一、一种快速检测启动子特异性的方法（论文文献综述）
马才[1]（2021）在《基于蛋白质组学和蛋白质翻译后修饰组学的猪肌内脂肪沉积机制分析》文中指出猪肉产品的消费是居民日常肉产品消费的主要来源,提高肉质水平是随着时代发展而出现的消费者需求。适度地提高肌内脂肪含量可以显着改善猪肉的嫩度和风味,满足消费者日益增长的需求。肌内脂肪（Intramuscular fat,IMF）,又称为大理石花纹,是指位于肌纤维附近和肌束膜结缔组织中的脂肪,它对人类健康具有重要意义。影响IMF含量的因素有很多,其中遗传因素对IMF含量影响较大,地方品种猪的IMF含量高于西方品种,地方品种猪中又以莱芜猪为典型代表。莱芜猪是华北型优良地方猪种,IMF含量高达10%,远高于其他品种,是研究IMF含量变化的理想实验材料。在我们课题组前期工作中,通过对莱芜猪四个发育时期背最长肌组织的转录组和甲基化组测序,发现莱芜猪IMF沉积最快速时期是120d到240d,并筛选出一些与IMF生成有关的基因。本研究进一步分析该时间段莱芜猪背最长肌组织蛋白质组和丙二酰化蛋白修饰组的变化,探讨影响莱芜猪IMF沉积的关键候选蛋白/丙二酰化蛋白及背最长肌脂肪沉积相关基因的功能。结果如下:（1）本研究利用TMT定量蛋白质组学技术对120d和240d莱芜猪背最长肌组织进行了蛋白表达谱分析,结果发现5074种蛋白质中有4770个蛋白质具有定量信息。根据240d与120d蛋白丰度值比值>1.2或<0.83的选择标准（P<0.05）,共获得191种差异表达蛋白,其中包括69个下调蛋白,122个上调蛋白。生物信息学分析结果显示大部分差异蛋白能够同时参与多个生物学过程以应对机体内的代谢变化。亚细胞结构定位显示大部分差异蛋白定位于细胞核中。KEGG通路富集分析表明,由差异蛋白CA2、CA13和GLUL参与的氮代谢信号通路被显着富集。蛋白互作结果显示差异蛋白CARNS1、ALDH1B1、GLUL和AMT形成一个互作网络,其中GLUL与其他差异蛋白互作最为紧密。对9个差异蛋白进行了实时荧光定量PCR和平行反应监测（parallel reaction monitoring,PRM）技术进行靶向检测,结果显示这些差异蛋白的表达趋势与蛋白质组学结果一致。（2）对120d和240d莱芜猪背最长肌组织进行了丙二酰化蛋白质组学表达谱分析,鉴定到188个蛋白质中有291个丙二酰化位点。生物信息学分析结果显示丙二酰化蛋白参与的分子功能主要有结合、催化活性等;参与的细胞组分主要包括细胞内过程、细胞器、大分子复合物等。蛋白结构域富集结果表明,丙二酰化蛋白主要参与RNA识别基序、核苷酸结合α-β辫状结构域和孔蛋白结构域。KEGG通路富集分析表明,丙二酰化蛋白参与的细胞通路有不饱和脂肪酸的生物合成、肌动蛋白细胞骨架调节、脂肪酸链的延伸以及糖酵解/糖异生通路。亚细胞定位结果表明丙二酰化蛋白主要定位于细胞质（48%）、细胞核（27%）、线粒体（10%）中。为了探讨ACOT7的丙二酰化修饰在猪背最长肌脂肪沉积过程中发挥的功能,我们首先对ACOT7的表达变化规律进行了分析,发现随着3T3的诱导分化ACOT7在m RNA水平的表达显着增加而蛋白水平的表达并没有发生显着变化,但是它的丙二酰化水平发生了显着变化;在3T3诱导分化过程中,ACOT7的丙二酰化水平在诱导分化10d时显着高于诱导分化到6d时。此外ACOT7的丙二酰化与细胞内丙二酰辅酶A浓度密不可分,在本研究中我们首次发现3T3细胞中的丙二酰辅酶A主要是由ACSF3生成。（3）在蛋白质组学分析中我们发现ZNF512在莱芜猪背最长肌组织中的动态变化规律与IMF沉积趋势完全相反,这提示ZNF512可能抑制甘油三酯生成或是促进脂肪分解。我们选择ZNF512作为候选差异蛋白来进一步探究它在脂肪形成过程中的功能。我们首先比较了不同品种间肌肉组织中ZNF512的蛋白表达丰度,结果发现ZNF512在莱芜猪中的蛋白表达丰度显着低于其在三元杂交猪中的蛋白表达丰度,我们在细胞水平也观察到同样结果,随着3T3诱导分化时间增加ZNF512在m RNA水平的表达逐渐降低,而甘油三酯（TAG）生成量显着增加;ZNF512干扰后TAG生成量显着增加,同时成脂基因的表达发生显着上调;而ZNF512过表达后TAG生成量显着减少,成脂基因的表达发生显着下调。综上所述,ZNF512在脂肪沉积过程中对TAG的生成起负调控作用。（4）甘油-3-磷酸酰基转移酶3（GPAT3）是调控TAG生成的限速酶和关键基因,我们发现它在莱芜猪背最长肌发育过程中的动态变化规律与IMF沉积趋势相一致,因此将GPAT3作为猪IMF沉积的候选基因作进一步的分析。结果表明,GPAT3的表达存在品种间差异,它在莱芜猪中的表达显着高于其在三元杂交猪中的表达;GPAT3基因5’调控区存在两处SNPs,其中TSS位点上游-1526处T等位基因能够显着增强GPAT3的转录活性。群体基因型分布检测结果表明与瘦肉型猪相比,T等位基因和TT基因型在脂肪型猪中更占优势。这些数据表明GPAT3启动子区-1526处的SNP位点是一个与IMF沉积有关的潜在DNA分子标记。综上所述,为了探讨莱芜猪IMF沉积的分子机制,我们对莱芜猪背最长肌进行了240d和120d的蛋白质组学的对比分析,共筛选到191个差异蛋白,其中CA13等6个蛋白是与猪脂肪快速沉积有关;对其进行的丙二酰化蛋白质组学分析筛选到31个差异丙二酰化修饰蛋白,其中PGAM2等的差异丙二酰化与猪脂肪快速沉积有关;ZNF512在脂肪沉积过程中起到一个负调控作用;GPAT3启动子上游-1526处的SNP位点是猪脂肪沉积性状的一个潜在的DNA分子标记。
雷建峰[2]（2021）在《棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究》文中研究表明棉花基因功能的鉴定和新品种的选育离不开突变体的获得,CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现为实现棉花分子育种提供了强大的技术工具。目前,棉花基因编辑技术体系已经建立并陆续得到升级和改良（CRISPR/Cpf1和单碱基编辑系统）。然而,要实现棉花目标基因的靶向编辑必须要经过转基因,通过组织培养的方法才能获得目标基因突变体。而棉花的遗传转化费时费力,周期长,且受棉花品种基因型的限制,仅有少数几个棉种可以进行有效的遗传转化。针对以上问题,本研究主要开展了两种途径的研究。第一种途径:以棉花花粉作为转基因受体,构建棉花生殖特异性CRISPR/Cas9基因编辑体系,在花粉内部靶向敲除目标基因,然后以突变后的花粉通过授粉的方式获得棉花突变体;第二种途径:建立基于棉花叶皱缩病毒CLCr V介导的基因编辑系统（VIGE）,以超表达Cas9（Cas9-OE）的棉花作为转基因受体,利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至棉花顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的棉花突变体。验证通过以上两种途径可以避开组织培养,高效获得棉花突变体。主要研究结果如下:1.在棉花TM-1根、茎、叶、花粉、萼片和花瓣6个组织中分析了GhPLIM2b和GhMYB24基因的组织特异性。结果显示:GhPLIM2b基因在棉花花粉中特异表达,而GhMYB24是一个在棉花花粉中表达的基因;进而克隆了GhPLIM2b（1530 bp）和GhMYB24（1435 bp）启动子,并成功构建了GhPLIM2b P::GUS和GhMYB24P::GUS的融合表达载体。瞬时转化棉花花粉GUS组织化学染色结果显示:GhPLIM2b和GhMYB24启动子均能驱动GUS在棉花花粉中表达,棉花花粉被染成蓝色,且这两个启动子转录活性无明显差异;使用GhPLIM2b和GhMYB24启动子驱动Cas9基因表达,设计了靶向编辑棉花GhCLA1、GhGGB和GhERA1的编辑载体。突变检测结果显示:GhMYB24P::Cas9和GhPLIM2b P::Cas9编辑载体均可以实现对棉花花粉内源基因的靶向编辑,编辑效率为3.29%-6.45%,且这两个编辑系统编辑效率无明显差异,但存在少数的脱靶现象。由于转化后的大部分花粉已经失去了授粉活力,导致无法以基因编辑的花粉通过授粉的方式获得可遗传基因编辑的后代。本研究证明了GhPLIM2b P::Cas9和GhMYB24P::Cas9编辑体系的有效性,为使用棉花花粉作为转基因受体快速获得棉花突变体提供了有效的基因编辑系统。2.在拟南芥中建立了基于棉花叶皱缩病毒CLCrV介导的VIGE系统,以Cas9-OE拟南芥作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统靶向敲除了拟南芥BRI1、GL2和PDS以及转基因GUS基因,验证了该系统的可行性和高效性;同时,证明了以分生组织高效表达的Pro Yao::Cas9转基因拟南芥作为转基因受体,可以显着提高CLCr V介导的VIGE的基因编辑效率;针对VIGE系统的不足,进一步将102 bp FT m RNA与sg RNA融合去转化Pro Yao::Cas9和Pro35S::Cas9拟南芥,探究利用拟南芥成花素FT基因将sg RNA长距离运输至植物顶端分生组织的功能,以期避开组织培养的过程来获得稳定遗传的突变后代。结果显示:5’端融合了FT m RNA的sg RNA（FT策略）,可以在当代植株中有效实现基因编辑。同时,也可以不经过稳定遗传转化的过程获得可遗传的突变后代,后代发生编辑的效率为4.35%-8.79%。此外,由FT-sg RNA产生的基因编辑的后代中并不存在CLCr V病毒基因组成分。利用FT-sg RNA策略在拟南芥上获得了可遗传给后代的基因编辑,展现了该策略在作物功能基因组学和分子设计育种中具有广阔的应用前景。3.为了扩展CLCrV介导的VIGE体系的应用范围,在棉花中测试了CLCr V介导的VIGE系统的可行性。以Cas9-OE棉花作为转基因受体,利用CLCr V介导的VIGE系统高效地实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的靶向编辑,证明了CLCr V介导的VIGE系统同样适用于棉花;与此同时,CLCr V介导的VIGE系统在棉花中可以同时投送多个sg RNAs,实现了棉花GhPDS和GhCLA1基因的双突变;鉴于FT-sg RNA策略在拟南芥中能够实现可遗传的基因编辑后代,进一步验证该策略在棉花中是否同样适用。结果显示:102 bp的FT m RNA融合到sg RNA的5’同样也能够实现棉花内源基因GhPDS、GhCLA1、GhBsrk1和GhMAPKKK2的靶向编辑;在棉花中CLCr V介导的VIGE系统,在不依赖FT-sg RNA的情况下,仍然可以实现棉花胚珠细胞的基因编辑。且由CLCr V介导的VIGE产生的基因编辑的后代（胚珠）中并不存在CLCr V病毒基因组成分。CLCr V介导的VIGE系统在棉花中的成功应用为棉花生物学研究、大规模构建棉花基因突变体库和实现棉花全基因组水平上的精准遗传改良奠定了重要的技术基础。
郑娜[3]（2021）在《大豆卵细胞特异表达CRISPR/Cas9基因编辑体系的开发与应用》文中研究表明大豆（Glycine max（L.）Merr.）是世界上重要的粮食和油料作物之一,由古四倍体进化的二倍体植物,基因组较大,且高度重复。已对一些品种和资源进行全基因组测序,并获得序列信息,为大豆基因功能的研究奠定了基础。但由于大豆稳定遗传转化困难,效率低,且受品种差异的影响,导致大豆基因功能的研究进展缓慢。CRIPSR/Cas9基因组编辑技术因经济高效,操作简便,被广泛应用于各类生物的研究中,特别是作物性状改良、基因功能研究及育种等方面。目前CRISPR/Cas9已成功诱导大豆靶标基因发生突变,但由于转化中嵌合体的存在,导致利用组成型启动子诱导的突变不能稳定遗传给后代。本论文围绕特异的大豆CRISPR/Cas9基因组编辑新体系的构建,编辑效率及多靶标位点同时编辑等核心问题及关键技术展开研究,主要工作及结果如下:1.构建不同的用于大豆转基因发根的CRISPR/Cas9体系,成功诱导大豆内源基因单靶标位点和双靶标位点的突变,其中2X35Sp驱动的CRISPR/Cas9基因组编辑系统可高效诱导双靶标位点的突变,且突变效率与guide RNA的活性相关;2.基于组成型表达的CRISPR/Cas9成功编辑大豆转基因发根内源基因的基础上,设计并构建了一套简单方便的多靶标位点编辑的CRISPR/Cas9系统,可视化GFP标签及植物除草剂Bar标签共同用于筛选转基因阳性植株或非转基因的突变体;用于同时靶向编辑大豆发根或转基因植株中2或4或6个靶标位点;3.针对特异性表达的CRISPR/Cas9体系,四个不同的卵细胞启动子（两个源自拟南芥:At P5p、At EC1.2e1.1p;两个来自大豆:Gm EC1.1p、Gm EC1.2p）用于在卵细胞及胚胎早期发育阶段表达Cas9,并利用农杆菌介导大豆的稳定转化。其中At EC1.2e1.1p:Cas9成功诱导T1代Gm AGO7a发生可遗传突变,编辑效率为26.8%;在T2代转基因植株中检测到靶标位点Gm AGO7a和Gm AGO7b都发生编辑,说明At EC1.2e1.1p:Cas9在T2代卵细胞及胚胎发育早期继续诱导靶标位点发生编辑。Gm AGO7b的突变效率很低,同转基因发根中结果一致,表明利用发根体系检测guide RNA的活性是保证高效率突变的行之有效的方法。4.利用拟南芥辅助研究四个不同卵细胞特异表达CRISPR/Cas9系统的编辑效率。结果显示,T1代,At EC1.2e1.1p:Cas9诱导At RPS4发生双等位基因突变,且突变可遗传;T2代,At P5p、At EC1.2e1.1p及Gm EC1.1p都介导At RPS4位点编辑的效率为8.3%到42.9%,但仅At EC1.2e1.1p:Cas9的At RPS4B位点成功编辑,Gm EC1.2p并未检测到靶标位点发生编辑;通过植物自身的遗传分离,在T3代获得了非转基因的单靶位点纯合突变体和双靶位点纯合突变体,再次证明靶标位点的编辑效率与guide RNA的活性密切相关;表型鉴定也显示基于Ws背景的突变体是有效的。综合以上结果,说明特异性表达的CRISPR基因编辑平台,可以在不发生体细胞突变的情况下产生可遗传的大豆和拟南芥突变体,为更有效地研究大豆和拟南芥基因的功能提供了一定的技术支撑。
岳静伟[4]（2021）在《大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析》文中指出胚胎期猪骨骼肌的发育受转录机制的精确调控,转录机制取决于染色质可及性。然而,关于染色质可及性如何在猪胚胎期骨骼肌发育过程中起调节作用的研究却鲜有报道。本研究利用ATAC-Seq（Transposase-accessible chromatin with high-through sequencing）和RNA-Seq技术对大白猪（Large White,LW）和民猪（Min pigs,M）妊娠期45天、70天和100天的胚胎期骨骼肌组织中的染色质可及性和转录变化进行鉴定,同时利用加权共表达网络分析（Weighted correlation network analysis,WGCNA）推测与猪胚胎期骨骼肌发育相关的共表达基因,然后对这些基因进行差异分析,推测导致不同品种猪的骨骼肌发育差异的候选基因;并进一步与GWAS结果相结合,推测影响肌纤维直径和肌纤维密度的候选基因。分别在大白猪妊娠期45天、70天和100天的胚胎中检测到21638、35447和60181个染色质可及性区域（Accessible chromatin regions,ACRs）;其中有13%-29%ACRs被注释到基因近端启动子区。45、70和100 dpc（day post-coitus）分别检测到722、989和5688个阶段特异性ACRs注释基因,这些基因均能显着富集到肌肉发育相关通路中。MYOG在45 dpc时显着富集,MEF2A、MEF2C和MEF2D在100 dpc时显着富集;在70 dpc时,检测到一个潜在的转录抑制因子,即E2F6;在LW70 vs LW45、LW100 vs LW70和LW100 vs LW45中,分别发现3、20和113个在ATAC-seq中下调但是在RNA-seq中呈上调趋势的基因,以及0、5和12个在ATAC-seq中上调但是在RNA-seq中呈下调趋势的基因。分别在民猪妊娠期45天、70天和100天的胚胎中检测到35088、61676和58264个ACRs;分别在M70 vs M45、M100 vs M70和M100 vs M45中得到5587、13355和18795个显着差异ACRs以及831、1497和2671个显着差异基因。差异ACRs和差异基因的联合分析发现,分别在M70 vs M45、M100 vs M70和M100 vs M45中得到340、1498和2815个差异ACRs,分别对应183、613和1167个差异基因。这些基因均能够显着富集到与肌肉发育相关的生物学进程中。这些通路中的ALPK2、NMRK2、PDLIM3、CD9、CSRP3、FGF9和FOS等基因可能在民猪骨骼肌发育过程中具有重要作用。对不同品种间的差异ACRs分析,分别在LW45 vs M45、LW70 vs M70和LW100 vs M100中得到794、1959和2779个差异ACRs。利用WGCNA分析共检测到6个与胚龄相关的候选模块,对这6个模块内的基因进行GO富集分析发现,45 dpc相关模块基因显着富集到与细胞增殖、细胞周期和骨骼肌发育的生物学进程;70 dpc相关模块基因显着富集到许多与骨骼肌组织发育的生物学进程;100 dpc相关模块基因显着富集到与蛋白质修饰有关的生物学进程。对45 dpc和70 dpc相关模块基因进行差异分析发现,分别在45 dpc和70 dpc中得到1576和205个差异基因。其中DLK2、TNFAIP1、SVEP1、VCAM1、FGFRL1、PARQ7和TUFT1等基因的差异表达可能导致大白猪和民猪骨骼肌发育差异。本研究揭示了猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性的动态变化,丰富了猪中关于染色质可及性的研究,增加了人们对猪染色质可及性的认识,为研究哺乳动物肌肉发育的机制提供参考。
李世琦[5]（2021）在《巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探》文中指出百合作为重要的球根植物,具有悠久的栽培历史,其在食用药用和观赏方面都有着广泛的用途,因此也被称为“球根花卉之王”。随着现代社会人们对美好生活的不断向往,百合鲜切花的需求量逐年递增,目前已经是国内继月季和菊花之后的第三大鲜切花材料。但是百合鳞茎的快速繁殖问题一直没有能得到有效的解决,对百合的大规模产业化种植和商业化应用有很大的影响。蔗糖作为植物生长发育中必不可少的营养物质,在百合小鳞茎发生发育过程中起着至关重要的作用。实验选用野百合（Lilium brownii）优异变种材料巨球百合（Lilium brownii var.giganteum）作为研究对象,通过对巨球百合三代转录组数据进行生物信息学分析、形态学观察以及分子实验等方法,旨在研究巨球百合淀粉-蔗糖代谢路径中的关键基因即细胞壁转化酶基因,克隆该基因及其上游启动子,并进行初步的功能验证,进而为小鳞茎的增殖发生与淀粉蔗糖代谢途径之间的相关性研究提供参考。本实验的主要结果如下:（1）LbgCWIN1基因克隆及序列分析根据转录组数据及共表达分析,并结合多个高等植物细胞壁转化酶基因开展进化树分析,结果表明巨球百合CWIN基因与抗逆基因RPP13以及与细胞膜物质转运相关的基因PATl5的表达模式具有直接的联系。筛选得到了巨球百合细胞壁转化酶基因的c DNA序列,在不同蔗糖浓度处理下巨球百合小鳞茎中的CWIN基因存在着明显的差异表达。设计引物并克隆到了长度为2928 bp基因组DNA序列,并命名为LbgCWIN1（登录号MN794186）,通过Protparam、TMHMM、SWISS-MODEL等生信软件进行分析,表明该基因编码的蛋白共574个氨基酸,并预测了蛋白的的二维、三维结构,同时,根据亚细胞定位的实验结果确定了巨球百合细胞壁转化酶的工作位点在细胞壁上。（2）LbgCWIN1基因启动子的克隆及功能验证使用染色体步移法对LbgCWIN1基因的启动子进行克隆,两次克隆共获得了2718 bp DNA序列,并通过Place、Plant Care等启动子在线预测软件,分析得到在该启动子序列中存在多个响应元件,其中包括脱落酸（ABA）响应元件ABRE、ABRE4,光响应元件ACE、AE-box、ATC-motif、Box 4、ERE和逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、Myb-binding site等等。设计启动子5’端缺失载体,获得了4个缺失启动子载体CWIN1-p1（2527 bp）、CWIN1-p2（1606 bp）、CWIN1-p3（904 bp）和CWIN1-p4（459 bp）。通过农杆菌注射烟草叶片的方法进行瞬时转化,获得了不同5’端缺失启动子载体在烟草叶片的GUS染色和GUS活性情况,发现LbgCWIN1基因启动子的核心结构区域存在于-459 bp以内,在其上游区域可能还存在一些增强子和沉默子序列。（3）LbgCWIN1基因过表达载体构建及异源转化通过拟南芥种子点播法观察发芽情况筛选出拟南芥潮霉素抗性筛选的抗生素使用浓度为40 mg/L。使用无缝克隆的方法将LbgCWIN1基因CDS序列与过表达载体p CAMBIA 1301进行连接构建重组质粒,随后通过农杆菌浸花法将过表达载体稳定转化拟南芥,在潮霉素抗性筛选、PCR阳性检测和q RT-PCR等方法筛选得到了稳定遗传LbgCWIN1基因过表达载体的T3代拟南芥株系,发现该基因的过量表达能够使得拟南芥的部分果荚长度增长,对于拟南芥的种子产量研究具有一定的指导意义。
苏畅[6]（2021）在《功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造》文中研究表明角蛋白（Keratin）作为一种天然生物材料,具有良好的生物相容性与生物可降解性,在组织工程材料领域表现出广阔的应用前景。角蛋白酶（Keratinase）因具备独特的高效降解角蛋白纤维的特性,可有效提取毛发中的可溶性功能角蛋白,在角蛋白质资源的生物降解与角蛋白生物材料制备方面具有重要的研究价值与应用潜力。鉴于角蛋白酶的产量低和稳定性差是限制其工业化应用的主要原因,本研究以高效生产角蛋白酶及改善其热稳定性为目标,首先通过前导肽工程和启动子工程改造策略实现角蛋白酶的高效表达,进而应用计算机辅助设计与分子进化相结合的方法提高角蛋白酶的热稳定性;并以该角蛋白酶为催化剂,探索羊毛角蛋白的生物制备工艺,主要研究结果如下:（1）利用前导肽工程改造提高角蛋白酶的活性前导肽作为分子内伴侣,能够有效指导成熟酶的正确折叠以及活性构象的形成。本研究通过对重组Bacillus subtilis角蛋白酶Ker Bp的前导肽区域进行逐段截短,证明前导肽全长对成熟酶的表达具有至关重要的作用。通过对前导肽切割位点（P1）的氨基酸进行替换,发现芳香族疏水氨基酸苯丙氨酸有利于前导肽的切割,突变体Y（P1）F使角蛋白酶活性提升了1.7倍。另外,基于同源序列比对,对前导肽序列中非保守位点进行定点突变,获得6个酶活性显着提升的突变体,其中I（62）K突变体使角蛋白酶活性提高约2.2倍。进一步对上述6个位点构建饱和突变体文库,经过3轮有效筛选获得15个活性超过800 U·m L-1的突变体,其中突变体M7的酶活可达到1114 U·m L-1,较野生型提高6倍。（2）通过启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程研究发现随着活性和产量的提升,角蛋白酶对菌体内源性蛋白表现出降解能力,影响了B.subtilis宿主细胞正常的生长过程,导致菌体及产酶量的减少。本研究采用启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶过程,发现通过菌体密度依赖型启动子Papr E代替组成型启动子PHpa II,使产酶生物量获得提升,最高菌浓(OD600 nm)从8提高到10;酶活最高可达到2300 U·m L-1,是使用组成型启动子的2倍。通过对启动子的拷贝数进行优化,获得了重组菌角蛋白酶活性最高的二串联体启动子Papr E-Papr E,酶活可达3080U·m L-1。将启动子的-10区和-35区序列突变为σ因子识别的保守序列,进一步使酶活提高到3500 U·m L-1。另外,对培养基的碳源进行优化,促进了菌体的生长与积累,结果表明添加2%的葡萄糖能够延长菌体的生长时间,最大菌浓可达到15.6。同时产酶量也随着菌体生长时间的延长而增加,培养84 h后达到峰值4200 U·m L-1。（3）借助计算机辅助策略改造关键Loop区域提高角蛋白酶热稳定性角蛋白酶的热稳定性是其在高温下高效降解羊毛纤维等角蛋白质资源的先决条件,本研究基于计算机辅助设计与蛋白质工程改造相结合,提升角蛋白酶Ker Bp的热稳定性。通过计算机辅助计算与分析,预测了角蛋白酶Ker Bp的3段高柔性Loop以及一个与钙离子结合相关的Loop,并定位了其中对稳定性贡献较小的氨基酸残基。另外,基于同源序列比对分析,将Ker Bp序列中出现的“低频氨基酸”残基替换为同源序列中该位点的“高频氨基酸”。共构建了65个单点突变体,采取虚实结合的筛选策略,在保持酶活的基础上,获得了6个热稳定性提升的突变体,进一步通过组合突变构建获得6个位点的协同改造突变体,使角蛋白酶在60℃下的失活半衰期从17.3 min提高至66.1 min,并且最适反应温度从40℃提高至60℃。（4）利用角蛋白酶对羊毛纤维的可控降解制备大分子功能角蛋白角蛋白是性能卓越、极具应用潜力的生物材料,但由于天然的角蛋白结构紧密、可溶性差,难以直接作为生物材料进行应用。而采用化学法制备角蛋白通常会破坏分子上的活性基团,因此探索大分子、可溶性角蛋白的酶法制备具有重要意义。本研究利用自主开发的角蛋白酶水解废弃羊毛,制备出主要分子量约为45 k Da和28 k Da的可溶性角蛋白,其羊毛溶解率达68.1%,角蛋白提取率为33.7%。详细考察了羊毛的酶解过程,发现角蛋白酶能够从羊毛纤维的鳞片层进行逐层水解,最终实现羊毛复杂结构的破坏及溶解,通过对过程条件的控制,能够提取获得大片段可溶性羊毛角蛋白。体外评价结果显示,该角蛋白提取物具有良好的生物相容性,表现出明显的促细胞增殖和迁移的作用,并且具有较强的抗氧化性。为探索角蛋白提取物在生物组织材料领域的应用,研究利用角蛋白自组装特性制备获得水凝胶;小鼠成纤维细胞的体外培养实验结果表明该角蛋白凝胶具有良好的生物相容性,可作为细胞生长的支架材料。小鼠体内伤口促愈实验探究表明其能够通过促进成纤维细胞的增长和迁移以及加速形成新生血管和胶原沉积达到促进伤口修复的效果,证明该角蛋白水凝胶是一种优良的伤口敷料。
秦英惠[7]（2021）在《赤点石斑鱼神经坏死病毒的分离鉴定及其B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应机制研究》文中研究指明鱼类病毒性神经坏死病（Virus nervous necrosis,VNN）是由神经坏死病病毒（Nervous necrosis virus,NNV）引起的一种严重威胁世界水产养殖业的传染性疾病,可导致120多种鱼类不同程度的损伤,严重制约了水产养殖业的可持续发展。本研究从病毒的分离鉴定、单克隆抗体的制备和逃逸宿主Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ）反应三个方面进行研究,以期为后续建立石斑鱼神经坏死病毒的快速检测方法、解析其致病机制和筛选抗病毒药物靶点提供了工具和理论基础。具体研究内容和结果如下:1、RGNNV的分离和鉴定:通过RT-PCR、细胞培养、组织切片和电镜观察等技术从广东某养殖场患病的杂交虎龙石斑鱼成鱼中分离鉴定出一株石斑鱼神经坏死病毒。肉眼观察患病鱼呈体色发黑、眼球突出、腹部膨大、侧翻打转等临床症状,发病水温28℃,对可能造成石斑鱼发病的病原进行PCR检测,结果只有NNV的T4引物扩增出条带,测序结果表明该产物与Genbank中已报道的NNV衣壳蛋白（Cp）序列相似性最高。组织切片表明患病鱼脑部可见明显的空斑,而且患病鱼脑组织匀浆液过滤除菌后接种的SSN-1细胞、GF-1细胞和GS细胞出现明显的细胞病变效应（CPE）。蔗糖密度梯度离心获得高纯度的病毒,电镜下该病毒粒子呈球形,是典型的NNV形态。分段扩增获得RNA1和RNA2全长,进化树分析结果显示分离得到的病毒属于NNV中的RGNNV基因型,命名为RGNNV-HL。浸泡感染和腹腔注射RGNNV-HL均能导致实验鱼大量死亡,14天累计死亡率分别为90%和83.3%。2、抗RGNNV衣壳蛋白（Cp）单克隆抗体的制备:首先扩增获得衣壳蛋白（Cp）的开放阅读框,双酶切后连接至pET-28a质粒得到融合衣壳蛋白的表达质粒（pET-28a-Cp）,转化后挑取含有pET-28a-Cp的BL21（DE3）阳性克隆进行IPTG诱导。SDS-PAGE结果表明42 kDa处有明显加粗蛋白条带。Ni+柱纯化后获得高纯度融合表达的衣壳蛋白（rCp）。以rCp为免疫原免疫Balb/c小鼠,经过细胞融合、HAT筛选、酶联免疫吸附实验和有限稀释法克隆后得到三株可以持续分泌抗RGNNV衣壳蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞。免疫印迹实验（western blot）表明三株单抗均能特异性识别RGNNV的衣壳蛋白。间接免疫荧光（IFAT）结果显示,三株单抗均可特异性识别RGNNV病毒粒子,可以用于后续RGNNV快速检测方法的建立。3、RGNNV B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应的机制研究:首先,笔者发现RGNNV感染能显着抑制poly（I:C）激活的IFNφ1启动子活性。分别过表达RGNNV的结构蛋白和非结构蛋白,检测它们对IFNφ1启动子活性的影响,结果表明RGNNV的A蛋白明显上调IFNφ1启动子活性,而B1蛋白和B2蛋白抑制IFNφ1启动子的活化且B2蛋白的抑制能力更强,因此选择B2蛋白进一步研究。将B2蛋白和RLRs信号通路关键分子共表达以期筛选出其靶向分子,结果表明B2蛋白显着抑制共表达分子活化IFNφ1启动子的能力。免疫印迹实验表明B2蛋白能抑制所有共转RLRs信号通路接头分子的表达,接着笔者发现B2蛋白能明显降低组成型启动子（CMV）的启动活性,笔者猜测B2蛋白可能是一个宿主转录或翻译抑制因子。为了验证这一猜想,笔者分别检测了过表达B2蛋白后CMV启动子启动的荧光素酶的mRNA表达量和稳定性,结果表明过表达B2蛋白后荧光素酶的mRNA水平明显降低但其稳定性并无显着变化,至此确定B2蛋白抑制宿主的转录。由于RNA聚合酶Ⅱ（RNAPⅡ）在宿主的转录过程中发挥着不可或缺的作用,因此检测了B2蛋白对RNAP Ⅱ的影响,结果表明B2蛋白可抑制RNAP Ⅱ的表达和磷酸化,而且B2蛋白的这种功能并不受其线粒体定位的影响。至此确定RGNNV B2蛋白通过影响RNAPⅡ及其磷酸抑制细胞转录间接抑制RLRS介导的Ⅰ型干扰素反应。
韩超[8]（2021）在《Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究》文中研究指明Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显着地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显着降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显着影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。
彭亚男[9]（2021）在《大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理在复杂的环境中植物需要在其整个生命周期中应对大量刺激,在这个过程中Ca2+是一种普遍存在的第二信使,在许多种细胞代谢过程中发挥作用从而响应植物的生物和非生物胁迫反应。类钙调神经磷酸酶B（CBL）蛋白作为钙感受器,能够感知逆境Ca2+信号并与Ca2+结合,进而激活其下游蛋白激酶CIPK,通过与CBL互作蛋白激酶（CIPKs）相互作用,在植物对各种非生物胁迫的响应和生长发育中发挥重要作用。在转录调控过程中,基因启动子及其顺式作用元件可以激活或抑制基因的表达。因此分析在转录水平上调节基因表达的启动子功能,对揭示基因在植物生长发育与逆境防御中的调控机制至关重要,并可以为植物的抗逆性品种改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL7基因启动子（Cbl P7-1）全长序列及其4个不同长度的5’端缺失片段。分别构建植物表达载体后稳定转化烟草和瞬时转化大豆毛状根,为GmCBL7基因启动子功能验证提供依据。本研究的主要研究结果如下:1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL7基因上游序列设计引物,从大豆中克隆得到GmCBL7基因启动子序列,序列长度为1523bp,命名为Cbl P7-1。通过启动子在线分析软件PLACE和Plant CARE预测后发现在该序列中存在许多启动子核心元件,如与转录起始有关的TATA-box和与转录频率有关的CAAT-box。还存在一些与逆境胁迫和植物激素诱导相关的调控元件:HSE（高温响应元件）,MBS（干旱响应元件,结合MYB转录因子）,MYB（参与干旱、盐和ABA应答）,MYC（干旱和ABA响应元件）,ABRE（ABA应答相关元件）,ERE（乙烯应答相关元件）等,以及一些与光调控、胚乳形成相关、分生组织表达和损伤响应相关的顺式作用元件。预测结果表明GmCBL7基因启动子在逆境胁迫下可被诱导表达。同时构建了该启动子驱动的植物双元表达载体p CAMBIA1301-Cbl P7-1。2.通过农杆菌介导的叶盘法将启动子植物表达载体p CAMBIA1301-Cbl P7-1稳定转化烟草,获得2株Cbl P7-1融合gus报告基因的阳性转化植株。对转基因植株的根、茎、叶中的GUS活性分析结果表明,GmCBL7基因启动子在转基因植株中表现出不同的组织表达模式,特别是在茎中表达活性最强。GUS酶活测定结果表明,GmCBL7基因启动子参与调控大豆对高盐和干旱胁迫的应答。3.为了进一步研究GmCBL7基因启动子的核心调控区域,对该启动子进行5’端缺失分析,克隆了4个5’端缺失片段,序列长度分别为1202bp（Cbl P7-2）,902bp（Cbl P7-3）,454bp（Cbl P7-4）和251bp（Cbl P7-5）,并分别构建了5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体,分别为p CAMBIA1301-Cbl P7-2、p CAMBIA1301-Cbl P7-3、p CAMBIA1301-Cbl P7-4和p CAMBIA1301-Cbl P7-5。4.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草和大豆毛状根进行瞬时转化,经过GUS组织化学染色后发现,全长片段Cbl P7-1（1523bp）和2个5’缺失片段Cbl P7-2（1202bp）,Cbl P7-3（902bp）具有启动活性,且Cbl P7-3启动活性最强;而Cbl P7-4（454bp）启动活性很弱,Cbl P7-5（251bp）无启动活性。推测该启动子核心调控区可能位于-1202～-454bp区域内。
孙雷[10]（2021）在《2-酮基-D-葡萄糖酸高效生产工艺构建及其代谢调控机制解析》文中研究指明2-酮基-D-葡萄糖酸（2KGA）是一种重要的天然有机酸,其衍生物D-异抗坏血酸（盐）,是一种应用广泛的食品安全抗氧化剂。目前国内外主要通过微生物发酵法工业化生产2KGA。假单胞菌（Pseudomonas）是2KGA主要生产菌种,采用的主要生产工艺包括分批发酵、分批补料发酵、连续发酵以及半连续发酵等,但仍存在批次间生产设备的重复灭菌耗时、生产强度不高、工业生产假单胞菌菌种中2KGA代谢调控机制不清晰等问题。本论文评估了2种2KGA生产菌株的生产水平,选择发酵水平高且更稳定的2KGA工业生产菌株变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）JUIM01为出发菌株,首先在已有2KGA发酵工艺的基础上开发了一种两级·半连续发酵工艺;同时考察了发酵过程中P.plecoglossicida JUIM01胞内2KGA代谢相关基因表达量的变化,挖掘调控2KGA代谢的关键因素,通过基因敲除及回补,结合凝胶迁移实验（EMSA）、DNase Ⅰ足迹分析、等温滴定量热法（ITC）以及分子对接模拟等手段,解析变形假单胞菌中2KGA代谢调控机制。主要研究结果如下:（1）基于微生物生理代谢活性的控制策略,在已有2KGA发酵工艺的基础上优化、开发了一种两级·半连续发酵工艺。通过适当降低第一级发酵培养基中的葡萄糖浓度,提高菌体转化合成2KGA的生物学活性,同时对一级发酵液进行合理分配,分别作为后续第一、二级发酵的种子。采用高糖低氮的二级发酵液,有效控制菌体在第二级发酵过程中的生长,以减少其自身生理代谢对底物葡萄糖的消耗。在优化条件下进行了三循环的2KGA两级·半连续发酵,其中一级发酵2KGA的得率和生产强度分别达到0.98 g/g和9.12 g/（L·h）,二级发酵2KGA的得率和生产强度则分别达到1.03 g/g和8.11 g/（L·h）。在三循环的两级·半连续发酵过程中,发酵产物2KGA浓度可达到215.2 g/L以上,总得率约为0.99 g/g,达到理论转化率的91.6%,平均生产强度达到8.46 g/（L·h）。（2）为了阐明2KGA在P.plecoglossicida JUIM01中的代谢调控机制,考察了发酵过程中与2KGA代谢相关的9个关键基因表达水平变化,结果表明,ptxS基因编码的转录调控因子Ptx S参与了2KGA代谢,并且可能具有关键的全局调控作用。继而通过构建敲除及回补ptxS基因的重组菌,研究Ptx S蛋白对菌株生长及2KGA代谢的影响,结果表明敲除ptxS基因不会显着影响2KGA产量,但能够使菌株在含20.0 g/L葡萄糖的培养基中的发酵周期缩短4 h;回补ptxS基因反而对菌株的生长速率、葡萄糖利用速率及2KGA积累速率造成不利影响,说明PtxS蛋白在2KGA生产中起到重要作用。进一步利用实时荧光定量PCR技术比较了ptxS基因敲除前后P.plecoglossicida JUIM01中2KGA代谢关键基因的表达量变化,结果表明,敲除ptxS基因后,P.plecoglossicida JUIM01中除编码葡萄糖脱氢酶的gcd基因的表达量基本未受影响外,gndS、gndL、gndC、kguE、kguK、kguT与kguD等基因的表达量均上调了2.9～3.6倍,而ptxS自身（ΔptxS片段）的表达量也上调了约3倍。说明Ptx S蛋白对变形假单胞菌中2KGA代谢关键基因kgu操纵子、gad操纵子以及ptxS基因的转录具有负调控作用。（3）解析了PtxS蛋白对变形假单胞菌中葡萄糖酸脱氢酶操纵子（gad操纵子）的转录调控机制。发现变形假单胞菌PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的结合位点与已报道的铜绿假单胞菌及恶臭假单胞菌存在差异,变形假单胞菌PtxS蛋白具有更广泛的序列识别及结合能力。首先将来自P.plecoglossicida JUIM01的ptxS基因在Escherichia coli BL21（DE3）中进行异源表达,分离纯化重组蛋白并分析其二级结构。然后利用EMSA验证了PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的特异性结合,并利用DNase Ⅰ足迹分析明确了PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的结合位点,该结合区域覆盖约37 bp（5’-GAGCGGG CTTGCCCCGCGATGGAGGCTGGCGCGGATT-3’）,该段序列位于gndS基因（gad操纵子的第一个ORF）上游156～192 bp处。与已报道的铜绿假单胞菌及恶臭假单胞菌不同,该段结合区域内并不包含已报道的14 bp的典型回文序列（5’-TGAAACCGGTTTCA-3’）。最后通过引物延伸手段确定了gad操纵子的转录起始位点,gad操纵子的转录起始于gndS基因上游214 bp处的G/C碱基对,随后的转录方向及部分序列同5’-GCTTGGGAGC GCAGGGCCAGT-3’。该转录起始位点位于PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的结合区域上游的22 bp处,而在gad操纵子的转录起始位点附近区域中,发现了与之前报道中典型的14 bp回文序列具有9 bp一致性的14 bp序列（5’-TGAATCCCATTGCT-3’）,且gad操纵子的转录起始位点（下划线标注）正位于这段序列中。（4）解析了PtxS蛋白对变形假单胞菌中ptxS基因的转录调控机制。相较于gad操纵子,PtxS蛋白对ptxS基因的转录调控与之前报道的PtxS蛋白在铜绿假单胞菌及恶臭假单胞菌中的调控机制更加相似。PtxS蛋白与ptxS基因启动子区的特异性结合区域覆盖约22 bp（5’-TTATGAAAACGGTTTCAATAAA-3’）,该段序列位于ptxS基因起始密码子（GTG）上游37～58 bp处。此外,在此段序列中存在与14 bp的典型回文序列仅有一个碱基差异（下划线标注）的相似序列（5’-TGAAACCGTTTTCA-3’）。ptxS基因的转录起始于其起始密码子上游46 bp处的C/G碱基对,转录方向及部分序列同5’-GTTTTCAT AACCCTGCCCA-3’。该位点位于PtxS蛋白与ptxS基因启动子区的22 bp结合区域乃至该区域中14 bp的回文相似序列（5’-TGAAACCGTTTTCA-3’,下划线标注即为转录起始位点）中,将该转录起始位点定义为“+1”,则PtxS蛋白与其编码基因启动区的结合位点处于“-12”至“+10”之间,14 bp的回文相似序列则处于“-7”至“+7”之间。（5）发现产物2KGA是变形假单胞菌Ptx S蛋白的效应物,通过与PtxS的结合从而达到解除PtxS对相应基因转录抑制的作用。利用ITC确定了2KGA为PtxS蛋白的效应物,而葡萄糖、葡萄糖酸、葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸以及2-酮基-L-古龙酸等则不是其效应物。通过EMSA实验证明效应物2KGA可通过与变形假单胞菌PtxS结合,从而解除PtxS对kgu操纵子及ptxS基因转录的抑制。SEC-MALS分子量分析及分子筛色谱实验结果表明,变形假单胞菌PtxS蛋白在溶液中主要以二聚体形式存在并可以与2分子2KGA结合。在此基础上,采用SWISS-MODEL模拟了变形假单胞菌PtxS蛋白的三级结构以及其与效应物2KGA的分子对接模型。分子对接结果显示,效应物2KGA主要结合在接近PtxS蛋白C端的位置,PtxS第296位至301位的氨基酸（Ala296、Gln297、Pro298、Thr299、Glu300及Arg301）参与了2KGA与Ptx S蛋白之间结合,而该区域正是预测的蛋白激酶C磷酸化位点。综上,本论文开发了2KGA高效生产工艺,并解析了P.plecoglossicida JUIM01中PtxS蛋白调控2KGA合成及代谢的机制。来自变形假单胞菌PtxS蛋白与已报道的铜绿假单胞菌及恶臭假单胞菌PtxS在转录调控机制方面相比存在一定的独特性,主要表现在其非典型的gad操纵子调控机制:1)PtxS蛋白与gad操纵子启动子区结合位点的表现出非典型性（不包含已报道的14 bp典型回文序列或相似序列）;2)不同于PtxS蛋白对变形假单胞菌kgu操纵子及ptxS基因的转录调控,在PtxS蛋白与gad操纵子启动子区结合后,对效应物2KGA不敏感。上述机制的解析为PtxS转录调控系统的合成生物学元件化奠定了理论基础。
二、一种快速检测启动子特异性的方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、一种快速检测启动子特异性的方法（论文提纲范文）
（1）基于蛋白质组学和蛋白质翻译后修饰组学的猪肌内脂肪沉积机制分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 骨骼肌生长发育研究进展 |
| 1.1 骨骼肌结构类型和发育过程 |
| 1.2 脂肪细胞的发育 |
| 1.3 猪骨骼肌发育调控机制的研究进展 |
| 2 猪IMF含量性状的概述 |
| 2.1 IMF与肉品质的关系 |
| 2.2 影响IMF含量的因素 |
| 2.3 IMF性状相关基因的研究进展 |
| 2.4 莱芜猪及其肉质性状研究进展 |
| 3 蛋白质/丙二酰化蛋白质组技术及其应用 |
| 3.1 蛋白质组学概述 |
| 3.2 蛋白质组学研究的常用方法 |
| 3.3 液相色谱-质谱串联的TMT标记定量技术 |
| 3.4 蛋白质组学在畜禽研究中的应用 |
| 3.5 靶向蛋白质组技术PRM(Parallel Reaction Monitoring)的原理与应用 |
| 3.6 蛋白质的丙二酰化修饰 |
| 3.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 莱芜猪脂肪快速沉积时期背最长肌的蛋白组学分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 试验材料和处理 |
| 1.2 蛋白质组学测序分析 |
| 1.2.1 样品制备 |
| 1.2.2 蛋白浓度的检测 |
| 1.2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.4 胰酶酶解 |
| 1.2.5 TMT标记 |
| 1.2.6 高效液相色谱-质谱联用分析 |
| 1.2.7 数据库搜索 |
| 1.2.8 差异蛋白的生物信息学分析 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 蛋白质组学结果 |
| 2.1.1 提取蛋白后考马斯亮蓝检测蛋白质质量 |
| 2.1.2 蛋白质组学质谱分析与统计结果 |
| 2.1.3 差异表达蛋白的聚类 |
| 2.1.4 蛋白质组生物信息学分析 |
| 2.1.5 PRM验证差异表达蛋白 |
| 3 分析与讨论 |
| 第三章 莱芜猪脂肪快速沉积时期背最长肌的蛋白质翻译后修饰组学分析 |
| 1 材料方法 |
| 1.1 试验材料和处理 |
| 1.2 丙二酰化蛋白质组学测序分析 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 蛋白质修饰组学预实验分析 |
| 2.2 丙二酰化修饰蛋白质组学质谱分析与统计结果 |
| 2.3 丙二酰化蛋白鉴定 |
| 2.4 差异丙二酰化蛋白GO功能注释和分类 |
| 2.5 差异丙二酰化蛋白GO富集分析 |
| 2.6 差异丙二酰化蛋白KEGG通路富集分析 |
| 2.7 丙二酰化蛋白结构域富集分析 |
| 2.8 丙二酰化蛋白ACOT7 的结构分析及功能初探 |
| 3 分析与讨论 |
| 第四章 锌指蛋白ZNF512 在脂肪沉积中的功能分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料和处理 |
| 1.2 主要试验仪器 |
| 1.3 主要试剂及溶液配制 |
| 1.4 主要分析软件及工具 |
| 1.5 试验方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 ZNF512 的表达特征 |
| 2.2 ZNF512 的结构分析 |
| 2.3 ZNF512 在不同品种猪肌肉组织中的蛋白丰度值分析 |
| 2.4 ZNF512在3T3 细胞不同诱导分化时期的表达规律分析 |
| 2.5 干扰ZNF512 对脂肪沉积的影响 |
| 2.6 过表达ZNF512 对脂肪沉积的影响 |
| 2.6.1 ZNF512 过表达效率的验证 |
| 2.6.2 ZNF512 过表达后3T3 细胞中TAG含量变化 |
| 2.6.3 ZNF512 过表达后对脂肪沉积关键基因表达的影响 |
| 3 分析与讨论 |
| 第五章 猪脂肪生成限速酶GPAT3 的转录调控及多态性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料和处理 |
| 1.2 主要试验仪器 |
| 1.3 主要试剂及溶液配制 |
| 1.4 主要分析软件及工具 |
| 1.5 试验方法 |
| 1.5.1 启动子删除载体的构建 |
| 1.5.2 猪原代脂肪细胞的分离与培养 |
| 1.5.3 质粒转染细胞 |
| 1.5.4 双荧光素酶活性检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 猪GPAT3 基因表达变化分析 |
| 2.2 猪GPAT3 的转录调控 |
| 2.2.1 猪GPAT3 启动子关键调控区的鉴定 |
| 2.2.2 猪GPAT3 启动子关键调控区的多态性分析 |
| 2.2.3 猪GPAT3 启动子定点突变后对转录活性的影响 |
| 2.2.4 GPAT3 SNP T-1526C位点基因型在不同品种猪中的分布 |
| 2.2.5 预测TSS上游-1526C bp处转录因子的结合 |
| 3 分析与讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附 资助经费 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文和申请专利情况 |
（2）棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 CRISPR/Cas基因组编辑技术概括 |
| 1.1.1 CRISPR/Cas的起源及发展 |
| 1.1.2 CRISPR/Cas系统的分类 |
| 1.1.3 CRISPR/Cas系统在植物中应用 |
| 1.1.4 CRISPR/Cas9 系统在棉花中的应用及存在问题 |
| 1.1.5 组织特异性CRISPR/Cas9 系统应用的研究 |
| 1.1.6 病毒诱导的基因编辑(VIGE)应用的研究 |
| 1.2 本研究目的、意义及研究内容 |
| 1.2.1 研究目的与意义 |
| 1.2.2 研究内容 |
| 1.2.3 技术路线 |
| 第2章 利用花粉表达基因GhPLIMP2b和 GhMYB24 启动子进行棉花花粉CRISPR/Cas9 基因编辑的研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 棉花各个组织RNA及基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 棉花GhPLIM2b和 GhMYB24 基因组织特异性表达检测 |
| 2.1.4 GhPLIM2b P::GUS-P1300和GhMYB24P::GUS-P1300 表达载体构建 |
| 2.1.5 农杆菌真空渗透转化棉花花粉及瞬时表达分析 |
| 2.1.6 CRISPR/Cas9 基因编辑载体构建 |
| 2.1.7 棉花CLA1、ERA1和GGB基因突变检测 |
| 2.1.8 脱靶率分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 GhPLIM2b和 GhMYB24 基因在棉花不同组织表达量分析 |
| 2.2.2 花粉活力检测 |
| 2.2.3 GhPLIM2b和 GhMYB24 启动子在棉花花粉中的瞬时表达分析 |
| 2.2.4 CRISPR/Cas9 编辑载体构建 |
| 2.2.5 CRISPR/Cas9 介导的棉花CLA1、ERA1和GGB突变检测 |
| 2.2.6 脱靶分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 利用可移动FT-sgRNA和 DNA病毒进行可遗传基因编辑的研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 载体构建 |
| 3.1.3 RT-PCR分析Cas9 表达量 |
| 3.1.4 CLCrV投送sgRNA瞬时转化Cas9-OE拟南芥 |
| 3.1.5 GUS染色及定量分析 |
| 3.1.6 突变检测 |
| 3.1.7 统计分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 基于CLCrV的 sgRNA传递系统设计 |
| 3.2.2 CLCrV介导靶向敲除拟南芥内源基因 |
| 3.2.3 组织特异性Cas9 系统提高基因编辑效率 |
| 3.2.4 利用移动FT-sgRNA实现可遗传基因编辑的研究 |
| 3.2.5 突变后代(M1)病毒检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 利用DNA病毒在棉花中实现可遗传基因编辑的研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 载体构建 |
| 4.1.3 CLCrV投送sgRNA瞬时转化Cas9-OE棉花 |
| 4.1.4 突变检测 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CLCrV介导靶向敲除棉花GhCLA1和GhPDS基因 |
| 4.2.2 CLCrV介导靶向编辑棉花多个基因 |
| 4.2.3 利用FT-sgRNA在棉花中进行基因编辑的研究 |
| 4.2.4 GhPDS和 GhCLA1 基因突变后代胚珠检测 |
| 4.2.5 M1 代棉花胚珠病毒检测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.1.1 利用花粉表达基因GhPLIMP2b和 GhMYB24 启动子进行棉花花粉CRISPR/Cas9 基因编辑的研究 |
| 5.1.2 利用可移动FT-sgRNA和 DNA病毒进行可遗传基因编辑的研究 |
| 5.1.3 利用DNA病毒在棉花中实现可遗传基因编辑的研究 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）大豆卵细胞特异表达CRISPR/Cas9基因编辑体系的开发与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 大豆基因组 |
| 1.2 基因组编辑技术的背景和发展 |
| 1.2.1 基因组编辑技术的原理 |
| 1.2.2 基因组编辑技术的发展 |
| 1.3 CRSIPR/Cas基因组编辑体系在作物中的应用 |
| 1.4 CRSIPR/Cas基因组编辑体系在大豆中的应用 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.1.3 酶和生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 常规试剂的配制 |
| 2.2.2 常用的分子克隆方法 |
| 2.2.3 载体构建 |
| 2.2.4 大豆发根转化 |
| 2.2.5 拟南芥转化 |
| 2.2.6 大豆植株转化 |
| 2.2.7 转基因植株的鉴定 |
| 2.2.8 突变体的鉴定 |
| 第三章 大豆发根CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 |
| 3.1 单靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系 |
| 3.1.1 单靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系载体构建 |
| 3.1.2 单靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系在大豆发根中的验证 |
| 3.2 双靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系 |
| 3.2.1 双靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系载体构建 |
| 3.2.2 双靶标CRISPR/Cas9基因编辑体系在大豆发根中的验证 |
| 3.3 不同发根转化方法的比较 |
| 3.4 本章小结及讨论 |
| 第四章 大豆ECp:CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 |
| 4.1 ECp:Cas9/gRNA基因编辑体系构建 |
| 4.1.1 多靶标Cas9/gRNA基因编辑体系 |
| 4.1.2 不同ECp:Cas9/gRNA基因编辑体系 |
| 4.1.3 ECp:Cas9/gRNA基因编辑体系使用策略 |
| 4.2 Egg-cell特异表达的CRISPR/Cas9体系在大豆中的验证 |
| 4.2.1 Egg-cell特异表达的CRISPR/Cas9体系诱导T1代突变 |
| 4.2.2 Egg-cell特异表达的CRISPR/Cas9体系诱导T2代突变 |
| 4.3 本章小结与讨论 |
| 第五章 拟南芥ECp:CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 |
| 5.1 Egg-cell特异表达的CRISPR/Cas9体系诱导T1代突变 |
| 5.2 Egg-cell特异表达的CRISPR/Cas9体系诱导T2代突变 |
| 5.3 T3代非转基因突变体的获得 |
| 5.4 突变体表型验证 |
| 5.5 本章小结与讨论 |
| 第六章 全文结论及展望 |
| 6.1 全文结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 猪胚胎期骨骼肌发育概述 |
| 1.1.1 骨骼肌发育过程 |
| 1.1.2 参与骨骼肌发育调控的关键基因及信号通路概述 |
| 1.2 不同品种猪骨骼肌转录组研究进展 |
| 1.3 染色质可及性概述 |
| 1.4 染色质可及性的研究方法 |
| 1.4.1 DNase-seq |
| 1.4.2 ATAC-seq |
| 1.4.3 MNase-seq |
| 1.4.4 NOMe-seq |
| 1.5 基于 ATAC-seq 技术探索染色质可及性的研究进展 |
| 1.5.1 基于ATAC-seq技术探索人类染色质可及性的研究进展 |
| 1.5.2 基于ATAC-seq技术探索其他物种染色质可及性的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要仪器及试剂 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 ATAC-seq文库测序 |
| 2.2.2 ATAC-seq测序数据的分析 |
| 2.2.3 RNA-seq数据处理 |
| 2.2.4 ATAC-seq与 RNA-seq的联合分析 |
| 2.2.5 大白猪和民猪的染色质可及性和转录组差异分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的高通量文库和测序数据质量检测 |
| 3.1.1 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的 ATAC-seq 文库和测序数据质量检测 |
| 3.1.2 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的 RNA 质量和 RNA-seq 数据质量检测 |
| 3.2 大白猪胚胎期骨骼肌发育过程中全基因组染色质可及性 |
| 3.2.1 大白猪ATAC-seq文库概述 |
| 3.2.2 大白猪中染色质可及性检测 |
| 3.2.3 大白猪中ACRs在基因组上的分布规律 |
| 3.2.4 大白猪中ACRs与基因表达水平的关系 |
| 3.2.5 大白猪中阶段特异性ACRs和阶段共有ACRs鉴定 |
| 3.2.6 大白猪ACRs注释基因功能富集分析 |
| 3.2.7 大白猪ATAC-seq和 RNA-seq联合分析 |
| 3.3 民猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性研究 |
| 3.3.1 民猪胚胎期骨骼肌组织的染色质可及性检测 |
| 3.3.2 民猪ACRs在基因组上的分布规律 |
| 3.3.3 民猪中ACRs与基因表达水平的关系 |
| 3.3.4 民猪ACRs在胚胎期骨骼肌发育不同阶段间的差异分析 |
| 3.3.5 差异ACRs与差异基因的联合分析 |
| 3.4 大白猪和民猪胚胎期骨骼肌组织的染色质可及性和转录组的差异分析 |
| 3.4.1 大白猪和民猪染色质可及性的时序性分析 |
| 3.4.2 大白猪和民猪在同一阶段的染色质可及性差异分析 |
| 3.4.3 大白猪和民猪在同一阶段的基因差异分析 |
| 3.4.4 大白猪和民猪差异ACRs与差异基因、GWAS的联合分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 ATAC-seq 测序应用局限性 |
| 4.2 ATAC-seq 文库和测序数据质量检测讨论 |
| 4.3 大白猪胚胎期骨骼肌发育过程中全基因组染色质可及性讨论 |
| 4.3.1 大白猪ACRs在基因组的分布规律 |
| 4.3.2 大白猪阶段特异性ACRs和阶段共有ACRs对基因表达的调控 |
| 4.3.3 大白猪ATAC-seq和 RNA-seq的联合分析 |
| 4.4 民猪胚胎期骨骼肌发育过程中染色质可及性研究 |
| 4.4.1 民猪差异ACRs注释基因功能富集分析 |
| 4.4.2 民猪ATAC-seq与 RNA-seq的联合分析 |
| 4.5 大白猪和民猪全基因组染色质可及性和转录组的差异分析讨论 |
| 4.5.1 不同品种胚胎期骨骼肌发育进程差异 |
| 4.5.2 大白猪和民猪差异ACRs分析 |
| 4.5.3 大白猪和民猪差异基因分析 |
| 4.5.4 大白猪和民猪差异ACRs与差异基因、GWAS的联合分析 |
| 第五章 结论 |
| 5.1 本研究的主要结论 |
| 5.2 本研究的创新点与特色 |
| 5.3 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 淀粉-蔗糖代谢酶相关研究 |
| 1.1.1 蔗糖代谢及其在植物发育中的作用 |
| 1.1.2 细胞壁转化酶及其在植物中的作用 |
| 1.1.3 细胞壁转化酶基因启动子与上游调控因子的相关研究 |
| 1.2 启动子概述 |
| 1.2.1 启动子结构 |
| 1.2.1.1 核心结构区 |
| 1.2.1.2 上游调控区 |
| 1.2.2 启动子的分类 |
| 1.2.2.1 组成型启动子 |
| 1.2.2.2 组织特异性启动子 |
| 1.2.2.3 诱导性启动子 |
| 1.3 启动子的功能分析方法 |
| 1.3.1 生物信息学分析 |
| 1.3.2 缺失体分析 |
| 1.3.3 瞬时表达分析 |
| 1.3.4 稳定表达分析 |
| 1.3.5 常用报告基因 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 2 基于转录组数据的关键细胞壁转化酶基因筛选及表达分析 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 LbgCWIN1 基因进化树分析 |
| 2.2.2 巨球百合二三代结合转录组共表达分析 |
| 2.2.2.1 数据来源 |
| 2.2.2.2 模块分析 |
| 2.2.2.3 基因共表达网络分析 |
| 2.2.3 LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.2.3.1 巨球百合不同组织LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.2.3.2 不同蔗糖浓度巨球百合LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 LbgCWIN1 基因进化树分析 |
| 2.3.2 巨球百合三代转录组共表达分析 |
| 2.3.3 LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3.3.1 巨球百合不同组织LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.3.3.2 不同蔗糖浓度处理下LbgCWIN1 基因表达量分析 |
| 2.4 讨论 |
| 3 LbgCWIN1 基因克隆与分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 菌株与载体 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 LbgCWIN1 基因全长克隆 |
| 3.2.1.1 巨球百合基因组DNA提取(试剂盒法) |
| 3.2.1.2 目的片段获取 |
| 3.2.1.3 目的片段切胶回收 |
| 3.2.1.4 目的片段连接克隆载体 |
| 3.2.1.5 重组载体转化大肠杆菌 |
| 3.2.1.6 序列测定与分析 |
| 3.2.2 LbgCWIN1 基因亚细胞定位 |
| 3.2.2.1 亚细胞定位载体构建 |
| 3.2.2.2 质粒提取(试剂盒法) |
| 3.2.2.3 冻融法转化农杆菌 |
| 3.2.2.4 农杆菌注射烟草及染色方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 LbgCWIN1 基因克隆 |
| 3.3.2 LbgCWIN1 基因序列分析 |
| 3.3.3 LbgCWIN1 基因亚细胞定位 |
| 3.3.3.1 亚细胞定位载体构建 |
| 3.3.3.2 亚细胞定位载体转化农杆菌 |
| 3.3.3.3 亚细胞定位载体转化烟草 |
| 3.4 讨论 |
| 4 LbgCWIN1 基因启动子克隆及功能分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 菌株与载体 |
| 4.1.3 实验试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 染色体步移法克隆LbgCWIN1 基因启动子 |
| 4.2.2 LbgCWIN1 基因启动子元件分析 |
| 4.2.3 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失载体构建 |
| 4.2.3.1 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失片段获取 |
| 4.2.3.2 重组载体构建 |
| 4.2.4 启动子5’端缺失载体功能验证 |
| 4.2.4.1 启动子5’端缺失载体 |
| 4.2.4.2 瞬时转化烟草GUS染色 |
| 4.2.4.3 瞬时转化烟草GUS活性检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 LbgCWIN1 基因启动子克隆 |
| 4.3.2 LbgCWIN1 基因启动子元件分析 |
| 4.3.3 LbgCWIN1 基因启动子缺失载体构建 |
| 4.3.3.1 LbgCWIN1 基因启动子5’端缺失片段获取 |
| 4.3.3.2 重组载体构建 |
| 4.3.4 启动子5’端缺失载体功能验证 |
| 4.3.4.1 启动子5’端缺失载体转化农杆菌 |
| 4.3.4.2 启动子5’端缺失载体转化烟草 |
| 4.3.4.3 瞬时转化烟草GUS染色 |
| 4.3.4.4 瞬时转化烟草GUS活性检测 |
| 4.4 讨论 |
| 5 LbgCWIN1 基因过表达与异源验证 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 菌株与载体 |
| 5.1.3 实验试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 LbgCWIN1 基因过表达载体构建 |
| 5.2.2 野生型拟南芥潮霉素抗性筛选 |
| 5.2.3 浸花法转化拟南芥 |
| 5.2.4 转基因拟南芥筛选 |
| 5.2.4.1 T1 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.4.2 T2 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.4.3 T3 代转基因拟南芥抗性筛选 |
| 5.2.5 转基因拟南芥功能验证 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 LbgCWIN1 基因过表达载体构建 |
| 5.3.2 拟南芥潮霉素抗性筛选 |
| 5.3.3 LbgCWIN1 基因过表达载体转化拟南芥 |
| 5.3.4 转基因拟南芥后代筛选 |
| 5.3.4.1 T1 代筛选 |
| 5.3.4.2 T2 代筛选 |
| 5.3.4.3 T3 代筛选 |
| 5.3.5 转基因拟南芥功能验证 |
| 5.4 讨论 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历 |
（6）功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角蛋白概述 |
| 1.1.1 角蛋白的结构 |
| 1.1.2 角蛋白的性质 |
| 1.1.3 角蛋白的应用 |
| 1.1.4 角蛋白的提取 |
| 1.2 角蛋白酶概述 |
| 1.2.1 角蛋白酶的来源和理化性质 |
| 1.2.2 角蛋白酶的降解机制和水解特异性 |
| 1.3 角蛋白酶的应用 |
| 1.3.1 角蛋白的生物降解 |
| 1.3.2 化妆品和药品 |
| 1.3.3 其他应用 |
| 1.4 角蛋白酶的克隆表达 |
| 1.4.1 角蛋白酶序列 |
| 1.4.2 异源表达体系 |
| 1.5 角蛋白酶的分子改造 |
| 1.5.1 角蛋白酶结构 |
| 1.5.2 分子改造策略 |
| 1.6 立项依据和研究意义 |
| 1.7 主要研究内容 |
| 第二章 前导肽改造提升角蛋白酶活性 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 基因、菌株和质粒 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 引物 |
| 2.2.5 角蛋白酶活性的测定 |
| 2.2.6 同源模型的构建 |
| 2.2.7 前导肽工程改造 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 截短突变验证前导肽的功能 |
| 2.3.2 前导肽切割位点氨基酸替换对角蛋白酶表达的影响 |
| 2.3.3 前导肽区域定点突变 |
| 2.3.4 多位点组合饱和突变 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 启动子元件改造调控宿主细胞生长与产酶 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 主要试剂和仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 引物 |
| 3.2.5 角蛋白酶对菌体生长的影响探究 |
| 3.2.6 启动子工程改造策略与方法 |
| 3.2.7 角蛋白酶活性的测定 |
| 3.2.8 碳源补充优化 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 角蛋白酶的表达对宿主细胞生长的影响 |
| 3.3.2 菌体密度依赖型启动子替换组成型启动子 |
| 3.3.3 利用串联apr E启动子提高角蛋白酶产量 |
| 3.3.4 启动子核心区域序列优化提高启动子活性 |
| 3.3.5 补充碳源提高菌体前期积累 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于Loop结构的设计与改造提升角蛋白酶热稳定性 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 引物 |
| 4.2.5 不稳定Loop区域的预测与分析 |
| 4.2.6 突变位点的选择与分析 |
| 4.2.7 钙离子结合位点的预测与分析 |
| 4.2.8 序列趋同性突变位点及突变类型的确定 |
| 4.2.9 突变体重组质粒构建及转化 |
| 4.2.10 角蛋白酶活性测定 |
| 4.2.11 突变体筛选及热稳定性评价 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 基于计算机辅助分析的不稳定Loop区域预测 |
| 4.3.2 基于B-Factor与 RMSF的突变位点选择 |
| 4.3.3 基于ΔΔG的突变氨基酸选择 |
| 4.3.4 突变体重组菌的活性测定与筛选 |
| 4.3.5 钙离子结合相关Loop改造策略的热稳定性提升 |
| 4.3.6 基于序列一致性突变策略的热稳定性提升 |
| 4.3.7 优势位点的组合突变 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 角蛋白酶对羊毛的可控降解及功能角蛋白的表征与应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 样品 |
| 5.2.2 主要试剂和仪器 |
| 5.2.3 可溶性角蛋白的酶法制备 |
| 5.2.4 可溶性角蛋白生物相容性评价 |
| 5.2.5 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.2.6 角蛋白凝胶用于细胞的体外培养 |
| 5.2.7 角蛋白凝胶促创伤愈合的小鼠体内评价 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 角蛋白酶提取羊毛角蛋白 |
| 5.3.2 可溶性羊毛角蛋白提取物的结构表征 |
| 5.3.3 .可溶性羊毛角蛋白提取物的性能表征 |
| 5.3.4 角蛋白自组装凝胶的制备 |
| 5.3.5 角蛋白凝胶冻干海绵用于细胞体外培养 |
| 5.3.6 角蛋白凝胶促进小鼠创伤愈合 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文主要创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）赤点石斑鱼神经坏死病毒的分离鉴定及其B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表(Abbreviation) |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 神经坏死病毒研究进展 |
| 1.1.1 神经坏死病毒的分布及流行规律 |
| 1.1.2 神经坏死病毒的分类 |
| 1.1.3 神经坏死病毒的超微结构 |
| 1.1.4 神经坏死病毒的基因组特征 |
| 1.1.5 神经坏死病毒编码蛋白的主要功能 |
| 1.1.6 神经坏死病毒的致病机制 |
| 1.1.7 神经坏死病毒的感染途径及体内传播方式 |
| 1.1.8 神经坏死病毒的检测方法 |
| 1.1.9 神经坏死病毒疫苗的开发 |
| 1.2 鱼类干扰素研究进展 |
| 1.2.1 RLRs介导的Ⅰ型干扰素抗病毒信号通路 |
| 1.3 鱼类病毒逃逸RLRs介导Ⅰ型干扰素的研究进展 |
| 1.3.1 抑制RLRs的检测和活化 |
| 1.3.2 抑制RLRs的信号传递 |
| 1.3.3 抑制JAK/STAT信号通路 |
| 1.3.4 降解ISGs分子 |
| 1.3.5 抑制宿主转录或翻译 |
| 1.4 研究目的与意义 |
| 第二章 石斑鱼神经坏死病毒的分离与鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验鱼 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验所需试剂的配制 |
| 2.1.5 实验细胞 |
| 2.1.6 病鱼检查 |
| 2.1.7 组织病理学观察 |
| 2.1.8 病毒的分离 |
| 2.1.9 病毒滴度测定 |
| 2.1.10 病毒的鉴定(RT-PCR法) |
| 2.1.11 全基因组序列测定及分析 |
| 2.1.12 病毒粒子的形态观察 |
| 2.1.13 病毒的纯化 |
| 2.1.14 人工感染实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 病鱼的症状观察及病理切片观察 |
| 2.2.2 寄生虫及致病菌分离 |
| 2.2.3 RT-PCR结果 |
| 2.2.4 病毒的分离 |
| 2.2.5 病毒滴度测定 |
| 2.2.6 超薄切片观察病毒粒子 |
| 2.2.7 病毒蛋白图谱及负染电镜图 |
| 2.2.8 基因组序列测定及分析 |
| 2.2.9 系统发育树分析 |
| 2.2.10 人工感染实验 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 抗RGNNV衣壳蛋白(Cp)单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物、病毒与细胞 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 衣壳蛋白的表达与纯化 |
| 3.2.2 三免后小鼠血清效价测定 |
| 3.2.3 单克隆抗体的筛选结果及亚型分析 |
| 3.2.4 单克隆抗体腹水效价测定 |
| 3.2.5 单克隆抗体的western blot分析 |
| 3.2.6 单克隆抗体的间接免疫荧光分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 RGNNV B2 蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应的机制研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 实验试剂 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 RNA提取及反转录 |
| 4.1.5 真核表达质粒的构建 |
| 4.1.6 细胞转染 |
| 4.1.7 RT-qPCR |
| 4.1.8 双荧光素酶报告实验 |
| 4.1.9 Western blot |
| 4.1.10 细胞活性实验-MTT法 |
| 4.1.11 mRNA稳定性实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RGNNV抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.2 RGNNV B2蛋白抑制poly(I:C)诱导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.3 B2 蛋白抑制RLRs介导的IFN-Ⅰ反应 |
| 4.2.4 B2 蛋白抑制宿主的转录 |
| 4.2.5 B2 蛋白下调RNA聚合酶Ⅱ的表达 |
| 4.2.6 B2 蛋白促进RGNNV的增殖 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 增强子RORCE2 通过增强RORγt的表达促进Th17 细胞的分化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 SOX-5 介导增强子RORCE2与RORγt启动子的相互作用影响Th17 细胞的分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Th17 细胞中SOX-5与STAT3 协同诱导增强子RORCE2 的染色质开放 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Th17 细胞中RORγt转录调控及转录后调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（9）大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物CBL-CIPK信号通路研究进展 |
| 1.1.1 CBL和 CIPK的结构和分类 |
| 1.1.2 CBL与 CIPK作用机制 |
| 1.1.3 CBL-CIPK信号通路在响应非生物胁迫中的作用 |
| 1.2 植物基因启动子的研究进展 |
| 1.2.1 启动子的结构 |
| 1.2.2 启动子的类型 |
| 1.3 发根农杆菌介导的毛状根转化 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第2章 大豆GmCBL7 基因启动子全长序列的克隆及植物表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料与试剂 |
| 2.2.2 大豆GmCBL7 基因全长启动子的克隆 |
| 2.2.3 GmCBL7 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.2 GmCBL7 基因启动子全长序列生物信息学分析 |
| 2.3.3 GmCBL7 基因全长启动子植物表达载体的构建 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 大豆GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料与试剂 |
| 3.2.2 GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.2.3 GmCBL7 基因5’缺失启动子植物表达载体的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 GmCBL7 基因启动子5’缺失片段的克隆 |
| 3.3.2 GmCBL7 基因5’缺失启动子植物表达载体的构建 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 GmCBL7 基因全长启动子的功能分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料与试剂 |
| 4.2.2 重组植物表达载体转化农杆菌EHA105 |
| 4.2.3 农杆菌介导的烟草遗传转化 |
| 4.2.4 非生物胁迫下转基因烟草的GUS检测 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 4.3.2 转基因植株的鉴定 |
| 4.3.3 GmCBL7 基因启动子的组织特异性表达模式分析 |
| 4.3.4 GmCBL7 基因启动子的GUS活性测定 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 GmCBL7 基因启动子5’端缺失片段的功能分析 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与试剂 |
| 5.2.1 植物材料及菌株 |
| 5.2.2 实验仪器及试剂 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 不同5’端缺失启动子片段植物表达载体转化发根农杆菌 |
| 5.3.2 农杆菌介导的烟草瞬时转化 |
| 5.3.3 发根农杆菌诱导大豆毛状根 |
| 5.3.4 大豆毛状根的GUS组织化学染色 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 重组植物表达载体转化农杆菌的鉴定 |
| 5.4.2 烟草GUS组织化学染色分析 |
| 5.4.3 毛状根GUS组织化学染色分析 |
| 5.5 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）2-酮基-D-葡萄糖酸高效生产工艺构建及其代谢调控机制解析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)概述 |
| 1.1.1 2KGA的主要性质 |
| 1.1.2 2KGA的应用 |
| 1.1.3 2KGA的生产方法 |
| 1.2 微生物法产2KGA的研究进展 |
| 1.2.1 2KGA的常用生产工艺 |
| 1.2.2 2KGA的常用生产菌种 |
| 1.3 2KGA在假单胞菌中的代谢 |
| 1.4 假单胞菌PtxS蛋白的研究进展 |
| 1.5 立题依据和研究意义 |
| 1.6 研究目标与主要研究内容 |
| 1.6.1 研究目标 |
| 1.6.2 主要研究内容 |
| 第二章 P.plecoglossicida JUIM01 两级·半连续发酵高产2KGA的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 培养基 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 菌株保藏与活化 |
| 2.3.2 种子培养 |
| 2.3.3 2KGA摇瓶分批发酵 |
| 2.3.4 2KGA发酵罐分批发酵 |
| 2.3.5 2KGA休止细胞转化 |
| 2.3.6 2KGA两级·半连续发酵 |
| 2.3.7 发酵过程参数的测定 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 P.plecoglossicida JUIM01及A.globiformis JUIM02 2KGA生产能力评价 |
| 2.4.2 一级发酵培养基中葡萄糖浓度优化 |
| 2.4.3 葡萄糖浓度为140.0 g/L时的2KGA分批发酵过程 |
| 2.4.4 一级发酵液中的残糖浓度对补料分批发酵2KGA的影响 |
| 2.4.5 一级发酵液的分配比例对一级罐2KGA发酵的影响 |
| 2.4.6 二级发酵补料培养基中葡萄糖浓度对二级罐2KGA发酵的影响 |
| 2.4.7 优化条件下的两级·半连续发酵 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 Ptx S蛋白对P.plecoglossicida JUIM01中2KGA代谢的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株和质粒 |
| 3.2.2 引物 |
| 3.2.3 培养基 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株构建及鉴定 |
| 3.3.2 菌株保藏与活化 |
| 3.3.3 碳源利用实验 |
| 3.3.4 种子培养 |
| 3.3.5 发酵过程参数的测定 |
| 3.3.6 RNA提取 |
| 3.3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.3.8 实时荧光定量PCR |
| 3.3.9 统计学分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 发酵过程中2KGA代谢关键基因表达量的变化 |
| 3.4.2 ptxS基因敲除菌株的鉴定 |
| 3.4.3 ptxS基因敲除对P.plecoglossicida JUIM01 的生长和2KGA代谢的影响 |
| 3.4.4 ptxS基因敲除后回补对P.plecoglossicida JUIM01 的生长和2KGA代谢的影响 |
| 3.4.5 ptxS基因敲除对2KGA代谢关键基因表达量的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 PtxS蛋白对变形假单胞菌葡萄糖酸脱氢酶操纵子的转录调控 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株和质粒 |
| 4.2.2 引物 |
| 4.2.3 培养基 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 菌株保藏与活化 |
| 4.3.2 异源表达PtxS重组大肠杆菌的构建 |
| 4.3.3 重组菌株的诱导表达 |
| 4.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 4.3.5 蛋白免疫印迹实验(Western Blot) |
| 4.3.6 蛋白浓度测定 |
| 4.3.7 重组蛋白的分离纯化 |
| 4.3.8 重组蛋白的圆二色谱远紫外扫描分析 |
| 4.3.9 基因组DNA提取 |
| 4.3.10 EMSA凝胶迁移实验 |
| 4.3.11 DNase Ⅰ足迹分析实验 |
| 4.3.12 RNA提取 |
| 4.3.13 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3.14 PCR产物的纯化回收 |
| 4.3.15 引物延伸实验 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 变形假单胞菌PtxS蛋白的异源表达 |
| 4.4.2 重组PtxS蛋白的分离纯化 |
| 4.4.3 重组PtxS蛋白的二级结构分析 |
| 4.4.4 PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的特异性结合 |
| 4.4.5 PtxS蛋白与gad操纵子启动子区的结合位点 |
| 4.4.6 变形假单胞菌gad操纵子的转录起始位点 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 PtxS蛋白在变形假单胞菌2KGA代谢过程中的转录调控作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 菌株与质粒 |
| 5.2.2 引物 |
| 5.2.3 培养基 |
| 5.2.4 主要试剂 |
| 5.2.5 主要仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 蛋白浓度测定 |
| 5.3.2 EMSA凝胶迁移实验 |
| 5.3.3 DNase Ⅰ足迹实验 |
| 5.3.4 RNA提取 |
| 5.3.5 引物延伸实验 |
| 5.3.6 等温滴定量热法(ITC)检测 |
| 5.3.7 重组蛋白的SEC-MALS分子量分析 |
| 5.3.8 重组蛋白的分子筛色谱分析 |
| 5.3.9 变形假单胞菌PtxS蛋白的同源建模与分子对接模拟 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 PtxS蛋白与ptxS基因启动子区的特异性结合 |
| 5.4.2 PtxS蛋白与ptxS基因启动子区的结合位点 |
| 5.4.3 变形假单胞菌ptxS基因的转录起始位点 |
| 5.4.4 PtxS蛋白效应物的确定 |
| 5.4.5 效应物2KGA对变形假单胞菌PtxS转录调控的影响 |
| 5.4.6 重组PtxS蛋白在溶液中的聚体状态 |
| 5.4.7 同源建模解析效应物2KGA对 PtxS调控机制 |
| 5.5 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1:作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
| 附录2:论文相关序列信息 |
四、一种快速检测启动子特异性的方法（论文参考文献）
- [1]基于蛋白质组学和蛋白质翻译后修饰组学的猪肌内脂肪沉积机制分析[D]. 马才. 山东农业大学, 2021
- [2]棉花高效CRISPR/Cas9基因编辑体系的研究[D]. 雷建峰. 新疆农业大学, 2021
- [3]大豆卵细胞特异表达CRISPR/Cas9基因编辑体系的开发与应用[D]. 郑娜. 中国农业科学院, 2021
- [4]大白猪和民猪胚胎期骨骼肌染色质可及性研究及差异分析[D]. 岳静伟. 中国农业科学院, 2021(01)
- [5]巨球百合细胞壁转化酶基因及其启动子功能初探[D]. 李世琦. 浙江大学, 2021(01)
- [6]功能角蛋白制备用酶在Bacillus subtilis中的高效表达与改造[D]. 苏畅. 江南大学, 2021(01)
- [7]赤点石斑鱼神经坏死病毒的分离鉴定及其B2蛋白抑制RLRs介导的Ⅰ型干扰素反应机制研究[D]. 秦英惠. 华中农业大学, 2021(02)
- [8]Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究[D]. 韩超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [9]大豆GmCBL7基因启动子的克隆与功能分析[D]. 彭亚男. 哈尔滨师范大学, 2021(08)
- [10]2-酮基-D-葡萄糖酸高效生产工艺构建及其代谢调控机制解析[D]. 孙雷. 江南大学, 2021(01)