一、Interaction of hepatitis B virus with tumor suppressor gene p53: its significance and biological function（论文文献综述）
贺凡[1]（2020）在《基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制》文中认为研究背景肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,因其恶性度高、预后差,目前对肝癌的诊治仍存在巨大挑战,随着分子免疫学研究的进展,对肝癌的治疗有了新的补充,但仍然存在应答率低、疗效欠佳的困境,中医药目前在肝癌的治疗中显示出一定的优势,在肿瘤治疗中的地位也越来越突出,但同时存在药物成分复杂、机制不明等问题。基于此,寻找敏感度高、特异性强的与肝癌的发病有密切联系的生物分子标记物的需求十分迫切。研究目的参桃软肝方（STR）是导师周岱翰教授的经验方,具有健脾养肝、软坚消症之效,临床运用数十载,取得了较好疗效,但因中药成分复杂,药效机制尚不明确,限制了其在临床的推广应用。本研究旨在通过网络药理学的方法对STR的成分及作用乙肝相关性肝癌（HBV-HCC）的靶点进行筛选,建立“药物-活性成分-关键靶点-通路”网络关系图,并通过体外细胞及动物实验,观察STR抑制肝癌细胞株及抑制裸鼠皮下移植瘤模型的疗效,进一步通过高通量测序技术综合分析筛选STR可能的作用靶点和机制,并进行生物信息学验证以确定STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及可能的作用机制。研究方法1.通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）对STR中的组成药物进行检索从而获取其化学成分,根据口服生物利用度（Oral bioavailability,OB）≥30%和类药性（drug likeness,DL）≥0.18作为条件筛选候选化合物,同时结合STR质谱分析的结果得到中药的潜在化合物,将其所对应的靶点基因与GEO数据库筛选出来的HBV-HCC相关的靶点基因进行配对后,获得STR和HBV-HCC两者共同拥有的关键靶点,即为STR作用HBV-HCC的潜在靶点。利用R软件中“cluster Profiler”安装包对其进行GO功能和KEGG通路富集分析,并构建“中药-化学成分-关键靶点-通路”网络关系图。2.采用MTT法观察STR对人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H增殖作用的影响,采用细胞划痕及Transwell实验观察STR对三株人肝癌细胞株的迁移能力的影响。3.建立人肝癌细胞株Hep G2.2.15裸鼠皮下成瘤模型,待瘤体积达100-200mm3时将其随机分为五组,即STR低、中、高剂量组,阴性对照组,阳性药对照组,分别进行灌胃,每天一次,连续给药25天,记录裸鼠状态、生长情况,测量瘤体积及裸鼠体重。最后一天给药结束,眼球取血,剥离瘤体,测量瘤重,进行统计学分析,取肝肾组织,HE染色观察肝肾形态学改变。4.取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行转录组学测序（RNA-seq）,通过文库构建、数据过滤及基因差异表达分析,筛选出差异表达基因（DEGs）,并以火山图、聚类热图形式表现,并进行GO功能注释和KEGG信号通路富集。取STR给药组和阴性对照组各3个肿瘤组织样本进行全基因组亚硫酸氢盐甲基化测序（WGBS）,通过文库构建、数据过滤及差异甲基化表达分析,筛选出差异甲基化区域及其对应基因,与转录组测序得到的DEGs重叠取交集。5.选取临床HBV-HCC病人8例癌组织与癌旁组织行WGBS,筛选差异甲基化区域（DMRs）相关基因,并将其与动物样本测序结果进行关联分析,寻找共同的差异甲基化基因,并进行GO与KEGG分析。6.通过Cytoscape软件将STRING构建的PPI网络进行可视化,并用拓扑分析进行核心基因筛选。将筛选出的核心基因通过c Bio Portal数据库中关联TCGA数据库对其进行突变谱分析,m RNA表达水平与甲基化状态的相关性分析;通过GEPIA数据库检验核心基因的m RNA表达水平及总生存期（OS）、无病生存期（DFS）的预后分析;通过人类蛋白质图谱（HPA）数据库验证核心基因的蛋白质表达水平的验证。研究结果1.通过TCMSP平台数据库检索西洋参、桃仁、大黄、丹参、当归、仙鹤草六种药物,以OB≥30%和DL≥0.18为条件进一步筛选,并通过质谱分析的结果,总共得到STR潜在化合物125个,删除重复靶点后得到437个蛋白靶点基因。通过GEO数据库筛选出HBV相关的HCC数据库GSE121248基因芯片数据,筛选出HBV-HCC的DEGs 888个。将STR药物预测的靶点与GEO数据库筛选出的DEGs进行配对,发现51个共同靶点基因,GO富集在971个条目中,KGEE通路富集分析显示靶点基因共富集了33条通路,其中与代谢相关的通路有酪氨酸代谢、细胞色素P450对外源性药物代谢的影响、视黄醇代谢通路;与炎症相关IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、NOD样信号通路、松弛素信号通路等;与细胞周期相关的通路有细胞衰老、细胞周期、凋亡、p53信号通路等;与激素调节有关的雌激素信号通路、卵巢类固醇生成等;与血管生成有关的通路有VEGF信号通路,另外,还有广泛参与细胞生物学行为的PI3K-AKT信号通路、MAPK信号通路等。2.细胞实验表明,STR能够抑制人肝癌细胞株Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H的增殖,并呈时间和剂量依赖性。划痕实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞的迁移能力,统计学结果见显着性差异（Hep G2.2.15 12h及24h划痕P<0.05,Hep G2 24h划痕P<0.05,MHCC97-H 12h及24h划痕P<0.05）。Transwell实验表明,STR能够抑制Hep G2.2.15、Hep G2、MHCC97-H细胞株的迁移,统计学结果提示STR低、中、高剂量组与对照组比较有显着性差异（P<0.05）。3.动物实验表明,STR组的瘤体积和瘤重都较阴性对照组小,其中STR中、高剂量组与对照组比较,结果具有显着性差异（P<0.05）。说明STR能够抑制荷Hep G2.2.15肝癌裸鼠肿瘤的生长。4.荷瘤裸鼠肿瘤组织样本转录组测序得到有效差异表达的m RNA 221个,其中上调185个,下调36个。GO功能注释GO分析显示这些差异基因主要参与的生物学过程（biological process,BP）有蛋白质糖基化（protein glycosylation）、激素的分泌调节（regulation of hormone secretion）、不饱和脂肪酸代谢（unsaturated fatty acid metabolic process）,细胞基质粘附（cell-substrate adhesion）、先天免疫反应激活细胞表面受体信号通路（innate immune response activating cell surface receptor signaling pathway）等463个过程;细胞组分（cell component,CC）结果分析显示与高尔基体腔（Golgi lumen）、含胶原细胞外基质（collagen-containing extracellular matrix）、肌节（sarcomere）、肌原纤维（myofibril）等55个条目;分子功能分析（molecularfunction,MF）结果表明,这些基因主要与细胞外基质结构成分（extracellular matrix structural constituent）、钙依赖性磷脂绑定（calcium-dependent phospholipid binding）、溶血磷脂酶的活动（lysophospholipase activity）等51个功能有关。此外,KEGG通路富集分析发现,这些差异表达基因与PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、TGF-β信号通路、谷胱甘肽代谢（Glutathione metabolism）等通路有关。5.对荷瘤裸鼠STR治疗组瘤组织和对照组瘤组织进行WGBS检测,共得到DMRs 80510个,DMRs长度共8056280,共筛选出8986个基因。其中启动子区域异常甲基化基因3760个,高甲基化基因1600个,低甲基化基因2160个。将其与转录组测序筛选的m RNA与WGBS筛选出的差异甲基化基因进行重叠取交集,得到甲基化水平与差异表达基因呈负相关关系的重叠基因151个,GO富集了499个条目,KEGG分析显示与12条通路密切相关。6.临床HBV-HCC首次术后标本WGBS分析与动物测序筛选的差异甲基化基因取交集,得到146个共同的差异甲基化基因,通过拓扑分析,最终筛选到了10个与肝癌密切相关的基因,即CD44、LGALS3、ACTA1、LCN2、MUC1、IGFBP3、HAMP、IRS2、PDK4、BDKRB2。结合现有研究及通过外部数据库验证发现,Hub基因中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用,IGFBP3、HAMP、PDK4为抑癌基因,ACTA1作为抑癌因子尚存争议。测序结果提示STR抑制了癌基因LCN2的表达及上调抑癌基因IGFBP3、HAMP、PDK4的表达。人与动物测序共同的到的差异甲基化基因富集分析显示GO富集了509个条目,KEGG富集了13条信号通路,包括与I肝II纤维化密切相关的ECM-受体互作通路,与炎症相关的IL-17信号通路、松弛素信号通路、TGF-β信号通路、补体凝血级联通路,与代谢相关的脂质调节、外源性物质细胞色素P450代谢、蛋白质的消化吸收等途径,以及广泛参与肿瘤生物学调控的PI3K-AKT信号通路、c AMP信号通路等。研究结论本研究通过高通量分子测序揭示了一系列STR作用下的异常甲基化修饰的差异表达基因及通路,为阐述肝癌的诊疗提供新的思路。我们在经STR处理荷瘤裸鼠肝癌组织与对照组肝癌组织中发现了部分癌基因与抑癌基因,其中CD44、LGALS3、LCN2、MUC1、IRS2、BDKRB2具有致癌作用被认为是有致癌活性的,IGFBP3、HAMP、PDK4被认为是抑癌基因,以上基因的表达水平与甲基化状态均呈负相关关系。STR可能通过抑制LCN2的表达及上调IGFBP3、HAMP、PDK4的表达而发挥抗肝癌作用,可能作为STR抗HBV-HCC的潜在靶点。与通过网络药理学方法筛选得到的靶点及通路进行对比,发现有PI3K-AKT信号通路、IL-17信号通路、松弛素信号通路、外源性物质细胞色素P450代谢等共同作用的通路,提示STR可能通过影响这些通路进而发挥抗肿瘤作用。
高健[2]（2020）在《基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究》文中研究说明肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC,文中缩写为肝癌）是全球第三大癌症死亡原因。它归因于多种基因突变和表观遗传改变。乙型肝炎病毒（HBV）感染、酒精、黄曲霉毒素、肥胖和糖尿病是肝癌的其他危险因素。尽管肝癌的诊断和治疗有很多新方法,但由于高复发率和转移率,预后仍然较差。预后不良的一个重要原因是缺乏准确的HCC预后分级系统和有效的早期HCC筛查方法。因此,评估潜在的生物标志物在HCC诊断和治疗中的价值是合理的。本研究首先在癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库中筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据,然后对我院肝癌标本进行转录组测序基因分析,挖掘可能与预后相关的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,接着我们筛选到ARHGEF39作为候选基因并进行验证。ARHGEF39基因,又称C9orf100,是鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEFs）人类Dbl（Diffiuse B lymphoma）癌基因家族成员之一,是Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶（Rho GTPases）的重要激活因子。ARHGEF39在多种人类癌症中存在高表达,比如肺癌、胃癌和肝癌。这些数据表明,ARHGEF39可能在不同的癌症类型中频繁上调,并与肿瘤进展相关。既往有报道称,肝癌标本中ARHGEF39的mRNA水平较邻近非肿瘤组织明显上调。ARHGEF39基因水平表达上调和肝癌肿瘤数目及血清AFP高低呈正相关性。然而,我们对ARHGEF39蛋白在肝癌中的表达及预后相关性仍知之甚少。为了探究ARHGEF39在肝癌中的表达与临床病理特点及预后的关系,以及预测ARHGEF39与肝癌进程的关系,利用TCGA挖掘肝癌中ARHGEF39的表达信息和对应的临床病理资料,分析ARHGEF39在肝癌和癌旁组织中的表达情况以及与肝癌患者临床特征及预后的关系。并在我们肝癌标本中验证,结果显示ARHGEF39在肝癌组织中的表达高于癌旁组织（P<0.05）。ARHGEF39表达水平与TNM分期、血清甲胎蛋白（AFP）水平呈正相关P<0.05)。COX多因素分析显示ARHGEF39过表达、TNM分期、Child-Pugh评分是肝癌患者生存的独立预后指标。ARHGEF39可作为促癌基因在肝癌患者的肿瘤组织中呈高表达,提示肝癌患者预后不良,有望成为早期诊断肝癌的分子标志物和判断预后的指标。进一步地在前一部分研究的基础上,我们探讨ARHGEF39对肝癌生长和转移的影响及其潜在分子机制,长非编码RNA（long noncoding RNAs,lncRNAs）是一类细胞中大于200bp不具有编码蛋白功能的RNA.越来越多证据表明lncRNAs参与肿瘤细胞的多种调控过程,包括分化,增殖,凋亡,转移,干细胞特性等。微小RNA（MicroRNAs,miRNAs）是属于基因进化历程中具有保守性的短非编码RNA,可以结合mRNA的3’端非翻译区（3’untranslated region,3’-UTR）对其进行转录后调控,MiRNAs也被报道在包括转移,凋亡,增殖,分化等多种细胞过程中起作用。研究报道lncRNA可作为竞争性内源RNA通过竞争性结合相同的miRNAs位点,抑制miRNAs对下游靶基因的靶向作用,提高靶基因的表达,从而调控肿瘤的进程。通过生物信息学分析及预测,我们提出了科学假说:ARHGEF39 通过与 lncRNA LINC00470 竞争 MicroRNA-4500（miR-4500）的活性位点来促进肝细胞癌的进展,于是我们通过体内细胞学及体外动物实验,证实LINC00470可通过吸附miR-4500上调ARHGEF39的表达;此外,解救实验显示,miR-4500抑制剂可以消除LINC00470抑制肝癌细胞进展的作用。因此,我们证明了 LINC00470可以作为miR-4500的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）,通过调控ARHGEF39的表达来促进肝癌的进展,这为肝癌患者的治疗提供了一个潜在的治疗靶点。第一部分基于TCGA数据库肝癌相关基因分析及筛选目的:肝癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一。本研究的目的是利用生物信息学分析,识别与肝癌发展相关的潜在中枢基因和失调通路。方法:1、基于癌症基因组图谱（TCGA）数据库的肝癌组织mRNA表达谱分析,筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据2、收集19对肝癌及癌旁组织的新鲜标本,随机选择5对进行转录组测序,并进行分析,寻找癌与癌旁DEGs,并绘制火山图和聚类图。3、我们筛选了两个平台的DEGs,通过选择这两个平台的交集,我们在来自TCGA数据库及本院肝癌标本队列的测序数据中找到了共同的DEGs。4、对交集的DEGs进行功能和通路富集分析。5、RT-qPCR验证候选基因在19对肝癌及癌旁组织中的表达情况。6、利用TCGA公共数据库中的肝癌数据进行Kaplan-Meier生存分析,了解候选基因与肝癌生存预后关系结果:1、利用TCGA数据库,筛选出肝癌及癌旁组织DEGs共1588个,其中在肝癌中高表达1520个,低表达68个;组织样本转录组测序共筛选出1281个DEGs,其中肝癌组织对比癌旁组织有873个mRNA表达呈上调趋势,有408个mRNA表达呈下调趋势。2、通过分别TCGA数据及本院组织样本转录组测序的数据交集联合分析,我们在肝癌中获得了 341个高表达的DEGs和31个低表达的DEGs。3、GO功能富集分析结果显示这些基因生物途径主要富集在浓缩核染色体外着丝点、Ndc80复合体、染色体乘客复合体等生物学过程。KEGG通路分析显示基因DNA复制、细胞周期等通路中富集。4、通过我们的分析,NT5DC2、ARHGEF39、SPSB2、SLC26A6、SLC52A2 被筛选作为候选基因。5、上述5个基因在我们的19例肝癌组织及相应的癌旁组织中的使用qPCR方法成功验证。6、TCGA数据分析显示候选基因的表达高低与肝癌患者的预后具有相关性。结论:本研究为肝癌发生的转录组解读和分子机制的研究提供了有用的信息,为开发新的生物标志物和进一步深入的研究提供了依据。第二部分ARHGEF39在肝细胞癌中的表达及其预后意义目的:既往研究报道ARHGEF39可能在不同的癌症类型中上调表达。然而,ARHGEF39表达水平与肝癌患者临床病理特点及预后的关系尚不清晰。因此,我们拟开展本部分实验对上述问题展开研究。方法:1、分析肝癌基因组图谱（TCGA）数据集中ARHGEF39的表达水平,通过TCGA数据库数据分析ARHGEF39与肝癌患者预后的关系。2、从基因和蛋白水平,分别验证我们收集的肝癌及癌旁组织中ARHGEF39的表达情况3、此外,我们还研究了 ARHGEF39表达与肝癌的临床病理特点及预后的关系。结果:1、TCGA数据显示,ARHGEF39在肝癌中呈高表达（P<0.05）。高水平的ARHGEF39是不良总生存（OS）的一个重要预后因素（TCGA,P=0.006）。2、肝癌标本中ARHGEF39 mRNA和蛋白的表达水平明显高于邻近肝标本（P<0.05）。3、我们调查了 ARHGEF39和患者的临床病理学特征之间的相关性,发现ARHGEF39高表达水平与肝癌的与血清甲胎蛋白（AFP）的水平（P=0.002,9.597）和 TNM stage（P=0.040,χ2=4.654）的显着正相关。4、进一步分析发现,高ARHGEF39水平与低OS（P<0.001）和短无病生存（DFS）（P<0.001）显着相关。Cox多因素分析显示,ARHGEF39是OS和DFS的一个独立的、不利的促进因素（P=0.000）。结论:ARHGEF39可能在肝癌的进程中作为癌基因发挥作用,可能是潜在的肝癌预后预测指标和治疗靶点第三部分LINC00470竞争性结合m i R-4500调节ARHGEF39的表达影响肝癌细胞恶性进展目的:基于第二部分研究,本部分研究旨在探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。方法:本部分主要通过分子生物学、生物化学的手段以及一系列体外细胞学功能实验（人肝癌细胞HepG2、Hep3B）和体内动物模型（人肝癌Hep3B细胞株）探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。1、通过qRT-PCR的方法检测ARHGEF39,miR-4500和LINC00470等相关基因的RNA水平;2、通过WB验证ARHGEF39的蛋白水平表达;3、MTT assay和克隆形成实验检测不同处理后细胞的体外生存能力;4、Caspase 3/7 activity assay 和 Nucleosome ELISA assay 检测细胞凋亡水平;5、Transwell assays检测细胞的体外迁移和侵袭能力;6、小鼠荷瘤体内动物实验评估对人肝癌Hep3B细胞ARHGEF39敲低后在体内肿瘤生长能力的影响;7、荧光素酶报告实验检测miR-4500对ARHGEF39和LINC00470的抑制作用;8、生物素标记的 RNA pulldown 技术检测 miR-4500 对 ARHGEF39 和 LINC00470的直接结合作用。结果:1、体外实验结果显示:下调ARHGEF39的表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡。2、敲低ARHGEF39抑制人肝癌Hep3B细胞株的体内肿瘤生长能力;3、ARHGEF39 在人肝癌细胞 HepG2、Hep3B 中被 miR-4500 负调控;ARHGEF39作为miR-4500靶基因,其表达水平可被miR-4500表达上调所抑制,表明在人肝癌细胞系中ARHGEF39-miR-4500负性调节关系的存在4、LINC00470扮演miR-4500的“海绵”角色调控ARHGEF39的表达;5、ARHGEF39对人肝癌细胞的恶性进程的效应依赖于LINC00470/miR-4500信号轴。结论:LINC00470通过吸附miR-4500促进ARHGEF39表达来调控肝癌的恶性进程,ARHGEF39至少部分通过LINC00470/miR-4500/ARHGEF39信号轴信号轴来促进人肝癌细胞HepG2、Hep3B的体外增殖,迁移和侵袭能力,以及抑制肝癌细胞体外凋亡能力。ARHGEF39,LINC00470,miR-4500可成为肝癌诊断和治疗的潜在靶标。
马丽[3]（2020）在《基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究》文中研究说明慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B,CHB）是世界范围内的重要公共卫生问题,中医药对CHB的防治已显示其独特优势,进一步提高中医药防治能力,深入阐述CHB的证候生物学基础,似为其主要一环。四川地区CHB常见的中医证候为脾胃湿热证与肝郁脾虚证,课题组前期从mi RNA对上述两证候的生物学基础进行了初步研究。有文献表明DNA甲基化参与CHB的发生发展,且DNA甲基化与中医证候的形成在理论上似有契合之处,此或许能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证生物学基础的研究提供新的思路。目的:本研究基于前期相关mi RNA研究,多维度综合观察CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化水平的差异表达,探讨上述两证候的生物学基础是否是通过DNA甲基化与mi RNA相互调控,影响表观遗传,进而调节基因表达,形成不同的证候,以期初步证实DNA甲基化的差异表达是否为CHB证候差异的主要表观遗传机制之一,为上述两种CHB中医证候的客观化与规范化提供部分实证依据。方法:1.招募CHB脾胃湿热证（Spleen-stomach damp heat syndrome,SSDHS）患者7例SSDHS组),肝郁脾虚证（Liver depression and spleen deficiency syndrome,LDSDS）患者7例（LDSDS组）和健康志愿者6例（健康对照组（Healthy control,HC））。2.采集所有受试者清晨空腹、无菌环境下外周静脉血,检测各组间肝功能相关指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量。3.用ELISA法检测各组间DNA甲基化相关蛋白DNMT1、Me CP2的表达水平及HBV相关蛋白P53、E-cad、P16的表达水平。4.及时分离外周静脉血血清,提取DNA,用Illumina Bead Array TM Infinium850K甲基化芯片检测各组间DNA甲基化差异表达的情况,对差异甲基化位点相关基因进行GO功能富集和KEGG pathway富集分析。5.利用Target Scan7.2与miRDB数据库对不同中医证候中部分相同mi RNAs靶基因进行预测,采用Cytoscape3.6软件构建DNA甲基化基因与mi RNAs预测靶基因共表达网络图。结果:1.SSDHS、LDSDS组分别与HC组相比,在DNMT1、p16表达水平、性别、年龄、病程、生化指标、乙肝两对半定性及HBV-DNA含量检测结果方面均无显着性差异（P>0.05）;E-cad表达水平均有显着性差异（P<0.05）,Me CP2、P53表达水平在SSDHS组中无显着性差异（P>0.05）,在LDSDS组中有显着性差异（P<0.05）。2.Illumina Bead Array TM Infinium 850K甲基化芯片检测结果显示CHB患者组与HC组有7868个显着差异甲基化位点,其中高甲基化位点2310个,低甲基化位点5558个;经过筛选高甲基化差异程度最高的位点为cg03278611位于基因NLGN4Y,低甲基化差异程度最高的位点为cg03670113位于基因TAZ;差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、脂肪颗粒、各种酶等;KEGG pathway主要富集在类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等。3.SSDHS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg21898358位于基因LILRA3,低甲基化差异程度最高的位点为cg09323788位于基因CHTF18,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在T细胞共刺激、Rho蛋白信号转导、Rho GTPases相关的功能等;KEGG pathway主要富集在ABC转运蛋白、AMPK信号通路及肿瘤相关通路;LDSDS组特有的高甲基化差异程度最高的位点为cg09857096位于基因BMPR1B,低甲基化差异程度最高的位点为cg09972436位于基因LCE3C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在树突棘、丝氨酸/苏氨酸激酶、Rac GTPase等;KEGG pathway主要富集在苯丙氨酸代谢、氮代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢通路;SSDHS组与LDSDS组间最显着的高甲基化位点为cg10765459位于基因COL6A2,最显着的低甲基化位点为cg07445365位于基因STK32C,差异甲基化位点相关基因GO功能主要富集在肌动蛋白相关细胞及组织,KEGG pathway主要富集在Erb B信号通路及代谢通路等。4.SSDHS、LDSDS组差异甲基化位点相关基因分别与mi R-122-5p、mi R-1228-3p、mi R-191-3p预测靶基因进行对比分析:两证候差异甲基化位点相关基因与mi R-122-5p预测靶基因均有6个基因重合,其中SSDHS组独有基因为RIMS1,LDSDS组独有基因为SLC41A1;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有21个基因重合,该组独有基因为OTUB、AMPH、SEMA3C、ZC3H12B、PCGF3、JAKMIP3,LDSDS组差异甲基化位点相关基因与mi R-1228-3p预测靶基因有17个基因重合,该组独有基因为ARID1B、NUDT7;SSDHS组差异甲基化位点相关基因与mi R-191-3p预测靶基因有2个基因重合,该组独有基因为MPP7、LDSDS组差异甲基化基因与mi R-191-3p预测靶基因有3个基因重合,该组独有基因为SPTB2、CCNY。结论:1.Me CP2、P53可能通过影响DNA甲基化修饰参与CHB肝郁脾虚证的形成;E-cad可能是CHB脾胃湿热证或肝郁脾虚证形成的物质基础之一。2.CHB患者存在DNA甲基化的差异表达,具体机制可能与NLGN4Y、TAZ等基因的甲基化及蛋白质去泛素化、I-kappa B激酶/NF-kappa B信号、类固醇生物合成通路、PPAR信号通路等有关。3.CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证均存在DNA甲基化的差异表达,同时分别具有各自特有的DNA甲基化谱。LILRA3、CHTF18等基因的甲基化及T细胞共刺激诱导肝脏炎症等,可能是CHB脾胃湿热证的分子生物学基础;BMPR1B、LCE3C等基因的甲基化及树突棘的改变和物质代谢异常等,可能是CHB肝郁脾虚证的分子生物学基础,提示DNA甲基化可能为CHB脾胃湿热证与肝郁脾虚证差异的表观遗传机制之一。4.不同证候出现部分相同mi RNA的原因可能与其影响不同靶基因甲基化水平的差异性有关,具体调控机制尚需进一步研究证实。
裴苗苗[4]（2020）在《原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义》文中提出第一部分miR-888-5p在原发性肝细胞癌患者血清中表达情况目的miR-888-5p是一种致癌microRNA,在人类多种恶性肿瘤中异常表达。近年来,诸多研究证实miR-888-5p在肝癌中表达上调,与肿瘤发生发展、浸润及转移密切相关。microRNA可稳定存在于外周循环,具有不被RNA酶降解、能耐受极端PH值及温度等特性。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）的检测方法,测定原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者血清中miR-888-5p的相对表达水平,并探讨其对HCC的诊断价值。方法1.采集外周血标本,离心后取上层血清作为待测样品。HCC患者68例,肝硬化（Liver cirrhosis,LC）患者43例,慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者46例,健康体检者40例;2.qRT-PCR法检测血清中miR-888-5p表达水平;3.2-△△CT法计算miR-888-5p的相对表达量,采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析,计量资料以均数和M[P25,P75]表示,计数资料以频数和率表示,组间比较采用秩和检验。P值<0.05为差异具有统计学意义。同时绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）予以评估 miR-888-5p 对于HCC患者的诊断价值。结果1.HCC患者血清中miR-888-5p表达水平显着高于LC、CHB及健康体检者,差异有统计学意义（P<0.05）;而LC、CHB与健康对照组三者相比无统计学差异（P>0.05）。2.对68例HCC患者绘制ROC曲线,血清miR-888-5p、甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein,AFP）的 ROC 曲线下面积（area under ROC curve,AUC）分别为 0.737、0.819,灵敏度分别为79.41%、73.53%,特异度分别为62.50%、97.50%;联合检测两者的AUC及灵敏度可分别高达0.907、91.18%,特异性为72.50%。3.以AFP等于20ng/mL为界将HCC患者分为AFP阳性（46例）及AFP阴性HCC（22例）两组,以AFP阴性HCC患者miR-888-5p为变量绘制ROC曲线:所得AUC为0.793,灵敏性90.90%,特异性62.50%。4.分别对HCC与CHB及HCC与LC绘制ROC曲线,AUC分别为0.672、0.706,敏感性分别为79.41%、88.24%,特异性分别为56.52%、51.16%。结论1.血清miR-888-5p在HCC患者中表达水平高于LC、CHB患者及健康对照组,差异具有统计学意义;而LC、CHB与健康体检者三者相比较无显着差异。2.与AFP相比,血清miR-888-5p对HCC诊断具有更高的敏感性,联合两者检测的AUC及敏感性均更高。3.血清miR-888-5p对于AFP阴性HCC患者具有良好的诊断价值,可作为AFP阴性HCC患者补充诊断的血清学分子指标。4.血清miR-888-5p具备鉴别HCC与CHB、LC的能力。第二部分 血清miR-888-5p表达水平与原发性肝细胞癌临床病理特征之间的关系目的研究证实miR-888-5p表达上调与HCC临床分期、病理分级及预后不佳密切相关,但目前尚无血清学相关研究。本研究第一部分实验结果证实HCC患者血清miR-888-5p表达水平显着高于LC、CHB及健康对照组,第二部分将进一步分析miR-888-5p与HCC患者临床病理特征及预后之间的关系。方法收集2019年4月至2019年11月至我院就诊的乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）相关且首次确诊为HCC患者的临床资料,包括性别、年龄、AFP、肝硬化、Child分级、肿瘤数目、肿瘤直径、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、肺部转移、AJCC TNM分期（第7版）、巴塞罗那（BCLC）分期。定量资料以四分位间距表示,组间差异比较采用秩和检验,数据采用SPSS21.0统计学软件进行分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果血清miR-888-5p表达水平与肝癌肺转移相关（P=0.01）,而与性别、年龄、AFP、肝硬化、Child分级、肿瘤直径、肿瘤数目、肝内转移、门静脉癌栓、淋巴结转移、TNM分期及BCLC分期无明显相关性（P>0.05）。结论HCC血清miR-888-5p表达水平与肺转移相关,提示其可能参与HCC浸润转移,可作为一种HCC判断病情及评估预后的新型循环肿瘤分子标志物。
赵和平[5]（2020）在《1180例原发性肝癌临床特征和基于贝叶斯网络模型的生存时间影响因素分析》文中进行了进一步梳理目的:1.通过回顾性研究,调查分析晋津地区1180例原发性肝癌（PHC）患者的临床特征,系统总结PHC患者的人群分布特点,探讨不同病因、性别、年龄PHC患者之间不同层级的分布,为该地区PHC的进一步研究提供线索;2.详细分析PHC患者的生化指标、肿瘤标记物及肝硬度值（LSM）在PHC巴塞罗那（BCLC）不同分期中的差别,为PHC患者早期筛查及评估预后的进一步研究提供理论依据;3.运用非条件logistics回归模型分析PHC患者生存时间的影响因素。在此基础上,通过建立贝叶斯网络模型,进一步深入研究因素间复杂的网络关系,并量化计算因素间的条件概率,从而为预测PHC患者的生存期,延长PHC患者生存时间提供科学依据。方法:1.本研究将天津市和山西省三所三甲医院作为研究现场,通过严格的纳入排除标准,选取1180例PHC患者,收集其一般资料及辅助检查资料。详细分析1180例PHC患者的临床特征,分析病因、性别和年龄段不同层级之间的分布,分析PHC巴塞罗那不同分期生化指标、肿瘤标记物及LSM的差别;2.选择1180例PHC患者中接受随访的患者295例,根据文献报道并结合本研究中PHC患者平均生存时间中位数（29.6月）,最终选择30个月作为生存时间的研究节点,将PHC患者生存时间分为<30个月及≥30个月,通过logistics回归分析影响PHC患者生存时间的相关因素,在此基础上,建立贝叶斯网络模型,深入探讨PHC患者生存时间的影响因素间复杂的网络关系,并计算因素间的条件概率。结果:1.1180例PHC患者发病年龄为24-84岁,平均（60.33±9.11）岁,41-60岁占48.47%（572/1180）,≥61岁占50.77%（599/1180）,PHC发病以40岁及以上年龄段高发;病因分析中,乙型肝炎病毒（HBV）导致PHC者占66.69%（787/1180）,丙型肝炎病毒（HCV）导致PHC者占18.39%（217/1180）,酒精所导致PHC者占14.92%（176/1180）,HBV导致PHC占主要地位。PHC研究病例中,41-60岁HBV相关者为395例（50.19%）,HCV相关者为76例（34.50%）;≥61岁HBV相关者为390例（49.56%）,HCV相关者为136例（63.32%）,HCV相关PHC患者中,≥61岁年龄段比例（63.32%）高于41-60岁年龄段所占比例（34.50%）。2.临床指标γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（ALP）、甲胎蛋白（AFP）及LSM在BCLC不同分期间差异均有统计学意义（P<0.05）。在HBV相关PHC患者中,随BCLC分期增加LSM也增加,分期与LSM成正相关,且差异有统计学意义（P<0.001）,同样,HCV相关PHC患者中分期与LSM亦呈正相关（P<0.001）,酒精相关PHC患者中,BCLC不同分期间LSM变化差异无显着性（P=0.807）。在BCLC的A期和B期,LSM值在酒精相关PHC组显着高于HBV相关PHC组和HCV相关PHC组（P<0.05）。3.肿瘤直径>3cm的PHC患者生存时间<30月的风险是肿瘤直径≤3cm的2.191倍;γ-GT>40U/L的PHC患者生存时间<30个月的风险是γ-GT≤40U/L的2.836倍;有肝外转移的PHC患者生存时间<30月的风险是没有肝外转移的2.776倍;4.贝叶斯网络模型结果显示,年龄、血小板计数、肿瘤大小、肿瘤个数、门静脉侵犯、肝外转移和γ-GT均与PHC患者30月生存时间相关。γ-GT、肿瘤大小和肝外转移均会影响PHC患者30月的生存时间;肿瘤的个数会影响患者肝外的转移,继而对PHC患者30月生存时间产生了影响;年龄对PHC患者肿瘤大小及肝外转移均有影响,而肿瘤大小及肝外转移均对PHC患者30月生存时间有影响;γ-GT对PHC患者30月生存时间会产生影响,同时也可以通过影响肿瘤大小及肿瘤个数,继而对PHC患者30月生存时间产生影响;肿瘤大小>3cm、γ-GT>40U/L,伴有肝外转移的患者,生存时间<30个月的概率最大（98.408%）。结论:1.天津市和山西省1180例PHC患者中,以男性为好发人群,年龄段集中在40岁以上,HBV相关性肝癌占比最大。男女PHC患者的病因均以HBV为主,不同年龄段PHC患者的病因亦以HBV为主。提示HBV感染者、男性、年龄在40岁以上者是PHC发病的高危人群,应加强对高危人群的监管和随访,同时,应提高人群乙肝疫苗接种的覆盖率,降低HBV感染率;2.ALP、γ-GT、AFP及LSM与PHC巴塞罗那不同分期显着相关,四个指标可为后续PHC患者早期筛查及评估预后的进一步研究提供线索;3.PHC患者的年龄、血小板计数、肿瘤大小、肿瘤个数、门静脉侵犯、肝外转移和γ-GT与PHC患者的生存时间均相关,且各个因素之间都有复杂的网络关系,相互影响。其中,肿瘤大小>3cm、γ-GT>40U/L、同时伴有肝外转移的患者,生存时间<30个月的概率最大,从而为预测PHC患者的生存期提供科学依据。
栗昀[6]（2020）在《复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究》文中研究指明肝癌是发病率和致死率都较高的恶性肿瘤,其发病率和致死率分别位于第三位和第五位,严重威胁人类健康。每年约有70万人被确诊为肝癌。引起肝癌的主要原因有酒精性以及非酒精性脂肪肝,肝纤维化以及肝硬化等。其中,在欧美国家,酒精性脂肪肝是引起肝癌的主要原因。与欧美国家不同,在我国,HBV感染是导致肝癌的主要因素。我国是HBV感染的高发区,每年约有9000多万人被检测出HBVsAg 阳性,42万死于肝癌,其中,90%存在HBV感染史。虽然随着HBV疫苗的普及,感染HBV的概率大大降低,但是,由于我国感染人数基数较大,对于已感染HBV的患者来说,控制HBV感染所导致的慢性肝炎,肝纤维化甚至是肝癌,仍然是一个巨大挑战。索拉菲尼是唯一一个FDA批准的,可用于治疗肝癌的抗癌药物。但是,对于HBV感染所导致的肝癌,其治疗效果远远低于其他原因引起的肝癌。并且,长期服用索拉菲尼也有可能导致耐药等副作用。对于HBV相关肝癌的患者而言,由于HBV的存在,其感染所导致的反复的慢性肝炎以及高滴度的HBV DNA仍然是肝癌复发的风险因素。HBV x基因是HBV4个开放编码框中最小的一个,在HBV相关HCC中具有重要作用,其可以通过直接作用或者是表观遗传学改变激活多种信号通路以及致癌基因,或者是灭活抑癌基因,在HBV相关HCC中是独立的风险因子。Hedgehog信号通路在修复组织损伤方面发挥着重要的调节作用。包括肝癌在内的多种肿瘤组织中该信号通路特异性激活,其主要蛋白Gli高表达;抑制其表达能够延缓肿瘤细胞增值。铁死亡是最新发现的一种细胞程序性死亡模式。其主要是由于铁依赖的大量脂质活性氧产生损伤细胞所致。索拉菲尼产生耐药的主要原因之一是抑制了肝癌细胞发生铁死亡作用。铁离子积聚引发的芬顿反应是发生铁死亡的主要特征之一。在HBV感染患者中,体内铁代谢的异常表达说明HBV感染有可能涉及铁死亡发生过程。长链非编码RNA虽然不具有编码蛋白的功能,但其可以调节miRNA或者是通过其他作用影响蛋白质表达,进而改变细胞正常生理功能,促使细胞发生病变。长链非编码RNA可以调节多条信号通路以及相关因子参与调节细胞表型改变。与蛋白或者是miRNA相比,靶向研究长链非编码RNA更具有优势以及前景。HBx作为致癌基因,可以调节多个长链非编码RNA参与到HBV相关HCC的发生过程中。并且,由于LncRNA具有组织特异性和时空特异性,以其为对象的生物学标志物以及药物干预靶点研究将对HBV相关HCC的基础研究和药物研发提供理论基础。复方叶下珠是由深圳市中医院肝病科创制的,用于治疗肝癌,尤其是HBV相关HCC的中药复方,其专利申请号为:201610517509.2。在临床应用中,复方叶下珠能够降低HBV相关HCC患者血清中病毒学标志物（HBVsAg,HBVcAg和HBV DNA）以及延缓HBV肝硬化发展成为HCC,具有较好的抗HBV相关HCC效果。实验研究发现,复方叶下珠能够抑制HBx基因表达。但是,其具体作用机制尚不明确,需要进一步研究。本次试验通过构建HBx过表达稳定细胞株HepG2-HBx,通过采用体内外实验,检测复方叶下珠对HepG2-HBx细胞增殖,迁移以及克隆的影响,评价复方叶下珠对HepG2-HBx细胞的抑制作用;同时检测HepG2-HBx细胞中HBx以及Hedgehog信号通路组成因子在mRNA以及蛋白的表达水平,探讨复方叶下珠抑制HepG2-HBx细胞作用机制。通过体内实验进一步明确复方叶下珠的抗HBV相关HCC作用并检测肿瘤组织中铁死亡相关因子的mRNA表达,评价复方叶下珠对铁死亡的影响,探索HBV相关HCC,Hedgehog信号通路以及铁死亡的关系。与此同时,通过长链非编码RNA高通量测序,筛选复方叶下珠靶向LncRNA,并通过Real-time PCR初步筛选,为进一步深入研究复方叶下珠的抗癌机制提供前期研究基础。研究目的通过复方叶下珠处理HepG2-HBx细胞,评价复方叶下珠对HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆的影响,并通过构建裸鼠移植瘤模型,体内评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的效果。检测复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞以及裸鼠移植瘤肿瘤组织中Hedgehog信号通路中相关因子的表达水平,证明抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗癌作用的机制之一。同时,检测肿瘤组织中铁离子染色和铁死亡相关基因的表达,探索HBV相关HCC与铁死亡的关系;通过LncRNA高通量测序,筛选复方叶下珠的靶向LncRNA,为后期进一步研究复方叶下珠的作用机制提供前期研究基础。研究方法1.评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的体外实验:构建过表达HBx基因的HepG2-HBx细胞稳定株,并用复方叶下珠进行不同浓度的处理,通过观察HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆实验,评价复方叶下珠对HBV相关HCC的抑制作用;并检测细胞中HBx和Hedgehog信号通路相关因子:SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1和GLI-2在mRNA和蛋白水平的表达;通过激光共聚焦检测细胞中GLI-1在细胞质和细胞核中的表达情况。2.评价复方叶下珠的抗HBV相关HCC的体内实验:将HepG2-HBx细胞接种到裸鼠皮下,并给予复方叶下珠进行治疗。通过测量裸鼠体重,肿瘤大小以及肿瘤抑制率等方法评价复方叶下珠对HBV相关HCC的抑制作用。并通过检测肿瘤组织中HBx和Hedgehog信号通路相关因子:SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1和GLI-2 在mRNA和蛋白水平的表达,以及利用免疫组化技术对SHH,PTCH-1,SMO,GLI-1以及HBx进行分析,进一步证实抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC的作用机制之一。3.复方叶下珠诱导铁死亡作用:利用普鲁士蓝染色技术,检测裸鼠移植瘤肿瘤组织中铁离子的浓度变化以及通过real-time PCR检测肿瘤组织中FTH mRNA和铁死亡关键基因CISD1,CISD2,CPX4和ACSL4的mRNA表达,初步评价诱导铁死亡是否为复方叶下珠发挥HBV相关HCC的作用机制之一。4.LincRNA高通量测序:通过对HepG2-HBx细胞以及复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞进行LincRNA高通量测序筛选,筛选出具有统计学差异的LncRNA,并通过real-time PCR进行初步验证,为进一步研究复方叶下珠的作用机制提供思路。研究结果1.复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞的增值、迁移以及克隆,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）。在mRNA水平,复方叶下珠能明显抑制HBx以及SHH、PTCH-1和GLI-1的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）。而复方叶下珠对SMO以及GLI-2的表达没有影响:在蛋白水平,复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞中HBx以及SHH、PTCH-1,GLI-1的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05）;与mRNA结果一致,复方叶下珠对SMO以及GLI-2在蛋白水平没有影响。激光共聚焦结果显示:复方叶下珠能明显抑制GLI-1在细胞质中的表达,其抑制效果呈量效关系。2.复方叶下珠能抑制HepG2-HBx细胞移植瘤体积增长,降低肿瘤/体重比率,提高肿瘤抑制率;与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.01,或p<0.001）。与体外实验结果一致,复方叶下珠能抑制HBx以及SHH、PTCH-1,GLI-1在mRNA以及蛋白水平的表达,与HepG2-HBx细胞相比,有统计学意义（P<0.05,或P<0.01）;而复方叶下珠对SMO以及GLI-2在mRNA以及蛋白水平均没有抑制作用,无统计学差异（P>0.05）。免疫组化结果显示:过表达HBx能增加细胞质中SHH、PTCH-1、GLI-1和SMO的表达,而复方叶下珠在625mg/kg的条件下,能明显抑制细胞质中HBx以及SHH、PTCH-1、GLI-1的表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）;复方叶下珠对SMO没有抑制作用,无统计学差异（P>0.05）。3.关于铁离子含量的变化,与HepG2-NC相比,HepG2-HBx组表达没有明显变化;但是,在环巴胺（cyclopamine）和复方叶下珠（625mg/kg）组,铁离子浓度明显增加,说明环巴胺和复方叶下珠可以提高肿瘤组织中铁离子含量。而对于FTH mRNA,HepG2-HBx组的表达水平明显升高（P<0.05）,而环巴胺和复方叶下珠可以降低其表达（P<0.05）。与HepG2-NC相比,CISD1和GPx4在HepG2-HBx组表达降低,但GPx4没有统计学差异（P>0.05）。复方叶下珠组（625mg/kg,300mg/kg）和环巴胺组能明显提高肿瘤组织中CISDlmRNA表达水平（P<0.01或P<0.00）,而对GPx4没有明显作用。在HepG2-HBx组中,CISD2表达明显降低（P<0.05）,并且环巴胺和复方叶下珠能明显提高其表达,尤其是复方叶下珠,有统计学差异（P<0.05或P<0.00）。而对于ACSL4,在HepG2-HBx组和复方叶下珠组,没有明显变化,无统计学差异（P>0.05）。4.LncRNA高通量测序结果显示,经过复方叶下珠处理后的HepG2-HBx细胞,与未处理的HepG2-HBx细胞相比,分别上调114个和下调65个LincRNA,通过real-time PCR 对 LncRNA MALAT1,LincRNA 0023,LncRNA GAS5,LncRNA ROR,LncBISPR,Lnc PSMB8-AS1,LncH19 以及 LncRP11-998D10.4 进行进一步验证,发现复方叶下珠对LncBISPR具有明显的抑制作用,并且具有量效关系,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.01）;而复方叶下珠在120mg/mL的药物浓度下,能明显提高Lnc PSMB8-AS1和Lnc RP11-998D10.4的表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.001）。而对于LncRNA MALAT1,在30mg/mL和60mg/mL的药物浓度下,复方叶下珠能明显降低其表达水平,而在120mg/mL的条件下,能促进其表达,与HepG2-HBx组相比,有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。对于 LncRNA 0023,LncRNA GAS5,LncRNA ROR 和 LncH19,复方叶下珠无明显的抑制或者是促进作用。结论通过体内外实验证明:复方叶下珠能够抑制HepG2-HBx细胞增殖、迁移以及克隆;能够抑制裸鼠移植瘤生长,降低肿瘤/体重比,提高肿瘤抑制率,说明复方叶下珠具有抗HBV相关HCC的作用。复方叶下珠可以抑制HBx表达,同时,也可以抑制Hedgehog信号通路中SHH,PTCH-1,GLI-1的表达,说明抑制Hedgehog信号通路激活是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC的作用机制之一。铁死亡是铁离子依赖性的,以脂毒性活性氧聚集为特性的非凋亡性细胞坏死形式。复方叶下珠能够提高肿瘤组织中铁离子浓度,降低FTH mRNA表达,提高CISD2 mRNA表达,有可能诱导肿瘤组织发生铁死亡,这也许是复方叶下珠发挥抗HBV相关HCC作用的另外一个机制。此外,Hedgehog信号通路抑制剂环巴胺能明显提高肿瘤组织中铁离子浓度以及抑制CISD1和GPX4 mRNA,说明Hedgehog信号通路能促进过氧化物反应,有可能参与调节铁死亡过程,因此,Hedgehog信号通路与铁死亡在HBV相关HCC以及HCC中的关系需要进一步深入研究。复方叶下珠能有效抑制LncBISPR的表达,并且呈量效关系,基因测序分析发现,复方叶下珠能对LncBLSPR的三个转录本有明显影响,但是,对于LncBISPR和这三个转录本在HCC以及HBV相关HCC中的作用还不清楚,需要进一步研究。LncRNA MALAT1作为致癌基因,在肿瘤组织中高表达,复方叶下珠能抑制其表达,但是,复方叶下珠是否能通过降低其表达而抑制肿瘤增长尚不清楚。同时,LncPSMB8-AS1在HBV相关HCC中的作用以及是否能作为HBV相关HCC的治疗靶点,需要更多的体内外实验去证实。
刘桂炎[7]（2020）在《LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异与肝癌易感性关联研究》文中研究表明目的:原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）,简称肝癌,是全球最常见的恶性肿瘤之一,近年来我国新发肝癌人数约占全球肝癌新发总数的一半,并且肝癌患者预后差,生存率低,导致肝癌死亡率和发病率几近相同。最新研究表明肝癌在广东省恶性肿瘤新发病和死亡谱中分别排第4和第2顺位,其不断增加的发病率和死亡率给广东省带来沉重的疾病负担,是严重威胁居民健康和生命的恶性肿瘤。肝癌被认为是环境暴露与遗传因素共同作用的结果,HOX转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA,HOTAIR）作为研究最多最热门的LncRNA之一,在人类恶性肿瘤中上调,与癌症的发生和转移呈正相关。HOTAIR具有复杂的生物学功能,基因遗传变异可以影响自身结构改变,影响转录和表达,从而干扰下游靶基因的功能,与下游靶基因的遗传变异共同促进肝癌发生发展。因此,本研究结合分子流行病学、分子生物学和生物信息学方法,探讨LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异的单独作用,遗传变异-环境、遗传变异间交互和中介效应对肝癌发生的影响,并进一步探究HOTAIR调控通路遗传变异单独作用和遗传变异-环境交互作用对肝癌发展的影响。方法:采用频数匹配的病例-对照研究方法,在广东人群中系统分析LncRNA HOTAIR调控通路（HOTAIR-EZH2-TP53-PTEN）遗传变异对肝癌易感性影响。综合多个功能预测数据库和生物信息学工具,结合国内外参考文献和标签单核苷酸多态性（tag Single Nucleotide Polymorphism,tagSNP）方法筛选HOTAIR调控通路上具有潜在功能的遗传变异（HOTAIR:rs12427129、rs3816153;EZH2:rs887569、rs12670401、rs80052686、rs6950683;TP53:rs16427129;PTEN:rs2735343）,应用Taq Man实时荧光定量PCR技术对目标遗传变异进行基因分型;采用c2检验比较病例组和对照组中环境因素和基因型分布的差异;运用MAX方法筛选各基因遗传变异最佳遗传模型;采用单因素和多因素Logistic回归模型分析环境因素与遗传变异对肝癌发生发展的影响;进一步用错误发现率（False Discovery Rate,FDR）方法进行多重校正;采用单体型和遗传风险评分方法分析基因遗传变异累积效应对肝癌易感性影响;在传统Logistic回归中引入交互项计算相乘交互,使用Logistic回归结合Delta方法计算相加交互,探索遗传变异与环境因素、遗传变异之间对肝癌发生发展的两两交互作用;应用多因子降维（MDR）和分类回归树（CART）分析HOTAIR调控通路遗传变异间、遗传变异-环境因素高阶交互作用对肝癌易感性影响;运用四向分解法探讨环境因素在各基因遗传变异与肝癌关联中的交互效应和中介效应以及各成分的贡献率大小。结果:1.本研究共纳入1453例原发性肝癌病例和1646例健康对照。多因素Logistic回归分析结果显示,慢性HBV感染和肝癌发病风险有关,关联OR值（odd ratio,OR）和95%置信区间（95%confidence interval,95%CI）为14.46（95%CI=12.08～17.65）;吸烟和饮酒也与肝癌的发病风险有关联（OR=2.76,95%CI=2.22～3.43;OR=2.27,95%CI=1.82～2.82）。2.HOTAIR基因rs12427129、rs3816153和PTEN基因rs2735343显性模型下与肝癌发病风险有关联。调整潜在混杂因素后,个体携带rs12427129 T等位基因与C等位基因相比降低肝癌发病风险（OR=0.64,95%CI=0.51～0.80,P<0.001）;与携带GG基因型相比,个体携带rs3816153GT+TT基因型会增加肝癌风险（OR=1.22,95%CI=1.01～1.46,P=0.039）,携带GC+CC基因型个体降低肝癌发病风险（OR=0.76,95%CI=0.61～0.94,P=0.012）。单体型分析结果显示,HOTAIR TG单体型携带者相比CG单体型降低肝癌发病风险（OR=0.24,95%CI=0.14～0.40,P<0.001）;相比携带EZH2 GCCT单体型,GTCC单体型携带者降低肝癌发病风险（OR=0.75,95%CI=0.65～0.89,P=0.001）。遗传风险评分结果表明,肝癌发病风险随着遗传风险评分等级增大而增加,其中6-7个风险评分等级风险最大（OR=3.12,95%CI=1.95～5.00,P<0.001）。3.遗传变异与环境因素、遗传变异间两两交互作用对肝癌发生分析结果显示,HOTAIR rs12427129与饮酒存在有统计学意义的相乘交互作用,与慢性HBV感染存在相乘相加交互作用;HOTAIR rs3816153与慢性HBV感染存在相加交互作用;PTEN rs2735343与癌症家族史之间存在相加交互作用,与慢性HBV感染存在相加交互作用（P值均小于0.05）;HOTAIR rs3816153与EZH2 rs80052686之间存在相乘和相加交互作用(Pmul=0.033,Padd=0.045),与EZH2 rs12670401之间存在临界统计学意义的相乘和相加交互(Pmul=0.072,Padd=0.074)。4.采用MDR分析遗传变异与环境因素、遗传变异间高阶交互作用对肝癌发生影响,遗传变异与环境因素MDR结果显示慢性HBV感染、HOTAIR rs12427129和rs3816153存在交互作用,该模型训练样本准确度为0.7939,验证样本准确度为0.7922,交叉检验一致性10/10,置换检验P<0.001;遗传变异间MDR结果最优模型EZH2 rs12670401、rs80052686和PTEN rs2735343,对应各项指标分别为0.5568、0.5434、10/10和P<0.001,提示3个遗传变异之间存在交互作用。5.采用CART分析遗传变异与环境因素、遗传变异间高阶交互作用对肝癌发生影响,遗传变异与环境因素CART分析显示慢性HBV感染、吸烟和PTEN rs2735343存在交互作用;遗传变异间CART分析结果显示HOTAIR rs12427129、EZH2 rs12670401和PTEN rs2735343之间存在交互作用。6.应用四向分解法分析遗传变异-环境因素、遗传变异间的中介效应,调整混在因素结果显示,HOTAIR rs12427129、rs3816153和PTEN rs2735343与慢性HBV感染对肝癌发生的效应主要归因于参考交互效应,超额相对危险度分别为0.91（95%CI=0.38～1.45,P=0.001）、-0.30（95%CI=-0.48～-0.11,P=0.002）和0.52（95%CI=-0.48～-0.11,P=0.037）;rs2735343与吸烟对肝癌的效应主要归因于参考交互作用,超额相对危险度为0.28（95%CI=-0.03～0.58,P=0.074）,贡献率为76.58%（P=0.008）;rs2735343和饮酒纯中介效应对肝癌影响有临界统计学意义（超额相对危险度=0.04,95%CI=-0.00～0.07,P=0.065）。7.EZH2 rs12670401隐性模型（CC vs TT+TC）会增加肝癌患者形成门静脉癌栓风险（OR=1.90,95CI=1.42～2.56,P<0.001）,rs12670401分别与吸烟和饮酒对门静脉癌栓形成存在相乘和相加交互作用（P值均小于0.001）;rs12670401与癌症家族史之间对门静脉癌栓形成存在有统计学意义相乘交互和临界统计学意义相加交互作用(Pmul=0.005;Padd=0.051)。rs12670401与吸烟对肝癌患者发展为TNM晚期风险存在有统计学意义相乘和相加交互作用（P均小于0.05）;rs12670401与饮酒之间对患者发展为TNM晚期风险存在有统计学意义相乘交互和临界统计学意义相加交互(Pmul=0.034;Padd=0.050)。结论:本研究通过遗传关联性分析发现HOTAIR调控通路遗传变异rs12427129、rs3816153和rs2735343与肝癌发生密切相关。慢性HBV感染分别与HOTAIR rs12427129、rs3816153和PTEN rs2735343,饮酒与rs12427129,癌症家族史与rs2735343之间存在的两两交互作用会影响肝癌的发生。分析影响肝癌发生的遗传因素交互时,除发现HOTAIR rs3816153分别与EZH2 rs12670401、rs80052686存在两两交互外,本研究还发现EZH2 rs12670401、rs80052686和PTEN rs2735343;HOTAIR rs12427129、EZH2 rs12670401和PTEN rs2735343之间存在高阶交互,其复杂的交互作用影响肝癌的易感性。进一步研究发现EZH2 rs12670401遗传变异及其与环境因素（吸烟、饮酒和癌症家族史）交互效应影响肝癌预后（TNM分期和门静脉癌栓）。本研究结果可为进一步肝癌发病机制提供新的思路和理论基础,对寻找肝癌潜在的治疗靶点提供参考方向,但本研究发现遗传变异与肝癌关联仅限于统计层面,进一步通过生物信息学功能预测HOTAIR-EZH2-TP53-PTEN影响肝癌发生发展潜在的生物学机制,该结果仍需要进一步分子生物学功能实验验证。
何彬[8]（2019）在《HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究》文中研究说明背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发病率在我国高居恶性肿瘤的第四位,死亡率更是高居第三位。我国每年新发肝癌46.6万,每年因肝癌死亡42.2万,两者均占全世界总数的50%以上。肝细胞癌具有起病隐匿、早期诊断困难、肝切除术后容易复发转移和晚期治愈率低等特点,对我国乃至全球人民的健康造成极其严重的危害。因此,早期肿瘤标志物的寻找、个体化精准诊断和治疗的实施、预后复发转移预警标记物的确立是目前肝癌诊治中亟需解决的问题。目的1.比较HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌与相应癌旁组织中的表达差异,分析HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝癌患者临床病理特征及预后之间的相关性,从而验证HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌中作为新型分子标志物的潜在价值。2.明确JNJ-26481585对肝癌细胞体外增殖和体内成瘤的抑制作用,并利用细胞和分子生物学技术探讨JNJ-26481585抑制肝癌细胞增殖的机制,进一步探究JNJ-26481585促进肝癌细胞G0/G1期阻滞及诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。3.明确JNJ-26481585与Sorafenib联合应用可以呈协同方式,抑制肝癌细胞体外增殖和体内成瘤,进一步探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用在体内外协同抑制肝癌细胞增殖的分子机制。4.探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。方法1.使用蛋白免疫印迹、免疫组织化学实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平,评价HDAC1、HDAC2、HDAC4在这两种组织中的表达差异。根据免疫组织化学评分结果,分析111例肝细胞癌组织中IHEDAC1、HDAC2、HDAC4的表达水平与临床病理特征及预后之间的相关性。2.使用实时荧光定量PCR实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞QSG-7701中mRNA的表达水平。3.通过CCK-8细胞活力检测、平板克隆形成、EDU实验,评估JNJ-26481585对肝癌细胞增殖的抑制作用。利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,探究JNJ-26481585对肝癌细胞周期、凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的作用。4.利用流式细胞术检测AKT抑制剂MK2206 2HCL对JNJ-26481585诱导细胞周期的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞周期阻滞的分子机制。5.利用流式细胞术检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。6.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。7.利用CompuSyn软件计算JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后的联合指数（Combination Index,CI）,明确 JNJ-26481585 与 Sorafenib 联合应用呈协同方式,并且确定两药联合应用的最佳搭配浓度。8.利用流式细胞术检测细胞凋亡,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对肝癌细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞凋亡相关蛋白的作用。9.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。10.在裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型中,评估JNJ-26481585在体内抑制肝癌细胞生长以及与Sorafenib联用后抑制肝癌细胞增殖的作用。11.利用HE染色法检测裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型体内重要脏器的组织形态学变化,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。12.利用免疫组化检测裸鼠瘤体组织的磷酸化JNK、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Ki67的蛋白表达情况;通过Tunel染色检测瘤体肿瘤细胞的凋亡情况;从而在体内探索JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。结果1.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平在肝癌组织中要高于相应癌旁组织。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,即HDAC1在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,门静脉血管就越容易被肿瘤侵犯,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度;HDAC2在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,组织学分化程度就越差;HDAC4在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度。3.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者术后总体生存率存在着密切关系,即低表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显长于高表达患者。4.HDAC1、HDAC2、]HEDAC4在肝癌细胞系中的mRNA表达水平要高于正常肝细胞。5.JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而诱导肝癌细胞周期阻滞。6.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP、Bax 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Survivin的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。7.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外均能够协同抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。8.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。9.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。结论1.HDAC1、HDAC2、HDAC4 在肝癌组织显着高表达,HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,高表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显短于低表达患者。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4对患者预后具有预警价值,未来有希望作为肝细胞癌术后新型预警分子标记物。3.JNJ-26481585通过调控PIBK/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而促进肝癌细胞的周期阻滞。4.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达水平,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。5.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内体外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。6.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。
徐由立[9]（2019）在《慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究》文中指出目的:观察慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者的肠道菌群变化情况,初步探讨肠道差异菌群与甲基化相关蛋白之间的关系。方法:采用病例--对照研究的方案,从四川省成都市郫县中医院门诊招募慢性乙肝患者12例,其中脾胃湿热证有5例、肝郁脾虚证7例,正常健康对照组由6名健康志愿者构成,采用16SrDNA高通量测序技术观察三组样本的菌群多样性和丰度变化情况,比较各组菌群结构特征;全自动生化仪检测肝功能指标;Elisa法检测甲基化感染相关蛋白DNMT1、MeCp2、E-cad、P53的浓度;Pearson相关系数分析肠道菌群与DNMT1、MeCp2、E-cad、P53之间的关系。结果:1.本次研究的三组18个样本DNA共检测出1980988条高质量的Clean reads,得到8352条OTUs,这些OTUs分属于11个菌门,19个纲,25个目,45个科,89个种,146个属,其中健康对照组（3399）>脾胃湿热组（2654）>肝郁脾虚组（2299）,三组样本共有的OTUs有263个,健康对照组和脾胃湿热组之间有469个交叉OTU,和肝郁脾虚组之间有445个交叉OTU,脾胃湿热组和肝郁脾虚组两组共有419个OTU,各组特有的OTU个数分别为健康对照组2748,脾胃湿热组1674,肝郁脾虚组2053。2.门水平上:本次研究三组样本均以拟杆菌门和厚壁菌门为优势菌,与健康对照组相比较,脾胃湿热组和肝郁脾虚组拟杆菌门丰度降低,厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门丰度升高,B/E值下降;科、属水平上,与健康对照组相比较,慢性乙肝证候组普雷沃菌属（Prevotella）、萨特菌属（Sutterella）、多尔氏菌属（Dorea）、毛螺旋菌下菌属（LachnospiraceaeUCG-008）、瘤胃梭菌属（Ruminiclostridium9）、阿里松氏菌属（Allisonella）、Anaeroglobus属丰度升高,食物谷菌属（Victivallis）丰度降低,且脾胃湿热组检出链型杆菌属（Catenibacterium）和丛毛单胞菌属（Comamonas）两个菌属,肝郁脾虚组检出泰泽属（Tyzzerella）;与脾胃湿热组比较,肝郁脾虚组检出放线杆菌属（Actinobacillus）,而链型杆菌属（Catenibacterium）、Intestinibacter菌属消失。经LEfSe分析,脾胃湿热组和肝郁脾虚组在变形菌门（Proteobacteria）上差异显着。3.与健康对照组比较慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证ALT、AST、GGT、TBIL、DBIL、TBA明显升高,HBV-DNA拷贝数高于检测下限（>1.0E+3）,（P<0.05）;与脾胃湿热组比较,肝郁脾虚组AST、GGT有所降低（P<0.05）。4.与健康对照组相比较慢性乙肝脾胃湿热组与肝郁脾虚组DNMT1、E-cad、P53、MeCp2浓度明显升高（P<0.05）;与脾胃湿热组相比较,肝郁脾虚组E-cad、P53、DNMT1、MeCp2浓度有所上升,差异无意义（P>0.05）。5.脾胃湿热组DNMT1与B/E呈较强相关（r=0.772）,E-cad、P53、MeCp2与B/E无明显相关（r<0.3,P>0.05）,肝郁脾虚组E-cad与B/E呈较弱相关性（r=0.601）,DNMT1、P53、MeCp2与B/E无相关性（r<0.4,P<0.05）。6.脾胃湿热组DNMT1与Proteobacteria呈较弱相关性（r=-0.589）,E-cad、P53、MeCp2与Proteobacteria无明显相关性;肝郁脾虚组E-cad、P53、MeCp2、与Proteobacteria无相关性（r<0.5,P>0.05）。结论:1.本次研究证实慢性乙肝患者与健康人群肠道微生物存在明显差异性;2.本次研究证实慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道具有各自的优势菌种;3.本次研究证实慢性乙肝的进展与宿主的DNA甲基化有关,DNMT1、E-cad、MeCp2、P53在影响宿主甲基化的同时可能也参与了慢性乙肝的进程;4.慢性乙肝状态下机体存在免疫功能紊乱,肠道微生态失调和甲基化修饰,B/E值、差异菌Proteobacteria与甲基化蛋白DNMT1、E-cad、MeCp2、P53呈一定相关性,很有可能是肠道菌群通过甲基化修饰的方式干预了某些特定基因的表达,从而在慢性乙肝中发挥作用,但其具体机制有待进一步研究。
李彤亚[10]（2019）在《HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究》文中指出由人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染引起的获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome,ADIS）是威胁人类最严重的传染病之一,它能破坏人体的免疫系统降低机体的免疫力,并引发严重的并发症,目前没有特效的治疗药物,HIV致病机制研究及药物靶标寻找的是对于人类健康和社会稳定有重要意义。Nef蛋白是HIV的负调控因子,主要表达于CD4+T细胞。Nef诱导的AIDS样症状主要表现为凋亡细胞的增加,且Nef基因突变或者缺失与长期不发病或病程进展缓慢的AIDS（Long-term Nonprogressors/Slowprogressors,LTNP/LTSP）的发生显着相关。Nef能下调CD4、CD28、CD86、MHC-I、MHC-II等细胞表面受体的表达,干扰免疫细胞的监视和清除,实现HIV-1的免疫逃逸;还能通过与诱凋亡因子及某些激酶直接结合抑制凋亡通路,使被感染细胞的存活期延长,利于病毒复制和感染力增强。我们通过酵母双杂交实验发现了Nef与细胞色素b（cytochrome b,Cyto b）C端（169-380 aa）存在相互作用,并通过免疫共沉淀验证了两者能在体内结合。而且我们发现Cyto b与Fas介导的凋亡有关。目前对于线粒体参与的凋亡通路,研究者的目光大都聚集在Cyto c上,Cyto c是线粒体凋亡通路的核心蛋白,通过与Apaf-1等辅助蛋白形成凋亡体,活化caspase并激发级联反应最终导致细胞的凋亡。而我们的研究结果证明Cyto b介导的凋亡与Apaf-1形成凋亡体无关,独立存在于Cyto c经典凋亡通路之外。我们的研究还发现,Nef可以抑制Apaf-1诱导的细胞凋亡,这说明了Nef是Cyto c凋亡通路的负调控因子。此外,我们用Fas的单抗C11刺激细胞的Fas凋亡通路,证明了Nef能通过直接与Cyto b的结合抑制Fas凋亡信号诱导的细胞凋亡。我们利用B型HIV-1的假病毒HIV-1BA-L感染Jurkat T细胞,证明了HIV-1可以通过与Cyto b的结合抑制Fas凋亡通路。迄今为止,关于Cyto b相关的凋亡通路及其机制的研究较少,我们的研究在这方面做出了初步探索,对于加深Nef诱导免疫逃逸机制的认识具有重要意义,也提供了治疗HIV的潜在靶点,然而深入的机制仍需进一步发现。乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染可以引起急、慢性肝炎,还与肝衰竭、肝硬化以及肝癌的发生发展有密切关系。乙型肝炎（Hepatitis B）是全球范围内的重要传染病,有较高的传染性和致死率。目前对于乙肝仍然缺乏有效的治疗药物。乙肝的治疗目标是持续抑制HBV的复制,减少肝细胞损伤,延缓肝炎演变为肝硬化（liver cirrhosis,LC）和肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的进程。HBV很难在体内完全清除,这与其复杂的免疫逃逸机制有关。干扰素（interferon,IFN）是一种广泛表达的细胞因子,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种生物学活性。IFN的生理作用是通过信号通路调节IFN诱导基因的转录来实现的。病毒感染首先诱发机体的天然免疫,IFN诱导的效应因子的表达是机体抗病毒感染的第一道防线。因而,研究HBV逃避IFN相关的天然免疫的机制的研究有重要的现实意义。干扰素诱导跨膜蛋白家族（interferon-inducible transmembrane protein,IFITM）是IFN的诱导重要的抗病毒、抗肿瘤的效应因子。它们主要由IFNγ通过诱导Jak-stat1信号通路诱导产生,具有广谱的抗病毒效应,如艾滋病毒（HIV）、SARS冠状病毒（SARS-CoV）、甲型流感病毒（IAV）、登革热病毒（DFV）和水泡性口膜炎病毒（VSV）等。但是,IFITM抗HBV的机制鲜见报道。HBV e蛋白有较强的免疫调节作用,与乙肝的发病机制有着密切的关系。我们为了研究HBV免疫逃逸的可能机制,首先利用酵母双杂交实验筛选能与HBe相互作用蛋白,发现ARID2编码的BAF200蛋白与HBe存在直接的相互作用。然而,HBe作为一种分泌蛋白,实际上难以在空间上与定位于核内的BAF200发生相互作用。但是,与HBe的基因序列大部分相同的HBV核心蛋白（HBc）大多位于胞质,于是我们推测HBc也可能与BAF200存在体内的相互作用。为验证此想法,我们进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明HBc和BAF200确实存在体内的相互作用。SWI/SNF家族是染色质重构复合物。SWI/SNF家族有BAF复合物和PBAF复合物两种形式,组成它们的亚基大多数是相同的,但BAF250只存在于BAF复合物,而BAF200和BAF180是PBAF的特有的亚基。据报道,只有PBAF复合物能调节细胞内核受体-配体依赖的转录活动。我们通过实验证实了,IFITM1的表达依赖于BAF200而并非BAF180。而且,我们发现IFNα对BAF200的调控并不STAT1的磷酸化,暗示IFNα诱导IFITM1的信号通路并不是JAK-STAT1途径。我们将pHBV1.31质粒转染HepG2细胞,并通过ELISA实验和荧光定量PCR,证明了IFNα的刺激可以显着降低HBeAg、HBsAg含量以及HBV DNA的拷贝数。这说明IFNα对HBV有抗病毒作用。此外,我们在HepG2和HepG2.2.15细胞内,通过干扰IFITM1基因的转录,证实了IFITM1介导了IFNα诱导的抗细胞生长作用。我们的实验还证明了,HBc能通过与BAF200的结合抑制IFNα诱导的IFITM1的表达,这可能是HBV免疫逃逸的机制之一,因而本研究为抗HBV复制和抗乙肝药物的研发提供了新思路。综上,我们探讨了关于HIV Nef蛋白和HBV HBc蛋白对宿主细胞的相互作用有机制,丰富和补充了对两种病毒感染及免疫逃逸机制的认识。
二、Interaction of hepatitis B virus with tumor suppressor gene p53: its significance and biological function（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Interaction of hepatitis B virus with tumor suppressor gene p53: its significance and biological function（论文提纲范文）
（1）基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 肝癌的流行病学研究 |
| 1.2 肝癌的西医治疗现状 |
| 1.3 中医对肝癌的认识及诊疗进展 |
| 1.3.1 中医治疗肝癌的历史沿革 |
| 1.3.2 当代肿瘤学家对肝癌的认识 |
| 1.3.3 中西医结合治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4 参桃软肝方治疗肝癌的研究进展 |
| 1.4.1 参桃软肝片的组方基础 |
| 1.4.2 参桃软肝方的研究现状 |
| 1.5 高通量测序的发展现状 |
| 1.5.1 高通量测序概述 |
| 1.5.2 转录组测序研究进展 |
| 1.5.3 基因功能富集分析 |
| 1.6 肝癌的表观遗传研究进展 |
| 1.6.1 表观遗传与甲基化 |
| 1.6.2 甲基化在肝癌中的研究现状 |
| 1.6.3 中医证候的DNA甲基化研究现状 |
| 1.7 网络药理学的发展概况 |
| 第二章 基于网络药理学的参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 参桃软肝方冻干粉的制备及质谱分析 |
| 2.1.2 主要药物化学成分搜集及筛选 |
| 2.1.3 药物靶点搜集与整理 |
| 2.1.4 GEO数据库寻找乙肝相关性肝癌的靶点 |
| 2.1.5 参桃软肝方化学成分-作用靶点网络的构建及关键靶点的分析 |
| 2.1.6 基因本体功能(GO)及KEGG通路富集分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 STR质谱分析及STR在网络药理学平台筛选的化合物及其对应靶点筛选结果 |
| 2.2.2 GEO数据库中乙肝相关性肝癌靶点基因获取结果 |
| 2.2.3 STR抗 HBV-HCC靶点基因的获取和GO功能注释及KEGGG通路富集分析 |
| 2.2.4 “药物-活性成分-关键作用靶点-通路”网络构建及分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 参桃软肝方的体外疗效研究 |
| 3.1 细胞实验研究 |
| 3.1.1 STR抑制人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 的增殖 |
| 3.1.2 STR 对人肝癌细胞株 HepG2.2.15、HepG2、MHCC97-H 迁移的影响 |
| 3.2 STR对 BALB/c裸鼠皮下成瘤模型的抑瘤作用及安全性研究 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 基于高通量测序筛选STR治疗HBV-HCC的潜在靶点及机制 |
| 4.1 STR对 HepG2.2.15 荷瘤裸鼠疗效的转录组学研究 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.1.3 实验结果 |
| 4.2 对HepG2.2.15 荷瘤裸鼠肿瘤组织全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析 |
| 4.2.1 实验步骤 |
| 4.2.2 实验结果 |
| 4.3 转录组测序和WGBS关联分析 |
| 4.3.1 关联基因的筛选 |
| 4.3.2 关联基因的GO注释与KEGG通路富集分析 |
| 4.4 临床HBV-HCC肝癌术后标本WGBS及差异甲基化基因筛选 |
| 4.4.1 临床样本的搜集 |
| 4.4.2 肝癌及癌旁组织样本WGBS测序 |
| 4.4.3 检测结果 |
| 4.5 临床样本WGBS与动物测序结果关联分析 |
| 4.5.1 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因筛选 |
| 4.5.2 临床样本WGBS测序与动物样本测序的关联基因GO与 KEGG分析 |
| 4.5.3 Hub基因的外部数据库验证 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 第六章 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 附件 |
（2）基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 研究背景(全文) 肝癌的现状 |
| 参考文献 |
| 第一部分 基于TCGA数据库肝癌相关基因分析及筛选 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-1(第一部分实验结果图表) |
| 参考文献(第一部分实验) |
| 第二部分 ARHGEF39在肝癌中的表达及其预后意义 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-2(第二部分结果图表) |
| 参考文献(第二部分研究) |
| 第三部分 LINC00470竞争性结合miR-4500调节ARHGEF39的表达影响肝癌细胞恶性进展 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 附图表-3(第三部分实验结果图表) |
| 参考文献(第三部分研究) |
| 全文总结 |
| 附录：文中所用所有寡核苷酸序列信息 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| Original article Ⅰ |
| Original article Ⅱ |
（3）基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 文献研究一 慢性乙型肝炎中医证候客观化规范化研究概述 |
| 1 中医对CHB病名的认识 |
| 1.1 肝着 |
| 1.2 肝毒 |
| 1.3 胁痞 |
| 1.4 异湿 |
| 2 中医对CHB病因病机的认识 |
| 2.1 湿热疫毒是本病的始动因素 |
| 2.2 毒损肝络是本病的病机关键 |
| 2.3 正气之盛虚决定本病的转归及预后 |
| 2.4 发则有证可辨,伏则无机可循为本病的发病特点 |
| 3 CHB中医证候分型指南与标准 |
| 4 影响CHB中医证候分布的相关因素 |
| 4.1 不同地域的CHB证候分布具有差异性 |
| 4.2 体质类型与CHB证候分布具有相关性 |
| 4.3 情志及生存质量的改变是部分CHB证候分布的易感性因素 |
| 5 中医证候的客观化规范化研究 |
| 5.1 肝功能指标 |
| 5.2 肝组织病理分级分期 |
| 5.3 肝脏硬度及肝纤维化值 |
| 5.4 细胞因子及免疫蛋白 |
| 5.5 HBV基因型 |
| 5.6 基因组学 |
| 5.7 转录组学 |
| 5.8 蛋白组学 |
| 5.9 代谢组学 |
| 6 小结 |
| 文献研究二 DNA甲基化在中医证候的应用研究 |
| 1 DNA甲基化概述 |
| 2 DNA甲基化在CHB发病机制中的作用 |
| 2.1 DNA甲基化与HBV |
| 2.2 Cp G岛与HBV基因型 |
| 2.3 DNMTs与 HBV |
| 2.4 甲基化相关蛋白与CHB |
| 3 DNA甲基化在中医证候的应用 |
| 4 小结 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化及HBV相关蛋白的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 常规检测方法 |
| 2.2 ELISA检测方法 |
| 2.3 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 一般资料收集结果 |
| 3.2 乙肝两对半定性检测结果 |
| 3.3 生化指标检测结果 |
| 3.4 HBV定性定量检测结果 |
| 3.5 DNA甲基化及HBV相关蛋白检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 中医证候与DNMT1间关系的探讨 |
| 4.2 中医证候与MeCP2间关系的探讨 |
| 4.3 中医证候与P53间关系的探讨 |
| 4.4 中医证候与E-cad间关系的探讨 |
| 4.5 中医证候与P16间关系的探讨 |
| 5 小结 |
| 实验二 慢性乙型肝炎全基因组DNA甲基化的研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 样本采集 |
| 2 方法 |
| 2.1 Infinium Human Methylation850K甲基化芯片简介 |
| 2.2 DNA抽提 |
| 2.3 DNA样本质检 |
| 2.4 DNA甲基化芯片实验流程 |
| 2.5 DNA甲基化芯片数据分析流程 |
| 2.6 数据分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 DNA样本质检结果 |
| 3.2 实验质控结果 |
| 3.3 样本beta值密度曲线 |
| 3.4 数据归一化 |
| 3.5 差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.6 GO功能富集结果 |
| 3.7 KEGG pathway富集结果 |
| 3.8 差异甲基化区域结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 差异甲基化位点结果分析 |
| 4.2 差异甲基化位点相关基因GO功能富集结果分析 |
| 4.3 差异甲基化位点相关基因KEGG pathway富集分析 |
| 5 小结 |
| 实验三 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候差异甲基化位点筛选结果 |
| 3.2 不同中医证候GO功能富集结果 |
| 3.3 不同中医证候KEGG pathway富集结果 |
| 3.4 不同证候差异甲基化区域分布结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 脾胃湿热证与肝郁脾虚证是四川地区CHB常见的中医证候 |
| 4.2 中医证候与DNA甲基化在理论上有共通之处 |
| 4.3 不同中医证候差异甲基化表达分析 |
| 5 小结 |
| 实验四 慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证DNA甲基化与mi RNA联合分析 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同中医证候中4条相同miRNA靶基因预测结果 |
| 3.2 不同中医证候差异甲基化位点相关基因筛选结果 |
| 3.3 miRNA预测靶基因与差异甲基化位点相关基因联合分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 mi RNA与 DNA甲基化间存在相互调控关系 |
| 4.2 miR-122-5p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.3 miR-1228-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 4.4 miR-191-3p与不同中医证侯差异甲基化位点相关基因融合分析 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 中药干预DNA甲基化修饰的研究进展 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1. 肝癌简介 |
| 2. miRNA简介 |
| 第二章 血清中miR-888-5p在原发性肝癌患者的表达 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 第三章 血清miR-888-5p与原发性肝癌患者临床病理参数及预后的关系 |
| 1. 研究背景 |
| 2. 肝癌患者的一般资料 |
| 3. 方法 |
| 4. 结果 |
| 5. 讨论 |
| 6. 结论 |
| 第四章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 问题及展望 |
| 中英文缩写词对照表 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
| 致谢 |
（5）1180例原发性肝癌临床特征和基于贝叶斯网络模型的生存时间影响因素分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 一、1180 例原发性肝癌临床特征分析 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究现场及对象 |
| 1.1.2 临床资料收集方法 |
| 1.1.3 研究内容 |
| 1.1.4 相关定义 |
| 1.1.5 统计学方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 基本资料 |
| 1.2.2 PHC患者不同病因及不同年龄段在不同性别中的分布 |
| 1.2.3 PHC患者不同年龄段及不同性别在不同病因中的分布 |
| 1.2.4 PHC不同病因及不同性别在不同年龄段上的分布 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、1180例原发性肝癌BCLC不同分期临床指标及肝硬度值变化特点 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 临床资料收集方法 |
| 2.1.3 血清标本的收集及检测方法 |
| 2.1.4 统计学方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床检测指标比较 |
| 2.2.2 肝硬度值的分布 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、295例原发性肝癌患者的生存及预后分析 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 临床资料收集 |
| 3.1.3 随访 |
| 3.1.4 统计学方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 影响PHC患者总生存时间危险因素的单因素分析 |
| 3.2.2 影响PHC患者总生存时间危险因素的多因素分析 |
| 3.2.3 影响PHC患者生存时间相关因素间贝叶斯网络模型的建立 |
| 3.2.4 年龄和γ-GT为父节点时肿瘤大小的风险推理 |
| 3.2.5 PHC患者生存时间风险推理 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 总结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 原发性肝癌高危因素及其发生机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一章 乙肝相关性肝癌中的研究综述 |
| 第一节 HBX在乙肝相关性肝癌中研究综述 |
| 第二节 HEDGEHOG信号通路在肝脏疾病中的研究进展 |
| 第三节 长链非编码RNA在HBV相关HCC中的作用 |
| 第四节 中医对肝癌的认识 |
| 第二章 复方叶下珠通过抑制HBX激活HEDGEHOG信号通路防治HCC的作用机制研究 |
| 第一节 HEPG2-HBX稳定细胞株的构建 |
| 一、质粒构建 |
| 二、病毒包装 |
| 第二节 复方叶下珠通过抑制HBX激活HEDGEHOG信号通路防治HCC的体外实验 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 试验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 第三节 复方叶下珠抑制HBX介导HEDGEHOG信号通路的抗肝癌作用的体内实验 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 试验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 第四节 复方叶下珠对HEPG2-HBX细胞中LINRNA表达的影响 |
| (一) 试验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 英文缩略语 |
| 攻读博士期间发表论文 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
| 详细摘要 |
（7）LncRNA HOTAIR调控通路遗传变异与肝癌易感性关联研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 课题思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 资料收集 |
| 2.2.1 流行病学调查 |
| 2.2.2 血液样本采集 |
| 2.3 遗传变异的选择 |
| 2.4 实验试剂和设备 |
| 2.4.1 主要实验试剂 |
| 2.4.2 主要实验设备 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 乙肝两对半定性检测 |
| 2.5.2 人血液基因组DNA提取 |
| 2.5.3 基因型检测 |
| 2.6 统计学分析 |
| 2.6.1 研究对象基本特征分析 |
| 2.6.2 最佳遗传模型的筛选 |
| 2.6.3 遗传变异基因型分布及其与肝癌发生发展的关联性分析 |
| 2.6.4 单体型与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 2.6.5 遗传风险评分与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 2.6.6 遗传变异-环境、遗传变异-遗传变异交互和中介效应分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 遗传变异与肝癌发生的关联性分析 |
| 3.1.1 研究对象基本特征 |
| 3.1.2 遗传模型筛选 |
| 3.1.3 单个遗传变异与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.1.4 单体型与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.1.5 遗传变异风险评分与肝癌发病风险的关联性分析 |
| 3.2 遗传变异-环境、遗传变异-遗传变异交互作用对肝癌发生的影响 |
| 3.2.1 HOTAIR基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.2 EZH2基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.3 TP53基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.4 PTEN基因遗传变异与环境因素两两交互作用 |
| 3.2.5 基因间遗传变异-遗传变异两两交互作用 |
| 3.2.6 应用MDR分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异高阶交互作用 |
| 3.2.7 应用CART分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异高阶交互作用 |
| 3.3 应用四向分解法分析遗传变异-环境和遗传变异-遗传变异中介效应 |
| 3.4 探索影响肝癌临床特征的危险因素 |
| 3.4.1 肝癌患者的TNM分期和门静脉癌栓情况 |
| 3.4.2 基因遗传变异与肝癌临床特征的关联性分析 |
| 3.4.3 遗传变异-环境交互作用对肝癌临床特征的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 环境因素对肝癌发生的影响 |
| 4.2 HOTAIR调控通路遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.1 HOTAIR基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.2 EZH2基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.2.3 PTEN基因遗传变异对肝癌易感性影响 |
| 4.3 交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.3.1 遗传变异-环境交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.3.2 遗传变异-遗传变异交互作用对肝癌易感性影响 |
| 4.4 HOTAIR调控通路遗传变异对肝癌临床特征的影响 |
| 第五章 创新与不足 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（8）HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HDACs在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平明显升高 |
| 2.2 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 |
| 2.3 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达差异与肝细胞癌患者术后长期生存的相关性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585抗肝癌的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞(QSG-7701)中的表达水平分析 |
| 2.2 JNJ-26481585能够抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.3 JNJ-26481585能够抑制肝癌细HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达 |
| 2.4 JNJ-26481585能够阻滞肝细胞癌细胞周期进程 |
| 2.5 JNJ-26481585能够促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.6 JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT和JNK/c-jun通路来影响细胞周期和凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 JNJ-26481585与Sorafenib联用能够协同抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.2 JNJ-26481585与Sorafenib联用通过调控JNK促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.3 JNJ-26481585与Sorafenib联用对裸鼠成瘤能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 文献研究 |
| 1 中医学对乙肝的认识 |
| 1.1 病名认识 |
| 1.2 病因病机概述 |
| 1.3 证候探索 |
| 1.4 中医药治疗 |
| 2 现代医学对乙肝的认识 |
| 2.1 病原学 |
| 2.2 流行病学 |
| 2.3 发病机制 |
| 2.4 治疗 |
| 3 肠道菌群的研究概况 |
| 3.1 肠道菌群的结构 |
| 3.2 肠道菌群的主要功能 |
| 3.3 影响肠道菌群结构的因素 |
| 3.4 肠道菌群研究方法 |
| 4 肠道菌群在乙肝中的研究现状 |
| 5 肠道菌群应用于中医证候的研究现状 |
| 5.1 脾虚证的微生态研究 |
| 5.2 湿热证的微生态研究 |
| 5.3 肾阳虚证的微生态研究 |
| 5.4 其它证型的微生态研究 |
| 第二部分 实验部分 |
| 一.利用16SrDNA测序技术对慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群结构的实验研究 |
| 1 研究目的 |
| 2 研究对象 |
| 2.1 病例来源及分组 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 排除纳入标准 |
| 3 实验材料 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要仪器 |
| 4 实验方法 |
| 4.1 粪便标本采集 |
| 4.2 肠道菌群DNA的提取 |
| 4.3 肠道菌群DNA的 PCR扩增 |
| 4.4 PCR产物的混样和纯化 |
| 4.5 文库构建和上机测序 |
| 4.6 测序数据处理 |
| 4.7 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 一般资料 |
| 5.2 肠道菌群检测结果 |
| 5.3 OTU聚类分析 |
| 5.4 Alpha多样性分析 |
| 5.5 Beta多样性分析 |
| 5.6 组间显着性差异metastats分析 |
| 5.7 群落结构分析与热图 |
| 5.8 群落相似度比较 |
| 5.9 LEfSe分析 |
| 二.肠道菌群与DNA甲基化相关指标的关联研究 |
| 1 研究对象 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 血液标本采集 |
| 3.2 血清生化指标检测 |
| 3.3 ELISA法检测血浆HBV慢性感染相关指标 |
| 4 统计学分析 |
| 5 实验结果 |
| 5.1 HBV-DNA定量 |
| 5.2 肝功能检测结果 |
| 5.3 DNA甲基化相关蛋白检测结果 |
| 5.4 肠道菌群与DNA甲基化相关指标的关联性分析 |
| 第三部分 综合讨论 |
| 1 四川地区慢性乙肝脾胃湿热证和肝郁脾虚证现状分析 |
| 2 慢性乙肝相关菌属分析 |
| 3 慢性乙肝不同证型相关菌属分析 |
| 3.1 脾胃湿热证菌群分析 |
| 3.2 肝郁脾虚证肠道菌群分析 |
| 4 DNA甲基化相关蛋白分析 |
| 5 DNA甲基化与中医证型分析 |
| 6 肠道菌群与甲基化相关蛋白的关联性分析 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（10）HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究（论文提纲范文）
| 本研究的创新点 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 人类免疫缺陷病毒Nef蛋白调控Fas凋亡通路的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HIV及调控蛋白Nef |
| 1.1.1 HIV基因组 |
| 1.1.2 Nef的特点 |
| 1.1.3 Nef对表面受体的调控 |
| 1.1.4 Nef对信号通路的调控 |
| 1.2 细胞凋亡的信号途径 |
| 1.2.1 死亡受体介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.2 内质网介导的凋亡信号通路 |
| 1.2.3 线粒体介导的凋亡信号通路 |
| 1.3 细胞色素B与细胞凋亡 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.2.1 菌株、细胞与动物 |
| 2.2.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 2.3 溶液的配制 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 酵母双杂交筛选 |
| 3.1.1 测定文库的滴度 |
| 3.1.2 扩增酵母文库 |
| 3.1.3 酵母菌的活化 |
| 3.1.4 小量转化诱饵蛋白质粒 |
| 3.1.5 文库质粒的转化 |
| 3.1.6 诱饵蛋白自身激活检测 |
| 3.1.8 酵母质粒的提取 |
| 3.1.9 DH5α感受态制备及质粒转化 |
| 3.2 重组质粒的构建 |
| 3.2.1 质粒的小量提取 |
| 3.2.2 限制性酶消化 |
| 3.3.3 用试剂盒回收DNA |
| 3.3.4 DNA片段和载体的连接 |
| 3.3 细胞培养和转染 |
| 3.3.1 细胞传代 |
| 3.3.2 细胞的转染 |
| 3.4 凋亡检测 |
| 3.5 多克隆抗体的制备 |
| 3.5.1 Cyto b免疫抗原的表达纯化 |
| 3.5.2 多克隆抗体的制备 |
| 3.6 线粒体的纯化 |
| 3.7 HIV-1BA-L假病毒的制备 |
| 3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.9 Western Blot实验 |
| 4 研究结果 |
| 4.1 Nef能直接与Cyto b结合 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 Cyto b与 Nef能产生体内的相互作用 |
| 4.2 胞质中的Cyto b参与了Fas凋亡通路 |
| 4.2.1 Cyto b免疫抗原的制备 |
| 4.2.2 Fas刺激后引起Cyto b的切割和C端从线粒体的释放 |
| 4.3 Nef抑制了Fas介导的细胞凋亡 |
| 4.4 Fas凋亡信号诱导Nef与 Cyto b的结合 |
| 4.5 Nef抑制了Cyto b介导的Fas凋亡途径 |
| 4.6 Nef是 Cyto b介导的Fas凋亡通路的抑制子 |
| 4.7 Nef也参与抑制了Cyto c介导的Fas凋亡途径 |
| 4.8 HIV感染细胞后,FasL诱生Cyto b的释放有所增强 |
| 5 结果讨论 |
| 第二章 乙型肝炎病毒核心抗原HBc抑制干扰素α诱导IFITM1 表达的分子机制 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 HBV及核心蛋白HBc |
| 1.1.1 HBV基因组 |
| 1.1.2 HBV与肝癌 |
| 1.1.3 HBc及其功能 |
| 1.2 IFN及其诱导的信号通路 |
| 1.2.1 干扰素的分类 |
| 1.2.2 干扰素的生物学作用 |
| 1.2.3 IFN诱导的信号通路 |
| 1.3 SWI/SNF家族 |
| 1.3.1 SWI/SNF的功能 |
| 1.3.2 BAF200 |
| 1.4 IFITM家族 |
| 1.4.1 IFITM家族的特点 |
| 1.4.2 IFITM1 及其功能 |
| 2 试剂与材料 |
| 2.1 菌株、质粒与细胞 |
| 2.1.1 菌株与细胞 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.2 文库、试剂及抗体 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 培养基、诱导剂及文库 |
| 2.2.3 抗体 |
| 3 研究方法 |
| 3.1 RNA干扰试验 |
| 3.2 RT-PCR |
| 3.2.1 RNA提取所用器具的处理 |
| 3.2.2 细胞总m RNA的提取 |
| 3.2.3 RNA电泳检测 |
| 3.2.4 RNA的反转录 |
| 3.3 细胞活力检测 |
| 3.4 ELISA 实验 |
| 3.5 荧光定量PCR |
| 4 研究结果 |
| 4.1 HBc与 BAF200 的相互作用 |
| 4.1.1 酵母双杂交结果 |
| 4.1.2 HBc与 BAF200 存在体内的相互作用 |
| 4.2 BAF200 调控IFNα诱导的IFITM1 的表达 |
| 4.3 HBc通过与BAF200 相互作用抑制IFITM1 的转录 |
| 4.4 HBc与 BAF180 竞争性结合BAF200,破坏PBAF复合体的形成,进而削弱了BAF200对IFITM1 的表达调控 |
| 4.5 IFNα的诱导不影响STAT1 的磷酸化水平 |
| 4.6 HBc削弱BAF200 对细胞活性的影响 |
| 4.6.1 BAF200 通过IFITM1 对细胞活力进行影响 |
| 4.6.2 HBc可以削弱BAF200 对细胞活力的影响 |
| 4.7 IFNα诱导下BAF200和HBc对 HBV复制水平的影响 |
| 5 结果讨论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的与学位论文相关的科研成果 |
| 致谢 |
四、Interaction of hepatitis B virus with tumor suppressor gene p53: its significance and biological function（论文参考文献）
- [1]基于高通量测序及网络药理学探讨参桃软肝方干预乙肝相关性肝癌的机制[D]. 贺凡. 广州中医药大学, 2020(09)
- [2]基于TCGA数据库的肝癌基因表达谱分析及ARHGEF39在肝癌中表达模式及机制的研究[D]. 高健. 山东大学, 2020(05)
- [3]基于DNA甲基化对慢性乙型肝炎脾胃湿热证与肝郁脾虚证的研究[D]. 马丽. 成都中医药大学, 2020(01)
- [4]原发性肝细胞癌患者血清中miR-888-5p表达水平及临床意义[D]. 裴苗苗. 南方医科大学, 2020(01)
- [5]1180例原发性肝癌临床特征和基于贝叶斯网络模型的生存时间影响因素分析[D]. 赵和平. 天津医科大学, 2020(06)
- [6]复方叶下珠抑制Hedgehog信号通路发挥抗HBV相关HCC作用的实验研究[D]. 栗昀. 广州中医药大学, 2020(06)
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- [8]HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究[D]. 何彬. 浙江大学, 2019(03)
- [9]慢性乙型肝炎脾胃湿热证和肝郁脾虚证患者肠道菌群的变化及其与甲基化相关蛋白的关联性研究[D]. 徐由立. 成都中医药大学, 2019
- [10]HIV和HBV病毒蛋白同宿主细胞的相互作用机制研究[D]. 李彤亚. 武汉大学, 2019(06)