亡的影响 |
| 第一节 试验分组转染及细胞分组处理 |
| 第二节 细胞增殖检测(CCK-8法) |
| 第三节 实验总结 |
| 第十章 FOXO3a蛋白对细胞模型自噬及凋亡的影响 |
| 第一节 试验分组转染及细胞分组处理 |
| 第二节 自噬蛋白测定 |
| 第三节 CCK8细胞活性试验测定细胞凋亡 |
| 第四节 本次实验总结 |
| 第十一章 对FOXO3a促凋亡的上游分子的进一步检验 |
| 第一节 对FOXO3a上游分子的筛查试验 |
| 第二节 JNK简介 |
| 第三节 JNK抑制实验与siRNA实验 |
| 第十二章 总结讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 部分缩写简称中英文对照 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（5）一种快速凝胶电泳及实时成像装置的研制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.2 凝胶电泳技术 |
| 1.3 凝胶电泳的种类 |
| 1.3.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.3.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 1.4 本论文主要研究内容 |
| 第二章 机械与电路控制系统设计 |
| 2.1 凝胶电泳芯片设计 |
| 2.1.1 结构设计 |
| 2.1.2 材料选取 |
| 2.1.3 试验论证 |
| 2.2 电泳装置结构设计 |
| 2.3 电源设计 |
| 2.3.1 常见DC-DC升压电路 |
| 2.3.2 直流稳压电路原理 |
| 2.3.3 开关电源电路常见拓扑结构 |
| 2.4 单端隔离反激式开关电源 |
| 2.4.1 反激式开关电源基本原理 |
| 2.4.2 单端反激式开关电源电路 |
| 2.4.3 单端反激式开关电源电路 |
| 2.5 驱动电路设计 |
| 2.5.1 驱动芯片选择 |
| 2.5.2 驱动芯片及外围电路 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 SGE软件设计 |
| 3.1 快速凝胶电泳仪的PC软件设计 |
| 3.1.1 系统的功能需求 |
| 3.1.2 软件开发 |
| 3.2 图像处理算法 |
| 3.2.1 彩色图像灰度化 |
| 3.2.2 图像降噪处理 |
| 3.2.3 图像增强 |
| 3.3 条带识别 |
| 3.3.1 条带检测 |
| 3.3.2 条带边缘检测 |
| 3.3.3 条带的泳道识别 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 快速凝胶电泳及实时成像装置功能测试 |
| 4.1 快速凝胶电泳及实时成像装置检测 |
| 4.1.1 硬件电路功能测试 |
| 4.1.2 软件功能测试 |
| 4.2 实验验证 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间公开发表的论文和承担科研项目及取得成果 |
| 致谢 |
（6）喜树亭碱类似物的设计、合成及抗肿瘤活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 化合物结构和编号 |
| 第一章 靶向拓扑异构酶Ⅰ的抗肿瘤化合物及其活性研究进展 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 DNA拓扑异构酶Ⅰ |
| 1.2.1 DNA拓扑异构酶Ⅰ结构与活性位点 |
| 1.2.2 DNA拓扑异构酶Ⅰ功能及催化过程 |
| 1.3 拓扑异构酶Ⅰ抑制剂的研究进展 |
| 1.3.1 喜树碱及其衍生物的研究进展 |
| 1.3.2 非喜树碱类Topo Ⅰ抑制剂的研究进展 |
| 1.4 本课题设计思路及研究内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 喜树亭碱类似物的设计、合成与表征 |
| 2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 合成路线 |
| 2.2.2 化合物1的合成 |
| 2.2.3 化合物2的合成与表征 |
| 2.2.4 化合物3～5的合成与表征 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 喜树亭碱类似物的体外抗肿瘤活性研究 |
| 3.1 实验仪器及试剂 |
| 3.1.1 实验仪器 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 肿瘤细胞株 |
| 3.2 喜树亭碱类似物体外抗肿瘤活性研究 |
| 3.2.1 体外抗肿瘤活性研究实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 喜树亭碱类似物的抗肿瘤作用机制研究 |
| 4.1 实验仪器及试剂 |
| 4.1.1 实验仪器 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 肿瘤细胞株 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 细胞周期实验 |
| 4.2.2 FITC Annexin V/PI细胞凋亡检测 |
| 4.2.3 Hoechst 33258染色实验测定细胞凋亡 |
| 4.2.4 活性氧(ROS)生成的测量 |
| 4.2.5 细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)])的测量 |
| 4.2.6 Rhodamine 123染色检测线粒体跨膜电位(ΔΨ_m) |
| 4.2.7 Western blot蛋白印记实验 |
| 4.2.8 琼脂糖凝胶电泳实验 |
| 4.2.9 分子对接实验 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 细胞周期分析 |
| 4.3.2 细胞凋亡分析 |
| 4.3.3 细胞间活性氧(ROS)水平的分析 |
| 4.3.4 细胞内钙离子浓度([Ca~(2+)])分析 |
| 4.3.5 线粒体跨膜电位(ΔΨ_m)的检测与分析 |
| 4.3.6 Western blot蛋白印记实验结果分析 |
| 4.3.7 琼脂糖凝胶电泳实验分析 |
| 4.3.8 分子对接实验分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 论文总结 |
| 附录 部分化合物的NMR图和HMRS图 |
| 致谢 |
（7）农村污水膜生物反应器系统中微生物群落解析（论文提纲范文）
| 1材料与方法 |
| 1. 1样品采集及处理 |
| 1. 2实验仪器 |
| 1. 3基因组DNA提取 |
| 1. 4 16S r DNA基因克隆文库构建 |
| 1. 4. 1基因组DNA的PCR扩增 |
| 1. 4. 2 16S r DNA基因克隆、转化和文库构建 |
| 1. 4. 3 16S r DNA基因克隆文库多样性分析 |
| 1. 4. 4构建系统发育树 |
| 1. 5 T-RFLP分析 |
| 1. 6实时荧光定量PCR |
| 2结果与讨论 |
| 2. 1污水处理工艺水质指标及处理效果分析 |
| 2. 2 16S r DNA基因克隆文库建立 |
| 2. 3 T-RFLP结果分析 |
| 2. 4病原菌定量结果分析 |
| 3结论 |
（8）体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 转基因动物研发现状的研究进展 |
| 1 传统转基因技术 |
| 1.1 显微注射法 |
| 1.2 精子载体法 |
| 1.3 逆转录病毒感染法 |
| 1.4 胚胎干细胞介导法 |
| 2 现代的转基因技术 |
| 2.1 体细胞核移植技术 |
| 2.2 基因打靶技术 |
| 2.3 RNA干扰介导的基因沉默技术 |
| 2.4 慢病毒载体技术 |
| 2.5 诱导多能干细胞转基因技术 |
| 2.6 多基因转基因表达策略和分时段的调控表达策略 |
| 3 乳腺的进化、发育及泌乳调节 |
| 3.1 乳腺发育及泌乳 |
| 3.2 激素和细胞因子对乳腺发育的影响 |
| 3.3 影响乳腺的进化和泌乳的基因 |
| 3.4 影响乳腺表达的其它因素 |
| 4 IGF-1的功能及其与泌乳的关系 |
| 4.1 IGF-I基因的结构及定位 |
| 4.2 IGF-1的生物活性 |
| 4.3 IGF-1与乳腺发育以及泌乳之间的关系 |
| 第二章 提高转基因阳性细胞筛选效率的几种策略 |
| 1 转基因研究的瓶颈 |
| 1.1 转基因供体阳性细胞筛选效率过低,转基因总体效率低下 |
| 1.2 外源基因表达不稳定,表达水平低下 |
| 1.3 插入的基因的位置难以控制 |
| 2 外源DNA克服屏障进入细胞的机制 |
| 2.1 细胞内吞机制 |
| 2.2 溶酶体逃避的机制 |
| 2.3 胞质内的运输 |
| 2.4 外源DNA进入细胞核的途径 |
| 3 核定位信号肽促进DNA入核,增加转染效率 |
| 3.1 核定位信号的分类 |
| 3.2 核定位信号介导的入核机制 |
| 3.3 核输入的结构基础及调控 |
| 3.4 核定位信号肽及其复合物的应用 |
| 4 双亲性小分子作用细胞增加转染效率 |
| 4.1 双亲性小分子与核孔复合体之间的相互作用 |
| 4.2 双亲性小分子增加转染效率的研究 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第三章 山羊乳腺特异性表达载体PIN的构建及其功能验证 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 类胰岛素生长因子(IGF-1)基因的克隆 |
| 1.3 标记基因新霉素(neo)的克隆 |
| 1.4 乳腺特异性表达载体pIN的构建与验证 |
| 1.5 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 igf-1基因和neo基因的克隆与分析 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体pIN的鉴定 |
| 2.3 乳腺特异性表达载体pIN的生物学功功能验证 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 双亲性小分子DMSO和薄荷醇增加转染效率的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 MTT细胞毒性试验确定DMSO和薄荷醇使用浓度 |
| 1.3 荧光定量PCR检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.4 荧光显微镜观察DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇处理对细胞转染效率的影响 |
| 1.6 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 MTT法检测不同浓度DMSO和薄荷醇对细胞的细胞毒性作用 |
| 2.2 荧光定量PCR检测转染效率 |
| 2.3 荧光显微镜观察转染情况 |
| 2.4 流式细胞检测转染效率 |
| 2.5 流式细胞检测DMSO和薄荷醇作用对细胞周期的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 核定位信号肽增加转染效率的研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 NLS/DNA和SPB-NLS/DNA复合物的制备 |
| 1.3 琼脂糖凝胶阻滞试验 |
| 1.4 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 |
| 1.5 流式细胞分析NLS和SPB-NLS对细胞周期的影响 |
| 1.6 激光共聚焦观察NLS和SPB-NLS协助质粒DNA入核情况 |
| 1.7 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 |
| 1.8 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 琼脂糖凝胶阻滞试验确定最佳DNA与NLS/SPB-NLS的复合浓度 |
| 2.2 NLS和SPB-NLS对转染效率的影响 |
| 2.3 流式检测NLS和SPB-NLS介导的转染对细胞周期的影响 |
| 2.4 激光共聚焦观察质粒DNA的入核情况 |
| 2.5 Western-blot检测SPB-NLS介导的质粒在山羊乳腺上皮细胞上的表达情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 转IGF-1基因阳性克隆细胞的筛选及转IGF-1基因奶山羊的制备 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 小羊耳皮成纤维细胞的分离和G418梯度抗性试验 |
| 1.3 乳腺特异性表达载体pIN转染成纤维细胞与细胞筛选 |
| 1.4 单克隆阳性细胞的PCR验证 |
| 1.5 核移植转IGF-1基因奶山羊的制备 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞和小羊耳皮成纤维细胞G418梯度抗性试验 |
| 2.2 乳腺特异性表达载体pIn转染成纤细胞及细胞筛选 |
| 2.3 单克隆阳性细胞的PCR验证 |
| 2.4 转pIN基因奶山羊的制备情况 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 转IGF-1基因奶山羊的鉴定 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料和仪器 |
| 1.2 PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊 |
| 1.3 Southern-blot鉴定转IGF-1基因奶山羊 |
| 1.4 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入基因拷贝数 |
| 1.5 TAIL-PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊插入位点序列 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PCR鉴定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 |
| 2.2 Southern-blot进一步确定克隆奶山羊为转IGF-1基因奶山羊 |
| 2.3 荧光定量PCR鉴定转IGF-1基因奶山羊质粒插入拷贝数 |
| 2.4 TAIL-PCR鉴定转转IGF-1基因奶山羊外源基因插入位点序列 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 本文创新点 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）民间酵面及相关基物中酿酒酵母菌的遗传多样性和群体分化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 第1章 研究背景及研究进展 |
| 1.1 酵母菌的概述 |
| 1.2 种群遗传变异的检测方法 |
| 1.2.1 同工酶电泳 |
| 1.2.2 限制性片段长度多态性分析（RFLP） |
| 1.2.3 脉冲电泳（PFGE） |
| 1.2.4 DNA 指纹图谱 |
| 1.2.5 DNA G+C 摩尔百分含量分析 |
| 1.2.6 单链构象多态性分析（SSCP） |
| 1.2.7 DNA 序列测定 |
| 1.2.8 DNA 芯片 |
| 1.3 酿酒酵母概述 |
| 1.4 酿酒酵母种群的研究现状 |
| 1.5 本文研究的内容和方法 |
| 第2章 酵母菌的分离 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 样品采集 |
| 2.2.2 样品富集培养 |
| 2.2.3 酵母菌的分离、纯化及保藏 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 酵面中酵母的分离结果 |
| 2.3.2 酵面相关基物酵母菌株分离结果 |
| 本章小结 |
| 第3章 酵母菌的鉴定 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 酵母菌鉴定方法 |
| 3.2.3 PCR 扩增及测序 |
| 3.2.4 脉冲电泳（PFGE） |
| 3.2.5 单链构象多态性分析（SSCP） |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 酵面酿酒酵母的鉴定 |
| 3.3.2 酵面相关基物酵母菌株鉴定结果 |
| 3.3.3 酵母菌新种的鉴定和描述 |
| 本章小结 |
| 第4章 酿酒酵母遗传多样性分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 IGS1-VR1 区 PCR 扩增 |
| 4.2.3 IGS1-VR1 区单链构象多态性分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 本章小结 |
| 第5章 酿酒酵母群体分化 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 酶解法提取酵母总 DNA |
| 5.2.3 PCR 扩增和测序 |
| 5.2.4 DNA 序列分析 |
| 5.2.5 克隆测序 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 酿酒酵母的群体分化 |
| 5.3.2 克隆间的系统关系 |
| 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）Ⅰ、西洛他唑改善糖尿病大鼠肾脏炎症及其机制研究 Ⅱ、中国汉族人群OCTN2基因多态性分布及相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 西洛他哩改善糖尿病大鼠肾脏炎症及其机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 第二部分 中国汉族人群OC下NZ基因多态性分布及相关研究 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论及展望 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文一 |
| 英文论文二 |
四、对琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段的有效性的再认识（论文参考文献）
- [1]玉米种子转基因成分新型分子检测体系的建立[D]. 任星旭. 吉林农业大学, 2021
- [2]参芪复方调节糖尿病GK大鼠胰岛细胞功能及肠道菌群的实验研究[D]. 张翕宇. 成都中医药大学, 2019(04)
- [3]凝胶内长片段基因克隆的实验方法研究[J]. 宋莉,刘鲁滨,孙莹莹,肖宁,宋燕,张银辉,孟宪敏,陈敬洲. 中国分子心脏病学杂志, 2018(03)
- [4]鱼藤酮诱导SH-SY5Y帕金森模型中对FOXO3a在自噬凋亡中作用的研究[D]. 王越. 南方医科大学, 2018(12)
- [5]一种快速凝胶电泳及实时成像装置的研制[D]. 杨波. 上海理工大学, 2018(04)
- [6]喜树亭碱类似物的设计、合成及抗肿瘤活性研究[D]. 魏凯. 广西师范大学, 2016(05)
- [7]农村污水膜生物反应器系统中微生物群落解析[J]. 孔晓,崔丙健,金德才,吴尚华,杨波,邓晔,庄国强,庄绪亮. 环境科学, 2015(09)
- [8]体细胞核移植制备转IGF-1基因奶山羊的研究[D]. 林建. 南京农业大学, 2013(08)
- [9]民间酵面及相关基物中酿酒酵母菌的遗传多样性和群体分化研究[D]. 陈倩. 黑龙江大学, 2012(10)
- [10]Ⅰ、西洛他唑改善糖尿病大鼠肾脏炎症及其机制研究 Ⅱ、中国汉族人群OCTN2基因多态性分布及相关研究[D]. 王芙蓉. 山东大学, 2010(09)